Espectrofotometra

Espectrofotometro. La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones qumicas y biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Principio de la Espectrofotometra
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiacin de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La espectrofotometra ultravioleta-visible usa haces de radiacin del espectro electromagntico, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro. Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce tambin como rango de uv cercano , la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible , de 400 a 800 nm.

Adems, no est de menos mencionar el hecho de que la absorcin y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin y de la distancia recorrida.

Ley de Beer
La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentracin en la solucin. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con ms azcar diluida. El detector es una celda fotoelctrica, y la solucin de azcar es la que se mide en su concentracin. Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos.

Ley de Lambert
En la Ley de Lambert se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentracin de azcar, pero, el segundo tiene un dimetro mayor que el otro. Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se explic en la ley de Beer.

Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la ley de Bouguer-Beer-Lambert (tambin conocida como ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinacin de las citadas anteriormente.

Transmitancia y absorcin de las radiaciones

Al hacer pasar una cantidad de fotones o de radiaciones, por las leyes mencionadas anteriormente, hay una prdida que se expresa con la ecuacin: It/Io=T-kdc'' Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica (llamada radiacin o intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiacin intensidad incidente) y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia. En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiente decrece a medida que el recorrido aumenta. Donde k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta. La ecuacin simplificada de la ley de Beer-Lambert A = .d.c

Comprende a la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin (). El factor de calibracin relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares. La absorcin (o absorbancia) es igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la transmitancia:[1] A= log 1/T lo que es igual a: A= -log T Las ecuaciones mencionados de las leyes son validas solo y solo s:[1] La radiacin incidente es monocromtica. Las especies actan independientemente unas de otras durante la absorcin. La absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal uniforme

Aplicaciones
Las aplicaciones principales son: Determinar la cantidad de concentracin en una solucin de algn compuesto utilizando las frmulas ya mencionadas. Para la determinacin de estructuras moleculares. La identificacin de unidades estructurales especificas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomeras).

Espectrofotmetro

Un espectrofotmetro es un instrumento usado en la fsica ptica que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones: 1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra

Componentes de un espectrofotmetro

Cubetas de espectofotometra. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz ultravioleta; en segundo plano, de plstico, para colorimetra (es decir, empleando luz visible).

Fuente de luz
La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son: lmpara de wolframio (tambin llamado tungsteno), lmpara de arco de xenn y lmpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atmicos.

Monocromador
Artculo principal: monocromador

El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica. Est constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.

Compartimiento de Muestra
Es donde tiene lugar la interaccin, R.E.M con la materia (debe producirse donde no haya absorcin ni dispersin de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de Lambert-Beer en su mxima expresin, en base a sus leyes de absorcin, en lo que concierne al paso de la molcula de fundamental-excitado.

Detector
El detector, es quien detecta una radiacin y a su vez lo deja en evidencia, para posterior estudio. Hay de dos tipos: a) los que responden a fotones; b) los que responden al calor

Registrador
Convierte el fenmeno fsico, en nmeros proporcionales al analito en cuestin.

Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la seal en forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mviles del equipo.

Ley de Beer-Lambert
En ptica, la ley de Beer-Lambert, tambin conocida como ley de Beer o ley de BeerLambert-Bouguer es una relacin emprica que relaciona la absorcin de luz con las propiedades del material atravesado.

Expresin

Diagrama de la absorcin de un haz de luz atravesando una cubeta de tamao l. La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente despus de que en dicho medio se produzca absorcin. La relacin entre ambas intensidades puede expresarse a travs de la siguiente relacin:

Donde: , son las intensidades saliente y entrante respectivamente.

, es la absorbancia, que puede calcularse tambin como: es la longitud atravesada por la luz en el medio, es la concentracin del absorbente en el medio. es el coeficiente de absorcin: es la longitud de onda de la luz absorbida. es el coeficiente de extincin. La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y , la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. Las unidades de c y dependen del modo en que se exprese la concentracin de la sustancia absorbente. Si la sustancia es lquida, se suele expresar como una fraccin molar. Las unidades

de son la inversa de la longitud (por ejemplo cm-1). En el caso de los gases, c puede ser expresada como densidad (la longitud al cubo, por ejemplo cm-3), en cuyo caso es una seccin representativa de la absorcin y tiene las unidades en longitud al cuadrado (cm2, por ejemplo). Si la concentracin de c est expresada en moles por volumen, es la absorbencia molar normalmente dada en mol cm-2. El valor del coeficiente de absorcin vara segn los materiales absorbentes y con la longitud de onda para cada material en particular. Se suele determinar experimentalmente. La ley tiende a no ser vlida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el material dispersa mucho la luz. La relacin de la ley entre concentracin y absorcin de luz est basada en el uso de espectroscopia para identificar sustancias.

ESPECTROFOTOMETRIA La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS

1. NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA
La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:

a)

Longitud de onda ( ): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0 = 10-9 m. b) Frecuencia ( ): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su frmula es: = c/ , y se mide en ciclos por segundo o hertzios. Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x = h x c/ (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa. d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes para nosotros son: Regin Ultravioleta: = 10-380 nm Regin Visible: = 380-780 nm Regin Infrarroja: = 780-30.000 nm En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro

de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA A.

FENMENO DE ABSORCIN Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h. ). La partcula en estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor. Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de absorcin. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

B.

FENMENO DE EMISIN Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.

3. LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia. Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida: T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100. Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco. La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional. La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente: Si el %T = 100 Si el %T = 0 A = 2-log T = 2-log 100 = 0 A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de la luz. A = . b. c Siendo: A: absorbancia. No tiene unidades. : el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm). b: es la longitud de paso de la luz, en cm. c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L. La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de dos formas: Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas: A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la curva de calibracin. Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin. Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad. Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4. ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos: Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda. Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difraccin. Monocromador de Prisma

2.2.

COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO 1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible.

Tipos de lmparas: Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante entre 360-950 nm. Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad. Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm. Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y cromatografa HPLC. Precauciones: - Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios en las lecturas de la Absorbancia. - La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato. (03/10/01) 2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda. 3. Monocromadores. Pueden ser: Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano. Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeo prisma. 4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01) 5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico. 6. Detector. Puede ser de dos tipos: Fotoclulas o clulas fotovoltaicas: Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre. A sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que seala el paso de corriente. Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan

una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra. Fototubos multiplicadores: Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces. Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y son muy sensibles. 7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin. ( 4.2 TIPOS DE APARATOS ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripcin dada para el espectrofotmetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para determinar bilirrubina directa en capilar). ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes estn duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de luz y de absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: utilizan los mismos componentes que el espectrofotmetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero no al mismo tiempo. Emplean un Chopper consistente en un interruptor rotativo del haz luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porcin de luz reflejada por el chopper a travs de una cubeta de referencia y de ah al detector comn. El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de referencia. Esto compensa la variacin de energa radiante.