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HPLC (Highperformance Liquid Chromatography) Antecedentes Anteriormente a los aos 70, pocos mtodos cromatogrficos confiables estaban disponibles

comercialmente para el cientfico del laboratorio. Durante los aos 70, la mayora de las separaciones qumicas eran realizadas usando una variedad de tcnicas incluyendo la cromatografa de columna abierta, la cromatografa de papel, y la cromatografa de capa delgada. Sin embargo, estas tcnicas cromatogrficas eran inadecuadas para la cuantificacin de compuestos y de la resolucin entre compuestos similares. Durante este tiempo, la cromatografa de presin lquida comenz a ser utilizada para disminuir el tiempo del flujo, reduciendo as tiempo en la purificacin de los compuestos que son aislados por la columna cromatogrfica. Sin embargo, los rangos de los flujos eran inconsistentes, y la cuestin de que si era mejor tener un flujo constante o presin constante fue discutida. La cromatografa lquida de alta presin fue desarrollada a mediados de los aos setenta y mejorada rpidamente con el desarrollo de los materiales de embalaje de columna y de la conveniencia adicional de usar detectores en lnea. A fines de los 70's, los nuevos mtodos incluyendo la cromatografa lquida de la fase reversa permitieron una mejor separacin entre los compuestos similares. La ltima dcada ha presenciado un gran desarrollo de las microcolumnas, y otras columnas especializadas. Las dimensiones de la columna tpica del HPLC son: 30 milmetros de longitud con un dimetro interno entre 35 milmetros. El dimetro generalmente de las microcolumnas, o las columnas capilares, se extiende a partir de 3 m a 200 m. El HPLC rpido, utiliza una columna que es ms corta que la columna tpica, con una longitud de cerca de 3 milmetros de largo, y estn apilados con partculas ms pequeas.

Descripcin del HPLC El HPLC preparatorio se refiere al proceso de aislamiento y purificacin de compuestos. Importante es el grado la pureza del soluto y el rendimiento de procesamiento, que es la cantidad de compuesto producida por unidad de tiempo. Este se diferencia del HPLC analtico, donde se enfoca a obtener informacin sobre el compuesto de la muestra. La informacin que puede ser obtenida incluye la identificacin, la cuantificacin, y la resolucin de un compuesto.

Las separaciones qumicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de que ciertos compuestos tienen diversos rangos de migracin dadas una columna determinada y una fase mvil. De esta manera, el cromatgrafo puede separar compuestos usando HPLC; el fragmento o el grado de la separacin es determinado sobre todo por la opcin de fase inmvil y fase mvil que tiene el aparato . La purificacin se refiere al proceso de separar o de extraer el compuesto buscado de otros compuestos o contaminantes. Cada compuesto debe tener un pico caracterstico bajo ciertas condiciones cromatogrficas. Dependiendo de qu necesita para ser separado y que tan cerca estn relacionados a las muestras, el cromatgrafo puede elegir las condiciones, tales como la fase mvil apropiada, permitiendo una separacin adecuada para recoger o para extraer el compuesto deseado mientras que se enjuaga a partir de la fase inmvil. La migracin los compuestos y los contaminantes a travs de la columna necesita ser bastante diferente para poder ser recogida o para poder extraer el compuesto deseado de manera pura sin incurrir en algn otro compuesto no deseado. La identificacin de compuestos de HPLC es la parte crucial de cualquier anlisis HPLC. Para identificar el compuesto de HPLC primero debe ser seleccionado un detector. Una vez que el detector se seleccione y se fije a las configuraciones ptimas de la deteccin, un anlisis de la separacin debe ser desarrollado. Los parmetros de este anlisis deben ser tales que un pico limpio de una muestra conocida sea observado en el cromatgrafo. El pico que se identifica debe tener un tiempo razonable de retencin y se debe separar bien de picos extraos en los niveles de la deteccin en los cuales el anlisis ser realizado. Para alterar el tiempo de retencin de un compuesto, varios parmetros pueden ser manipulados. El primero es la opcin de la columna, otra es la opcin de la fase mvil , y la ltima es la opcin del flujo. La identificacin de un compuesto de HPLC se logra investigando la literatura y por el ensayo y error. Una muestra de un compuesto conocido se debe utilizar para asegurar la identificacin del compuesto desconocido. La identificacin de compuestos puede ser ms segura combinando dos o ms mtodos de deteccin. La cuantificacin de compuestos de HPLC es el proceso para determinar una concentracin desconocida de un compuesto en una solucin conocida. Esto implica inyectar una serie de concentraciones conocidas de la solucin compuesta estndar sobre el HPLC para la deteccin. La cromatografa de estas concentraciones conocidas dar una serie de picos que se correlacionen con la concentracin del compuesto inyectado. Debido al alto grado de flexibilidad del HPLC no encontrado en otros sistemas cromatogrficos tiene la capacidad de separar fcilmente una variedad amplia de mezclas qumicas. Hay muchas maneras de clasificar la cromatografa de columna lquida. Si esta clasificacin se basa en la naturaleza de la fase inmvil y del proceso de la separacin, peden ser especificados tres modos: cromatografa de la adsorcin cromatografa de intercambio inico cromatografa de la exclusin de la talla Referente al primer tipo, dos modos se definen dependiendo de la polaridad relativa de las dos fases: cromatografa normal cromatografa inversa. El aparato para la instrumentacin del HPLC incluyen una bomba, un inyector, una columna, un detector y un registrador o un sistema de los datos, conectados segn lo mostrado en la figura de abajo. El corazn del sistema es la columna donde ocurre la separacin. Desde la fase inmvil que se compone de partculas porosas de la talla del micrmetro, se requiere una bomba de alta presin para mover la fase mvil a travs de la 2

columna. El proceso cromatogrfico comienza inyectando el soluto sobre la tapa de la columna. La separacin de componentes ocurre mientras que los analitos y la fase mvil se bombean a travs de la columna. Eventualmente, cada componente se enjuaga de la columna como una banda estrecha (o pico) en el registrador. La deteccin de los componentes del enjuague es importante, y ste puede ser selectivo o universal, dependiendo del detector usado. La respuesta del detector a cada componente se visualiza en una pantalla del registrador o del ordenador de carta y se conoce como cromatograma. Para recoger, para salvar y para analizar los datos cromatogrficos, los ordenadores, los integradores, y el otro equipo de proceso de datos se utilizan con frecuencia

Caso: La identificacin y la cuantificacin de 77 pesticidas en agua subterrnea usando fase slida junto con microextraccin lquidolquido y fase inversa de cromatografa lquida. Analytical Chemistry [H.W. Wilson Gs]; Jul 15, 2000; Vandecasteele, Karel; Gaus, Irina; Debreuck,William; Objetivo: Realizar la cualificacin y cuantificacin de los compuestos presentes en el agua subterrnea.. Este artculo describe un mtodo para la extraccin, separacin, identificacin, y la cuantificacin de 77 pesticidas (neutros, cidos, y bsicos) incluyendo algunos metaloides del sstriazina. El mtodo es apropiado para muestras orgnicas altamente concentradas del agua subterrnea. En el proceso de investigacin se realiza un estudio comparativo de una mezcla en fase slida de ph controlado con diversos solventes de desorcin (acetonitrilo o acetonitrileo y diclorometano/metanol), con la finalidad de conocer las concentraciones de los pesticidas. Los pesticidas en la muestra se separan usando RPHPLC y son detectados, e identificados por un diodo. Ejemplos adicionales donde se aplica el HPLC Tendencias Del Futuro El HPLC continuar siendo una de las tcnicas ms importantes de la separacin del laboratorio para los propsitos analticos y preparatorios. La biotecnologa y las ciencias de vida es donde el HPLC ser un procedimiento crucial. Las compaas biotecnolgicas continuarn utilizando el HPLC para probar al gobierno que sus productos son no txicos, puros, y activos.. Las tcnicas de la afinidad y de la inmunoafinidad sern utilizadas con ms frecuencia para la produccin de farmacuticos biotecnolgicos debido a la necesidad de ultrapurificacin que ayudar a quitar todo el material indeseado de las clulas husped. El HPLC continuar siendo la herramienta principal en la purificacin y la separacin de protenas, de pptidos, y de nucletidos. Columnas analticas ms pequeas sern necesarias en el anlisis del genoma humano. En cuanto a la ecologa el desarrollo del HPLC implicara vigilar los agentes de contaminacin ambiental detectando contaminantes metlicos en el agua, desarrollando separaciones rpidas para vigilar la fermentacin, y desarrollan mtodos rpidos en la identificacin de virus y bacterias. El HPLC solo o en conjunto con otros mtodos puede vigilar el uso indebido de drogas en los atletas. El uso de robots puede estar cerca; una funcin importante poda ser manejar y cargar muestras peligrosas tal como la del SIDA, muestras de viral/bacterial, radioistopos, o contaminantes ambientales.