Protocolo de Diagnstico de Malaria por Mtodo de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

PRODUCTO 6 Metodologa utilizada para el diagnstico y diferenciacin de Plasmodium spp. en pacientes positivos por Malaria. Lic. Juan C. Domnguez 30 de junio de 2011

INDICE

INTRODUCCION PALUDISMO O MALARIA LA TCNICA DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) REACTIVOS Y EQUIPOS o Extraccin de DNA o Diagnstico mediante PCR o Electroforesis PROCEDIMIENTOS PARA LAS PRUEBAS MOLECULARES o Extraccin de DNA o PCR diagnstico (Nested-PCR) a. Primer PCR b. Segundo PCR o Preparacin de Geles de Agarosa BIBLIOGRAFIA

INTRODUCCIN

La malaria es una parasitemia de preocupacin mundial. Las estimaciones de la Organizacin Mundial de la Salud, 300 hasta 500 millones de casos de infecciones de malaria que resulta en ms de un milln de muertes que ocurren a nivel mundial cada ao. Aunque, la gran mayora de estos casos se encuentran en los pases de las regiones tropicales de frica, Asia, Amrica Central y Amrica del Sur, donde la enfermedad es endmica. Los Centros para el Control y Prevencin recomienda que la malaria se debe considerar un diagnstico diferencial en pacientes febriles que hayan viajado a una regin donde la malaria es endmica y en todo los pacientes que presenten fiebre de origen desconocido, independientemente de su historial de viajes.

La diferenciacin de las especies de Plasmodium es esencial para seleccionar el tratamiento adecuado, especialmente la diferenciacin de P. falciparum de los dems, ya que esta especie es responsable de casi 95% de las muertes por malaria.

La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se ha sumado a la lista de desarrollos tecnolgicos originados en el mbito industrial que provocaron cambios cualitativos en las ciencias bsicas. Uno de los proyectos ms ambiciosos de la biologa moderna es la determinacin de la secuencia completa del genoma humano, y sumndose a eso, el diagnostico de nuevas enfermedades trasmitidas por diferentes patgenos: virus, bacterias, parsitos y otros; y de otra ndole.

PALUDISMO O MALARIA El paludismo o malaria es una enfermedad muy extendida en el trpico. Es una de las principales causas de mortalidad en el mundo. Est causada por un protozoo (Plasmodium) que es transmitido al hombre a travs de la picadura de la hembra del mosquito Anopheles. Existen cuatro especies de Plasmodium que causan la enfermedad en el hombre (P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. falciparum). Las tres primeras producen un paludismo relativamente benigno, pero la cuarta produce un paludismo grave que amenaza la vida del enfermo. Adems, con el paso del tiempo, Plasmodium falciparum ha desarrollado resistencia a algunos de los medicamentos utilizados por el ser humano para combatirlo. Figura 1. Ciclo de trasmisin del Paludismo

Las tasas de transmisin del paludismo pueden variar en funcin de factores locales como las precipitaciones (los mosquitos se cran en condiciones hmedas), la proximidad de los lugares de cra a las personas y las especies de mosquitos presentes en la zona. Algunas regiones, denominadas "endmicas", tienen un nmero bastante constante de casos a lo largo de todo el ao. En otras hay "estaciones paldicas", generalmente coincidentes con la estacin lluviosa. Pueden producirse grandes y devastadoras epidemias cuando el parsito se introduce en una zona donde la poblacin ha tenido poco contacto con l y posee escasa o nula inmunidad al paludismo o cuando personas con baja
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inmunidad se desplazan a zonas donde los casos de paludismo son constantes. Estas epidemias pueden ser desencadenadas por condiciones climticas hmedas y agravadas an ms por inundaciones o movimientos masivos de poblacin originados por conflictos.

Los primeros sntomas comunes (fiebre, dolor de cabeza, escalofros y vmitos) suelen aparecer 10 a 15 das despus de que se haya producido la infeccin. Si no se trata rpidamente con medicamentos eficaces, el paludismo puede ser grave, y a menudo mortal.

Grupos especiales de riesgo: Son muy vulnerables los viajeros procedentes de regiones libres de paludismo, con escasa o nula inmunidad, que se desplazan a zonas donde la enfermedad es frecuente. Las embarazadas no inmunes corren un alto riesgo de sufrir el paludismo. La enfermedad puede producir tasas de aborto elevadas y causar una mortalidad materna anual de ms del 10% (cifra que puede llegar al 50% en casos de enfermedad grave). Las embarazadas semi-inmunes corren el riesgo de sufrir anemia intensa y retraso del crecimiento fetal, aunque no presenten signos de enfermedad aguda. Se calcula que anualmente mueren 200 000 lactantes a consecuencia del paludismo adquirido durante el embarazo. Las embarazadas infectadas por el VIH tambin corren mayor riesgo.

El tratamiento temprano del paludismo reduce su duracin, previene las complicaciones y evita la mayora de las muertes. Debido a sus considerables repercusiones sanitarias en los pases de bajos ingresos, el tratamiento del paludismo es parte esencial del desarrollo sanitario mundial. El objetivo del tratamiento consiste en curar al paciente, ms que en reducir su nmero de parsitos.

La OMS recomienda: Un tratamiento rpido de todos los episodios de la enfermedad (a ser posible, en las 24 horas siguientes al inicio de los sntomas);
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El uso de mosquiteros tratados con insecticida para evitar las picaduras de los mosquitos por la noche; En las embarazadas de zonas muy endmicas, dosis profilcticas de sulfadoxina pirimetamina para eliminar peridicamente los parsitos que pueda haber en la placenta;

La fumigacin de interiores con insecticidas de accin residual para matar los mosquitos que haya en las paredes y techos de las casas.

Figura 2. La fumigacin con insecticidas como medidas preventivas.

LA TECNICA DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Esta tcnica permite amplificar pequeas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta ms de dos mil nucletidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. El mtodo se basa en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalizacin". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos (oligonucleridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicar. Para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucletidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonuclesidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reaccin. La temperatura a la que se realiza el tercer paso est condicionada por aqulla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la

aplicacin de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del segmento de ADN delimitado por los primers. Figura 3. Ciclo de la Tcnica PCR

El hecho de que las molculas de ADN obtenidas al finalizar la reaccin en cadena correspondan efectivamente al fragmento de inters queda asegurado por la intervencin de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese fragmento. As, una vez que la reaccin a finalizado, el tamao del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reaccin a una electroforesis en gel de agaroza o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin por difusin bajo la accin de un campo elctrico. Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alcuota de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicacin tras haber colocado dos primers internos. Mediante el empleo de esta metodologa, conocida como nested PCR (PCR anidada), la filiacin de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que poseen tamaos previsibles.

En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas y clivadas por ciertas enzimas llamadas en donucleasas de restriccin. La determinacin del tamao al que quedan reducidos los fragmentos al ser puestos en contacto con la enzima de restriccin adecuada indica que nos encontramos ante los segmentos de inters. Se han desarrollado varias pruebas diagnosticas basadas en la amplificacin del ADN de Plasmodium spp mediante PCR. Estas pruebas han demostrado a nivel experimental tener una mayor sensibilidad y especificidad para detectar el parasito al compararlas con otras pruebas diagnosticas convencionales. Se han diseados varias tcnicas de PCR empleando oligonucletidos que amplifican regiones del ADN especificas para cada una de las especies de Plasmodium que infectan al humano. Para el diagnostico de P. falciparum se ha descrito un PCR que amplifica una regin altamente repetitiva del genoma del parsito. Esta misma prueba tambin se ha descrito en formato multiplex para detectar simultneamente P. falciparum y P. vivax, empleando otro par de oligonucletidos dirigidos a una secuencia repetitiva de P. vivax. Adems de la utilidad diagnostica, la tcnica de PCR puede emplearse para detectar mutaciones en el parsito asociadas con resistencia a medicamentos y para conducir estudios de epidemiologia molecular durante brotes de malaria.

Reactivos y Equipos Extraccin de ADN Micropipetas de 40-200 l y 200-1000 l Pinzas Puntas de 1-100 l y 200-1000 l Sacabocados Tubos eppendorf Agua destilada esteril Buffer 0.5 % saponina de 1 x PBS Chelex- 100 HCl NaOH PBS (Phosphate Buffer Saline) Autoclave Bao seco Microcentrifuga Refrigerador Vortex

Diagnstico mediante PCR Micropipetas 1-10 l, 5-40 l, 20-200 l, 200-1000 l Puntas con filtro 1-10 l, 10-200 l, 200-1000 l Tubos eppendorf Tubos de PCR Agua destilada esteril Cloruro de magnesio Hielo PCR Master Mix Cmara de flujo laminal

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Cubetas Gradillas Vortex

Electroforesis Equipo Balanza analtica Sistema de mini gel horizontal Fuente de corriente Transiluminador

Materiales y Reactivos Erlenmeyer Micropipeta de 1-10 l, 10-200 l Papel parafina Probeta de 100 ml Puntas con filtro de 1-10 l, 1-200 l Acrilamida-Bisacrilamida Agarosa de lata resolucin Agarosa Low meeting Agua destilada Loading buffer Marcador molecular 50-2000 bp

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Procedimientos para las Pruebas Moleculares Pasos para la recoleccin de las muestra en papel filtro Whatman 3MM Rotular el papel filtro Limpiar la piel con alcohol y dejar secar Puncionar con la lanceta la yema del dedo hacia el borde lateral, mas debajo de la ua Limpiar la primera gota de sangre con algodn seco Presionar el dedo para obtener una gota pequea Colocar 3 gotas sobre el papel sin firmar el dedo en el papel y dejar que se forme un botn del tamao de una moneda de 10 centavos Dejar secar por lo menos dos horas a temperatura ambiente y almacenar en bolsas plsticas transparentes hasta su procesamiento. Extraccin de ADN 1. Se toma con un sacabocados crculos de muestras en papel filtro y se coloca en un microtubo tipo eppendorf de 1.5 ml, debidamente rotulado con el nombre del paciente y la fecha 2. Se aade un 1 ml de buffer 0.5 % saponina en 1X PBS a cada tubo con su respectiva muestra. Se mezcla bien y se incuba a 4 C durante toda la noche 3. Se descarta la solucin de glbulos rojos lisados y se remplaza con 1 ml de 1X PBS por 30 min. 4. Por cada muestra analizada se calienta 200 l de Chelex-100 a 100 hasta que se C disuelvan las perlitas 5. Se retira el lisado de glbulos rojos y a continuacin se transfieren los crculos de papel filtro a los tubos con Chelex-100 disuelto, mezclando vigorosamente por 30 segundos 6. Posteriormente las muestras se incuban en le bao seco durante 100 y se mezclan C en le vortex durante 30 segundos 7. Las muestras se centrifugan a 10 000 rpm durante 2 min. El sobrenadante donde se encuentra el ADN es retirado con cuidado y transferido a otro tubo debidamente rotulado. La centrifugacin se repite y el sobrenadante es extraido nuevamente. 8. Todas las muestras son almacenadas a -20 C

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PCR diagnstico (Nested-PCR) La extraccin del DNA de malaria a partir de sangre recolectada en papel filtro Whatman 3MM se realiza empleando la metodologa estndar de Chelex, descrita anteriormente, o empleando el Kit de QUIAGEN, de acuerdo a las instrucciones de la casa comercial. Inicialmente, el ADN extrado ser empleado para confirmar el diagnstico de Plasmodiun vivax empleando un PCR anidado. El procedimiento consiste en realizar una primera amplificacin por PCR para la identificacin de un fragmento de gnero-especifico seguido de una amplificacin especie-especifico que permite distinguir entre Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum, inclusive permite detectar infecciones mixtas. a. Primer PCR (gnero-especifico) rPLU5: CTTGTTGTTTGCCTTAAACTTC rPLU6: TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG Rotular los tubos para cada una de las muestras de ADN Aadir 25 l de PCR mix, 1 l de MgCl2 Agregar 2 l de rPLU5 y 2 l de rPLU6 15 l de agua libre de DNAasas y RNAasas 5 l de DNA Colocar esta mezcla en el termociclador con las siguientes condiciones: PROGRAMA N DE CICLOS Desnaturalizacin inicial Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final 94 x 2 minutos C 94 x 1 minuto C 58 x 2 minutos C 72 x 2 minutos C 72 x 2 minutos C 1 ciclo
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1 cicl o

25 ciclos

b. Segundo PCR (especie-especifico) Cebadores de PCR especie especfico: P. falciparum rFAL1: 5-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3 rFAL2: 5-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3 P. vivax rVIV1: 5-CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3 rVIV2: 5-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3 Aadir PCR mix agregar 25 l Agregar 1 l de MgCl Agregar 2 l de rV1V1 Agregar 2 l de rV1V2 Agregar 2 l de rFAL1 Agregar 2 l de rFAL2 Aadir 14 l de H2O Aadir 2 l de DNA amplificado en el primer PCR PROGRAMA N de Ciclos Desnaturalizacin inicial Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final 94 x 2 minutos C 94 x 30 segundos C 65 x 1 minutos C 72 x 1 minutos C 72 x 4 minutos C Final 1 ciclo 35 ciclos 1 cicl o

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Los productos esperados son: Plasmodium falciparum: 205 pb Plasmodium vivax: 120 pb

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Preparacin de geles de Agarosa La electroforesis en geles de agarosa se realiza generalmente en cubetas horizontales, requiriendo de una fase mvil y la fase estacionaria. El polmero utilizado para el anlisis electrofortico de cidos nuclecos de gran tamao es la agarosa. La migracin del ADN o ARN en un gel de agarosa sometido a un campo elctrico depende del voltaje del campo, como del tamao del poro del gel de agarosa. La separacin efectiva de los fragmentos de ADN o ARN depende de la masa como de la carga de los distintos fragmentos, es decir, la relacin carga/masa

Gel de Agarosa al 2%

Pesar 1 g de agarosa en un papel de pesa, aadir 50 ml de TBE (1X) llevar a ebullicin. Dejar enfriar la disolucin en un bao de agua fra. Agregar 2.5 l de bromuro de etidio (10ml/1 ml) y agitar. Verter la solucin de agarosa en la cmara de electroforesis apropiada, sellando los extremos y colocar los peines. Dejar polimerizar, 20 minutos aproximadamente. Una vez polimerizado el gel, llenar la cmara electrofortica con tampn 1X y quitar el peine con cuidado de no romper los pocillos. Llenar cada pocillo con 5 l de muestra y 1 l de buffer de corrida. Aplicar la fuente de corriente 75-85 V durante 30 min.

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BIBLIOGRAFIA A. Santamaria Salazar. Diagnstico y caracterizacin molecular de las

infecciones por Plasmodium falciparum en la Comarca Kuna Yala. Panam 20032004. J. Botella, A. Espacio, L. Aguilella. Medicina para Montaeros. 2006

www.ctv.es/USERS/borobar/paludismo.htm PALUDISMO. ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD. PCR en tiempo real para la deteccin e identificacin de Plasmodium spp. Journal Clinical Microbiology. Volumen 43 (5), Mayo 2005.

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