Revisin

Inmunologa Vol. 25 / Nm 2/ Abril-Junio 2006: 115-130

Receptores tipo Toll: entre el reconocimiento de lo no propio infeccioso y las seales endgenas de peligro
M. Mesa-Villanueva, P.J. Patio
Grupo de Inmunodeficiencias Primarias, Facultad de Medicina Corporacin Biognesis, Universidad de Antioquia, Sede de Investigacin Universitaria, Medelln, Colombia.

TOLL LIKE RECEPTORS: BETWEEN INFECTIOUS NON-SELF RECOGNITION AND THE ENDOGENOUS DANGER SIGNALS
Recibido: 25 Mayo 2006 Aceptado: 13 Junio 2006

RESUMEN Los receptores tipo Toll (TLR) se conocen clsicamente por su expresin en las clulas presentadoras de antgeno (APC) donde participan en el reconocimiento de estructuras moleculares asociadas a los patgenos (PAMP) que no estn presentes en las clulas del hospedero. Sin embargo, como lo demuestran varios estudios recientes, los TLR tienen una distribucin tisular mucho ms amplia, pueden reconocer molculas derivadas de los tejidos lesionados del hospedero y desencadenan respuestas no solo inmunes sino tambin metablicas y de comportamiento propias de los estados de enfermedad. De acuerdo con estas observaciones es posible considerar a los TLR como receptores de seales de peligro tanto exgenas como endgenas, y por tanto como un puente entre la teora del reconocimiento de lo no propio infeccioso y la teora del peligro, lo cual plantea una serie de repercusiones que van ms all de la respuesta inmune. PALABRAS CLAVE: Receptores tipo Toll/ Inmunidad natural/ Clulas presentadoras de Ag/ Linfocitos/ Fagocitos/ Fibroblastos/ Adipocitos/ Epitelio/ Microglia/ Osteoclastos/ Protenas de choque trmico/ cido hialurnico.

ABSTRACT Toll like receptors (TLR) are classically known by their expression in antigen Presenting Cells (APC), where they participate in recognition of pathogen molecular patterns (PAMP), absent in host cells. However, recent studies show a broader tissue spectrum for TLR expression, being able to recognize molecules derived from injured host tissue and triggering immune, metabolic and behavioral responses typically observed in disease stages. Based on the latter observations, it is feasible to consider TLR as receptors for danger signals derived from exogenous and endogenous injuries and therefore as a bridge between two immunological theories; the non-infectious self recognition and the danger theory. The latter assumption has implications beyond the immune response. KEY WORDS: Toll-like receptors/ Immunity-natural/ Antigen presenting cells/ Lymphocytes/ Phagocytes/ Fibroblasts/ Adipocytes/ Epithelium/ Microglia/ Osteoclasts/ Heat-shock proteins/ Hyaluronic acid.

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INTRODUCCIN Uno de los enigmas ms interesantes en el campo de la inmunologa es porqu se genera una respuesta inmune y para responderlo se han planteado varias teoras. El modelo inicial fue propuesto por Frank Macfarlane Burnet a mediados del siglo XX y se conoce como la discriminacin propiono propio. Esta teora ha prevalecido desde su planteamiento y sostiene que el sistema inmune se activa en presencia de componentes extraos en tanto que no responde, es decir tolera los componentes propios. Segn la propuesta de Burnet, la respuesta inmune se iniciaba cuando los linfocitos B (LB) reconocan los antgenos (Ags) no propios mediante su receptor especfico, el Receptor de las clulas B (BCR). En 1969, Bretscher y Cohn propusieron al linfocito T ayudador (LTh) como indispensable en la provisin de una segunda seal (seal 2 de ayuda) que evitaba la muerte de los LB que haban recibido la seal proveniente del Ag (seal 1). En 1974 el modelo fue modificado nuevamente por Lafferty y Cunningham por la inclusin de una nueva clula, la clula presentadora de antgeno (APC) que provea otra segunda seal que llamaron seal 2 coestimuladora del LTh. Durante muchos aos se estudi la seal 2 de ayuda derivada del LTh y se ignor la seal 2 coestimuladora de la APC porque se desconoca de qu forma la APC poda diferenciar lo propio de lo extrao. Ante la imposibilidad de explicar muchos fenmenos inmunolgicos con este modelo, Charles Janeway en 1989, encontr una forma ingeniosa de integrar la coestimulacin en el modelo del reconocimiento de lo propio versus lo no propio, cuando plante la teora de la discriminacin entre lo no propio infeccioso y lo propio no infeccioso. Janeway acu el trmino Receptores de reconocimiento de Patrones (PRR) para referirse a receptores no clonales, codificados en la lnea germinal y expresados en las APC para reconocer productos microbianos, ausentes en las clulas del hospedero, tales como el lipopolisacrido (LPS); es decir estos PRR le permitiran a las APC discriminar entre lo no propio infeccioso y lo propio no infeccioso. Este modelo ubica el inicio de la respuesta inmune en el reconocimiento de los agentes infecciosos no por los linfocitos sino por las APC; de acuerdo con esta propuesta y partiendo de la hiptesis de que normalmente las APC estn en reposo y deben activarse mediante algn tipo de seal, Janeway sugiri que la unin de los PRR a sus ligandos activaba a las APC, las cuales solo entonces aumentaran la expresin de molculas coestimuladoras para activar al LT. Sin embargo, aunque la adicin de los PRR explicaba la respuesta inmune a las bacterias y otros patgenos evolutivamente distantes, no poda explicar la respuesta inmune a trasplantes y tumores, ni la disfuncin observada en las enfermedades autoinmunes(1).

Para resolver este vaco, en 1994, Polly Matzinger propuso la teora del peligro segn la cual, las APC son estimuladas no por los PAMP sino por seales de alarma/peligro liberadas por los tejidos lesionados como aquellos expuestos a patgenos, toxinas, dao mecnico y muerte por necrosis; seales que nunca son emitidas por clulas saludables o que sufren muerte fisiolgica. En ese momento se desconoca cules podan ser esas seales de peligro; sin embargo, sin importar su naturaleza, lo que propona esta teora era que estas seales endgenas liberadas en respuesta al peligro eran las que iniciaban la respuesta inmune. A diferencia del modelo de discriminacin propio-extrao que sostiene que lo extrao es esencial para desencadenar una respuesta inmune, la teora del peligro sugiere que el estado de activacin de una APC depende de la salud de su entorno; de esta manera, las clulas saludables envan seales de normalidad a las APC, en tanto que las clulas estresadas, daadas, destruidas anormalmente muertas por necrosis envan seales de alarma que alertan a las APC. El modelo del peligro plante dos aspectos novedosos en la inmunologa; el primero, que no es la naturaleza extraa del patgeno el rasgo importante que desencadena la respuesta inmune sino las seales que libera la clula lesionada; y el segundo, que el reconocimiento de lo propio no es garanta de tolerancia porque si lo propio est alterado tambin puede inducir una respuesta(2) (Fig. 1). La teora de lo no propio infeccioso y la teora del peligro tienen en comn que ubican el inicio de la respuesta inmune en la APC; segn sus supuestos, esta clula debe ser activada ya sea por PAMP de los patgenos o por seales de peligro derivadas del tejido lesionado. El modelo de lo no propio infeccioso ha sido respaldado por el descubrimiento de los TLR y de los receptores con dominios de oligomerizacin para unin a nucletidos (NOD). Estas molculas actan como PRR de PAMP derivados de patgenos como bacterias y hongos en organismos tan distantes en la escala evolutiva como insectos y mamferos. Por otro lado, la teora del peligro ha sido respaldada por el hallazgo de seales de alarma endgenas tales como DNA, RNA, protenas de choque trmico (HSP), interfern alfa (IFN-), interleucina 1 beta (IL-1), el ligando de CD40 (CD40L) y los productos del hialuronano que se generan durante la ruptura de los vasos sanguneos. Aunque no se conocen completamente los receptores de estas seales de peligro, las investigaciones recientes muestran que muchas de ellas son reconocidas por los mismos TLR y NOD. Se podra sugerir entonces que estos receptores reconocen seales exgenas o endgenas de peligro y que hacen parte de un sistema que alerta al organismo para defenderse tanto de las agresiones del medio externo como del interno(3). De acuerdo con esta

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Figure 1. Teoras sobre el inicio de la respuesta inmune. A. 1959: Modelo de discriminacin propio vs no propio. B. 1969: El LB requiere una seal de ayuda del LTh. C.1975: El LTh requiere una seal coestimuladora 2 de la APC. D. 1989: Modelo de discriminacin propio vs no propio infeccioso; la APC requiere estimulacin va PRR. E. 1994: Modelo del peligro; la APC requiere estimulacin por seales de peligro derivadas del tejido infectado o lesionado (Adaptado de Matzinger,P. Science. 2002. 296:301-305)(3).

observacin, no es de extraar que la expresin de los TLR sea ms amplia de lo que originalmente se pens; en efecto, las investigaciones recientes han evidenciado expresin de TLR en muchas clulas no solo del sistema inmune sino tambin en los tejidos epitelial, adiposo y muscular entre otros. En cada uno de estos tejidos, los TLR son susceptibles de activacin por sus ligandos respectivos y desencadenan respuestas diferentes que en general pueden verse como mecanismos de defensa del hospedero frente al peligro. En esta revisin se presentan algunas evidencias de la expresin y activacin de los TLR no solo en clulas del sistema inmune sino tambin en tejidos distintos al sistema inmune, de manera que se pueda apreciar en conjunto como estas respuestas individuales hacen parte de un mecanismo mayor cuyo objetivo es proteger al hospedero del dao o la destruccin. Al parecer la alarma es general y se inducen respuestas no solo inmunes sino tambin metablicas y de comportamiento que son claves en el manejo de las agresiones sin importar cual sea su origen. De esta manera, es posible considerar a los TLR y a otros receptores aun desconocidos como un puente que permite expandir el modelo del peligro ms all de las fronteras del sistema inmune.

Los Receptores tipo Toll (TLR) son receptores transmembrana de tipo 1 que presentan homologa con la protena Toll de Drosophila y el receptor de la IL-1 (IL-1r). Estos receptores fueron descritos primero en Drosophila melanogaster, como un grupo de molculas necesarias durante el desarrollo embrionario; posteriormente se observ que algunos de ellos protegan a la mosca adulta de las infecciones por hongos mediante la estimulacin de la secrecin de pptidos anti-fngicos. Ms adelante se empezaron a clonar genes relacionados en plantas, gusanos, aves y mamferos, lo cual demostr su importancia en la escala evolutiva como parte del sistema inmune innato y como un mecanismo para reconocer patrones moleculares de organismos no relacionados (4-7). En la actualidad se conocen 11 TLR en humanos (TLR1-TLR11) que tienen un patrn de expresin variable en los tejidos linfoides y no linfoides. De modo caracterstico, los TLR tienen un amplio rango de ligandos que incluyen motivos estructurales presentes en bacterias, hongos levaduras y parsitos (Tabla I), as como de algunos componentes derivados de los tejidos del hospedero(8) que se mencionarn posteriormente. Despus de la interaccin con su ligando respectivo, los TLR dimerizan y sufren un cambio

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TABLA I. TLR de mamferos: expresin y ligandos

Receptor Expresin (mRNA) Ligando Lipopptidos triacilados (Pam3Cys) Factores solubles Lipoprotenas y lipopptidos Peptidoglicano (PG) cido lipoteicoico (LTA) Lipoarabidomanano Modulina soluble en fenol Glicoinositolfosfolpidos Glicolpidos Porinas Lipopolisacrido atpico Lipopolisacrido atpico Zymosan RNA viral de doble cadena Poli(I:C) Lipopolisacrido (LPS) Potena de fusin Protena de la envoltura HSP60 Flagelina Lipopptidos diacilados (Pam2Cys) LTA Zymosan Imidazoquinolina ss RNA Imidazoquinolina ss RNA DNA con motivos CpG ND ND Origen del ligando Bacterias y micobacterias Neisseria meningitidis Varios patgenos Bacterias Gram + Bacterias Gram + Mycobacteria S. epidermidis T. cruzi T. maltophilum Neiseria Leptospira interrogans Porphyromonoa gingivalis Hongos Virus Sinttico Bacterias Gram Virus Sincitial respiratorio Virus de tumor mamario Chlamydia pneumoniae Bacterias Mycoplasma Bacterias Gram + Hongos Compuesto sinttico Virus Compuesto sinttico Virus Bacterias y virus ND Bacterias uropatognicas

TLR1 (con TLR2) M, N, LB, NK, CDi, CDpl TLR2 PMN, M, CD, CDi

TLR3 TLR4

CD, CDi C.End, M, N, CD

TLR5

M, CD, CDi

TLR6 (con TLR2) M, CDi, CDpl

TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 TLR11

CDpl M, CDi M, CDpl CDi Epitelio renal*

M: monocito; N: neutrfilo; CD: clula dendrtica, CDi: CD inmadura; CDpl: CD plasmocitoide; C.End: clula endotelial; NK: Natural killer. * Murino. En humanos se expresa una forma truncada de la protena. (Adaptado de Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 2004;4:499-511.

conformacional requerido para el reclutamiento corriente abajo de molculas de sealizacin. Estas incluyen molculas adaptadoras como MyD88, TIRAP/MAL, TRIF y TRAM, cinasas asociadas con el receptor de IL-1 (IRAK), cinasas activadas por el factor transformante de crecimiento beta/TGF- (TAK1), protenas de unin a TAK1 (TAB1), TAB 2 y el factor 6 asociado con el receptor de TNF (TRAF6). Cada molcula adaptadora induce vas de sealizacin intracelular distintas que promueven la transcripcin de genes de citocinas pro-inflamatorias, quimiocinas y molculas coestimuladoras(8).

EXPRESIN DE LOS TLR EN CLULAS DEL SISTEMA INMUNE El sistema inmune adaptativo ha evolucionado para desarrollar diferentes tipos de respuesta contra diferentes patgenos. Es as como los virus y las bacterias intracelulares estimulan la generacin de clulas Th1 que secretan IFN; esta citocina activa los macrfagos incrementando su actividad fagoctica y citocida e induce a los LB hacia la secrecin de inmunoglobulinas IgG3 e IgG1. En contraste, los helmintos casi siempre inducen respuestas de LTh2; estos linfocitos producen IL-4, IL-5 e IL-13 que activan

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eosinfilos e inducen en los LB el cambio de isotipo hacia IgE e IgG4 (9-11). Cada una de estas respuestas es la ms adecuada para eliminar el tipo de infeccin que lleva a su induccin; por ejemplo, las IgG3 e IgG1 median efectivamente la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (Acs) contra patgenos intracelulares, en tanto que el entrecruzamiento de la IgE unida a los receptores FceR resulta en la degranulacin de los mastocitos, basfilos y eosinfilos cuyo contenido es crtico en la destruccin de los helmintos. Adems, de los LTh1 y LTh2, la respuesta inmune muchas veces induce LT reguladores (LTreg) que controlan a los LTh, previenen la autoinmunidad y el dao tisular y aseguran el desarrollo de la memoria inmunolgica(12). El mecanismo que determina la decisin LTh1, LTh2 LTreg en respuesta a un patgeno particular no es muy claro; sin embargo, la evidencia experimental sugiere que el resultado se debe a la interaccin compleja de varios determinantes, incluyendo el tipo de APC involucrada, la naturaleza del estmulo microbiano, el microambiente y las citocinas(13, 14). Entre las poblaciones de APC que incluyen las clulas dendrticas (CD), LB y macrfagos, las CD son las nicas capaces de activar a los LT vrgenes especficos de un Ag durante las respuestas primarias, lo que demuestra su importancia como puente entre la inmunidad innata y la adaptativa. Existen varias subpoblaciones de CD que difieren en su fenotipo; entre ellas se encuentran las CD mieloides (CDm) y las CD plasmacitoides (CDpl). Las CDm CD11c+ residen como clulas inmaduras en los epitelios de piel y mucosas donde interceptan los patgenos invasores, sufren un proceso de maduracin caracterizado por la expresin de CD80, CD86, CCR7 y la migracin a los tejidos linfoides secundarios, donde presentan los Ags derivados de los patgenos a los LT vrgenes. Por su parte, las CDpl CD11cmigran directamente de la sangre a los rganos linfoides secundarios y son potentes productores de IFN-(15, 16). La CD madura determina el destino del LT CD4+ virgen mediante tres seales: La seal 1 depende de la unin del complejo formado por la molcula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II y el pptido derivado del patgeno (MHC II-pptido) con el TCR del LTh; la seal 2 se refiere a la interaccin de molculas coestimuladoras expresadas en la membrana de la CD y el LT mientras que la seal 3 depende de las citocinas producidas por la CD activada. En la CD, la expresin de MHCII, CD80 y CD86 y la produccin de citocinas polarizantes se produce durante su maduracin y depende a su vez de la forma en que la CD sea activada por seales derivadas de los PAMPs y de los tejidos lesionados(17). Es importante sealar que las CD expresan diferentes PRR dependiendo de su origen y estado de maduracin, razn por la cual responden al reto con

antgenos microbianos de diferente origen(18-20). Por ejemplo, las CDm expresan todos los TLR, excepto TLR9 y su estimulacin con LPS y peptidoglicano (PG) conduce a una potente produccin de IL-12; por su parte, las CDpl que expresan TLR7 y TLR9 producen interferones tipo I en respuesta a ssRNA y a los oligodesoxinucletidos (ODN) ricos en motivos CpG. Tanto la IL-12 como los IFN tipo I dirigen la polarizacin de los LT vrgenes hacia el fenotipo Th1(16, 21). En el caso de los helmintos y de los alergenos que inducen respuestas Th2, los datos de las investigaciones an no son claros y se ha postulado que la generacin de los LTh2 es una respuesta constitutiva ante la falta de IL-12. Sin embargo, como slo unos pocos Ags de esta clase son reconocidos por TLR (fosfoglicanos de T. cruzi, Ags de los huevos de Schistosoma-SEA, ciertas formas de Candida o LPS de Porphyromona gingivalis)(22), algunos investigadores opinan que la respuesta Th2 es regulada mediante un sistema de reconocimiento diferente que es independiente de la familia de los TLR(23). Los TLR tambin participan en el modelamiento de la respuesta adaptativa al inducir en las CD la secrecin de citocinas que actan sobre los LTreg naturales o sobre los LTreg adaptativos. Se ha observado por ejemplo, que las hifas de Candida albicans, la hemaglutinina filamentosa de Bordetella o el factor de virulencia LcrV de Yersinia inducen CD maduras que secretan IL-10, citocina importante en la expansin de las poblaciones de LT reguladores naturales. Por otro lado, algunos patgenos como Plasmodium falciparum, especies de micobacterias, el virus de la hepatitis C, el herpes simple y el citomegalovirus pueden inducir una maduracin incompleta de las CD y generar CD que polarizan los LT hacia un fenotipo regulador adaptativo(12). Tambin se ha observado que la activacin de las CD por algunos ligandos de TLR puede inducir la secrecin de IL-6 y de otros factores que eliminan la supresin de los LT efectores ejercida por los LTreg naturales(24). Adems de las CD, los TLR se expresan tambin en fagocitos, mastocitos y clulas NK. La estimulacin de estas clulas mediante estos receptores activa vas de sealizacin que amplifican la inmunidad innata en calidad y duracin. Fagocitos: Los polimorfonucleares neutrfilos (PMN) expresan todos los TLR excepto TLR3. La estimulacin de los PMN mediante los TLR induce el desprendimiento de L-selectina (CD62L), inhibe la quimiotaxis frente a IL-8, incrementa la fagocitosis de perlas de ltex opsonizadas y los sensibiliza al estmulo con el pptido bacteriano f-MLP para generar anin superxido. Adicionalmente, los PMN producen quimiocinas como MIP-1/CCL3 y MIP-1/CCL4 responsables de reclutar monocitos y clulas NK, IL-8/CXCL8

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y GRO-a/CXCL1 que atraen otros neutrfilos y MIP-3/CCL20 que recluta CD inmaduras. Por el contrario, no expresan genes de quimiocinas especficos de LT, LB, CD maduras ni de LTh2. Es interesante anotar que la activacin de los neutrfilos con LPS y LTA altamente purificado inhibe su apoptosis e incrementa su vida media til ms all de 610h(25). Estos resultados en conjunto sugieren que la activacin de los neutrfilos va TLR no se asocia con la inmunidad adaptativa, sino ms bien con una expansin de la inmunidad innata tanto en magnitud como en duracin con el fin de conceder el tiempo necesario para que el sistema inmune adaptativo genere inmunidad esterilizante y de memoria(26). Por otro lado, los macrfagos tambin expresan TLR y su activacin es responsable no slo de la produccin de citocinas pro-inflamatorias sino tambin de los procesos de formacin del fagolisosoma. Los macrfagos de ratones knock out para TLR2 y TLR4 (TLR2 x 4/) internalizan menos bacterias, generan menos fagolisosomas y tienen menor actividad bactericida que los de tipo silvestre(27). Otra funcin importante de los macrfagos que se modula va TLR es la sntesis de molculas involucradas en la reparacin tisular. Este efecto est mediado por redes ms complejas en las que participa la adenosina. La adenosina es una molcula protectora durante estados de estrs celular que estimula en los macrfagos la secrecin de citocinas anti-inflamatorias y reduce la de citocinas pro-inflamatorias; sin embargo en presencia de algunos PAMP como LPS, el perfil de citocinas del macrfago no slo deja de ser pro-inflamatorio sino que cambia a angiognico mediante la induccin del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)(28) y la disminucin simultnea de TNF-(29). No es claro an el mecanismo responsable de la expresin incrementada de VEGF pero teniendo en cuenta que ni el receptor de adenosina (A2AAR) ni los TLR inducen niveles elevados de VEGF, este sinergismo para la induccin del factor angiognico sugiere la existencia de un puente entre inflamacin post-infecciosa y reparacin tisular (Fig. 2)(30). En este aspecto, es importante mencionar que el LPS puede estimular la produccin de endotelio tanto in vitro como in vivo. En un estudio con lneas de clulas endoteliales humanas cultivadas sobre perlas inertes recubiertas de gelatina y embebidas en fibrina, se observ que el LPS poda inducir la germinacin de la capa celular y que este efecto dependa de la va de sealizacin TLR4-TRAF6- NFB y JNK. Adems es de resaltar que este hallazgo se corrobor in vivo mediante la evidencia de neovascularizacin de la membrana corioalantoidea de embriones de pollo tratados con LPS(31). Mastocitos: Dependiendo de su origen tisular, los mastocitos expresan diferentes TLR. Por ejemplo, los mastocitos humanos derivados de sangre de cordn umbilical expresan

Figure 2. Los TLR sinergizan con el A2AAR en la induccin de VGEF (Adaptado de Olah, M. Mol Inter. 2003:370-374)(30).

TLR1, TLR2, TLR6, MD-2 y MyD88 y en presencia de PG de S. aureus y de zymosan, sintetizan GM-CSF, IL-1, RANTES y leucotrienos aunque no se degranulan; por el contrario el estmulo con Pam3Cys induce degranulacin pero bajos niveles de mediadores proinflamatorios(32). Curiosamente tambin se ha observado que los mastocitos humanos estimulados con PG pueden secretar histamina y sintetizar un perfil de citocinas pro-Th2 (TNF-, IL-5, IL-10 e IL-13)(33). Por su parte, los mastocitos derivados de sangre perifrica expresan TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 y TLR9 y sintetizan TNF-, IL-1, IL-5 y GM-CSF en respuesta al estmulo con PG, LPS, flagelina y CpG-A. Por su parte, algunos virus dsRNA y el poli I:C inducen produccin de IFN-/, sealando que los TLR de los mastocitos tambin pueden alertar sobre la presencia de infecciones virales(34). Es probable que la estimulacin de los mastocitos va TLR sea importante en la polarizacin de las CD presentes en el tejido afectado y/o que amplifique la respuesta del hospedero a la infeccin por patgenos; sin embargo, tambin podra ser responsables de la inflamacin crnica en sitios ricos en mastocitos tales como la piel y los pulmones(32). Clulas NK: Aunque las clulas NK participan en la respuesta inmune contra los microorganismos, su capacidad de reconocer y ser activadas directamente por los patgenos no es clara. Como es de esperarse por su participacin en la defensa antiviral, las clulas NK expresan TLR3 y responden a la estimulacin con poli I:C incrementando la expresin

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de TLR3 y CD69 y la secrecin de IL-6, IL-8 e IFN- (35). Tambin se ha observado activacin de las clulas NK humanas cultivadas con IL-12 en respuesta al estmulo con dsRNA y CpG va TLR3 y TLR9 respectivamente. En respuesta a estos PAMP, las clulas NK expresan CD69 y CD25, liberan TNF- e IFN- e incrementan su actividad citoltica sobre clulas tumorales(36). Las NK tambin responden directamente al estmulo con PAMP derivados de protozoarios y bacterias; por ejemplo responden va TLR2 a lipofosfoglicanos (LPG) de Leishmania, induciendo la produccin de IFN- y TNF(37). Tambin son activadas por la protena A de la membrana externa de Klebsiella pneumoniae (ligando de TLR2) y la flagelina (ligando de TLR5) que inducen la produccin de IFN- y la liberacin rpida de -defensinas, amplificando as la respuesta innata(38). Aparte de su amplia distribucin en las clulas del sistema inmune innato, tambin se ha observado expresin de TLR en los LTreg y en los LB. En ratones por ejemplo, se detect la expresin de TLR4, TLR5, TLR7 y TLR8 en LTreg CD4+ CD25+. La estimulacin de estas clulas con LPS indujo un incremento en la expresin de marcadores de activacin, su proliferacin y aumento de su actividad supresora sobre los LT efectores CD4+CD25 (39). De acuerdo con estas observaciones se ha postulado que despus de la activacin inicial de los LTh, este mecanismo podra contribuir al control de la respuesta inmune evitando el desarrollo de reacciones de autoinmunidad. Linfocitos B: Adems de su participacin en la respuesta inmune adaptativa, los LB tienen caractersticas de APC porque se activan cuando detectan molculas mediante los TLR. A diferencia de los LB murinos que expresan TLR4 y TLR9 constitutivamente, la expresin de los TLR en LB humanos es regulada durante su desarrollo y maduracin. Los LB vrgenes (CD19+CD27-) expresan la mayora de TLR en bajos niveles y la expresin de TLR9 y TLR10 se induce rpidamente luego de activacin va BCR. Por el contrario, las clulas de memoria (CD19+CD27+) expresan TLR6, 7, 9 y 10 en niveles constitutivamente elevados, especialmente TLR7 y TLR9 y proliferan en respuesta a su agonista, el CpG. Con base en estos experimentos, se concluy que los LB de memoria proliferan y se diferencian a clulas secretoras de Ig en respuesta a CpG en tanto que los LB vrgenes slo lo hacen si simultneamente son activados por el BCR. De acuerdo con estas observaciones, los TLR regulan la respuesta de Acs en una forma independiente de LT y de manera diferente durante la respuesta primaria y la secundaria. Por eso se ha propuesto el siguiente orden de eventos: En la respuesta primaria, el Ag primero se une al BCR y activa la expresin de TLR9, luego el Ag y el ligando de TLR9 se internalizan en el endosoma y se activa la transcripcin de

los genes involucrados en la respuesta de los LB; De esta forma se previene la activacin policlonal y se asegura la induccin de genes en respuesta a un Ag determinado. En contraste, la expresin constitutiva de los TLR en los LB de memoria permite la activacin policlonal de la poblacin completa de memoria facilitando la generacin de una respuesta rpida40. El TLR9 tambin puede modular la respuesta de los LB dependiente del LT. Especficamente se evidenci que la produccin de IL-6, TNF- e IL-10 por los LB vrgenes y de memoria estimulados con CD40L se incrementaba en presencia de CpG. Adems, la combinacin de los dos estmulos indujo la sntesis de IL-12p70 y la secrecin de IgM sin necesidad de entrecruzamiento del BCR. Curiosamente, estos LB fueron capaces de inducir la sntesis de IFN- en LTCD4+ en una forma dependiente de IL-12 aunque no pudieron inducir su proliferacin. Estos resultados son particularmente interesantes, porque demuestran que los LB podran regular la polarizacin de los LTh en la respuesta primaria. En este aspecto, es interesante sealar que el reconocimiento del Ag especfico por el BCR induce respuestas Th2; sin embargo, varios estudios indican que luego de estimulacin mediada por CD40L, el LB adquiere caractersticas de CD con capacidad de captar y presentar Ags exgenos a los LT independientemente del BCR. De esta forma, se puede suponer que el estmulo adicional mediante el TLR9 que induce secrecin de IL-12 puede polarizar la respuesta hacia Th1(41).

EXPRESIN DE TLR EN CLULAS DE SISTEMAS DIFERENTES AL SISTEMA INMUNE La evidencia creciente de la expresin de los TLR en clulas no pertenecientes al sistema inmune (Tabla II), sugiere un papel ms amplio para estos receptores en la respuesta de los tejidos infectados o lesionados y dan soporte al modelo del peligro para explicar no slo el inicio de la respuesta inmune sino tambin del desarrollo de una serie de respuestas metablicas y de comportamiento que son importantes en la resolucin de los estados anormales que amenazan la integridad del hospedero. Fibroblastos: Los productos bacterianos que penetran en el compartimiento subepitelial pueden activar la inmunidad innata al interactuar con clulas como los miofibroblastos intestinales. Estas clulas as como las lneas celulares derivadas de ellas, presentan expresin constitutiva de TLR19; adems la estimulacin con LPS y LTA produce un incremento de TLR2, 3, 4, 6, 7 y de MyD88. En las lneas celulares se observa adicionalmente traslocacin de p65 al ncleo, activacin de la va de las MAPK e incremento en la secrecin de IL-8(42). De modo similar, los fibroblastos

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TABLA II. Expresin de TLR en clulas no inmunes

Clula TLR

Miofibroblastos intestinales TLR1-9 Fibroblastos gingivales TLR2, TLR4 Adipocitos TLR2 Epitelio respiratorio TLR1-10 Epitelio Intestinal TLR 2, TLR3, TLR4 variable Osteoblastos TLR2, TLR4, TLR6 Osteoclastos TLR4 Astrocitos y oligodendrocitos TLR2, TLR3 Microglia de CVO y del parnquima TLR2, TLR4 Placenta TLR7

gingivales que son los principales constituyentes de la gingiva responden al estmulo de LPS de bacterias patgenas de cavidad oral mediante la produccin de IL-1, IL-1, IL-6, IL-8, TNF- y expresin de CD14, TLR2 y TLR4(43). Adipocitos: Los pre-adipocitos y adipocitos pueden jugar un papel importante en la regulacin de la inmunidad innata y la adaptativa. Los adipocitos murinos 3T3-L1 expresan TLR4 constitutivamente y cuando se estimulan con LPS incrementan la expresin de TLR2, TNF-, IL-6 y de leptina. Respecto a la leptina, es importante la observacin de que esta molcula puede ser un vnculo entre el sistema inmune y la regulacin del balance energtico en estados de peligro; en efecto la leptina incrementa la fagocitosis y la secrecin de citocinas pro-inflamatorias pero disminuye el apetito; observacin que podra asociarse con la anorexia caracterstica de los estados infecciosos(44). Epitelio: Los mecanismos de defensa de las superficies epiteliales son muy importantes por varias razones: (i) Todas las infecciones invasivas se inician al atravesar la barrera epitelial (ii) Muchas superficies corporales estn densamente colonizadas por una microflora normal de modo que la diferenciacin entre microorganismos comensales y patgenos supone un problema para el epitelio. (iii) La gran mayora de retos microbianos del hospedero son rupturas menores de las superficies epiteliales por lesiones traumticas y sin embargo, los microorganismos son rpidamente atacados por los mecanismos de defensa local sin activacin de respuesta sistmica. Para poder responder ante el reto de la flora comensal y la patgena, el epitelio requiere receptores como los TLR. Sin embargo, es importante tener en cuenta que un lugar anatmico como el tracto respiratorio inferior mantiene estriles sus superficies epiteliales de modo que la presencia de PAMP es indicativa de infeccin y por tanto debe activar los mecanismos de defensa para eliminarla y mantener la funcin del rgano. Por el contrario la mayora de superficies corporales tales como piel, tracto respiratorio

superior y tracto gastrointestinal estn permanentemente colonizadas por una variedad de microbios. Aunque algunas bacterias comensales no producen seales estimuladoras, otras s lo hacen y en ese caso es necesario que las clulas epiteliales sean refractarias a los PAMP que sean capaces de diferenciar los microbios comensales de los patgenos mediante mecanismos aun desconocidos. Actualmente no es claro el mecanismo que regula la tolerancia del epitelio a la flora normal y que permite la respuesta a los patgenos invasores. Sin embargo, con base en algunos estudios se propone que la tolerancia puede deberse a la expresin compartimentalizada de los TLR en el epitelio, a una baja expresin de TLR y de coreceptores como MD2, a la expresin de molculas inhibidoras como la forma truncada de MyD88 a la activacin de la cinasa inhibidora IRAK-M. Por otro lado, en el caso de una infeccin, las citocinas pro-inflamatorias regularan positivamente la expresin de los TLR y sus coreceptores en el epitelio para que pueda responder adecuadamente. A pesar de su importancia en los epitelios, solo existen unos pocos trabajos sobre la expresin y funcin de los TLR en este tipo de tejido y los datos son diversos debido en parte a los diferentes sistemas experimentales empleados, al origen, dosis y tiempo de incubacin con los PAMP. El mRNA de varios TLR se ha detectado en diferentes epitelios; sin embargo es importante tener en cuenta que la presencia del transcrito no indica necesariamente la expresin de la protena. El TLR4 ha sido el receptor mas analizado ya que se ha detectado en varias lneas celulares derivadas de epitelio de piel, crnea, gingiva, tracto respiratorio, estmago, intestino, tbulos renales, vejiga, cervix y ovario (45). A continuacin se describen algunos de los hallazgos en epitelio respiratorio e intestinal. Epitelio respiratorio: El epitelio del tracto respiratorio es el primer punto de contacto para las sustancias inhaladas tales como los contaminantes ambientales, el humo de cigarrillo, los aeroalergenos y los microorganismos. El epitelio respiratorio no es solamente una barrera pasiva sino que adems contribuye activamente al sistema inmune innato. La respuesta inmune en el epitelio respiratorio es muy importante en una variedad de enfermedades humanas; los defectos en el sistema de defensa pueden producir colonizacin microbiana y posterior infeccin del parnquima pulmonar o desencadenar procesos inflamatorios crnicos que son la base fisiopatolgica de enfermedades como el asma. El epitelio respiratorio detecta la presencia de microorganismos mediante PRR como TLR y lectina unidora de manosa (MBL) y responde mediante la liberacin de pptidos antimicrobianos hacia el lumen de la vas areas y de quimiocinas y citocinas hacia la submucosa iniciando

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as una reaccin inflamatoria. Esta respuesta inflamatoria incluye el reclutamiento de fagocitos que sirven para remover microorganismos y de CD y linfocitos que pueden ayudar a montar una respuesta inmune adaptativa(46). La expresin del mRNA de todos los TLR (TLR1-TLR10) se ha detectado tanto en clulas de epitelio respiratorio normal como en la lnea celular BEAS-2B mediante RT-PCR y PCR en tiempo real(47). En cuanto a compartimentalizacin, se ha observado que TLR2 se expresa especficamente en la porcin apical de las clulas junto con el ganglisido asialoGM1, lo cual permite que despus de la estimulacin, las molculas se agreguen en microdominios lipdicos de la membrana celular (raft) para desencadenar seales que son capaces de iniciar la defensa del hospedero en las vas areas(48). Diferentes bacterias y PAMP se han utilizado para estimular clulas del epitelio respiratorio. La bacteria Haemophilus influenza y la lipoprotena de su membrana, P6 son reconocidas por TLR2, lo cual desencadena la traslocacin de NF-B, la activacin de las MAPK y el incremento en la produccin de IL-8, IL-1 y TNF-(49). El LPS y el LTA tambin inducen traslocacin de NF-B va TLR4 y TLR2 respectivamente e inducen no slo la sntesis de citocinas pro-inflamatorias sino tambin de -defensinas que reclutan CD(50). Respuestas similares son desencadenadas por el rinovirus, su dsRNA y el poli I:C que interactan con TLR3(51). El estmulo con PG, zymosan, dsRNA, LPS, flagelina y CpG de la lnea BEAS2B induce la expresin de IL-8, SAA, TLR3, MIP-3 y GMCSF, aunque el efecto es mayor con dsRNA. La induccin de las citocinas MIP-3 y GM-CSF es crtica porque facilita la migracin de las CD inmaduras y su posterior maduracin(47). Epitelio intestinal: De modo similar al epitelio respiratorio, el epitelio intestinal no es una simple barrera fsica sino que contribuye activamente en la respuesta inmune; sin embargo a diferencia del epitelio respiratorio inferior que es estril, el epitelio intestinal est expuesto al mayor reservorio de microorganismos del cuerpo humano. Existen relativamente pocas bacterias en los dos primeros tercios del intestino delgado, pero la densidad se incrementa a 108 bacterias/ml en el leon y a 1011-1012 organismos/g en el colon; adems muchos compuestos microbianos llegan a la mucosa intestinal por la ingestin de alimento contaminado. Ante este reto microbiano, las clulas del epitelio intestinal deben tener mecanismos de tolerancia y a la vez conservar latente la capacidad de respuesta al reto por patgenos. El reconocimiento de las bacterias comensales y de los patgenos en el epitelio intestinal tambin involucra la participacin de los TLR. El TLR3 y el TLR4 se han detectado en lneas celulares derivadas de epitelio intestinal humano como CaCO2, T84 y HT29; sin embargo cuando se estimulan con LPS no responden, al parecer por la ausencia de CD14.

Cuando se adiciona suero como fuente de LBP y de CD14, la respuesta es variable; en el caso de CaCO2 se observa activacin de NF-B y de las cinasas MAPK, p38 y JNK aunque la magnitud de la respuesta de MAPK p42/p44 es menor a la observada con PMA. Esto sugiere que las clulas de este epitelio pueden estar parcialmente desensibilizadas o ser tolerantes al LPS para limitar la activacin de las clulas inmunes adyacentes ante la exposicin constante de LPS en la superficie apical del epitelio(52). En otro trabajo se detect expresin muy baja de TLR4, y ausencia de MD2 as como falta de respuesta a LPS evaluada mediante traslocacin de NF-B y produccin de IL-8 en las lneas utilizadas(53); de acuerdo con esto, se postul que la falta de respuesta de las clulas intestinales a LPS se deba a la ausencia de MD-2. Posteriormente se observ que las citocinas IFN- e IFN- incrementan la expresin de TLR4 y de MD-2 respectivamente, lo cual sugiere que aunque la expresin de los TLR puede ser baja en estado basal y en presencia de LPS, ante un estmulo inflamatorio o infeccioso que genere respuestas adaptativas Th1, su nivel y el de otros co-receptores puede incrementarse para poder responder adecuadamente. De acuerdo con esta hiptesis, el epitelio intestinal que es tolerante a los comensales, puede integrarse a la respuesta inflamatoria slo tardamente cuando el sistema inmune adaptativo requiere su ayuda para eliminar a los patgenos(54). Otro mecanismo potencial para establecer tolerancia a la flora comensal en el intestino, es la ubicacin de los TLR en las clulas epiteliales. Aunque los TLR se han detectado en la superficie apical y basolateral, en un estudio reciente en ratones se demostr su expresin preferencial en las criptas primarias que contienen clulas de Paneth productoras de pptidos antimicrobianos. Estos pptidos antimicrobianos pueden proteger el sitio de la invasin por microorganismos comensales y adems pueden unirse al LPS e inhibir su actividad pro-estimuladora. Sin embargo, en el curso de una infeccin por patgenos entricos invasivos con destruccin tisular subsecuente se facilita la aproximacin entre TLR4 y LPS de modo que se podra estimular la respuesta del hospedero(55). Adems, la compartimentalizacin de los TLR en el epitelio gastrointestinal tambin se presenta a nivel celular; por ejemplo, se ha observado que TLR4 se concentra en el aparato de Golgi y que el TLR5 se ubica preferencialmente en la cara basolateral de la clula(56); esta ubicacin puede ser otra estrategia para ocultar los TLR a la flora comensal y evitar la activacin de la respuesta inflamatoria. La importancia de la regulacin de TLR4 en el epitelio intestinal se hace evidente en condiciones como la enfermedad inflamatoria del intestino en la que se observa inflamacin crnica en ausencia de patgenos acompaada de una elevada expresin de TLR4(45).

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Tejido seo: La formacin y destruccin de hueso es un proceso dinmico a cargo de macrfagos, osteoblastos (clulas del estroma de la mdula sea), osteoclastos (clulas derivadas de monocitos) y citocinas. Entre estas se encuentran el factor estimulante de macrfagos (M-CSF) secretado por los osteoblastos y el ligando del receptor activador de NF-B (RANKL) que se expresa en los osteoblastos como una citocina asociada a la membrana celular. Los precursores de osteoclastos expresan el receptor de RANKL (RANK) que les permite interactuar con el RANKL de los osteoblastos y mediante interacciones clula-clula se diferencian en osteoclastos en presencia de M-CSF; adicionalmente, la interaccin RANK del osteoclasto maduro con el RANKL del osteoblasto genera seales de supervivencia de los osteoclastos y aumenta su capacidad de resorcin sea(57, 58). Se ha observado que LPS es un potente estimulante de la resorcin sea durante las enfermedades inflamatorias(59) aunque el mecanismo responsable hasta ahora empieza a conocerse y parece implicar una relacin compleja entre osteoblasto y osteoclasto. Se sabe por ejemplo que los osteoblastos expresan TLR4, MD-2, CD14 y MyD88 y que cuando se estimulan con LPS producen IL-1, IL-6 y TNF en una va dependiente de las MAPK p38 y ERK. Adems de las citocinas pro-inflamatorias, la estimulacin de los osteoblastos con LPS induce un incremento en la expresin de CXCL10, ligando de CXCR3 que se encuentra presente en la membrana de LT; es decir que ante un reto infeccioso por Gram negativos, los osteoblastos pueden reclutar LT al sitio de la infeccin(60-63). Estudios posteriores han mostrado que las vas de sealizacin de los TLR en las clulas que participan en la formacin y resorcin sea son mucho ms complejas y estn reguladas en parte por la expresin diferencial de TLR y de molculas adaptadoras. Por ejemplo, utilizando ratones MyD88/ y TRIF/, se observ que el LPS y el diacil-lipopptido activan al osteoblasto en una va dependiente de MyD88 que estimula la expresin del RANKL; adems, slo el LPS promovi la secrecin de IL-6. Por su parte, los osteoclastos no fueron susceptibles de activacin por diacil-lipopptido debido a la ausencia de TLR6 y la activacin con LPS indujo seales de sobreviva mediante una va dependiente de MyD88. Estas observaciones de la regulacin sea mediadas por PAMP ponen en evidencia la existencia de vas normales en la regulacin de este proceso por ligandos fisiolgicos an desconocidos cuya importancia es obvia ante la evidencia de osteopenia en ratones deficientes en MyD88(64). Sistema Nervioso Central (SNC): El SNC, que por mucho tiempo se consider un sitio inmunolgicamente privilegiado, es capaz de generar una respuesta innata en parte gracias a la expresin de algunos TLR. Se ha observado expresin

de TLR en clulas del SNC como clulas de microglia, astrocitos y oligodendrocitos. En ratones, los receptores TLR4 y CD14 se expresan constitutivamente en macrfagos y clulas de microglia de los rganos circunventriculares del cerebro (organum vasculosum de la lamina terminalis, el rgano subfornical, la eminencia media, el rea postrerna), los plejos coroideos y las leptomeninges y en otras estructuras que carecen de barrera hematoenceflica(65, 66). Adems, en respuesta a una dosis nica de LPS, estas regiones muestran expresin inducible de TLR2 que se inicia en estas zonas y que al cabo de unas horas se extiende a zonas mas profundas del cerebro(67). Las clulas de microglia humanas expresan mRNA de TLR1-9 en tanto que los astrocitos y oligodendrocitos expresan primariamente TLR2 y TLR3. La expresin de las protenas en clulas de microglia cultivadas est restringida a vesculas intracelulares en tanto que en astrocitos estn localizadas en la superficie celular(68). Tambin, se ha observado que los TLR expresados en clulas del parnquima cerebral pueden interactuar directamente con ligandos que acceden al SNC en sitios que carecen de barrera hematoenceflica; se postula por ejemplo que el LPS puede inducir localmente la sntesis de prostaglandinas inductoras de fiebre, de citocinas y neurotrasmisores asociados con el comportamiento propio de la enfermedad(69). Por otro lado, las citocinas secretadas por clulas de microglia activadas va TLR pueden desencadenar indirectamente muchas respuestas cerebrales. El LPS circulante puede unirse a sus receptores sobre macrfagos y clulas de microglia estimulando la sealizacin de NF-B y activando la transcripcin de TNF-; esta citocina a su vez activara la sealizacin de NF-B y la transcripcin de genes que codifican citocinas y quimiocinas primero en la misma clula de microglia y ms tarde en otras adyacentes(70). Se desconoce el papel de CD14, TLR2 y TLR4 en el cerebro. Se ha postulado que la estimulacin directa tenga funcin protectora aunque paradjicamente tambin podran participar en la produccin de daos degenerativos. La evidencia experimental y clnica en pacientes con enfermedades neurodegenerativas seala que es poco probable que la respuesta innata que se presenta en el cerebro en respuesta a infecciones sistmicas o daos cerebrales sea deletrea para el SNC porque ocurre rpidamente e induce la liberacin de factores neurotrficos y otras molculas importantes en la homoeostasia cerebral, la neuroproteccin y la reparacin tisular. Por ejemplo, el TNF- induce la proliferacin de oligodendrocitos y estimula el proceso de remielinizacin y la IL-1 acta sobre los astrocitos induciendo la sntesis del factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrfico ciliar (CNTF) y el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1) que promueven la reparacin del tejido nervioso; sin embargo, si esta respuesta es elevada o sostenida y se acompaa de

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TABLA III. Ligandos endgenos de TLR

Estmulo endgeno HSP Hialuronano Protena surfactante A Clulas necrticas HMGB1 Complejos de cromatina-IgG Fibronectina, fibringeno, heparan TLR involucrado TLR4 (HSP60) TLR2/4 (HSP70, GP96) TLR4 TLR4 TLR2 ? TLR9 TLR4 Respuesta celular activada Activacin de NF-B, maduracin de CD, sntesis de citoquinas Activacin de NF-B, maduracin de CD, sntesis de citoquinas Activacin de NF-B, sntesis de citoquinas Activacin de NF-B, maduracin de CD, induccin de genes de reparacin tisular Inflamacin Activacin del LB Induccin de genes inflamatorios, maduracin de CD

Revisado por Beg,AA.. Endogenous ligands of Toll-like receptors: implications for regulating inflammatory and immune responses. Trends Immunol 2002;23:509-512.

una respuesta adaptativa especialmente mediada por LTh1 puede ser nociva(71). Por otro lado, se postula que la respuesta inmune innata que se desarrolla en el cerebro es un espejo de la respuesta que ocurre en periferia y que es indispensable para organizar los componentes centrales de respuesta del hospedero a la infeccin que comprende desde la fiebre y la activacin neuroendocrina hasta el comportamiento asociado con enfermedad(72).

TLR Y SEALES DE PELIGRO ENDGENAS: LO PROPIO ALTERADO Cuando se presenta un dao tisular, las clulas del organismo deben reconocer rpidamente la injuria para poder activar la inmunidad innata, reclutar clulas inflamatorias e iniciar el proceso de reparacin. En el caso de las infecciones, las seales de alerta son aportadas en gran parte por los mismos microorganismos mediante los PAMP que son reconocidos por los TLR. En el caso de dao tisular en ambientes estriles, las seales provienen de componentes intracelulares de las clulas necrticas, de la matriz extracelular (ECM) y seales de estrs tales como las protenas de choque trmico (HSP). En los ltimos aos se ha observado que algunas de estas molculas endgenas que actan como seales de peligro son reconocidas por los TLR. En el 2000, se public el primer artculo sobre una seal endgena de peligro que induca una respuesta pro-inflamatoria mediada por un TLR; la seal de peligro era la HSP60 y el receptor implicado, el TLR4. Las HSP son protenas evolutivamente conservadas presentes en todos los organismos procariticos y eucariticos, cuya expresin aumenta en

respuesta a diferentes formas de estrs. En dicho trabajo se observ que los macrfagos de ratones C3H/HeN pero no los de ratones C3H/HeJ (que presentan una mutacin en TLR4) estimulados con HSP60 producan TNF- y NO y por tanto se concluy que su actividad estaba mediada por TLR473. Aunque ms adelante se encontr que la respuesta tambin dependa de TLR2 y que se acompaaba de activacin de p38, JNK1/2 y ERK1/2 y NF-B(74), estudios posteriores identificaron un receptor especfico de HSP60 que interactuaba con TLR2 y TLR4 para transmitir seales(75). Ms adelante se observ que otra HSP, la HSP70 tambin induca en macrfagos la secrecin de IL-12 y de la molcula de adhesin del leucocito al endotelio (ELAM-1) mediante una va dependiente de TLR2, TLR4, MyD88 y TRAF6(76). Desde entonces se han descrito otras molculas endgenas que interactan directa o indirectamente con los TLR para transmitir seales de alerta al organismo (Tabla III). El hialuronano: (HA) es un componente estructural importante de la ECM que tambin hace parte de la superficie bacteriana. El HA se sintetiza en la superficie celular y es un polmero de alto peso molecular (mayor de 1x106 Da) compuesto de unidades repetidas de N-acetilglucosamina y cido glucurnico. Cuando se producen lesiones tisulares, el HA se degrada a componentes de bajo peso molecular (sHA) que estn involucrados en procesos de angiognesis, proliferacin celular, maduracin, migracin, activacin de cascadas de sealizacin y expresin de genes inflamatorios. En un trabajo reciente se observ que las clulas endoteliales humanas aisladas de dermis de neonatos en cultivo reconocen estos sHA mediante TLR4 y activan la secrecin de IL-8; adems en ratones Balb/c inyectados intraperitonealmente

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con sHA, los niveles sricos de los homlogos de IL-8 humana, MIP-2 y KC aumentaron significativamente; por el contrario, este efecto no se observ en los ratones C3H/HeJ(77). Es importante recordar que aunque IL-8 es una citocina clave en el proceso de dao tisular porque recluta neutrfilos al sitio de la lesin, tambin induce la proliferacin y migracin de queratinocitos, incrementa la adherencia de monocitos y la quimiotaxis de linfocitos, eventos importantes en todas las fases de reparacin tisular. Teniendo en cuenta que el HA tambin se encuentra en la superficie de bacterias como Streptococcus del grupo A, que es degradado por hialuronidasas de la bacteria y que los sHA bacterianos son igualmente reconocidos por TLR4, se puede considerar que HA no es una molcula que discrimina lo propio de lo no propio sino que es simplemente una seal de peligro. Por lo tanto, la habilidad de algunas bacterias para degradar el HA en componentes inactivos no reconocidos por los TLR puede ser un mecanismo de evasin de los sistemas de reconocimiento. Por otro lado, el organismo controla la activacin del sistema innato por niveles elevados de sHA aclarando rpidamente el exceso producido diariamente; en efecto, aunque cerca del 50% del HA se recambia diariamente y aunque alrededor de 10-100 mg de HA entran a la sangre cada 24 horas, el nivel srico slo alcanza el 0,1% de esta cantidad y esta pequea cantidad no activa la respuesta inmune(77). La protena surfactante A (SP-A): Es una colectina involucrada en la defensa innata del hospedero y en la regulacin del proceso inflamatorio en el pulmn. Puede transmitir seales va TLR4 a los macrfagos que a su vez activan NF-kB y de esta manera induce la secrecin de citocinas como TNF- e IL-10(78). Las clulas necrticas: A diferencia de las clulas apoptticas, las clulas que sufren necrosis liberan su contenido intracelular, lo cual contribuye a la inflamacin secundaria al dao tisular. Las clulas necrticas son reconocidas va TLR2 y activan la traslocacin nuclear de NF-B en fibroblastos viables, macrfagos y CD. Esta activacin induce la transcripcin de genes inflamatorios y de reparacin tisular incluyendo quimiocinas especficas para los neutrfilos, la metaloproteinasa 3 y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)(79). Adicionalmente, las clulas necrticas pero no las apoptticas pueden inducir maduracin de las CD, colaborando as indirectamente en la activacin del LT(80). La protena de alta movilidad del grupo 1 (HMGP1): Este ligando potencial de los TLR, es una protena clave en la arquitectura del ncleo que se libera pasivamente de clulas necrticas y que acta como una citocina al ser reconocida por receptores especficos de productos terminales glicosilados. La respuesta inflamatoria mediada por HMGP1 incluye la produccin de mltiples citocinas, la quimioatraccin

de algunas clulas pluripotenciales, la induccin de molculas de adhesin vascular y la funcin alterada de clulas intestinales; su importancia es evidente cuando se observa que los antagonistas de HMGP pueden rescatar a los ratones de la sepsis letal(81). Acidos nucleicos: Teniendo en cuenta que el DNA y el RNA de los patgenos son reconocidos por TLR9, TLR3, TLR7 y TLR8, se supone que los productos derivados de los cidos nucleicos del hospedero podran tambin ser reconocidos por los TLR presentes en CD y macrfagos que participan como clulas removedoras de detritus celulares en los lugares de lesin tisular. Se ha observado por ejemplo, que TLR9 se une al DNA del hospedero ligado a histonas o a autoanticuerpos anti-histona(82) y que el RNA heterlogo liberado de asociado con clulas necrticas y el RNA generado por transcripcin in vitro inducen la secrecin de IL-8 en clulas embrionarias de rin 293 transfectadas con TLR3(83). Estas observaciones tienen importantes implicaciones fisiolgicas por su potencial de inducir respuestas autoinmunes(84). Finalmente, es importante sealar que no es claro si los ligandos endgenos de los TLR adems de inducir inflamacin y reparacin tisular pueden activar una respuesta adaptativa aunque la evidencia sugiere que es mas probable que se induzcan fenmenos de tolerancia(85, 86).

TLR Y RECONOCIMIENTO DE XENOANTGENOS? Existen algunas evidencias incipientes que sugieren que el sistema inmune innato reconoce antgenos de los tejidos de mamferos y que promueve el rechazo de tejidos transplantados particularmente cuando provienen de otras especies. En uno de estos trabajos se utilizaron micromatrices para comparar la expresin de PRR en pncreas fetal fresco de cerdo con pncreas fetal recuperado dos das despus de trasplante en ratones y se encontraron varios mRNA relevantes incluyendo los de algunos TLR, la protena unidora de lpido A, el CD14, las galectinas, KIR, receptores scavenger de macrfagos y lectinas tipo C de macrfagos. Teniendo en cuenta que las clulas xenognicas de los mamferos no encajan dentro de lo no propio infeccioso ni en lo propio alterado, se podra pensar que los PRR reconocen algunos xenoantgenos porque existe cierto grado de sobrelapamiento entre ellos y los PAMP o porque existe reactividad cruzada para clulas xenognicas de mamferos, particularmente aquellas de especies filogenticamente distantes(87).

CONCLUSIONES Las evidencias presentadas sobre la amplia distribucin tisular de los TLR as como el hecho de que reconocen y

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trasmiten seales en respuesta a ligandos endgenos permiten considerar estas molculas como receptores de reconocimiento de seales de peligro sin importar cual sea su origen; pero adems, pone de manifiesto el hecho de que la maquinaria de molculas adaptadoras y de las vas de sealizacin de los TLR est exquisitamente diseada para responder ante esas seales de peligro de acuerdo con el patgeno o el ligando endgeno reconocido. Por esta razn los TLR y probablemente otros PRR se comporten como un puente que reconcilia las teoras de reconocimiento de lo propio no infeccioso y el modelo del peligro. Por otro lado, las observaciones an incipientes sobre las respuestas generadas mediante los TLR en clulas diferentes a las del sistema inmune, plantea la posibilidad de empezar a considerar que cada una de las clulas del hospedero hace parte de ese sistema inmune innato que aunque est en reposo en condiciones normales, mantiene una capacidad de respuesta inmediata para defenderse de las agresiones no solo del medio externo, sino tambin del interno. Incluso, se ha propuesto que tal vez los PRR no evolucionaron para unirse a patgenos, sino que por el contrario los patgenos evolucionaron para unirse a ellos. Segn este planteamiento, es posible que los TLR se hayan generado como receptores de seales de tejidos lesionados y que a travs de la evolucin los microorganismos hayan desarrollado mecanismos para utilizarlos como vehculos de invasin para aumentar su propia sobreviva.

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CORRESPONDENCE TO: Martha Mesa-Villanueva, MSc, Departamento de Microbiologa, Universidad Javeriana. Carrera 7 No. 43-82. Bogot, Colombia. Phone: 57 1 3208320, Ext 4153. Fax: 57 1 3208320, Ext 4022. email: mmesa@javeriana.edu.co

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