Bioqumica de Macromolculas

Monografa: Protenas de membrana. Principios de su arquitectura

Profesor: Mario Ermcora Alumna: Alejandra Cecilia Schoijet Segundo Cuatrimestre 2001

Presencia de residuos de aminocidos cargados positivamente como determinantes importantes de la topologa de las protenas de membrana
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Las protenas de membrana no slo se deben localizar en el compartimento correcto sino que deben contener la informacin necesaria en su secuencia para determinar su topologa. Una serie de trabajos realizados sugieren que regiones cargadas positivamente que se encuentran flanqueando segmentos hidrofbicos son determinantes en la topologa de las protenas de membrana. En bacterias, las protenas integrales de membrana se pueden dividir en tres clases segn su orientacin: (2) (Fig. 1) protenas bitpicas, las cuales atraviesan una vez la membrana con su extremo Ct expuesto al citoplasma (tipo I) o al periplasma (tipo II). protenas oligotpicas, las cuales atraviesan dos veces la membrana con sus extremos Ct y Nt orientados hacia el mismo lado de la membrana. protenas politpicas, las cuales pueden atravesar la membrana alrededor de 12 veces y presentan estructuras ms complejas. Segmentos de integracin: Est ampliamente aceptado el concepto de que la informacin para la topologa de las protenas de membrana est localizada dentro de dominios hidrofbicos en la secuencia polipeptdica. Estos segmentos se pueden dividir en cuatro grupos: (Fig. 2) 1) pptidos leader amino terminales, los cuales son necesarios para la direccin e insercin de las protenas en la membrana. Estos inician la translocacin y luego son clivados por una peptidasa. 2) seales que no son clivadas, localizadas en el extremo Nt o en posiciones internas de la protena. 3) secuencias stop que finalizan la transolcacin de la cadena polipeptdica a travs de la membrana. 4) dominios de insercin, formados por dos regiones hidrofbicas separadas por una regin polar, los cuales se insertan espontneamente en la membrana sin la necesidad aparente de que otras protenas medien dicha insercin.

Fig. 1. Posibles orientaciones de las protenas

Fig. 2. Segmentos de integracin dentro de las protenas de membrana

Influencia de residuos cargados positivamente en la orientacin de las protenas de membrana: Existen fuertes evidencias que sugieren que las cargas positivas tienen un papel importante en la orientacin de las protenas de membrana. Estudios de comparacin de secuencias de varios segmentos de integracin constituyen la primer evidencia. (3) Los residuos bsicos estn localizados tpicamente en el extremo Nt de los pptidos leader y raramente se encuentran en el extremo Ct. Esta diferencia de carga en los

pptidos leader tambin se observa en las seales que no son clivadas, especialmente si estn localizadas en el extremo Nt de la protena. Diversos estudios demostraron que la introduccin de cargas positivas en el extremo Ct de los pptidos leader tiene efectos deletreos en la insercin de las protenas, lo cual sugiere que la orientacin de los dominios hidrofficos dentro de la membrana puede estar influenciada por los residuos bsicos flanqueantes. Las cargas positivas que preceden un segmento hidrofbico tienden a orientar dicho segmento con su extremo Ct expuesto hacia el periplasma. Protenas de membrana bitpicas: Muchas de estas protenas, como por ejemplo la protena de cubierta del fago M13, son sintetizadas con una secuencia leader que luego es clivada y se orientan en la membrana con su extremo Ct hacia el citoplasma y el Nt hacia el periplasma. Ciertos trabajos sobre dicha protena de M13 sugieren que las regiones Ct y Nt se unen electrostticamente a las cabezas de los lpidos en la membrana. Esta unin permite a la protena insertarse con su segmento hidrofbico en el interior de la misma. (4) Otras protenas de membrana bitpicas no tienen un pptido leader, por ejemplo la protena de cubierta de Pf3, la cual tambin presenta su extremo Ct hacia el citoplasma y el Nt hacia el periplasma. Al igual que la protena de cubierta de M13, la protena de Pf3 tambin requiere un gradiente electroqumico pero no el producto del gen sec para su insercin en la membrana. Ambas protenas, a pesar de que una tiene un pptido leader y la otra no, guardan similitudes estructurales: un corto extremo Nt cido extracitoplasmtico, un segmento no polar de aproximadamente 20 residuos y un extremo Ct terminal bsico hacia la regin citoplasmtica. Se ha postulado que los residuos cargados positivamente que siguen a al segmento apolar pueden ser los determinantes de su topologa y promover la insercin en la membrana de dicho segmento en su correcta orientacin. Protenas de membrana oligotpicas: La protena leader peptidasa, la cual contiene tres segmentos apolares, es uno de los mejores ejemplos estudiados de este tipo de protenas. (Fig. 3). La translocacin del largo dominio Ct requiere de protenas sec y del potencial electroqumico de membrana. Se ha demostrado que el segundo dominio apolar es esencial para la translocacin de dicho dominio Ct. Como en las protenas de M13 y Pf3, las cargas positivas proceden esta regin apolar. Aunque no se sabe con certeza qu factores determinan la orientacin de esta regin, se ha encontrado que la insercin de cargas positivas delante de este dominio apolar pueden revertir su orientacin dentro de la membrana y convertir dicha regin en una seal de exportacin. Sin embargo, esto slo ocurre si la secuencia polar citoplasmtica es deleccionada. Esta regin polar, contiene 10 residuos bsicos y 5 cidos y se ha encontrado que cuando dos ms de estos residuos cargados positivamente son removidos, el subsiguiente dominio apolar puede actuar como una seal de exportacin. En conclusin, esta regin, denominada segmento venenoso de translocacin, puede ser importante en la insercin de las protenas y en prevenir que regiones hidrofficas puedan funcionar como seales de exportacin. (5) Protenas de membrana politpicas: En este caso, para estudiar la protena transportadora de maltosa (MalF) se utiliz un mtodo basado en el hecho de que la fusin de la protena fosfatasa alcalina (phoA) a dominios periplsmicos de protenas de membrana resulta en una alta actividad de dicha enzima, y la fusin a loops citoplasmticos resulta en una baja actividad enzimtica. Basndose en la secuencia de aminocidos, se predijo que esta protena tena ocho segmentos transmembranales con

una topologa de acuerdo a la mostrada en la figura 3. Como se esperaba, las fusiones de los segmentos 1, 3, 5 y 7 mostraron una elevada actividad fosfatasa indicando que la phoA se exportaba al periplasma. Por otro lado, con algunas excepciones, las respectivas fusiones luego de los dominios apolares 2, 4, 6 y 8 resultaron en una baja actividad fosfatasa, sugiriendo que la phoA se encontraba localizada en el citoplasma. La localizacin de la mitad de las construcciones fusionadas a phoA que permanecieron en el citoplasma requeran aminocidos bsicos dentro del loop citoplasmtico del polipptido MalF. Estos resultados representan un fuerte soporte para la idea de que aminocidos cargados positivamente tienen un rol importante en la orientacin de los segmentos hidofbicos.

Fig. 3. Topologa de la protena leader peptidasa y de la protena transportadora de maltosa.

Distribucin de las cargas positivas de protenas de membrana en bacterias: (6) En general hay una predominancia de residuos cargados positivamente en el lado citoplasmtico de la membrana: los residuos de Lys y Arg son aproximadamente cuatro veces ms abundantes en los loops citoplasmticos que en los periplsmicos. Una explicacin de la importancia de dichos residuos bsicos adyacentes a los segmentos apolares es que stos interactan con las cabezas cidos de los lpidos de la membrana. Por ende, es dificultoso para estos residuos penetrar la membrana. Esta interaccin electrosttica puede promover la insercin de los dominios hidrofbicos dentro de la membrana. Una segunda posibilidad es que los residuos cargados positivamente pueden orientarse por s mismos hacia el citosol ya que el potencial electroqumico es ms negativo en el lado citoslico de la membrana de E. coli. Conclusiones: Diversos estudios indican que las cargas positivas, junto con los dominios hidrofbicos, son importantes determinantes en la topologa de las protenas de membrana. La orientacin del primer segmento transmembrana de estas protenas est influenciado por los residuos flanqueantes cargados positivamente: un dominio hidrofbico que posee residuos cargados positivamente en su extremo amino terminal se orientar en la membrana con su extremo carboxilo terminal hacia el periplasma, y un segmento hidrofbico con residuos cargados positivamente en su extremo carboxilo terminal se ubicar de manera inversa. En eucariotas, la diferencia de cargas entre los dos extremos de la primera secuencia de integracin de las protenas de membrana tambin parece ser un factor crucial en la topologa de las mismas. Por ltimo, la caracterizacin de los residuos flanqueantes a los segmentos hidrofbicos ayudara a progresar en la prediccin de la longitud precisa de la regin transmembranal y su posicin. Incluso, este tipo de informacin permitira optimizar predicciones en lo que respecta a interacciones hlice-hlice inter e intramoleculares de las protenas en la membrana lipdica.
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Referencias: 1) 2) 3) 4) 5) 6) Ross E. Dalbey (1990). Trends Biochem Sci 15, 253-257 Wickner W. And Lodish H. F. (1998). Science 230, 400-407 Von Heijne, G. and Gavel, Y. (1989) Eur. J. Biochem. 174, 671-678 Dalbey, R. E. and Wickner, W (1990) Science 235, 783-787 Laws, J. K. And Dalbey, R. E (1989) EMBO J. 8, 2095-2099 Von Heijne, G (1997) EMBO J. 5, 3021-3027

Bibliografa: 1) Thomas E. Creighton, Proteins, Structures and Molecular Properties, 2da ed, W. H. Freeman and Company. New York 2) Lehninger A.L., Nelson D.L. y Cox M.M., Principios de Bioqumica, 2da ed., Editorial Omega.

P ROTENAS C INASAS D EPENDIENTES DE Ca 2+ : C ARACTERSTICAS Y A CTIVACIN* Rodrigo Flores-Vieyra, Juan Carlos Raya-Prez y M. Eugenia Torres-Mrquez RESUMEN La fosforilacin reversible de las protenas es clave en la regulacin de vas metablicas y en la mayora de las funciones celulares. Una gran proporcin de las protenas cinasas (PK) forman parte de cascadas de sealizacin y algunas de estas cascadas involucran modificacin en los niveles de segundos mensajeros como el Ca 2+ . En esta revisin se describen las caractersticas estructurales fundamentales de estas protenas junto con los modelos propuestos para su activacin por Ca 2+ . PALABRAS CLAVE: CDPK, PKC, CaMK, CCaMK *Recibido: 8 de mayo de 2005 Aceptado: 13 de septiembre de 2005 Departamento de Bioqumica, Facultad de Medicina UNAM, Apdo. Postal 70-159, Mxico 04510 DF. Telfono 5623-2510, Fax 5616-2419. Correo E: metorres@servidor .unam.mx INTRODUCCIN La fosforilacin reversible de las protenas es un mecanismo modulador de una gran cantidad de las funciones celulares (1) y virtualmente de todos los seres vivos. El proceso es llevado a cabo conjuntamente por la accin de protenas cinasas y fosfatasas que mantienen los niveles de fosforilacin de las protenas blanco. Las protenas cinasas [2.7.1.37 2.7.3.11-12] se definen como enzimas que tienen la capacidad de transferir el fosfato gamma del ATP a un residuo de un aminocido

receptor localizado en una protena que funciona como sustrato (2). Los residuos de aminocidos que son sustrato de la accin de las protenas cinasas, son Ser, Tre, Tir e His, en sus grupos hidroxilo e imidazol, respectivamente. En esta revisin slo se considerarn a las protenas cinasas de residuos de Ser/Tre, pues dentro de ellas estn los miembros que se ha demostrado son modulados por Ca 2+ . CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS CINASAS La clasificacin de las protenas cinasas en cinco grupos se ha realizado con base en la homologa entre dominios catalticos (3) independientemente de que el sitio de unin para el ATP se encuentra altamente conservado. A) Grupo AGC: Este grupo considera a las cinasas dependientes de nucletidos cclicos protena cinasa A (PKA), protena cinasa G (PKG), adems de las cinasas dependientes de Ca 2+ y fosfolpidos (PKC). Una caracterstica importante de este grupo es la regulacin de su actividad por segundos mensajeros como el diacilglicerol, el Ca 2+ , el AMPc o el GMPc. B) Grupo CaMK: Este es representado mayoritariamente por dos sub-grupos principales, el subgrupo de las cinasas dependientes de Ca 2+ (CDPK) y las dependientes de Ca 2+ / calmodulina (CaMK y CCaMK) y aqullas con cierto parecido estructural a las no fermentadoras de sacarosa de la levadura (SNF1, por sus siglas en ingls) denominadas

SnNRK. ABSTRACT Reversible protein phosphorylation is key to the regulation of metabolic pathways and most aspects of cell function. Numerous protein kinases are part of signaling cascades, some of which are mediated by second messenger levels modification, like Ca 2+ . In this review, Ca 2+ dependent kinases main structural characteristics as well as their proposed calcium dependant activation models are described. KEY WORDS: CDPK, PKC, CaMK, CCaMK 74 REB 24(3,4): 74-80, 2005 C) Grupo CMGC: Incluye a los subgrupos cinasas dependientes de ciclina (CDK), las protenas cinasas activadas por mitgenos (MAPK), las cinasas de la glucgeno sintetasa (GSK3) y la casena cinasa II (CKII). Estos cuatro subgrupos actan en un proceso posterior a la activacin por segundos mensajeros. D) Grupo PTK: Este grupo se ha encontrado hasta ahora en animales, hongos y algunas bacterias, tiene como caracterstica que fosforila especficamente residuos de tirosina. E) nicas: Incluye una amplia gama de protenas cinasas clonadas a partir de plantas que no se han podido clasificar en alguno de los cuatro grupos anteriores. Las protenas cinasas de inters de esta revisin se encuentran en los primeros dos grupos, ya que estos contienen a las cinasas dependientes de Ca 2+ . La pregunta que podra surgir, una vez que se hayan establecido las caractersticas generales de las protenas cinasas dependientes de Ca 2+ es, si en

la clula se dan variaciones en los niveles de Ca 2+ libre y si estas se encuentran en el rango de activacin de las cinasas que se describirn. En cualquiera de los dos casos la respuesta es si; los niveles de Ca 2+ libre en clulas de animales y de hongos se ha reportado alcanzar hasta 1.2 M, ante estmulos como adrenalina o AMPc, respectivamente. Mientras que en clulas de vegetales las estimaciones han llegado a ser de hasta 2-3 M para los cambios que se dan en el tubo polnico en crecimiento. El valor de la Kd para Ca 2+ de las diferentes cinasas est alrededor de 1 M, como se sealar para cada familia de manera particular en el texto correspondiente. Grupo CaMK Subgrupo CDPK. Muchas de las protenas cinasas dependientes de Ca 2+ no requieren calmodulina, fosfolpidos o diacilglicerol, lo que marca una diferencia entre las familias CaMK y AGC. Este grupo de cinasas se ha encontrado en plantas vasculares y no vasculares y en el protozoario Plasmodium falciparum (4). Este tipo de protenas se distingue por presentar una estructura en el carboxilo terminal que tiene parecido con el sitio de regulacin mediado por calmodulina (CaM-LD) (Fig. 1). Las CDPK presentan cuatro dominios: el dominio cataltico, el dominio auto-inhibitorio, un dominio

variable y el dominio especfico para la unin de Ca 2+ (Fig. 1). Este ltimo comparte caractersticas con el de la calmodulina (CaM). Todas las CDPKs caracterizadas hasta el momento son activadas por Ca 2+ (5), su Kd est en el rango micromolar, por ejemplo para la DcCPK1 de zanahoria la Kd es de 1.7 M (6). Las CDPKs caracterizadas de Arabidopsis (a excepcin de CPK25) presentan, en el dominio que une al Ca 2+ , cuatro secuencias de aminocidos denominados manos EF. Estas manos EF son estructuras de 29 residuos, que forman una a -hlice (hlice E), seguida de una asa (que es la regin donde se une el in, al agruparse varios dominios EF) y una segunda a -hlice. Los dominios de manos-EF se presentan en pares Figura 1. Diagrama estructural de las protenas cinasas dependientes de Ca 2+ . Se indican el dominio cataltico que comparten las cinasas, as como el sitio de auto-inhibicin. El dominio de manos-EF ( ) es variable en los subgrupos. En CRK se presenta al dominio manos-EF en crculos abiertos para indicar que estos han degenerado. REB 24 (3,4): 74-80, 2005 PK dependientes de Ca 2+ 75 CRK Dominio CaM-LD degenerado Manos EF Inhibidor Inhibidor Dominio CaM-LD

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CDPK Inhibidor Inhibidor Manos-EF modificadas Modificacin Por lpidos CCaMK Manos -EF Inhibidor Inhibidor Dominio CaM-LD Dominio cataltico Dominio cataltico Dominio cataltico Dominio cataltico Dominio cataltico D o mi n io C a ta lt ic o Dominio de unin A CaM Inhibidor Unidad CaM Regiones altamente conservadas Seccin variable V3 CaMK SnRK3 PKC CCaMK C3 C N Dominio CaM-LD degenerado C4 C2 C7 C1 76 Flores-Vieyra R, Raya-Prez J C y Torres-Mrquez M E orientados cara a cara. Los residuos 1, 3, 5, 7, 9 y 12 de la asa son los encargados de quelar al Ca 2+ formando un complejo de arreglo piramidal con una base pentagonal (Fig. 2), que proporciona siete ligandos oxigenados. Los residuos 1, 3, 5 suministran

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ligandos monodentados, el residuo 12 que es un ligando bidentado, generalmente corresponde a un glutmico, El residuo 7 coordina directamente al Ca 2+ por los oxgenos de su grupo carboxilo. El residuo 9 permite la formacin de puentes de hidrgeno los cuales unen al Ca 2+ (7). Modelo de regulacin por Ca 2+ para CDPK. Hasta la fecha se proponen dos modelos de activacin para esta protena: en el primer mecanismo (Fig. 3A), se propone que una estructura flexible pero de movimiento limitado (por analoga de tipo balero) une el dominio CaM-LD a la cinasa. Despus de la estimulacin por Ca 2+ el dominio CaM-LD cambia la conformacin del dominio inhibidor, desplazando a ste y permitiendo as la activacin de la cinasa. Este modelo es muy parecido al propuesto para explicar la activacin de la familia CaMK, con la excepcin de que la regin CaM-LD est unida covalentemente mientras que la calmodulina acta como una protena independiente. El segundo modelo (Fig. 3B), propone que la unidad CaM-LD est siempre unida al dominio inhibidor, independientemente de los niveles de Ca 2+ . No obstante, al incrementarse la concentracin del in, la estructura de esta regin se modifica generando a su vez un rearreglo del sitio inhibitorio de tal manera que lo desplaza del sitio activo. Subgrupo CRK. Este subgrupo, que originalmente se reconoci como semejante a CDPK (8) y que de all deriv su nombre (CDPK related

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kinase), se ha hipotetizado tiene un origen evolutivo reciente a partir de un grupo particular de isoformas de CDPK (Fig. 1). Se piensa que el dominio CaM-LD evolucion a un dominio de manos-EF modificado (Fig. 1). En algunas CRK el extremo C presenta dominios que pueden unir Ca 2+ , pero no por esto activan a la cinasa; por lo que se considera que han degenerado. El peso molecular del subgrupo CRK oscila entre 64.3 y 68 kD y sus dominios variables son de longitud homognea, su extremo amino presenta modificaciones posttraduccionales como la esterificacin por miristato y palmitato. Resulta interesante que las CRK solo se han encontrado en angiospermas. Hasta la fecha no se han reportado funciones fisiolgicas reales o hipotticas para las CRK, en ningn organismo (4). Subgrupo CaMK. Dentro de este grupo de cinasas activadas por calmodulina, son 4 las que han sido mejor estudiadas: las CaMK I, II, III o MLCK (por sus siglas en ingls) y la IV. Las MLCK-I, II y IV se encuentran asociadas a varias protenas en el citoplasma, las membranas de los organelos incluyendo la plasmtica, o a elementos del citoesqueleto. La MLCK o cinasa de la cadena ligera de miosina se considera el modelo ms simple, incluye a las formas de msculo esqueltico, msculo liso y clulas no musculares; esto es porque parece estar asociada exclusivamente con la actomiosina y fosforila slo un sustrato, la cadena ligera de la miosina (9). El cDNA que codifica para la MLCK de conejo permite predecir que se trata de una protena de 610 aminocidos (aa); aunque en realidad es de 603 aa y consta de tres dominios: el extremo N, el cataltico (residuos 302-539) y el regulador (residuos 577-593). Este ltimo en el ex-

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tremo C, contiene por tanto al sitio de unin a CaM (Fig. 1). Los estuFigura 2. Estructuras del asa de una mano-EF. Se marca la bi-pirmide de base pentagonal que forma el anillo de coordinacin en lnea continua; las lneas discontinuas muestra los anclajes que forman los tomos de oxgeno con el tomo de Ca 2+ (esfera al centro). El residuo E31 corresponde al doceavo residuo de la estructura, presenta dos sitios de coordinacin. El residuo T28 corresponde al residuo 9 el cual presenta puentes de hidrgeno. D24 T28 T26 -X Y E31 D22 D20 X Z -Z 77 REB 24(3,4): 74-80, 2005 PK dependientes de Ca 2+ dios de hidrodinmica y de espectrofotometra de dicrosmo circular sugieren que los dominios cataltico y regulador forman una estructura globular con un alto contenido de alfahlice, mientras que el resto de la protena es asimtrica y rica en residuos de prolina (10). In vitro es dependiente de la unin con Ca 2+ /CaM, esta ltima protena tiene una Kd para el calcio de 1 M (9). En msculo liso, la MLCK, regula la contraccin y en clulas no musculares participa en la motilidad, la mitosis, la dinmica del citoesqueleto de actina y la secrecin (9). La funcin de las otras CaMK se ha establecido principalmente en la regulacin de la transcripcin (11). Modelo de regulacin por Ca 2+ para la CaMK. La unin del com-

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plejo Ca 2+ /CaM con la regin que lo une en la protena cinasa causa un cambio conformacional muy grande. La hlice central acta como un balero flexible, que se dobla y enrolla de forma que los dominios globulares de la CaM envuelven completamente al pptido blanco (Fig. 4A). Esta interaccin a su vez desplaza la regin inhibitoria de la cinasa que deja expuesto al sitio de unin al sustrato. Se ha propuesto que la interaccin entre el extremo C de la CaM y el dominio N de la cinasa forman un complejo inactivo. El incremento en Ca 2+ permite entonces la interaccin de la CaM con su cinasa en sitios adicionales que permiten la activacin de la enzima (9). Subgrupo CCaMK. Este nombre se ha usado para describir un grupo de cinasas cuyo extremo C presenta tres manos EF en lugar del sitio de unin a CaM, caracterstica que la distingue de las CDPK (Fig. 1). Este grupo de protenas ha sido clonado del tabaco y las azucenas (Lilium longiflorun) (12) pero no se han encontrado protenas representativas de este tipo en Arabidopsis. La conformacin estructural de esta familia en general tiene parecido al del subgrupo CDPKs, aunque el dominio especfico encargado de la unin a Ca 2+ es ms parecido al de la familia de las visininas. Estas son protenas que unen Ca 2+ por estructuras conformadas por tres manos-EF y son abundantes en tejido nervioso (13). Las CCaMKs tienen un sitio de unin de calmodulina que se sobrepone al sitio de regulacin (Fig. 1). Aunque el mecanismo de activacin

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por Ca 2+ y calmodulina es complejo, se ha propuesto que se da por una auto fosforilacin en respuesta a la unin de un dominio tipo calmodulina de otra protena. Esta autofosforilacin, trae como consecuencia aumento en la afinidad por el sustrato. Modelo de activacin por Ca 2+ para CRK y CCaMKs. El modelo de activacin por Ca 2+ para las CRK se basa B C CRK D E CCaMK CCaMK CaM Ca 2+ Balero Ca 2+ CaM-LD CDPK Activa CDPK inactiva Autoihibidor A CDPK inactiva Autoinhibidor Ca 2+ Balero CDPK activa CaM Ca 2+ CaM Ca 2+ Figura 3. Modelos de activacin por Ca 2+ de las CDPK, CRK y CCaMK Las regiones mar-

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cadas como CaM-LD y CaM representan los sitios de unin a calcio. Los cambios de tono as como los de forma, indican un cambio en la estructura de los mismos, el cual se describe en el texto. K K . . . K Balero K K K K K P K K A C D E B 78 Flores-Vieyra R, Raya-Prez J C y Torres-Mrquez M E en el potencial que tiene el complejo Ca 2+ -CaM de una protena activadora exgena para estimular la actividad de la cinasa. El proceso de activacin consiste en que al unirse el Ca 2+ a la CaM (Kd ~1 M), dirige el complejo Ca 2+CaM al sitio inhibitorio, lo que provoca el cambio estructural de ste y por tanto la activacin de la cinasa (Fig. 3D). Algunas interrogantes que no resuelve este modelo de activacin, es la funcin que pudiera tener el domino C-terminal de la protena, pues parece capaz de unir Ca

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2+ , pero no participa directamente en la activacin de la cinasa (14). Las cinasas CCaMKs presentan adems de un sitio que une al complejo Ca 2+ -CaM de una protena exgena; un dominio, semejante al de visinina, el cual funciona como un sensor adicional para la activacin por Ca 2+ . De tal manera que a niveles basales de Ca 2+ el dominio semejante a visinina estara unido al sitio inhibitorio, pero al incrementar la concentracin de Ca 2+ , la protena activadora que trae consigo el complejo Ca 2+CaM sera capaz de desplazar al dominio de visinina y tendra entonces el sitio de activacin libre para ejercer su funcin (Fig. 3E). Aun se desconoce la posicin del dominio de visinina en el sitio inhibitorio y si en realidad el complejo Ca 2+ -CaM es capaz de desplazar tal dominio del sitio inhibitorio, pues tambin se puede especular que el desplazamiento se produjera por el incremento mismo de Ca 2+ (15). Grupo AGC Dentro de los miembros de la familia AGC, son las PKC donde dirigiremos nuestra atencin, por contener miembros cuya actividad es regulada por Ca 2+ . Esta familia de protenas consiste de 12 isoformas con estructuras estrechamente relacionadas entre s.

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Todas las especies de PKC presentan diferencias en su modo de activacin, propiedades cinticas y especificidad de sustrato; se subdividen en tres grupos. Las clsicas son dependientes de Ca 2+ y diacilglicerol, a , I, II, . ; las nuevas que son insensibles a Ca 2+ : d IIII, e , . , . ; y las atpicas que no son reguladas por Ca 2+ ni diacilglicerol, . PKM. y . / . . Las isoformas clsicas consisten en una sola cadena polipeptdica (Fig. 1) con una estructura homloga general de 4 regiones altamente conservadas y 5 regiones variables distribuidas en dos dominios, uno regulador y el otro cataltico separados por la regin variable V3 (16). Las PKC o sus ortlogos, se encuentran ampliamente distribuidos en los eucariotes, con la posible excepcin de las plantas. En organis-

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mos pluricelulares complejos pareciera haber expresin de algunas isoformas en tejidos especficos. En general, se encuentran en forma soluble, aunque contienen regiones que les permite asociarse a las membranas. Dentro de las funciones ms importantes de la PKC estn las que modulan a los receptores de membrana plasmtica, ie. receptores acoplados a protenas Gq o receptores con actividad de tirosina cinasa que son componentes del mecanismo de transduccin de seales. Entre los diversos procesos celulares en los que participa la PCK pueden mencionarse: la secrecin de insulina y calcitonina, la liberacin de neurotransmisores, la sntesis de ADN y la regulacin de la expresin de ciertos genes como el que codifica para . -interfern. Modelo de regulacin por Ca 2+ de las PKC convencionales. Las PKC convencionales, sensibles a Ca 2+ con una Kd de 700 nM para la protena asociada a la membrana (17), contienen un dominio auto-inhibitorio, conocido tambin como el pseudosustrato, en el extremo N de la proteAuto inhibicin Sitio de unin Ca 2+ /CaM Activacin dependiente de Ca 2+ /CaM Regin de autofosforilacin Regin de

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activacin autnoma Desfosforlilacin Auto inhibicin A CaMK + Ca 2+ DAG + PS inactiva activa B PKC Pseudo-sustrato + Ca 2+ DAG + PS inactiva activa B PKC Pseudo-sustrato Figura 4. Modelos de activacin por Ca 2+ de las CaMK (A) y la PKC (B). La regin ( ) corresponde al dominio cataltico, las regiones C1a y C1b estn indicadas como ( y ) respectivamente, la regin C2 y C3 esta indicada con y a a a a d d d d b b b b c c c

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c e e e e A B 79 REB 24(3,4): 74-80, 2005 PK dependientes de Ca 2+ na. Tambin en esta regin N se encuentran los domnios denominados C1 y C2 donde se encuentran los sitios de unin de diacilglicerol/esteres de forbol y fosfolpidos cidos/Ca 2+ , respectivamente. En estado basal la PKC (Fig. 4B) se encuentra inactiva por tener el sitio activo ocupado por el pseudo sustrato. La movilizacin del pseudo sustrato se da cuando el diacilglicerol y la fosfatidil serina se unen a los sitios C1 y C2, pues modifican la estructura de ste. La accin del Ca 2+ es sinrgica con la del diacilglicerol para permitir la accin activadora de la fosfatidil serina (18). CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Ha quedado establecido el papel del Ca 2+ como un segundo mensajero en prcticamente las formas de vida eucariotes. De igual manera, a medida que se avanza en el estudio de las protenas cinasas dependientes de Ca 2+ , en general, corroboramos lo extendidas que estn entre los diversos organismos. Las manos-EF como regiones de interaccin con Ca 2+ se encuentran en todas los dominios regu-

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ladores de las diferentes protenas cinasas dependientes de Ca 2+ estudiadas. El conocimiento ms ntimo de la forma en que son activadas y reguladas estas enzimas permitirn saber si estos dominios fueron los primeros que surgieron en la naturaleza para unir al Ca 2+ y as modular la actividad. De ser as, algunos de ellos perdieron su funcin (CRK) o se separaron a protenas reguladoras independientes (CaMK). Esto nos indicara un posible origen monofiltico. Agradecimientos. Este trabajo se realiz con apoyo parcial del donativo IN218303, DGAPA, UNAM http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/html/490/49024402/49024402.html

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