cido p-nitrobenzico para identificao do M.

tuberculosis

Artigo Original

Avaliao do cido p-nitrobenzico para identificao do complexo Mycobacterium tuberculosis no sistema MB/BacT
Angela Maria Werneck Barreto,1 Paulo Cesar Souza Caldas,1 Leda Maria dos Santos,1 Fatima Moreira Martins,1 Reginalda Ferreira de Melo Medeiros1

Resumo A fim de avaliar o uso do cido p-nitrobenzico (500 g/ml) como agente inibidor do crescimento de micobactrias no pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (MNT) foram testados 78 escarros negativos baciloscopia, artificialmente inoculados com 0,1ml de uma suspenso de MNT (24 amostras de M.kansasii, 25 de M. avium-intracellulare, 25 de M. fortuitum e 4 de M. scrofulaceum) e 85 escarros positivos baciloscopia. Todas as culturas positivas de M. tuberculosis foram sensveis ao PNB, diferindo do material inoculado com MNT, no qual foram resistentes. Este teste apresentou excelente desempenho com 100% de sensibilidade e de especificidade. Com base nesses resultados, recomendamos o uso de PNB como agente inibidor para identificao preliminar de M. tuberculosis no sistema MB/BacT. Palavras-chave: Mycobacterium infections, atypical, Mycobacterium tuberculosis

Summary In order to evaluate the use of PNB (p-nitrobenzoic acid) (500 g/ml) as a growth inhibitor agent of mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis complex in the MB/BacT system, we have tested 78 negative sputum samples obtained in our reference laboratory. These were innoculated artificially , with 0.1 ml of a suspension of nontuberculous mycobacteria (NTM) - (24 samples of M.kansasii, 25 of M. aviumintracellulare, 25 of M. fortuitum, and 4 of M. scrofulaceum) and 85 microscopy positive sputa. All the M. tuberculosis cultures showed sensitivity to PNB, differing from the material inoculated with NTM that were resistant. This test performed well, with 100% sensitivity and specificity. Based on these results, we recommend the use of PNB as an inhibitory agent in the MB/BacT system for preliminary identification of M. tuberculosis. Key-words: Mycobacterium infections, atypical, Mycobacterium tuberculosis

Artigo recebido em 03/04/2006. Aceito em 06/04/2006. 1. Centro de Referncia Prof. Hlio Fraga/SVS/MS

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Barreto AMW et al

INTRODUO
O ensaio de sonda gentica AccuProbe (AccuProbe Gen-Probe, Inc., San Diego, CA), tem sido a principal ferramenta para identificao rpida de micobactrias isoladas no sistema de MB/BacT (BioMrieux).1-5 Este mtodo caro para uso na rotina de laboratrios de sade pblica. O meio de cultura contendo agentes inibidores para a identificao presuntiva de micobactrias tem sido investigado por diversos pesquisadores. Tsukamura, em 1964,6 estudou o cido pnitrobenzico (PNB) na concentrao de 500 g/ml em meio de cultura a base de ovo, como agente inibidor do crescimento de amostras pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis. Rastogi, Goh & David, 1989, 7 compararam a atividade inibitria do PNB com p-nitro--acetilamine-- hidroxipropiofenona (NAP) em meio Middlebrook 7H11. O NAP foi tambm a alternativa oferecida pelos fabricantes do primeiro sistema semi-automatizado BACTEC 460 TB como agente inibidor para identificao do complexo Mycobacterium tuberculosis,8 assim como outros que surgiram desta linha como o MGIT 960, tambm da Becton Dickinson. O objetivo deste estudo foi avaliar o uso do PNB como um inibidor de crescimento de micobactrias no pertencentes ao complexo M. tuberculosis utilizando o sistema MB/BacT.

nossa coleo de culturas, para confirmar a negatividade da amostra de escarro. Todos os frascos foram monitorados a cada 10 minutos para verificar a presena do crescimento, e o resultado final foi avaliado aps 6 semanas de incubao. As espcies foram identificadas por meio de testes bioqumicos usuais: Mycobacterium tuberculosis pelos testes de niacina, nitrato, e catalase a 68 C, e as espcies restantes pelos mesmos testes, como tambm Tween 80, telurito de potssio, -glicosidase, urease, arilsulfatase, citrato frrico amoniacal, agar McConkey, crescimento em acares (frutose, manitol, citrato de sdio, inositol), em cloreto de sdio a 5%, em gel nutriente, como recomendado pelo Manual de Bacteriologia da Tuberculose.9

RESULTADOS
Todas as culturas de M. tuberculosis mostraram sensibilidade ao PNB, diferindo do material inoculado com as demais micobactrias que foram resistentes ao PNB (Tabela 1). As espcies de micobactrias testadas aqui so as mais prevalentes mundialmente. O teste mostrou boa performance, com 100% de sensibilidade, com intervalo de confiana de 95% entre 94.6-100, e 98.7% de especificidade, com intervalo de de 95% entre 92.2-99.9.
Tabela 1. Resultados obtidos nas amostras de escarro inoculadas com suspenso de micobactrias

MATERIAIS E MTODOS
Foram testadas 85 amostras de escarro positivas baciloscopia, isoladas de pacientes com tuberculose pulmonar e 78 negativas, obtidas em nosso laboratrio de referncia entre 1999-2000. Os materiais foram tratados, volume a volume, com soluo de fosfato trissdico a 23% e incubados a 36 1C durante 24 horas. Aps a neutralizao, volume a volume, com soluo de fosfato monobsico a 20%, os tubos foram centrifugados a 3000 g durante 20 minutos, e o sedimento foi semeado em dois frascos de MB/BacT contendo PNB na concentrao de 500 g/ml. Antes da semeadura, as amostras de escarro negativas baciloscopia foram divididas em duas alquotas. Uma alquota foi artificialmente inoculada com 0,1 ml de suspenso de micobactrias no pertencentes ao complexo M. tuberculosis, com turvao comparada ao tubo n 1 da escala de McFarland (24 amostras de Mycobacterium kansasii, 25 de Mycobacterium avium-intracellulare, 25 de Mycobacterium fortuitum e 4 de Mycobacterium scrofulaceum) de origem humana, selecionadas ao acaso, de
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Culturas

MB/Bact + PNB 500 ug/ml

Sensvel M. M. M. M. M. tuberculosis avium-intracellulare fortuitum kansasii scofulaceum 85 -

Resistente 25 25 24 4

CONCLUSO
Baseados nos resultados dos testes, recomendamos o uso do PNB como um agente inibitrio no sistema de MB/BacT para identificao preliminar de Mycobacterium tuberculosis, por se tratar de uma opo acurada, simples e de baixo custo, pois os resultados so obtidos no mesmo momento do crescimento e uma determinao por meio de sonda gentica , pelo menos, duas vezes mais cara que um frasco de meio de cultura do MB/BacT.

cido p-nitrobenzico para identificao do M.tuberculosis

REFERNCIAS
1. Rohner P, Ninet B, Metral C, Emler S, Auckenthaler R: Evaluation of the MB/BacT system in comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology (1997) 35: 31273131. 2. Manterolla JM, Gamboa F, Padilla E, Lonca J, Matas L, Hernndez A, Gimenez M, Cardona PJ, Viado B, Ausina V: Comparison of a nonradiometric system with Bactec 12B and culture on eggbased media recovery of mycobacteria from clinical specimens. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (1998) 17: 773 -777. 3. Roggenkamp A, Hornef MW, Masch A, Aigner B, Autenrieth IB, Heesemann J: Comparison of MB/BacT and the BACTEC 460 TB systems for recovery of mycobacteria in a routine diagnostic laboratory. Journal of Clinical Microbiology (1999) 37: 3711-3712. 4. Badak FZ, Goksel S, Sertoz R, Nafile B, Ermertcan S, Cavusoglu C, Bilgic A: Use of nucleic acid probes for identification of Mycobacterium tuberculosis directly from MB/BacT bottles. Journal of Clinical Microbiology (1999) 37: 1602-1605.

5. Palacios JJ, Ferro J, Ruiz Palma N, Garcia JM, Villar H, Rodriguez J, Macas MD, Prendes P: Fully automated liquid culture system compared with Lwenstein-Jensen solid medium for rapid recovery of mycobacteria from clinical specimens. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (1999) 18: 265 273. 6. Tsukamura M & Tsukamura S: Differentiation of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by p-nitrobenzoic acid susceptibility. Tubercle (1964) 45: 64-65. 7. Rastogi N, Goh KS, David HL: Selective inhibition of the Mycobacterium tuberculosis complex by p-nitro--acetylamine - -hydroxypropiophenone and p-nitrobenzoic acid (PNB) used in 7H11 agar medium. Research in Microbiology (1989) 140: 419-423. 8. Siddiqui S: BACTEC TB System. Product and Procedure Manual. Becton Dickinson and Company. Sparks, Maryland, USA (1996). 9. Brasil/MS/FUNASA/CRPHF - Manual de Bacteriologia da Tuberculose, 2nd ed., Rio de Janeiro (1994) p 115.

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