UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

MANUAL DE PRCTICAS BIOQUMICA CLNICA

(CLAVE 1807)

MXICO, D. F.

2009

El laboratorio clnico es un ambiente dinmico que esta continuamente cambiando para a satisfacer las necesidades de salud pblica. El presente manual ser de mucha utilidad como recurso informativo en la formacin de los alumnos en el rea de Bioqumica Clnica. El aspecto valioso de la informacin es que tiene un enfoque actual de los procesos habituales de laboratorio como la tendencia tecnolgica de la automatizacin, lo que permite enfrentar el reto de manejar pruebas mas sensibles, especficas y efectivas en el monitoreo de la salud y la enfermedad. Adems, la posibilidad de obtener resultados a tiempo y el costobeneficio que representa. Es recomendable la introduccin de la terminologa actual, completar la informacin acerca de los organismos y guas de regulacin de las buenas prcticas de laboratorio La elaboracin de ste manual estuvo a cargo de la Q.F.B Rosalinda Velzquez Salgado a travs de su seccin de Bioqumica Aplicada

CONTENIDO PRLOGO INTRODUCCIN UNIDAD I 1. INFORMACIN SOBRE EL CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CLNICO 1.1Etapa preanaltica 1.1 Etapa analtica 1.1.Etapa Post-analtica 1.2Toma de muestra 1.3Estudio de la variacin en condiciones de rutina UNIDAD II 2. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO RENAL. 2.1 Determinacin de cido rico. Mtodo enzimtico. 2.2 Determinacin de Urea. Mtodo enzimtico 2.3 Determinacin de Creatinina . Bossnes- Taussky. 2.4 Determinacin de sodio/potasio/cloro . Mtodo In Selectivo 2.5 Determinacin de pH, pPO2, pCO2 . Gasometra 2.6 Examen general de orina (EGO) UNIDAD III 3.METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y LPIDOS 3.|. Determinacin de Glucosa. Mtodo enzimtico (GOD-PAD) 3.2. Determinacin de Colesterol total. . Mtodo enzimtico (CHOD-PAD) 3.3. Determinacin de Triglicridos. Mtodo enzimtico UNIDAD IV 4. METABOLISMO SEO Y MINERAL 4.1Determinacin de Calcio. Mtodo Colorimtrico 4.2Determinacin de Fsforo. Mtodo UV UNIDAD V 5. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO HEPTICO. Mtodo colorimtrico 5.1 Determinacin de Bilirrubina. Mtodo DMSO Total y Directa 5.2 Albmina. Mtodo verde de Bromocresol 5.3 Protenas totales. Mtodo de Biuret 5.4. INTRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA CLNICA. 5.5 Determinacin de fosfatasa Alcalina. Mtodo cintico 5.6 Determinacin de gama Glutamiltransferasa. GGT Mtodo cintico 5.7. Determinacin de aspartato aminotransferasa GOT (ASAT ) . Mtodo cintico 5.8 Determinacin de alanino aminotransferasa GPT ( ALAT) . Mtodo cintico. 5.9 Determinacin de lactato deshidrogenada ( LDH). Mtodo cintico.

UNIDAD VI PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO PANCRATICO. 6.1 Determinacin de lipasa. LPS Mtodo cintico 6.2 Determinacin de - amilasa. AMY Mtodo cintico UNIDAD VII 7. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO CARDACO. 7.1 Determinacin de alanino aminotransferasa GPT. Mtodo cintico. 7.2 Determinacin de creatin cinasa CK. Mtodo cintico. 7.3 Determinacin de lactato deshidrogenada. LDH. Mtodo cintico. PRUEBAS AUTOMATIZADAS Autoanalizador utilizado en Qumica Clnica 8. BIBLIOGRAFA Glosario

PRLOGO La Bioqumica Clnica es un campo multidisciplinario cuya finalidad es la aplicacin de la Ciencia Qumica para contribuir a la resolucin de problemas de salud. La funcin del laboratorio de Bioqumica Clnica es realizar anlisis, tanto cualitativos como cuantitativos, en fluidos corporales como sangre, orina, lquido seminal, lquido cefalorraqudeo, etc. Para que los resultados de dichos anlisis sean tiles a los mdicos en el diagnstico, tratamiento y seguimiento de una enfermedad, stos debern realizarse bajo un estricto control de calidad logrando niveles ptimos de precisin y exactitud, caractersticas deseables en cualquier resultado de diagnstico. Los objetivos del curso son: 1. Que el alumno sea capaz de realizar el anlisis de productos biolgicos incluyendo una adecuada manipulacin de los especmenes, desde la toma y/o recepcin de muestras hasta la entrega de resultados. 2. Que el alumno adquiera una formacin y preparacin en Bioqumica que le permita afrontar los retos que encontrar en su vida profesional, ante el creciente nmero de tcnicas que continuamente se estn desarrollando para la deteccin y cuantificacin de metabolitos de inters en la medicina moderna. 3. Que el alumno realice los procedimientos correctos tanto en forma manual como automatizada utilizando un equipo mecanizado. 4. Que el alumno adquiera los elementos formativos que le permitan desarrollar una actitud y pensamientos crticos, y de independencia en el trabajo. Este proceso de enseanza incluye: planeacin, seleccin, elaboracin y ejecucin analtica, evaluacin y resolucin de problemas con la metodologa empleada, aplicacin e interpretacin de programas de control de calidad, interpretacin de grficas y correlacin de los datos obtenidos con las alteraciones que se presentan en el organismo en los diferentes cuadros patolgicos. Este manual fue elaborado con base en la Norma Oficia Mexicana NOM -166SSA-1-1997 que actualmente se encuentra en revisin Proy- NOM -007-SSA12006, para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos , misma que pretende lograr que los laboratorios clnicos establezcan programas de aseguramiento de la calidad de sus servicios . El curso de la asignatura prctica de Bioqumica Clnica hace nfasis en el control de calidad. Las prcticas estn diseadas con el propsito que los alumnos dispongan de un conjunto de habilidades que les permitan la aplicacin flexible de las tcnicas manuales y adems utilicen equipos semiautomatizados como automatizados, (equipo de uro-anlisis, gasmetro, in selectivo y autoanalizador para qumica clnica que con ms frecuencia se emplean en las actividades propias del mbito profesional.

Los residuos originados en las prcticas permanecern en el laboratorio 301 hasta que sean recogidos y tratados en la facultad de qumica en el programa Unidad de Gestin Ambiental a cargo de la Dra. Elvira Santos Santos. Los residuos biolgico infecciosos como Punzo-cortantes, algodn con sangre, se recolectan y almacenan en los contenedores de deposito temporal (Lab.301) en recipientes rgidos o bolsas de color rojo dependiendo del desecho, con el emblema RPBIs y son llevados cada mircoles por el personal auxiliar de laboratorio o laboratorista al camin de recoleccin de RPBIs. Los residuos como sangre, plasma, suero, paquete globular, materiales con sangre o sus derivados se tratan internamente en el laboratorio de acuerdo a la NOM-087ECOL-SSA1-2002.(12) TRATAMIENTO DE RESIDUOS TXICOS: Los desechos que se produzcan en cada sesin de prctica deben recolectarse en recipientes previamente etiquetados con el siguiente emblema:

Universidad Nacional Autnoma de Mxico Facultad de Qumica Facultad de Qumica RESIDUO ( ) Lquido_______________ ( ) Slido________________ CARACTERISTICA: Corrosivo ( ) Reactivo ( ) Explosivo ( ) Txico ( ) Inflamable ( )

Laboratorio_______________ Responsable______________

_______________________ Fecha
Unidad de Gestin Ambiental

INTRODUCCIN

Los nuevos mtodos analticos se desarrollan con el fin de mejorar la exactitud y la precisin de los mtodos existentes, tambin tiene el propsito de permitir el manejo de equipo automatizado, para reducir los costos de los reactivos o de la mano de obra, o para medir un compuesto nuevo. En cualquier caso, se debe verificar experimentalmente el rendimiento analtico en el laboratorio clnico mismo, aun si se cree que el mtodo nuevo es una mejora con respecto a los mtodos anteriores. La extensin de los experimentos y la interpretacin de los datos van a depender del propsito de la evaluacin y de quien la realiza, pero el fundamento bsico y el diseo experimental son similares en todas las evaluaciones. El proceso de evaluar un mtodo es distinto del proceso rutinario para el control de calidad, despus de haber sido introducido en la rutina diaria. El control de calidad rutinario (diario) es un proceso establecido por medio del cul se detectan los incrementos en los errores analticos de un mtodo con el fin de evitar la liberacin de datos incorrectos de los pacientes. El control de calidad rutinario detecta los errores slo cuando estos son superiores a los errores presentes registrados en el momento que se establecieron los intervalos para los controles. El uso del control de calidad rutinario no le permite al investigador determinar la magnitud de los errores inherentes del mtodo o de decidir si son aceptables. EVALUACIN DE MTODOS En Mxico las metas de calidad las rige el Reglamento de Ley General de Salud , que indica en su artculo 158 los laboratorios debern emplear reactivos y medios de la ms alta calidad y se cuenta con organismos que acreditan la competencia tcnica, como la Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA),adems de CLIA `88. Es necesario experimentar la evaluacin de los mtodos para establecer los errores analticos inherentes del mtodo y relacionarlos con los requisitos mdicos o reglamentarios. Las evaluaciones de los mtodos en la mayora de las veces son realizadas por el personal del laboratorio en los hospitales y laboratorios comerciales. Estas evaluaciones se hacen con el fin de determinar si el rendimiento del mtodo cumple, primariamente con los requisitos de aplicacin mdica dispuestas para el usuario y, secundariamente las metas de calidad especificadas por CLIA88 se cumplen para tener un rendimiento exitoso en las pruebas de aptitud La decisin de aceptar o rechazar un mtodo posible para el laboratorio se debe basar en la capacidad del mtodo para cumplir con los requisitos del usuario final, el mdico, que por otra parte que es quien usa los resultados de la prueba del laboratorio.

Caractersticas del mtodo El paso siguiente en el proceso de seleccin, es la definicin de las caractersticas metodolgicas ideales que permitirn que el mtodo seleccionado tenga buena probabilidad de xito en el laboratorio. Estas caractersticas incluyen la metodologa preferida, que tendr potencialmente la especificidad qumica necesaria (libre de interferencias) y sensibilidad qumica (capacidad de detectar cantidades pequeas o pequeos cambios en la concentracin del compuesto analizado). Tambin es importante la capacidad de usar estndares acuosos para calibrar (libertad de efectos de matriz). La eleccin de reactivos, temperatura, tiempo de reaccin, tiempo de medicin y tipo de medicin (como mtodos de determinacin de un punto, dos puntos o cinticos), son caractersticas de un mtodo que deben definirse. La IFCC abreviatura de Internacional of Federation Clinical Chemistry and laboratory Medicine y AACC asociacin Americana de Qumica Clnica han desarrollado una serie de recomendaciones para los mtodos empleados en qumica clnica, la familiaridad del operador con el procedimiento del mtodo; la estabilidad de los calibradores, controles y reactivos; y la linealidad de la respuesta a travs de todo el intervalo de trabajo. Error aleatorio y error sistemtico Por lo general, los errores que afectan el rendimiento de los procedimientos analticos se clasifican en aleatorios o sistemticos. Los factores que contribuyen al error aleatorio, son los que afectan la reproducibilidad de la medicin. Entre estos se incluyen: (1) la inestabilidad del instrumento, (2) variaciones en la temperatura, (3) variaciones en los reactivos y calibradores (y la estabilidad de la curva de calibracin), (4) variabilidad en las tcnicas de manejo como el pipeteo, mezcla y control de los tiempos y (5) variabilidad en los operadores. Estos factores sobreponen sus efectos entre s a diferentes tiempos. Algunos producen fluctuaciones muy rpidas y, otros, ocurre en perodos ms largos de tiempo. Por consiguiente, el error aleatorio (RE) tiene componentes diferentes de variacin que estn relacionados con la disposicin actual del laboratorio. El componente de variacin dentro de una corrida (c.v .wr) es causado por etapas especficas en el proceso, tales como la precisin en el pipeteo y variaciones a corto plazo de la temperatura y la estabilidad del instrumento. La variacin intradiaria entre corridas (c.v br) es causada por la inestabilidad de la curva de calibracin o por diferencias en recalibracin que ocurren a travs del da, variaciones a ms largo plazo en el instrumento, cambios pequeos en las condiciones del laboratorio durante el da y la fatiga del personal del laboratorio. El componente intradiario de variacin es causado por variaciones en el instrumento que ocurren a travs de los das, cambios en los calibradores y reactivos (especialmente s se abren frascos nuevos cada da) y cambios en el personal de da a da. Aunque no es un componente aleatorio real de variacin, cualquier variacin en la curva de calibracin a travs del tiempo tambin afectar de manera considerable el componente intradiario de variacin. Estos componentes se pueden combinar de tal manera que se puede obtener un clculo de la varianza total del mtodo.

Entre los trminos usados para indicar el error aleatorio se incluyen precisin, imprecisin, reproducibilidad y repetibilidad. En cada uno de los casos se refieren a la dispersin aleatoria de los resultados de las mediciones alrededor de algn punto de tendencia central. El error sistemtico (ES) describe el error que es consistentemente alto o bajo. Si el error es consistentemente bajo o alto en la misma cantidad, independientemente de la concentracin se designa como error sistemtico constante. Si el error es consistentemente bajo o alto en una cantidad proporcional a la concentracin del compuesto analizado, se conoce como error sistemtico proporcional. Los factores que contribuyen al error sistemtico constante son independientes de la concentracin del compuesto analizado, y la magnitud del error es constante a travs de todo el intervalo de la concentracin del compuesto analizado. El error sistemtico constante es causado por una sustancia interferente presente en las muestras o los reactivos, provocando una seal falsa. El error puede ser positivo o negativo. Una reaccin entre una sustancia interferente y los reactivos causada por una falta de especificidad es un ejemplo de error sistemtico constante. Otra causa de un error sistemtico es una sustancia interferente en la reaccin entre el compuesto analizado y los reactivos. Se observa este tipo de error en los mtodos enzimticos que usan reacciones acopladas oxidasa-peroxidasa en las cuales el perxido de hidrgeno formado es destruido por agentes reductores endgenos, tales como el cido ascrbico. Las sustancias interferentes tambin pueden inhibir o destruir el reactivo de modo que queda en cantidad mayor para reaccionar con el compuesto analizado. Una fuente no qumica de error sistemtico constante es el error causado por el uso de blancos inapropiados de la muestra o los reactivos. La causa ms frecuente de error proporcional es la asignacin incorrecta de la cantidad de sustancia en el calibrador. Si el calibrador tiene ms compuesto analizado que la indicada en el rtulo, todas las determinaciones desconocidas darn bajas; una menor cantidad del compuesto que el rotulado provocar un error positivo. El error ser proporcional al error de calibracin original. El error proporcional tambin puede ser causado por una reaccin secundaria del compuesto analizado. El porcentaje de la sustancia a determinar que participa en la reaccin secundaria, ser el porcentaje de error en el mtodo. Error constante calculado a partir de estudios de interferencia El estudio de interferencia mide el error constante causado por la presencia de una sustancia sospechosa de interferir con el mtodo en estudio. Para realizar este estudio se toma una muestra a la cual se le ha agregado el interferente. El volumen de esta adicin debe ser pequeo, menos del 10% del volumen de muestra para que el efecto sobre la matriz de la muestra sea mnimo. Con el fin de compensar la dilucin de la muestra se debe preparar una muestra de lnea de base mediante la adicin de una cantidad igual del solvente usado para el interferente, en otra alcuota de la muestra. A continuacin se deben analizar las dos muestras, por lo menos por duplicado. La diferencia entre los resultados en las dos muestras se puede atribuir a la interferencia causada por la sustancia aadida.

El lmite de cuantificacin (LQ) que es el valor mnimo de la magnitud que puede estimarse con una impresicin aceptada (habitualmente el 10%) (IUPAC). EL lmite de deteccin (LD) que es el valor mnimo de la magnitud para el cual la probabilidad de que el valor estimado no exceda al valor crtico es (habitualmente 0.05). El valor crtico (Lc)que es el valor mnimo de la estimacin de una magnitud para el cual la probabilidad de que el valor verdadero de la magnitud sea cero es (habitualmente 0.05).En el laboratorio clnico, los interferentes ms frecuentes son hemlisis, lipemia e ictericia . Un esquema para estudiar los efectos de la hemlisis consiste en tomar dos muestras de sangre. Una es centrifugada y analizada directamente (muestra de base) y los glbulos rojos del otro tubo son traumatizados fsicamente para romper las membranas celulares con el fin de obtener una cantidad elevada de hemoglobina srica. La muestra hemolizada es analizada despus de centrifugarla. La diferencia entre las dos muestras se atribuye a los efectos de la Se puede simular una hemlisis ligera, moderada o severa dependiendo del volumen de glbulos rojos traumatizados. Este enfoque tiene ms coherencia con los problemas encontrados en el laboratorio, que el enfoque en el cual se aade hemoglobina pura a la muestra. Sin embargo, el procedimiento no es vlido si los glbulos rojos contienen el compuesto analizado. Se pueden estudiar los efectos de la lipemia dividiendo una muestra lipmica en dos porciones; una se analiza directamente y la otra se somete a ultracentrifugacin antes de su anlisis para eliminar las lipoprotenas. La eleccin de sustancias a probar es casi infinita. Para todos los mtodos espectrofotomtricos se debe determinar los efectos de hemlisis, ictericia y lipemia. Tambin se deben ensayar otras sustancias que hayan sido reportadas como interferentes para mtodos similares. El pipeteo debe ser (1) preciso, para que las muestras de lnea de base y las que contienen el interferente reflejen el mismo grado de dilucin y (2) exactas con el fin de aadir una cantidad conocida de sustancia interferente. Nuevamente, resulta importante que la concentracin del compuesto analizado en la muestra est cercana a los niveles de decisin mdica. Se debe aadir la sustancia considerada como posible interferente, de tal manera que su concentracin final sea la mxima fisiolgicamente esperada. Si no se producen errores a esta concentracin tan elevada, se puede asumir que concentraciones menores no afectarn de manera adversa el rendimiento del mtodo. Si el error es demasiado grande a la concentracin mxima de sustancia interferente, es conveniente comprobar las interferencias a concentraciones menores. Una muestra ligeramente ictrica puede ser aconsejable, pero una francamente ictrica, no. Se recomienda que estos estudios de interferencia sean realizados tambin al mismo tiempo con un mtodo comparativo, con el fin de verificar la tcnica experimental. Medidas cinticas. Un mtodo frecuentemente usado para la correccin de la interferencia espectral es la medicin de una tpica reaccin de punto final, como lo es la reaccin cintica de dos puntos. Si se monitorea la absorbancia de una reaccin

colorimtrica no instantnea en funcin del tiempo, se observa una curva de reaccin. Una reaccin de punto final se monitorea a un solo punto de tiempo, cuando la reaccin casi se ha completado .Si no hay interferencias espectrales, la curva de reaccin debera pasar por el origen. Si existe este tipo de interferencia, la curva ser paralela a la original, pero sesgada hacia valores ms elevados debido al color endgeno de la muestra. Si se usa un blanco de muestra para restar el color endgeno, se obtendr una lnea idntica a la de la muestra que no contiene interferencias. En un ensayo cintico de dos puntos, la absorbancia es medida a dos puntos diferentes de tiempo; cuando (1) el desarrollo final de color no ha ocurrido y de hecho puede ser pequeo y, (2) cuando la respuesta de absorbancia versus tiempo es todava lineal. La lectura inicial se toma realmente cuando casi no ha ocurrido formacin de color. De esta manera, cualquier absorbancia a este tiempo es principalmente ocasionada por interferentes espectrales endgenos. Despus de un tiempo corto se toma una segunda lectura cuando se ha formado solamente una pequea cantidad de color y la respuesta de absorbancia versus tiempo es todava lineal .Esta absorbancia por lo tanto incluye la del color endgeno original y la del color producido debido a la reaccin analtica especfica. Al substraer la primera lectura de la segunda, la delta de absorbancia calculada (DA) es causada solamente por el color especfico formado por la reaccin analtica. En la curva estndar basada en los anlisis cinticos se grafica el cambio en la absorbancia (DA) versus la concentracin .En esta curva estndar la presencia de un interferente coloreado, no reactivo, endgeno, no tiene efecto. Por consiguiente no se necesita hacer una medicin separada de blanco de muestra; una reaccin cintica de dos puntos es por s misma un blanco cuando no hay cambio en la naturaleza del interferente durante la reaccin. Esta es una tcnica importante cuando se estn desarrollando anlisis qumicos automatizados en un gran nmero de muestras. Anlisis bicromtico. Muchos instrumentos de uso corriente emplean diferentes tcnicas para la correccin de interferencias espectrales. Esta tcnica involucra la medicin de la absorbancia de una mezcla de reaccin a dos longitudes de onda diferentes simultneamente. Estas son la longitud de onda principal ( )1y otra longitud de onda cercana .2 y, 1 es la longitud de onda a la cual el cromgeno tiene la mxima absorcin. En 2 hay un mnimo de absorcin del cromgeno. Como la reaccin es monitoreada simultneamente a dos longitudes de onda, sta es conocida como anlisis bicromtico. Esta tcnica est basada en la premisa que aunque un compuesto puede dar una interferencia espectral, la absorbancia mxima del interferente ser diferente de la de la reaccin analtica verdadera. Adems, este procedimiento se realiza bajo la presuncin que la absorcin causada por el compuesto interferente es aproximadamente la misma en 1 que en .2 Aunque la absorbancia medida a 1 ser producida por ambas, la reaccin analtica y el interferente, la absorbancia a la segunda longitud de onda ( 2) ser causada solamente por el interferente. El uso de este procedimiento

permite tambin que cada muestra sea utilizada como su propio blanco para el color endgeno. Otro mtodo similar para la correccin de la interferencia de fondo es la medicin de la absorbancia a la longitud de onda primaria Amax y a dos longitudes de onda adicionales, generalmente equidistantes del pico, A1 y A2. Las lecturas de absorbancia a estas dos ltimas longitudes de onda son promediadas par dar la absorbancia de fondo promedio en la muestra. Esta tcnica para la correccin de la absorbancia de fondo de las sustancias interferentes es conocida como la correccin de Allen. Dilucin. Como se discuti en el caso de la turbidez, la dilucin de una muestra que contiene interferentes espectrales puede algunas veces reducir el problema. Se debe ser cuidadoso en no diluir en exceso el compuesto deseado o el cromgeno a una concentracin por debajo del nivel mnimo detectable para ese ensayo. Muchas diluciones deben ser analizadas simultneamente para determinar la dilucin ms efectiva.

Interferencias qumicas Todas las interferencias que se discutieron hasta ahora han sido interferencias espectrales causadas por compuestos que no participan en la reaccin qumica analtica. Sin embargo, muchas interferencias reaccionan con las sustancias analizadas. Los productos de reaccin de estas interferencias generalmente provocan interferencias positivas, aunque se han observado interferencias negativas. Los tipos de interferentes reactivos qumicamente, no especficos pueden variar ampliamente,. El cido rico produce una interferencia positiva, y la bilirrubina y el cido ascrbico producen interferencias negativas en los mtodos de glucosa oxidasa usados para medir la glucosa. La reaccin de picrato alcalino para la medicin de creatinina presentan ambas interferencias positivas (cetonas, protenas) y negativas (bilirrubina). Correccin de las interferencias qumicas La eliminacin de muchos de los interferentes qumicos no especficos se logra frecuentemente por medio de una o ms de las siguientes tcnicas: 1. Diluyendo el interferente. 2. Aumentando la especificidad de la reaccin. 3. Removiendo el interferente. 4. Monitoreando un ensayo por medicin cintica. 5. Monitoreando un ensayo por medicin bicromtica. La dilucin de la muestra es un mtodo efectivo en los casos de los interferentes que no reaccionan a la misma velocidad o producen la misma intensidad de color que el compuesto analizado. La interferencia por protenas se minimiza en muchos analizadores automatizados por una dilucin grande de la muestra.

El aumento de especificidad de una reaccin analtica es a menudo lograda por el uso de enzimas especficas como reactivos. Los ejemplos de este mtodo incluyen: la medicin de glucosa por hexocinasa o glucosa oxidasa, cido rico por uricasa, y urea por ureasa. Las reacciones con base inmunoqumica son tambin usadas para aumentar la especificidad del anlisis. Un ejemplo sera la medida de teofilina por inmunoensayo enzimtico comparado con otros mtodos, los cuales emplean absorbancia ultravioleta. La separacin de un interferente del compuesto analizado puede lograrse por el uso de: una muestra libre de protenas, extraccin lquido-lquido, o cromatografa de adsorcin o particin. Las muestras libres de protenas fueron originalmente preparadas por precipitacin de las protenas del suero y separacin de la muestra libre de protenas por filtracin o centrifugacin. Los mtodos de laboratorio logran confiabilidad diagnstica una vez realizados los protocolos de validacin clnica, a travs de emplear grupo de pacientes en quienes se conoce la presencia o ausencia de niveles normales de lo que cuantifica el mtodo.

1. INFORMACIN SOBRE EL CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CLNICO. El laboratorio clnico es un servicio mdico indispensable, cuya importancia ha ido creciendo y desarrollndose a lo largo de los aos hasta ocupar un lugar central en la medicina. La meta fundamental de los laboratorios clnicos es proporcionar datos confiables acerca de la composicin de muestras obtenidas de pacientes, de tal forma que puedan contribuir al diagnstico, tratamiento y seguimiento de diversas enfermedades. La obtencin de datos verdaderamente confiables, requiere de la rigurosa aplicacin de diferentes tcnicas de control de calidad, teniendo siempre presente que el mejor sistema de control es el que permite prevenir, identificar y corregir los errores. Cuando no se dedica la atencin suficiente a la calidad, se pueden presentar deficiencias serias.(1) Un laboratorio clnico debe tener como uno de sus propsitos principales, la produccin de datos analticos de alta calidad por medio del uso de mediciones analticas que sean precisas, exactas y adecuadas para tal fin; conduciendo esto a resultados confiables. Para concretar este propsito se hace necesario la utilizacin de programas de control de calidad interno y externo, entre otros elementos, se debe recordar que se puede tener buena o mala calidad en todo tipo de sistemas analticos ya sean stos manuales o automatizados, por lo que se debe tener mucho cuidado en ambos casos.(4) La meta de un sistema de control de calidad deber ser que: La variacin en las determinaciones que se llevan a cabo en el laboratorio sea lo suficientemente pequea para que no se afecte la utilidad .(1) La realizacin de cualquier procedimiento analtico puede estar amenazada por cometer un sin nmero de errores, algunos de los cuales pueden llegar a tener consecuencias realmente serias. Actualmente, frente a la demanda creciente de los usuarios del laboratorio clnico (mdicos y pacientes) y como resultado del avance cientfico y tecnolgico, se requiere controlar la operacin total, incluyendo las etapas pre-analtica, analtica y post-analtica.(5)

1.1 ETAPA PREANALTICA Las pruebas de laboratorio que miden un compuesto analizado en un espcimen de sangre u otro fluido corporal, son solicitadas por los mdicos para evaluar el estado del paciente. Se asume que el resultado analtico obtenido es representativo de la concentracin real del compuesto analizado en el paciente. Desafortunadamente, hay numerosos factores que pueden invalidar esta suposicin. Un nmero de errores no analticos pueden tambin cambiar la concentracin de uno o ms compuestos analizados en un espcimen de tal forma que los resultados no reflejan la condicin fisiolgica del individuo. stos factores son llamados colectivamente fuentes de error pre-analtico. De la misma forma

en que al controlar la temperatura, la longitud de onda, y tiempo de incubacin se limitar el error analtico, el error pre-analtico tambin puede ser controlado. Es responsabilidad de los laboratorios tomar medidas que minimicen las fuentes de error, desarrollando procedimientos estandarizados referidos a la preparacin del paciente, la recoleccin de la muestra, los mtodos de transporte y la preservacin de la misma. (6) 1. Causas de Variacin Previas a la Recolecta A) Variables del ciclo biolgico Variacin cclica se refiere a los cambios en la concentracin de los compuestos analizados, que ocurre de forma predecible a ciertas horas del da, semana o mes. El estudio de estos cambios cclicos es llamado "cronobiologa". La variacin rtmica es tpica de muchas funciones biolgicas; la variacin diurna en el metabolismo de drogas y la incidencia de infarto al miocardio son dos ejemplos de la importancia de este campo. La variacin cclica ms reproducible es la circadiana, la cual ocurre durante el transcurso de un solo da. La variacin cclica durante un perodo de tiempo mayor que un da (infradiana), tambin puede afectar los resultados en las pruebas de laboratorio. La variacin circanual, la cual ha sido reportada en algunas sustancias, est relacionada con cambios en la dieta debido a la estacin, o con la variacin del clima. Infradiana:mayor que un da (ejemplo, ciclo menstrual) Circadiana :alrededor de un da Ulfradianos :menmor de 24 hr Pruebas Sujetas a Variacin Diurna Fosfatasa cida * ACTH Catecolaminas Cortisol (y otros esteroides adrenales) Gastrina* Hormona del Crecimiento* Tolerancia a la Glucosa Hierro Osteocalcina* Hormana Paratiroidea* Prolactina* Renina/aldosterona TSH* *Ms alta en pasado meridiano ( PM) y las otras, ms altas en (A.M.)

Pruebas Afectadas por la Ingestin de Alimentos Cloro*

Gastrina Glucagn Glucosa Hormona del Crecimiento Insulina Calcio Ionizado Fosfato * Potasio * Triglicridos pH en Orina *Ms bajo despus de los alimentos; todos los dems, ms altos. (6) B)Variables fsicas relacionadas con el paciente El ejercicio fsico es una causa comn controlable de variacin en los resultados de las pruebas de laboratorio. Dentro de las pruebas qumicas de rutina se ha observado que: el potasio, el fsforo, la creatinina y las protenas sricas son significativamente alterados por un perodo breve de ejercicio. Con el ejercicio regular, hay un aumento en las enzimas relacionadas con la actividad muscular y un aumento en la concentracin de cido rico en sangre. El ejercicio intenso, como correr en un maratn, produce una rpida elevacin en la concentracin del potasio, cido rico, bilirrubina y enzimas musculares, mientras que la concentracin de glucosa y fsforo disminuyen significativamente. En personas sometidas a entrenamiento para competencias de distancias largas, las concentraciones de gonadotropina y esteroides sexuales estn marcadamente disminuidas, mientras que la concentracin de prolactina est aumentada. La postura es una causa de variacin preanaltica fcilmente controlable. En la posicin de pie, se observa que un incremento en la presin hidrosttica causa prdida de agua y electrlitos procedentes del compartimiento del lquido intravascular, lo que a su vez da como resultando un aumento en la concentracin de protenas. (1) Procedimientos para minimizar las variables en el paciente a) Variables biolgicas cclicas. El laboratorio deber determinar cuales de las pruebas realizadas tienen cambios significativos de concentracin, ya sean cclicos o relacionados con la ingesta de alimento. En condiciones ptimas, los especmenes para estas pruebas debern ser colectados tan pronto como el paciente despierte y que est todava en ayunas. Si hay un patrn de variacin ultradiana, como lo hay para la mayora de las hormonas pituitarias, se debern colectar varios especmenes a intervalos mayores del ciclo usual, para proveer una nocin exacta sobre la produccin de hormonas. b) Variables fsicas.

Si se estn colectando muestras para medir compuestos analizados, que son afectados por el ejercicio, es necesario interrogar al paciente para saber si ha realizado ejercicios vigorosos en las ltimas 24 a 48 horas. Cualquier historia de ejercicio vigoroso deber ser anotada en la forma de requisicin e incluirse en el reporte final. Otra alternativa ser pedirle al paciente que regrese despus para la toma de esa muestra. Antes de la toma de muestra el estado de estrs es difcil de controlar; sin embargo, los mdicos debern estar informados sobre aquellas pruebas que pueden estar afectadas, as como de la magnitud del cambio inducido por el estrs, ya sea fsico o mental. Hay casos donde resulta recomendable que el laboratorio solicite asesora especial antes de llevar a cabo pruebas que son severamente afectadas por el estrs del paciente, tales como las pruebas de funcin adrenal o pituitaria, metabolitos de catecolaminas, anlisis de lpidos y prueba de tolerancia a la glucosa. Los efectos provocados por la postura pueden minimizarse pidiendo a los pacientes ambulatorios, que permanezcan sentados por lo menos 15 minutos antes de la extraccin de la sangre. Para los anlisis que sufren alteraciones por la dieta, incluyendo las mediciones de tolerancia a la glucosa, hidroxiprolina, 5-HIAA y los metabolitos de las catecolaminas urinarias, es recomendable proveer al paciente con las indicaciones por escrito, antes de ser programado para la colecta de la muestra. Si pruebas tales como la medicin de renina y aldosterona, tolerancia a la glucosa, orina de 24 horas, grasa en heces de 72 horas, requieren de una preparacin especial del paciente, resulta buena prctica citar entes al paciente antes para entregarle una explicacin detallada en una hoja impresa. (6) 2. Causas de Variacin en la Recolecta de Sangre Tcnicas para la recolecta de sangre El uso incorrecto de los procedimientos para obtener especmenes puede inducir errores significativos en los resultados finales de las pruebas de laboratorio; los errores relacionados con la colecta de muestras en el laboratorio son las causas ms comunes de resultados errneos. En hospitales de enseanza, la flebotoma es llevada a cabo por una variedad de individuos (enfermeras, asistentes de mdicos y estudiantes) quienes tienen un entrenamiento formal limitado o incluso carecen de l, en tcnicas de flebotoma. En la mayora de los laboratorios, los especmenes son colectados usando tubos al vaco y agujas especialmente diseadas, que simultneamente permiten la puncin de la vena y del tapn del tubo. Los tubos para colecta son hechos: de vidrio, plstico los cuales estos ltimos son usados con ms frecuencia; ambos son apropiados para la mayora de las pruebas. Muchos tubos estn cubiertos con silicn, el cual reduce la adhesin del cogulo, permitiendo mejor separacin del suero y de las clulas. Los tapones estn tpicamente hechos de hule. En nios y adultos con difcil acceso venoso, puede hacerse una puncin capilar para la obtencin de la muestra. Ciertos micro tubos especiales, que contienen anticoagulantes pueden llenarse por capilaridad. La contaminacin de la muestra con fluidos de tejido es una causa potencial de preocupacin en todos los

procedimientos de coleccin capilar de sangre, ya que el fluido tisular virtualmente no contiene protenas y, por lo tanto, no tiene compuestos analizados unidos a protenas. Este tipo de contaminacin puede ser minimizado usando solo la sangre que fluye libremente del sitio de puncin. (6) Tipos de muestras de sangre Las diferencias que existen entre sangre arterial, venosa y capilar, son causas ocasionales de resultados errneos. La sangre arterial es la fuente de nutrientes para todos los tejidos del cuerpo y es la mejor muestra para el anlisis de la distribucin de sustancias necesarias para los tejidos corporales como el oxgeno. La sangre venosa difiere de la sangre arterial en que tiene menores concentraciones de sustancias usadas en el metabolismo, tales como oxgeno y glucosa, y ms altas concentraciones de productos de desecho tales como: cidos orgnicos, amoniaco y dixido de carbono. Si sitios especficos como el pie se mantienen tibios, se pueden obtener muestras de sangre capilar que son muy parecidas a las de sangre arterial. En estados de poca perfusin tisular y en los neonatos, sin embargo, hay una diferencia significativa entre la presin parcial de oxgeno (PO2) de la sangre capilar y la arterial. (6) a) Errores relacionados con preservativos y anticoagulantes Los preservativos y anticoagulantes son ampliamente usados para colectar muestras de sangre, orina y otros fluidos corporales. Cuando se extrae sangre del cuerpo y se deja coagular, sta se separa en una fase lquida llamada suero y en un cogulo slido conteniendo clulas sanguneas y fibrina. Si se aade un anticoagulante como la heparina, la fase lquida es llamada plasma. El suero y el plasma son similares en muchos aspectos. El suero difiere del plasma en que carece de fibrina, disminuyendo el total de protena en un promedio de 3 g/L. En la coagulacin, las plaquetas liberan potasio al suero; la concentracin de potasio en el plasma es aproximadamente de 0.2-0.3 mmol/L ms bajo que el potasio en suero. Por razones desconocidas, la concentracin de fsforo es ms baja en plasma por un promedio de 2 g/L. En pacientes con algunos trastornos hematolgicos estas diferencias son exageradas. Con estas pocas excepciones, el suero y el plasma heparinizado son usados indistintamente para pruebas de laboratorio. La seleccin del tipo de muestra depende de la instrumentacin, mtodos de ensayos y de la necesidad de rapidez en los resultados. El EDTA, contenido en el tubo utilizado para la recoleccin de muestras en hematologa, es usado tambin para algunos ensayos qumicos porque la quelacin de los cationes divalentes inactiva muchas enzimas y conduce a cambios in vitro de hormonas peptdicas y lpidos. La quelacin de cationes tales como el hierro, magnesio y calcio, sin embargo, causa una disminucin artificial de los resultados en la mayora de los ensayos colorimtricos y reduce la actividad de enzimas, que requieren cationes activadores (fosfatasa alcalina y creatin cinasa). La contaminacin de muestras con anticoagulantes, especialmente EDTA, es un problema comn en muchos laboratorios. Debido al potencial del EDTA para

interferir en muchos ensayos, los recomendable ser qu los tubos conteniendo EDTA deban llenarse al ltimo. Si se est usando anticoagulante lquido, es importante asegurarse que sea proporcional la cantidad de sangre y anticoagulante. (6) b) Errores relacionados con los tubos separadores de suero Los tubos separadores de suero y plasma son usados por muchos laboratorios para simplificar el proceso de separacin del suero (o plasma) de los elementos celulares. Los tubos separadores de suero y plasma, contienen un gel relativamente inerte e impenetrable, el cual tiene una densidad intermedia entre los elementos celulares y el plasma o suero. Durante la centrifugacin, el gel se levanta desde el fondo del tubo y forma una barrera mecnica que evita que los cambios metablicos afecten las concentraciones plasmticas. Los tubos que contienen estos geles pueden ser centrifugados y almacenados sin ser destapados, reduciendo as el riesgo de producir aerosoles infecciosos y evitando en forma simultnea la evaporacin. Algunos agentes teraputicos se adsorben en el gel, disminuyendo falsamente las concentraciones de antidepresivos tricclicos y ciertas drogas antiarrtmicas como el flecainide. Con estas excepciones, la mayora de sustancias en plasma no son afectadas por el uso de geles separadores. (6) c) Errores relacionados con las tcnicas de recolecta inadecuada Torniquetes. El uso de los torniquetes constituye una importante causa, adems controlable, de variacin en los resultados de pruebas de laboratorio. Los torniquetes son ampliamente usados en flebotomas para bloquear el retorno venoso, causando dilatacin de las venas y haciendo ms fcil la identificacin de un sitio de venopuncin. Los torniquetes a menudo se permanecen colocados durante el proceso de venopuncin asumiendo que la continua dilatacin venosa permitir una colecta ms rpida de la muestra y evitar el "colapso" de la vena. Aunque los torniquetes hacen el proceso de flebotoma ms fcil, la disminucin en el flujo de sangre que stos inducen, causa cambios en los resultados de las pruebas de laboratorio que pueden predecirse. Un minuto despus de aplicar el torniquete, el incremento de presin causa prdida de agua y electrlitos del plasma hacia el espacio del fluido extracelular, produciendo una elevacin en la concentracin de protenas, clulas y sustancias unidas a clulas y protenas. Si un torniquete se deja por 5 minutos, la elevacin en la concentracin puede alcanzar hasta 15%. La magnitud de estos efectos puede diferir entre el primero y el ltimo tubo colectados, mostrando una hemoconcentracin mayor en las ltimas muestras. (6) Hemlisis. La hemlisis ocurre cada vez que hay un trauma en los relativamente frgiles eritrocitos, ya sea durante la colecta o con menor frecuencia despus de la flebotoma. Una causa poco comn de hemlisis, es cuando se lleva a cabo la

flebotoma antes de que se seque el alcohol o cualquier otro desinfectante usado. Frecuentemente, la hemlisis es causada por un flujo turbulento no laminar, durante el proceso de colecta. Dentro de los tamaos de agujas que comnmente se utilizan, la hemlisis no es causada por el uso de agujas muy grandes o muy pequeas. El flujo no laminar ocurre comnmente cuando la sangre se mueve muy lentamente o demasiado rpido a travs de la aguja. Si la sangre se extrae con una jeringa, al sacar el embolo con fuerza o al inyectar la sangre en los tubos usando presin en el embolo, generalmente se produce hemlisis. En forma similar, el flujo de sangre lento de una vena colapsada que es depositado a un tubo con vaco a menudo produce una muestra hemolizada. La turbulencia en un tubo conteniendo sangre tambin puede causar hemlisis despus de haber terminado la colecta; los transportadores mecnicos y centrfugas en mal estado son causas raras de hemlisis. La hemlisis altera los resultados de las pruebas de laboratorio. De manera importante el contenido de los glbulos rojos es liberado, incrementando la concentracin de sustancias intracelulares tales como lactato deshidrogenasa (LD H), potasio y magnesio, mientras que disminuye la concentracin de solutos extracelulares como el sodio. (6) Contaminacin con fluidos intravenosos A muchos de los pacientes hospitalizados,por prescripcin mdica se les administra fluidos intravenosos, los cuales tpicamente tienen una concentracin ms alta de glucosa, drogas y algunos electrlitos, que los que estn presentes en la sangre. La contaminacin con fluidos intravenosos ocurre, cuando la sangre es extrada de una vena conectada a la vena que tiene el catter. Aunque pudiera parecer que una vena en el antebrazo es suficientemente distante del catter, hay una gran cantidad de interconexiones. Cualquier extraccin de sangre de una vena que se encuentre en el mismo lado donde est instalado un catter, corre el riesgo de experimentar contaminacin por fluidos. (6) c)Errores relacionados con la identificacin del correspondiente. paciente y la muestra

Debido a que no hay forma de probar que una muestra sin etiqueta pertenece a un paciente dado, resulta esencial la identificacin apropiada de las muestras. Mientras que el etiquetado puede parecer la parte ms simple de la colecta de muestras, en la mayora de los laboratorios es la causa ms comn de resultados errneos. Muchos errores se cometen cuando se etiquetan muestras de pacientes con nombres similares (6) 3. Causas de Variacin Posteriores a la Recolecta La causas de variacin posteriores a la recolecta son ms fcilmente controladas por el laboratorio que las variaciones relacionadas con la flebotoma, ya que es posible desarrollar criterios para las condiciones aceptables de almacenamiento y manejo de muestras despus de la colecta, durante el tiempo que las muestras estn en posesin del laboratorio. Dentro de las variables en el

manejo de muestras que afectan los resultados de las pruebas estn: transporte, separacin del suero de los elementos celulares y las condiciones de almacenamiento. (6) Transporte de las muestras Errores relacionados con el transporte de muestras. Comnmente las muestras son transportadas por los flebotomistas o por los mensajeros. Una tardanza razonable en la transportacin, por lo general es bien tolerada por la mayora de los compuestos analizados, ya que los cambios metablicos ocurren relativamente despacio a temperatura ambiente. As, la tardanza hasta de una hora no cambia la concentracin de la mayora de los compuestos analizados. La glucosa, a menudo considerada una de las sustancias ms lbiles en la sangre disminuye de 2 a 3% por hora, a temperatura ambiente, en tubos sin inhibidores glucolticos como el fluoruro. Los productos del metabolismo (como lactato, amonio y el ion hidrgeno) se acumulan en el plasma despus de la toma de la muestra, a menos que las reacciones enzimticas sean retardadas. (6) Procedimiento para minimizar errores de transportacin Para minimizar la variacin posterior a la colecta, los especmenes deben ser entregados y almacenados rpidamente despus de la toma de muestras. Los compuestos analizados que estn sujetos a cambios de concentracin in vitro a temperatura ambiente, inmediatamente deben ser transportados en hielo al laboratorio. Las instrucciones de manejo deben ser claras; en muchos casos, las muestras son colocadas incorrectamente sobre hielo, transportadas sobresaliendo de un recipiente con hielo o sumergidas en hielo sin agua. Debido a que un slido conduce calor ms lentamente que un lquido, las muestras manejadas de esta manera, no se enfriarn tan rpido y pueden mostrar cambios en la concentracin del compuesto analizado. Aunque el enfriamiento de las muestras durante su transporte minimiza muchos cambios artificiales en la concentracin de compuestos analizados, el enfriamiento tambin incrementa la liberacin de potasio de las clulas. Para una sustancia que sufre cambios en la concentracin debidos al metabolismo in vitro, debe indicarse un tiempo especfico tolerable de retraso. (6) Procesamiento de muestras Errores originados debido al procesamiento incorrecto de las muestras La centrifugacin es el mtodo ms comnmente usado para la separacin inicial del suero y las clulas. En general, la centrifugacin de muestras por 5 a 10 minutos a 1000-2000 G es adecuada para la completa separacin del suero y eritrocitos, incluyendo las muestras que contienen geles separadores de suero o plasma. Las muestras para obtener suero deben ser centrifugadas nicamente hasta que la formacin del cogulo sea completa (al menos 20 a 30 minutos despus de su colecta). Se debe tener la precaucin de revisar que realmente el cogulo se haya formado, ya que puede haber razones fisiolgicas para que

ocurran tiempos prolongados de formacin del cogulo. Por ejemplo, las muestras de pacientes de dilisis pueden continuar coagulndose por horas despus de la colecta debido a la heparina empleada en la preparacin de los pacientes para dilisis. Con tubos que no contienen geles separadores, es necesaria una etapa adicional para completar la separacin. Antes de la centrifugacin, los objetos tales como perlas de vidrio, tapones o cualquier otro objeto mecnico puede ser adicionado a los tubos para realizar la misma funcin que el gel. El suero debe ser separado de las clulas, de otra manera, las clulas sanguneas continuarn llevando a cabo sus funciones metablicas y alterarn la composicin del espcimen. (6) Almacenamiento de muestras Errores originados debidos al almacenamiento inadecuado de muestras Una vez que el suero o plasma ha sido separado de las clulas, la mayora de las sustancias en un perodo de 2-3 das muestran pequeos cambios en la concentracin cuando se mantienen a 4 Para com puestos analizados lbiles, C. incluyendo, enzimas y algunas otras sustancias, las muestras deben ser congeladas para prevenir cambios relacionados con el almacenamiento. Los compuestos analizados que pueden ser intrnsecamente estables en almacenamiento, tambin pueden cambiar en presencia de otros compuestos. La evaporacin puede incrementar la concentracin de la muestra. Cuando una muestra no est cubierta, la velocidad de evaporacin es afectada por la temperatura, humedad, movimiento del aire y el rea superficial de la muestra. (6) Procedimientos para minimizar errores por almacenamiento. Los errores por almacenamiento pueden ser evitados seleccionando adecuadamente la hora, la temperatura y las condiciones de almacenamiento. La mayora de los compuestos analizados son estables, cuando se almacenan refrigeracin durante 72 horas. Si un compuesto analizado no es estable, las muestras deben ser congeladas, hasta su anlisis. La mayora de especmenes pueden almacenarse a -70 sin que sean afectadas las concentraciones de los C compuestos analizados, ms que cuando sean congelados por varios aos. A las temperaturas estndares de congelacin de 10 a 2 0 C, la mayora de las sustancias sern estables por perodos ms cortos. Debe evitarse la descongelacin y recongelacin repetidas de muestras; esto es especialmente problemtico con los congeladores modernos "libres de escarcha", los cuales peridicamente incrementan la temperatura de congelacin para permitir la fusin de la escarcha. Los compuestos analizados que son susceptibles a ciclos repetidos de congelacin y descongelacin, como el complemento, debern ser almacenados en otro tipo de congeladores. Las muestras congeladas deben ser descongeladas lentamente a temperatura ambiente o en un bao de agua a 37 C, y entonces ser mezcladas meticulosamente antes de su anlisis. (6)

Criterio para el rechazo de especmenes Para evitar el reporte de resultados falsos, cada laboratorio debe establecer el criterio para el rechazo de especimenes. Un espcimen debe ser rechazado cuando los resultados obtenidos en su anlisis no representan el estado del paciente. La causa ms comn de rechazo de un espcimen se origina por una identificacin inadecuada. Los especimenes debe tener el nombre del paciente y nmero de identificacin tanto en la muestra como en la requisicin. Los especimenes que no son extrados por el personal del laboratorio debern ser cuidadosamente revisados antes de ser aceptados en el laboratorio. En especmenes que requieren manejo especial, las causas ms comunes de rechazo son la colecta y/o transporte inadecuado. Cada laboratorio deber tener una lista de muestras alternativas aceptables para cada prueba; por ejemplo, el manual del laboratorio puede sugerir la colecta de suero para una prueba en particular, pero una muestra de plasma heparinizado puede ser una alternativa aceptable. Si las muestras contienen otros anticoagulantes o preservativos, deben ser rechazadas (aunque sean tiles para otros anlisis). Cuan las muestras se manejen en tubos que contienen anticoagulantes o preservativos, se indicar la proporcin hay entre los mismos . Esto es ms crtico con preservativos en soluciones lquidas, pero puede ocurrir tambin con anticoagulantes en polvo. Los tubos que no tengan la proporcin apropiada no deben ser aceptados para anlisis. Para pruebas que requieren una preparacin especial del paciente y si sta no se llev a cabo, las muestras deben ser rechazadas. Si una prueba es afectada por hemlisis, los especmenes hemolizados deben rechazarse. As mismo, si el resultado de una prueba es afectado por lipemia (y la muestra no puede ser clarificada por ultra centrifugacin antes del anlisis), este resultado de la prueba no deber ser reportado. Aunque muchos mdicos se quejen cuando el laboratorio no les reporta el resultado de las pruebas que solicitaron para sus pacientes, si hay alguna duda a cerca de la validez de un resultado este no debe ser reportado. Los resultados errneos pueden conducir al tratamiento inadecuado del paciente. (6) 1.2 ETAPA ANALTICA En la fase analtica se realizan las mediciones y observaciones en funcin de los procesos o protocolos que cubre el laboratorio. Cada procedimiento de anlisis describir no slo las mediciones y observaciones implementadas en el laboratorio, sino tambin la verificacin de las caractersticas de ejecucin, que pretende la persona que elabor el procedimiento o el fabricante del sistema analtico. Los procedimientos, materiales de sistema de control, varan segn la especialidad. Algunas veces los valores obtenidos son variables continuas (mtodo cuantitativo), en otros casos las variables son discretas (semicuantitativas y cualitativas), pero en todos los casos, en la fase analtica se debe considerar la medicin u observacin y un procedimiento de control. La seleccin del procedimiento se basa en los criterios de practicabilidad y confiabilidad. Los aspectos de practicabilidad incluyen la educacin y el entrenamiento requerido, disponibilidad de reactivos, los requerimientos instrumentales, el tiempo de

ejecucin, el costo y la seguridad. El personal encargado de elaborar los procedimientos con base en un estndar de operacin, debe cuidar estos aspectos al igual que la industria que los adapte a su versin comercial y es importante tomarlos en cuenta antes de seleccionar un procedimiento que se vaya a implementar en el laboratorio. Los criterios de confiabilidad describen la ejecucin analtica del mtodo cuando se utiliza en condiciones rutinarias y son los siguientes: la exactitud en la ejecucin, la precisin (expresada como una desviacin estndar o coeficiente de variacin), la veracidad (expresada como desviacin), la linealidad, la especificidad analtica, la interferencia analtica, el lmite de deteccin, el intervalo de medicin y el error total. Las caractersticas anteriores pueden variar de un laboratorio a otro, ya que la implementacin de cada uno de ellas modifica las condiciones ptimas. La etapa o fase analtica en qumica clnica, tambin incluye otros aspectos como son: la calibracin, los estndares de calibracin, los mtodos de medicin, la capacidad de rastrear los resultados para validarlos, los clculos para los resultados, la utilizacin de curvas de medicin, el uso de relaciones tericas para algunas magnitudes, las transformaciones de resultados para hacerlos ms informativos al mdico, el uso de computadoras y analizadores, los procedimientos que permiten monitorear la ejecucin de un procedimiento de medicin con el propsito de una accin correctiva, el uso de materiales o sueros control y la preparacin del mismo, el establecimiento de los lmites de control, la realizacin de grficas de control, la interpretacin de las mismas, el uso de reglas de control, el archivo de todo lo relativo al control de calidad para posteriores requerimientos, entre otros aspectos.(7) 1.3POST-ANALTICA La preservacin de la calidad post-analtica es el proceso para verificar la calidad en todos los procedimientos que se llevan a cabo cuando el reporte sale del laboratorio y queda en manos del mdico o profesional al cuidado de la salud. Adems de utilizar intervalos de referencia correctos, las reas de preservacin de la calidad post-analtica incluyen: Verificacin de los clculos en los reportes finales. Revisin de los resultados de la prueba para detectar posibles errores de trascripcin. Que los reportes sean fciles de leer e interpretar. Procedimientos para informar al mdico de resultados que requieran de atencin inmediata. Vigilar que se reporten en el momento preciso los valores en el expediente del paciente. Verificar que el medico interprete en forma correcta las pruebas de laboratorio. Mantener una interaccin constante con el personal responsable de la institucin, con el fin de asegurar que el paciente reciba cuidados directos de buena calidad como resultado de las pruebas de laboratorio. En general, la vigilancia de esta parte de la preservacin de la calidad se realiza de dos maneras. Estas observaciones suelen relacionarse con reportes de

laboratorio incorrectos o con que transcurre demasiado tiempo, desde que se solicita la prueba de laboratorio hasta que se reciben los resultados finales. El otro tipo de vigilancia de la calidad en esta rea, se practica mediante la valoracin continua del impacto de los resultados y procedimientos del laboratorio dentro de la institucin en la cual brinda sus servicios. El objetivo de estas valoraciones continuas es promover la excelencia en los cuidados para los pacientes, por medio de las relaciones humanas con todos los departamentos de la institucin. Los programas de preservacin de la calidad a nivel institucional toman la forma de crculos de calidad, comits para preservacin de la calidad o comits revisores. El objetivo de estos grupos no es resolver problemas sino evitar que ocurran. Adems es necesario que el laboratorio tenga algn mtodo para preservar en forma continua la calidad, verificando peridicamente su capacidad para funcionar como un departamento de buena calidad. Esto puede incluir la evaluacin de los espacios disponibles en el laboratorio para asegurar eficacia en los servicios, revisar el grado de preparacin del personal y apoyarlo, para que participe en actividades de actualizacin de conocimientos y continuar con su formacin profesional. Todos los miembros del personal de laboratorio son responsables de que se preserve la calidad dentro del mismo. Esto ser una forma de convivencia y una actitud evidente en todos los niveles de prctica. La calidad debe extenderse ms all de los confines fsicos del laboratorio e incluye la responsabilidad de los servicios hacia cualquier mdico que ordene una prueba y una preocupacin permanente para que el paciente reciba tratamiento eficaz como resultado de los datos que arroja el laboratorio.(5) Una vez que se propicie un aseguramiento de la calidad de los estudios en cada una de las etapas anteriores, se podrn obtener resultados concretos respaldados con bases slidas, es decir, se podr afirmar entonces que se tiene un laboratorio con la adecuada estructura operativa y administrativa.

1.4 FLEBOTOMA PUNCIN VENOSA 1.0 INTRODUCCIN La flebotoma constituye una de las etapas ms importantes en el trabajo del laboratorio clnico. Por una parte representa el primer contacto entre el laboratorio y sus pacientes, y respecto a la muestra sangunea: la enorme importancia que conlleva una muestra apropiadamente colectada, la seguridad de su origen, y el correcto envasado y transporte constituyen factores fundamentales en la evaluacin e informe de los exmenes a realizar.(11) El organismo utiliza la sangre para el transporte de oxgeno, alimento, residuos y otros materiales que hay en el interior del cuerpo, y tambin para regular la temperatura corporal, los lquidos y el equilibrio cido bsico. Debido a las mltiples funciones de la sangre dentro del cuerpo, los exmenes de sta o de sus componentes pueden suministrar indicios claves para el diagnstico de muchas condiciones mdicas. La sangre est compuesta de una porcin lquida (plasma) y de una porcin celular; el plasma contiene varias substancias que estn disueltas en el lquido. El suero es lo que queda, cuando el fibringeno se ha separado del plasma (lquido que queda despus de que se deja coagular la sangre en un tubo de ensayo). La porcin celular de la sangre consta principalmente de glbulos rojos, pero tambin tiene glbulos blancos y plaquetas.(8) Los tubos al vaco han reemplazado a las jeringas. Estos tubos pueden estar siliconados para evitar la hemlisis de la muestra, vienen preesterilizados por irradiacin y presentan tamaos de 2 a 30 mL. Durante la recoleccin de la sangre y hasta que el suero es separado de los glbulos rojos, debe reducirse la posibilidad de hemlisis (utilizando agujas de calibre adecuado, tubos limpios y secos, un mezclado suave, etc.) ya que la hemlisis produce la elevacin in vitro de la concentracin de los metabolitos del suero, al liberarse estos de los eritrocitos, p.ej. fsforo , sodio, hemoglobina, protenas totales, lpidos, enzimas, bilirrubinas, etc., tambin puede provocar un efecto de dilucin de los componentes qumicos del suero, al liberarse sustancias del interior de los eritrocitos.(9) Si se toma varias muestras de sangre, con tubo al vaco y una sola puncin venosa hay que tener precaucin de poner los tubos en un orden definido para evitar la contaminacin cruzada entre tubos. El orden recomendo de la toma, cuando se efecta una recoleccin mltiple de muestras es el siguiente: Tubos sin anticoagulante (Rojo). Tubos para pruebas de coagulacin. (Azul). Tubos con otros anticoagulantes (Lila, Verde, Verde-Gris y Amarillo).(10) Cuadro I

TUBOS DE FLEBOTOMA Y SU APLICACIN Tipo de Anticoagulante Tubos de flebotoma Plasma. Citrato. Plasma. EDTA. Plasma. Heparina. Plasma. Citrato. Agentes antiglucolticos Suero. Yodoacetato. Muestras Color del tapn Azul. Lila. Verde. Negro. Bases qumicas Aplicacin

Captura calcio. Captura calcio. Inhibe trombina. Captura calcio.

Coagulacin. Hematologa. Qumica. Coagulacin.

Gris.

Plasma parcial. Fluoruro. Tubos especiales Suero. Ninguno. Suero. Suero. Ninguno. Separador de suero.

Gris.

Inhibe la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogensa. Inhibe la enolasa.

Glucosa, cido lactico Glucosa.

Azul. Brillante. Marrn. Gris/rojo.

Libre de contaminantes. Libre de plomo. Barrera de gel.

Oligoelementos, metales pesados. Plomo. Qumica.(10)

Sistema de tubo colector(9)

CUADRO 1

2.0 OBJETIVOS Definir y realizar los procedimientos necesarios para minimizar los errores en la toma de muestras. Definir y aplicar adecuadamente el procedimiento para la puncin venosa.

Validar la enorme importancia para obtener una muestra apropiadamente colectada, su correcto envasado y transporte. Realizar la puncin venosa entre los alumnos y utilizar el modelo brazo mecnico para manejo de material utilizado en la punci

3.0 MATERIAL Para desinfectar la piel: Alcohol isoproplico al 70%. Algodn. Gasas. Para puncin de la vena Ligadura de goma de ltex (2-5 mm de dimetro por 35-40 cm. de largo). Tubos al vaco correctamente identificados. Soporte para tubos VACUTAINER Agujas desechables estriles calibre 20, 19 o 18.(9)
recipiente para desechos punzo cortantes bolsas rojas para desechos biolgicos

4.0 CONDICIONES DE LA TOMA DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA Es necesario que la persona que va a tomar la muestra adopte actitud de confianza, autoseguridad y equilibrio. Conocer y realizar los procedimientos necesarios para minimizar los errores en la toma de muestras. Debe explicar brevemente al paciente las maniobras que va a realizar para obtener la mayor colaboracin posible. Debe tranquilizarse al paciente para disminuir el estado de estrs. Revisar que todo el material est listo (tubos rotulados, torundas de algodn, alcohol, ligaduras, jeringa, gradilla, tapones). El paciente y el operador deben estar en posicin confortable y en un sitio con buena iluminacin. El paciente debe estar sentado en una silla y debe extender el brazo sobre el borde de una mesa, encima de una toalla desechable, para tener acceso fcil y cmodo a la fosa antecubital. Evitar el uso de bancos altos sin respaldo. Es necesario tener en cuenta el tipo de anlisis, el volumen de la muestra y la edad del paciente.

Para volmenes pequeos de muestra es recomendable utilizar el lbulo de la oreja, pues en caso de utilizar los dedos de la mano se corre el riesgo de infecciones por contaminacin en el trabajo de laboratorio. Para un volumen mayor, el sitio ms adecuado es la vena que se encuentra en el pliegue anterior de la flexin del codo, se recomienda utilizar la vena mediana baslica o ceflica ver la Figura1 En los pacientes obesos las venas que se observan azulosas son demasiado superficiales y pequeas y es mejor no utilizarlas. Es conveniente que el paciente no mire mientras se est realizando la puncin.(9)

5.0 SELECCIN DEL SITIO DE PUNCIN FIGURA 1

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

VENAS SUPERFICIALES DEL BRAZO V. Ceflica. V. Baslica. V. Media baslica. V. Mediana ceflica. V. Radial accesoria. V. cubital superficial. V. Radial superficial.(9) 6.0 PROCEDIMIENTO PARA LA PUNCIN VENOSA 6.1 DESARROLLO DE LA PRCTICA:

Verificar que las etiquetas coincidan con la solicitud de las pruebas. Se identifica al paciente comprobando su nombre completo y fecha de nacimiento. Si se encuentra inconsciente, debe de verificarse su identidad a travs de una enfermera o un familiar. No se debe extraer muestra alguna sin identificar adecuadamente al paciente. 3. Si se solicita una muestra en ayunas, debe comprobarse que el paciente no ha ingerido alimentos. Hay que dirigirse al paciente e informarle sobre el procedimiento. 4. Se debe colocar adecuadamente al paciente, segn se encuentre sentado o en decbito prono, para tener acceso fcil a la fosa antecubital. 5. Se debe preparar todo el material, incluidos los tubos, la ligadura, los objetos para limpiar la piel, las jeringas; cuando sea necesario, la aguja estril y el dispositivo para fijarla. 6. Se solicita al paciente que cierre el puo para que las venas resulten ms palpables. 7. Se selecciona la vena adecuada para la puncin (fig. 1 ) 8. Se limpia la zona de la puncin con una torunda humedecida con alcohol isoproplico al 70%. Se comienza en el punto de la puncin y se prosigue la limpieza hacia fuera siguiendo un movimiento espiral. 9. Se aplica un torniquete varios centmetros por encima de la zona de puncin. No dejarlo ms de un minuto. 10. Se fija la vena tanto por encima como por debajo del lugar de puncin, con ayuda de los dedos pulgar y medio o ndice y pulgar. Se realiza la venopuncin: a) se penetra la piel con la aguja formando un ngulo de 15 con el brazo y con el bisel hacia arriba, se sigue la direccin de la vena; b) se introduce la aguja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias. No hay que enterrar la aguja; c)si se utiliza una jeringa , se tira hacia atrs del mbolo, con tensin lenta y uniforme a medida que la sangre va fluyendo en su interior; d)si se utiliza un tubo al vaco, en cuanto la aguja haya penetrado en la vena se dirigir el tubo todo lo posible hacia delante apoyndose en el dispositivo de sujecin (de la misma forma en que se introduce el mbolo de una jeringa). Al mismo tiempo mantenga firmemente la aguja en su lugar. Una vez que se haya llenado el tubo, se retira cogindolo por su extremo y tirando suavemente de l. Se mezcla la sangre con el anticoagulante por inversin suave. Si la muestra ha sido extrada con jeringa se transferir la sangre a los tubos correspondientes despus de retirar la aguja.
1. 2.

7.0 CRITERIOS DE LABORATORIO PARA ESPECMENES INACEPTABLES Las causas ms frecuentes de rechazo de especmenes sanguneos son:
1.

Identificacin inadecuada. Cada laboratorio debe determinar la cantidad mnima de informacin del paciente que debe ser incluida en la solicitud de laboratorio y en el recipiente de la muestra. Esta informacin incluye generalmente nombre, direccin, habitacin, nmero de identificacin, sexo , edad. El flebotomista debe verificar visual y verbalmente la identidad del

paciente, comparando su nombre con el de la pulsera de identificacin, la prueba requerida y las etiquetas. El tubo y la solicitud de laboratorio deben volverse a controlar para verificar su identidad luego de ser recibidos. Las diferencias entre el nombre de la solicitud del laboratorio y el envase de la muestra es causa de rechazo de sta.
2.

Volumen de sangre inadecuado recogido en tubos o jeringas con aditivo. La cantidad de aditivo adicionada a un tubo al vaco presupone que ste se llenar totalmente con sangre. Si se extrae menos sangre de la requerida, la cantidad excesiva de aditivo tiene el potencial de afectar adversamente la exactitud de los resultados de las pruebas. El EDTA y citrato de sodio para hematologa y coagulacin son inaceptables con menos del 100% del llenado del tubo. No se han investigado recomendaciones de tolerancia absoluta para otros aditivos. Hasta ahora, el lineamiento solamente puede alterar sobre los posibles efectos perjudiciales de los aditivos en exceso. Utilizacin de tubos de recoleccin inadecuados. En general, el suero es la muestra preferida para la mayora de los anlisis bioqumicos. Los tubos de fluoruro de sodio diseados para la muestra de glucosa son inapropiados para la mayor parte de los otros procedimientos. Los agentes quelantes son inaceptables para las determinaciones enzimticas la mayora de la veces. La heparina es tal vez el anticoagulante que menos afecta los procedimientos de laboratorio, aunque esto depende en gran parte del mtodo. Hemlisis. La hemlisis puede ser el resultado de una venipuntura difcil o de un manejo impropio del espcimen recolectado. La hemlisis tambin puede resultar de un proceso de la enfermedad que causa la destruccin intravascular de los eritrocitos. La hemlisis visible es inaceptable (mayor a 200 mg/L de hemoglobina) cuando se analizan estas sustancias utilizando ciertos mtodos. El grado de interferencia depende del grado de hemlisis, la concentracin de la variable analtica y la metodologa empleada. Transporte inapropiado. Las muestras para determinacin de cido lctico, gases en sangre, amonio y otros procedimientos donde existe una significativa susceptibilidad de stas al deterioro, no deben ser analizadas si no son transportadas al laboratorio en hielo y dentro de un tiempo preestablecido. Tiempo preanaltico permisible. Cuando el tiempo mximo permisible es excedido, deben tomarse medidas. La falsificacin de los resultados ser asumida mdicamente. El responsable del laboratorio marcar el resultado obtenido con una nota apropiada, o se negar a llevar a cabo la prueba. La ltima medida es especialmente aconsejable cuando la conclusin mdica

3.

4.

5.

6.

puede deducirse del resultado, lo cual es una desventaja para el paciente.(9)

1.5 ESTUDIO DE LA VARIACIN EN CONDICIONES DE RUTINA (VCR) 1.0 INTRODUCCIN Todos los laboratorios de salud deben tener un sistema para valorar la calidad de su trabajo. La experiencia ha demostrado que entre los laboratorios que han aceptado esta recomendacin, existen muchos que han elegido mtodos de ensayo de la variacin de los resultados que persiguen ms la satisfaccin y la seguridad que la informacin veraz y completa sobre su calidad. Existen tres posibles causas de variacin en el laboratorio de la salud. Una de ellas es la debida a errores al azar. Como ejemplos pueden citarse: Error en la lectura de los instrumentos. Errores aleatorios en los clculos. Errores de trascripcin incluyendo la transposicin de nmeros. Colocacin incorrecta de la coma decimal. El uso de un espcimen incorrecto del paciente debido al intercambio de especimenes. El uso de un reactivo o patrn preparado incorrectamente. Las otras dos causas de variacin son la precisin: concordancia entre los resultados de una serie de mediciones. Y la exactitud: concordancia entre la medida de una serie de mediciones y el valor verdadero. VARIACIN EN CONDICIONES PTIMAS: La variacin de las condiciones ptimas (VCO) es la menor variacin que puede obtenerse para un mtodo analtico concreto en un laboratorio individual. Deben realizarse aproximadamente 20 anlisis para obtener la (VCO). El objetivo es intentar repetir los anlisis en las condiciones analticas tan ideales y constantes como sea posible. Han de aplicarse estrictamente todas las medidas preventivas necesarias. Algunas son: Usar el mismo aparato para todas las determinaciones. Usar reactivos recin preparados y verificados. Realizar los anlisis sobre un material homogneo y estable. Verificar las lecturas del instrumento y los clculos. Realizar los anlisis en el menor intervalo de tiempo posible. Controlar cuidadosamente la temperatura y el tiempo. Evitar cambios bruscos en las condiciones ambientales; luz, temperatura, humedad. Asegurarse de que todos los reactivos estn correctamente mezclados. Utilizar personal experimentado.(13) En resumen en el tratamiento de los resultados deben calcularse la media y la desviacin estndar y ms importante an, deben representarse grficamente los resultados individuales en una grfica control como lo indica la siguiente grfica :

Grfica de control en ptimas condiciones de variacin.(M: media ; S: desviacin estndar). En est grfica de control se han trazado cinco lneas horizontales, una corresponde al valor medio de los valores observados, y dos lneas por encima y dos por de bajo de la media correspondiendo a dos y tres desviaciones estndar de la media. En la valoracin de la VCO deben buscarse tendencias y anormalidades en la distribucin de los resultados, buscar su causa y resolver el problema antes de pasar al siguiente nivel.(13) VARIACIN EN CONDICIONES DE RUTINA: Otra etapa en las tcnicas de control de calidad es determinar la varianza en condiciones de rutina (VCR). Esta es la variacin de los resultados de una tcnica cuando el material es analizado en condiciones de trabajo similares a las que se encontrar cotidianamente. Este tipo de control consta de dos partes. La primera se refiere al anlisis del material de control cuando previamente se conocen los valores del mismo (VCRC). La segunda se refiere al anlisis de materiales cuyos valores no son conocidos (VCRN). Con frecuencia la variacin en condiciones de rutina ser mayor que la obtenida en condiciones ptimas. Para la mayora de las tcnicas colorimtricas la razn entre ambas variaciones es de 2. Esto se debe a la dificultad de mantener las condiciones analticas en situacin totalmente estable durante un perodo prolongado de tiempo en condiciones de rutina. Dentro de la variacin en condiciones de rutina con valores desconocidos deben tomarse en cuenta tres componentes esenciales: Utilizar ms de un nivel de concentracin del material de control. Asegurarse de que los valores esperados son desconocidos para el operador. Colocar el material de control al azar dentro de las series de anlisis de la misma forma en que se colocan los sueros de los pacientes.(13)

Para el estudio de la variacin en condiciones de rutina se utilizar la determinacin cuantitativa de albmina. La albmina tiene varias funciones en el torrente sanguneo incluyendo nutricin, mantenimiento de la presin onctica y transporte de sustancias como Ca ++, bilirrubina, cidos grasos, drogas y esteroides. Valores bajos en suero pueden resultar de mal nutricin en enfermedades del hgado, un incremento en el catabolismo, incremento en la excrecin en, orina o heces, o un cambio de distribucin entre los compartimientos intravascular y extravascular. Valores altos en suero pueden resultar de deshidratacin o quemaduras severas.(5)

2.0 OBJETIVOS Proporcionar resultados de anlisis con exactitud y con precisin, de tal manera que se puedan obtener conclusiones y tomar decisiones basadas en una informacin que tenga niveles aceptables de error. Realizar 20 repeticiones de una muestra control comercial determinando protena o cualquier analito en condiciones de rutina y determinar el coeficiente de variacin que debe ser menor a 5%. El analito a evaluar se le informar al alumno antes de la prctica. analizar estadsticamente los resultados obtenidos de la misma muestra para establecer el grado de precisin y exactitud. Determinar las fuentes de variacin analtica ms frecuentes en el trabajo del laboratorio. Manejar e interpretar adecuadamente las cartas control de Levey-Jennings.

GRFICAS Y CARTAS DE CONTROL : Cada equipo reportar los resultados obtenidos en el procedimiento de la determinacin de albmina en el pizarrn. Los datos de los controles de cada equipo representaran los anlisis diarios de las mezclas de control de calidad de un laboratorio (cada equipo representara un da diferente de un mes). A partir de los datos reportados: Calcule la media, la desviacin estndar y el coeficiente de variacin de sus resultados. Grafique sus resultados en las cartas control de Levey-jennings, resaltando los lmites de alerta (x 2s). Realizar la carta de control de calidad: NOMBRE__________________________________________ MATERIA______________ EQUIPO__________FECHA____ COMPONENTE_____________________________________ METODO_______________UNIDADES__________________ LONGITUD DE ONDA______nm. APARATO______________ (SIGUIENTE TABLA 1)

tabla1
FECHA No. DE DETERMINACIONES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 . . . . . . . . . . . . . . 25 n= VALORES INDIVIDUALES Xi DESVIACIONES DEL CUADRO DE LAS 2 VALOR MEDIO Xi-X DESVIACIONES (Xi-X)

Xi=

(Xi- X)2

Calculado el:__________Firma:________________

Cul sera su conclusin, respecto de la precisin con la que se trabaja en el laboratorio?

Superior Lmites de alerta Inferior

x +

2s

2s

Superior Limites de control Inferior

+ 3s

3s

Realizar grafico de Levey-Jennings:

NOMBRE__________________________________________ MATERIA______________ EQUIPO__________FECHA____ COMPONENTE__________ ______________________ MTODO_______________UNIDADES__________________ LONGITUD DE ONDA________APARATO________________ DATOS DEL CONTROL UTILIZADO: MARCA: NIVEL: LOTE: CADUCIDAD:

(SIGUIENTE GRFICO 2)

Grfico 2 de Levey-Jennings
x

+ 2S

+ 1S

MEDIA

- 1S

- 2S

UNIDAD II 2. PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO RENAL 2.1 CIDO RICO Mtodo enzimtico colorimtrico 1. INTRODUCCIN El cido rico en los mamferos es el metabolito final del catabolismo de las bases pricas y su elevacin est asociada a la gota, es decir, los reumatismos hiperuricmicos. En los pacientes con tal disfuncin, aparecen cristales de cido rico en las articulaciones y en los tendones, lo que origina las manifestaciones reumticas caractersticas. Niveles altos de cido rico estn tambin asociados a patologa renal por retencin de productos nitrogenados, asocindose en estos casos a valores tambin altos de urea y de creatinina. 2. OBJETIVO Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de cido rico en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de cido rico y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de cido rico en una muestra biolgica.

3. FUNDAMENTO DEL MTODO El cido rico es oxidado por la uricasa a alantona y perxido de hidrgeno que en presencia de POD y 4-AF y DCPS forma un compuesto rosceo. Uricasa c. rico + 2H20 + 02 POD 2H202 + 4AF + DCPS 4-AF = 4 aminofenazona DCPS = 2,4,diclorofenol sulfonato Guardar en refrigeracin a 2-8 C. Estos productos son, solamente, para uso de laboratorio y pruebas "in vitro". 4. PREPARACIN 4.1MUESTRA CLNICA MUESTRA Suero, plasma u orina. Orina: Diluir la orina al 1:10 con agua destilada, mezclar y seguir la tcnica. Multiplicar el resultado por 10. Quinona + 4H20 Alantona + CO2 + 2H202

4.2 REACTIVOS Y MATERIAL 1Micropipeta de 1 mL 1Micropipeta de 50 L. 1Piseta con agua desionizada o destilada 2Celdas de plstico de 3 ml 4 Tubos de vidrio de 13X100 Puntas para micropipeta. Gradilla. EQUIPO Fotmetro con filtro de lectura de: 520 nm. Centrfuga

CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Fosfatos pH 7.4, 50 mM Sol. Tampn 2-4 DCPS, 4 mM Reactivo 2 Uricasa 60U/L Vial Enzimas Peroxidasa 660 U/L Ascorbato-Oxidasa 200 U/L 4 - Aminofenazona 1Mm Standard Sol. c. rico 6.0 mg/dL PREPARACION Y ESTABILIDAD Disolver, con agitacin suave, el contenido del vial de enzimas R.2 con un poco de R.1 tampn, una vez disuelto el liofilizado retornar al frasco original de tampn, homogeneizar la solucin. Esta solucin es estable 1 mes a 2-8C o 10 das a temperatura ambiente, protegida de la luz. 5. PROCEDIMIENTO TECNICA Longitud de onda: . . . . . . . 520 nm (490-550) Temperatura : . . . . . . . . . . 25/30/37C Paso de luz : . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Ajuste del cero con blanco de reactivo. Blanco Estndar Muestra Estndar 25 L Muestra 25 L Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL Mezclar e incubar durante 5 min a 37C 10 min a temperatura ambiente. Efectuar las lecturas de las densidades pticas del estndar y de la muestra frente al blanco del reactivo. Coloracin estable como mnimo 30 min.

Clculo Conc. Muestra mg/dL = D.O. Muestra / D.O. Estndar X Conc. estndar Estndar= 6.0 mg/dL mg/dL x 59 485 = mol/L Cuando la muestra sea orina, multiplicar el resultado por 10. Si la concentracin de la muestra es superior al lmite de linearidad (25mg/dL) diluir sta a la mitad y el resultado final se multiplicar por 2.

Lmite de Seguridad Biolgica Mujeres Suero o plasma mg/dL mmol/L Orina de 24 horas mg/dL mmol/L 2.5 - 6.0 148 - 357 Hombres 3.4 -7.0 202 416

250 - 750 14,872 - 44,616

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia, considerando edad, sexo, estado nutricional y dems factores. CONSIDERACIONES IMPORTANTES: -Si la muestra de orina es turbia, calentarla a 60C para disolver el cido rico. -El cido rico en suero es estable de 3 a 5 das en T de 2-8C. -Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no afectan los resultados de la prueba. -Se sugiere procesar junto con las muestras algn suero control valorado con niveles normal y anormal que le permitir tener un control de la exactitud y precisin de los resultados. -La hemlisis (hasta 100mg/dL de hemoglobina) y la bilirrubina hasta 20mg/dL, no interfieren en los resultados. -El estndar es muy vido a contaminarse, cuidar mucho su manipulacin, ya que los agentes reductores tienden a disminuir la respuesta del color, mientras que los oxidantes generan aparicin de color, aumentando las lecturas de los blancos. -Los detergentes son inhibidores enzimticos, asegrese de que el material de vidrio este perfectamente lavado y enjuagado con agua desionizada.

CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y Patolgico. Sueros control valorados.

2.2 CREATININA Mtodo colorimtrico-cintico 1. INTRODUCCIN La creatinina es un producto final del metabolismo muscular. Se origina a partir de la creatina por prdida de una molcula de agua. A su vez, la creatina se produce por hidrlisis del fosfato de creatina, por accin de la creatin-fosfo-kinasa (CPK), apareciendo como metabolitos de dicha reaccin el fosfato energtico y la creatina. El radical fosfato puede aportar energa directamente por dicha reaccin o a travs de su acoplamiento a una molcula de ADP para formar ATP y posterior hidrlisis por accin de ATPasa. La eliminacin de creatinina en el cuerpo humano tiene lugar casi exclusivamente a travs de la filtracin glomerular, siendo un importante ndice del funcionalismo renal. A diferencia de la urea, la eliminacin de creatinina por la orina no viene afectada por la diuresis, al mismo tiempo que para una misma persona es muy constante su eliminacin diaria con casi independencia de la dieta alimenticia, siendo la masa muscular el factor condicionante ms directo de su excrecin total por da. En resumen, podemos decir que la eliminacin de creatinina en un intervalo de 24 horas es un valor constante, dependiente principalmente de la masa muscular del individuo, y que por otro lado el clculo del aclaramiento de la creatinina ser un parmetro directo del funcionalismo renal.

2.OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de creatinina en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la creatinina y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de creatinina en una muestra biolgica 3.FUNDAMENT0 DEL MTODO La reaccin qumica aplicable para fotometra es la descrita por Jaffe, basada en el color anaranjado que se produce al reaccionar la creatinina con el picrato alcalino. Hay varias substancias en el suero y orina que actan como cromgenos inespecficos, lo que es un problema principalmente para el clculo del aclaramiento. Por este motivo tiene una gran importancia la adecuacin de todas

las variables de la reaccin, muy especialmente el pH, con el fin de obtener la mxima sensibilidad para la creatinina y la mnima interferencia de cromgenos. Adaptando la reaccin a una medida cintica, se logra una gran especificidad debido a que la creatinina reacciona con el picrato alcalino con ms rapidez que los cromgenos (metilguanidina, picramato,), por lo que la medida del incremento de color en un breve perodo de tiempo inicial de la reaccin valorarn principalmente creatinina, con poca influencia de los cromgenos inespecficos, por esto es recomendable, de ser posible, la determinacin cintica.

4.PREPARACIN 4.1MUESTRA CLNICA Suero o plasma heparinizado. La creatinina en suero y plasma tiene una estabilidad de al menos de 24 horas a 2-8C. Orina .Diluir previamente a 1:50 con agua destilada, multiplicar el resultado por 50. 4.2REACTIVOS Y MATERIAL Material necesario 1 Micropipeta de 1 mL 1 Micropipeta de 200 L. 1 Piseta con agua desionizada o destilada 2 Celdas de plstico de 3 ml 5 Tubos de vidrio de 13X100 Puntas para micropipeta Gradilla. EQUIPO Fotmetro termostable a 37C con filtro de 490-510 nm. Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Ac. pcrico 17.5 mmol/L Reactivo 2 Hidrxido sdico 0.29 mol/L Estndar Sol. Creatinina 2.0 mg/Dl PREPARACIN Y ESTABILIDAD Los reactivos estn listos para su uso. Son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de caducidad indicada en el envase. Mezcla reactiva: Mezclar ambos reactivos a partes iguales segn necesidades. Esta mezcla es estable 10 das a temperatura ambiente.

5. PROCEDIMIENTO 5.1TCNICA Longitud de onda: . . . . . . . 490 nm (490-510) Temperatura : . . . . . . . . . . 25/30/37C Paso de luz : . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Ajuste del cero con blanco de reactivo. Blanco Estndar Muestra Estndar 200 L Muestra 200 L Reactivo 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL Mezclar e incubar 5 min a 37C 10 min a temperatura ambiente. Mezclar y poner en marcha el cronmetro. Anotar la D.Optica a los 30 segundos (E1) y a los 90 segundos (E2). Lectura a 492 nm (490-510)

6. RESULTADOS

mg/dL creatinina

6.1 Clculos = . Extincin muestra/ . Extincin estndar x conc. estndar = conc. muestra

mg/dL x 88.4 = mol/L DEPURACION DE CREATININA Depuracin de creatinina CC(ml/minuto/1.73 m2)= U x V x 1 x 1.73 P T AS

U= Concentracin de orina en mg/dL V= Volumen P= Concentracin plasmtica en mg/dL T= Tiempo en minutos 1.73= Factor estandarizado AS= Superficie corporal en m2

Valor de referencia Mujeres 70 130 mL/min Hombres 70 140 mL/min

6.2 Linealidad Hasta valores de 15 mg/dL (1326 mol/L) Para valores superiores se deber diluir a 1:2 con sol. salina, multiplicando el resultado por 2. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica Suero. 0.7 - 1.4 mg/dL (61.8 - 132.6 mol/L) Orina. 15 a 25 mg/Kg/24 h NOTA: En orina debe multiplicar los valores de referencia por los Kg que pesa el paciente. DEPURACIN Hombres: 97 - 137 mL/min Mujeres: 88 - 128 mL/min OBSERVACIONES La hemlisis interfiere en el test. No utilizar sueros lipmicos.

CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

2.3 UREA MTODO CINTICO "UREASA-GLDH". 1. INTRODUCCIN Urea y amonaco La concentracin sangunea de amoniaco es superior en los infantes que en los adultos, debido a que el desarrollo de la circulacin heptica se termina despus del nacimiento. La hiperamonemia es una entidad que se presenta con frecuencia debido a defectos congnitos en el ciclo de la urea. El error innato del metabolismo ms comn es la deficiencia en ornitina transcarbamilasa. La hiperalimentacin es una causa mucho ms frecuente de hiperamonemia en infantes. Con frecuencia, se diagnostica el sndrome de Reye por un amoniaco sanguneo elevado en ausencia de otra causa demostrable. Los pacientes adultos muestran elevadas concentraciones de amonaco sanguneo en las etapas terminales de: la cirrosis heptica, la falla heptica y la necrosis del hgado aguda y subaguda. Se presagia el comienzo de la encefalopata heptica por una elevacin en el amonaco sanguneo. Se ha demostrado que la medicin en lquido cefalorraqudeo (LCR) de la glutamina, correlaciona bien con el desarrollo de la encefalopata heptica. Tambin se puede utilizar la medicin de la glutamina en el LCR, para diferenciar la encefalopata heptica de la sptica. Sin embargo, no es comn la medicin de la glutamina en el LCR. La excrecin de amonaco urinario se eleva con la acidosis y se disminuye en la alcalosis, puesto que la formacin de sales de amonio es un mecanismo importante para excretar el exceso de iones hidrgeno. Daos en los tbulos renales distales, tal como ocurre en la falla renal, la glomerulonefritis, el hipercorticoidismo y la enfermedad de Addison, conllevan a una excrecin de amonaco disminuida sin presentar cambios en los niveles sanguneos de amonaco. Puesto que la urea se sintetiza en el hgado, en la enfermedad heptica sin dao en la funcin renal, se presenta nitrgeno ureico srico bajo, aunque la relacin urea a creatinina se puede conservar normal. La elevacin en el nitrgeno ureico srico no implica necesariamente dao renal, puesto que la deshidratacin puede llevar a concentraciones de nitrgeno ureico tan altas como 600 mg/L. En los infantes que reciben una frmula alta en protenas pueden tener niveles de nitrgeno ureico de 250 a 300 mg/L. Naturalmente, enfermedades como la glomerulonefritis aguda, la nefritis crnica, el rin poliqustico y la necrosis renal elevan el nitrgeno ureico.

2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de urea en una muestra biolgica Establecer los valores de referencia de la urea y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar.

Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de urea en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea dando amonio y CO2. El amonio formado se valora mediante una reaccin enzimtica (GLDH), pasando NADH a NAD+. La disminucin de la absorbancia frente al tiempo es proporcional a la concentracin de urea. Ureasa Urea + H2O +2H+ 2 NH3 + CO2 GLDH 2NH3 + -cetoglutarato + 2NADH H2O + NAD+ + 2L-glutamato 4. PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA Suero o plasma heparinizado. 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 1 Micropipeta de 1 mL 1 Micropipeta de 200 L. 1 Piseta con agua desionizada o destilada 2 Celdas de plstico de 3 ml 5 Tubos de vidrio de 13X100 Puntas para micropipeta. Gradilla. EQUIPO Fotmetro termostable a 37C con filtro de 340 nm. Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tampn TRIS pH 7.8, 80 mmol/L Reactivo 2 Ureasa 3750 U/L Vial enzimas GLDH 6000 U/L NADH 0.32 mmol/L -cetoglutarato 6 mmol/L Estndar Sol. Urea 50 mg/dl PREPARACIN Y ESTABILIDAD Disolver el contenido del vial enzimas R.2 en el frasco de solucin tampn R.1

El reactivo al uso es estable un mnimo de 4 semanas a +2+8C 7 das a +15+25C. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 TCNICA Termperatura: 25/30/37C Longitud de onda: 340 nm. /334 nm Paso de luz: 1 cm Lectura: frente a agua destilada Blanco Estndar Muestra Reactivo Estndar 10 L 1.0 mL Muestra 10 L 1.0 mL

1.0 mL

Pipetear en un tubo: Muestra o estndar . . . . . . . . . . . . . . . 0.01 mL Reactivo al uso. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.00 mL Mezclar y anotar la disminucin de extincin entre los 30 y los 90 segundos ( Extincin) 6.0 RESULTADOS 6.1Clculo Con las diferencias de extincin anotadas, aplicar la siguiente ecuacin: . Extincin muestra/ . Extincin estndar x conc. estndar = conc. muestra Factor de conversin : mg/dL x 0.1665 = mmol/L 6.2Linealidad El mtodo es lineal hasta valores de 500 mg/dL (83.25 mmol/L) Para concentraciones superiores se deber diluir la muestra a 1:2 con solucin salina, multiplicando el resultado por 2. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica Suero: de 15 a 45 mg/dL Orina: de 20 a 35 g/24 horas NOTAS: Muestra: Suero, plasma o orina.. La orina diluirla a 1:50 con agua destilada. No emplear suero o plasma turbios o hemolizados.

CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico

Sodio / Potasio / Cloro 1.0 INTRODUCCIN SODIO: La prueba del sodio srico es una medida del catin principal (electroltico, carga positiva) en el espacio vascular, componente del lquido extracelular. Deber considerarse una medida proporcional, la proporcin entre sodio y agua, ms que una medicin directa del sodio corporal total. El sistema amortiguador del bicarbonato de sodio es uno de los principales controles renales de las concentraciones de iones hidrgeno, que convierten al sodio en un catin importante para la conservacin del equilibrio acidobsico corporal y tambin para la distribucin del agua corporal. La hipernatremia significa un exceso de sodio en la sangre, esto se advierte cuando hay vmito profuso, succin nasogstrica, enfermedades infecciosas como traqueobronquitis, diarrea acuosa profusa, diabetes inspida, aldosteronismo primario, ingestin inadecuada de agua libre, alimentos con alto contenido de solutos. La hiponatremia significa una deficiencia sangunea de sodio o una deplecin de sal, que por lo general indica un aumento excesivo de agua respecto a la elevacin del sodio; esto sucede en: diarrea o vmito donde se pierde ms sodio que agua, drenado de fstulas intestinales, uso prolongado de diurticos, enfermedad de Addison, insuficiencia renal crnica con acidosis, retencin anormal de agua, ingestin excesiva de agua y restitucin inadecuada de sal.(18) POTASIO: El potasio es el catin principal del lquido intracelular. Un desequilibrio en el nivel de potasio tiene un efecto directo sobre la irritabilidad muscular, la funcin miocardiaca y la respiracin. La hiperpotasemia se define como una concentracin plasmtica mayor de 5.5 mEq/L. Con una funcin renal adecuada es virtualmente imposible permanecer en un estado de hiperpotasemia pues el potasio es excretado con suma facilidad por el rin. Por tanto, un incremento significativo de potasio se encuentra principalmente en casos de insuficiencia renal grave con azotemia; tambin podra haber aumento con una administracin desmedida de potasio si hay excrecin urinaria inadecuada, con el uso excesivo de diurticos antagonistas de la aldosterona. La hipopotasemia se define como una concentracin srica menor de 3.5 mEq/L. Los sndromes de deficiencia de potasio son bastante comunes. Si esta deficiencia es grave, se producen cambios funcionales y estructurales renales en el rin, los

cuales perpetan el desequilibrio hidroelectroltico y acidobsico. Se tiene disminucin de potasio en: estados diarreicos, perdidas abundantes de lquidos gastrointestinales, diuresis masiva, pacientes postoperatorios con prdidas mltiples de potasio, pacientes despus de tratamiento de cetoacidosis diabtica, respuesta a la tensin, falta de ingestin adecuada de potasio, sndrome de malabsorcin donde el intestino no es capaz de absorber nutrientes.(18) CLORO: El cloro, el principal anin extracelular, ejerce un efecto directo sobre la presin osmtica, la distribucin del agua y el equilibrio entre aniones y cationes. Los niveles bajos de cloro son causados por pielonefritis crnica, crisis del sndrome de Addison, acidosis metablica y vmito prolongado. Se observan niveles altos de cloro en la deshidratacin, insuficiencia cardiaca congestiva, hiperparatiroidismo y el tratamiento prolongado a base de cloro o la ingestin repetida de dicha sustancia.(6) 2.0 OBJETIVOS

Determinar la concentracin en una muestra biolgica de sodio / potasio / cloro utilizando el mtodo de in selectivo. Destacar la importancia de los iones sodio, potasio y cloro en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas.

3.0 FUNDAMENTO DEL MTODO El mtodo para determinar sodio / potasio / cloro basado en el ion selectivo, utiliza como elemento sensor del ion Cl- plata/cloruro de plata o sulfuro de plata y la medicin de Na+ / K+ emplea membranas de intercambio inico de vidrio para el sodio y membranas de intercambio inico liquidas que incorporan valiomicina para el potasio. Hay dos formas generales para medir la potenciometra por electrodo in selectivo (ISE) en muestras clnicas, la directa y la indirecta. Los sistemas potenciomtricos directos miden la actividad del in en una muestra sin diluir, mientras que los sistemas ISE indirectos miden la actividad del in en una muestra prediluida.(6) 4.0 PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA: Sangre entera o plasma. La muestra debe recolectarse en ayuno.

La muestra debe recolectarse en tubo colector de sangre con heparina de litio. Si se trata de sangre entera la muestra debe mezclarse mediante inversin y rotacin del tubo. Para plasma se mezcla mediante inversin y se centrifuga el espcimen dentro de una hora a partir de la recoleccin. La sangre entera debe analizarse antes de transcurrida una hora a partir de su recoleccin; despus de este perodo de tiempo, se podra obtener niveles falsamente elevados de potasio. No enfriar ni refrigerar las muestras. El plasma debe analizarse dentro de un periodo de 4 horas a partir de su extraccin. Es necesario dejar que las muestras refrigeradas alcancen la temperatura ambiente de la habitacin y que sean centrifugadas antes del anlisis.(19) Nota: No agitar los tubos Se recomienda utilizar material de plstico de un solo uso para evitar contaminaciones. La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si la identificacin es inadecuada. c) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. d) Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis permisible.(9) 4.2 REACTIVOS: Se utilizan los reactivos para el analizador de in selectivo. Dependiendo del modelo.(19) 4.3 EQUIPO: El alumno debe consultar el manual del analizador de in selectivo para utilizarlo correctamente siguiendo paso a paso las instrucciones de operacin. 5.0 PROCEDIMIENTO 5.1 DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Encender el analizador. 2. Seguir los pasos que va indicando el analizador primero una calibracin a 2 puntos que se efecta despus de instalar o cambiar sensores, mdulo de reactivos u otros componentes y posterior el anlisis de la muestra como se indica en el siguiente diagrama:(19)

CALIBRAR? ANALIZAR MUESTRA?

YES NO CALIBRACION EXITOSA YES NO

LIMP. DIARIA? SUBIR MUESTREADOR PARA ANALIZAR SONDA EN MUESTRA?

YES NO

ASPIRANDO... RETIRAR MUESTRA REST MUESTREADOR ANALIZANDO... Na+/K+/ClNO YES

Nota: Todos los mtodos de anlisis de cloruro muestran una interferencia positiva con otros haluros. La nica interferencia con haluros clnicamente importante es con el bromuro, el cual se suministra en algunas preparaciones farmacuticas. Para Sodio / Potasio la interferencia de la muestra puede ser por protenas o lpidos.(19) 5.2 TRATAMIENTO DE RESIDUOS: Los desechos que se producen en esta prctica se colectan en un colector incluido dentro del analizador. Los residuos biolgico infecciosos como Punzo-cortantes, algodn con sangre, se recolectan y almacenan en los contenedores de deposito temporal (Lab.301) en recipientes rgidos o bolsas de color rojo dependiendo del desecho, con el emblema RPBIs y son llevados cada mircoles por el personal auxiliar de intendencia al camin de recoleccin de RPBIs. Los residuos como sangre, plasma, suero, paquete globular, materiales con sangre o sus derivados se tratan internamente en el laboratorio de acuerdo a la NOM-087-ECOL-SSA1-2002.(12)

6.0 VALORES DE REFERENCIA El intervalo de referencia para el cloruro en suero o plasma es de 98 a 107 mmol/L o mEq/L. Sodio 135 - 145 mmol/L mEq/L. Potasio 3.6 - 5.0 mmol/L mEq/L. Cloruro 98 mmol/L o mEq/L Nota: Estos intervalos fueron obtenidos utilizando mtodos indirectos. Cuando se miden por mtodos directos estos intervalos sern algo mayores que cuando se miden mediante tcnicas indirectas. Los valores de potasio plasmtico pueden ser de 0.1 a 0.2 mmol/L mEq/L menores que los correspondientes valores sricos.(6)

GASOMETRIA

Pendiente

2.6 EXAMEN GENERAL DE ORINA (EGO) 1.0 INTRODUCCIN Los anlisis de orina realizados en el laboratorio clnico, puede proporcionar una informacin amplia, variada y til del rin de un individuo y de las enfermedades sistmicas que pueden afectar este rgano excretor. Por medio de este anlisis, es posible elucidar tanto desrdenes estructurales (anatmicos) como desrdenes funcionales (fisiolgicos) del rin y del tracto urinario inferior, sus causas, y su pronstico. La realizacin cuidadosa del examen de orina, por parte del laboratorio, ayuda al diagnstico diferencial de numerosas enfermedades del sistema urinario. Usualmente, los datos de laboratorio obtenidos por medio de este anlisis, se logran sin dolor, dao o tensin para el paciente. Esta es la razn por la cual, la realizacin e interpretacin correcta del anlisis de orina, por parte del laboratorio permanecer siempre como una herramienta esencial de la prctica clnica. En la actualidad, se practican tres tipos de exmenes de orina: anlisis de orina por tira hmeda, empleado generalmente por los mdicos en sus consultorios y por los pacientes en sus casas; tamizaje de anlisis hmedo de la orina, comnmente llamado anlisis bsico o rutinario de orina; y citodiagnstico de la orina, que es una evaluacin citolgica especializada del sedimento urinario que correlaciona con los anlisis realizados por medio de la tira reactiva. El anlisis de orina realizado con la tira hmeda es un ensayo de primera etapa para la deteccin y monitoreo de pacientes con anormalidades qumicas. Los pacientes diabticos a menudo monitorean permanentemente su propia enfermedad, buscando signos de glucosuria, proteinuria, e infecciones del tracto urinario, mediante pruebas realizadas en casa.(20) El anlisis de orina hmedo o rutinario, proporciona, a costos razonables, un tamizaje adecuado para la deteccin de anormalidades qumicas y morfolgicas presentes en la orina. Este procedimiento se compone de dos partes: 1) un anlisis macroscpico, en el cual se determinan las caractersticas fisicoqumicas (apariencia, gravedad especfica y la medicin de los constituyentes qumicos por medio de la tira), y 2) un examen microscpico del sedimento, en campo claro o contraste de fases, para verificar hematuria, piuria, cilindruria, cristaluria, y otros signos. Por medio de este simple examen de orina, un uromicroscopista experimentado puede detectar y monitorear muchas entidades que afectan al rin y al tracto urinario inferior. Recientemente, el citodiagnstico de la orina ha ganado aceptacin mdica como un anlisis nuevo, ms sensible en el diagnstico de ciertas patologas renales y del tracto urinario inferior. Como este anlisis requiere mayor inversin de tiempo debido a la preparacin de coloraciones, debe reservarse para pacientes sintomticos con enfermedades renales, del tracto urinario inferior, o neoplasias.(6)

2.0 OBJETIVOS Establecer el mtodo adecuado de recoleccin de especimenes de orina para un anlisis especfico. Discutir las propiedades fsicas ms importantes de la orina y sus relaciones con la enfermedad. Identificar los constituyentes qumicos ms importantes de la orina, como cuantificarlos y como confirmar su presencia. Describir mtodos adecuados para estandarizacin de los especimenes de orina y de los hallazgos microscpicos ms comunes. 3.0 FUNDAMENTO El anlisis de orina rutinario, se basa en un procedimiento que se compone de dos partes: 1) un anlisis macroscpico, en el cual se determinan las caractersticas fisicoqumicas (apariencia, gravedad especfica y la medicin de los constituyentes qumicos por medio de la tira como protenas, glucosa, cetonas, pH), y 2) un examen microscpico del sedimento, en campo claro o contraste de fases, para verificar hematuria, piuria, cilindruria, cristaluria, y otros signos. (20) 4.0 PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA El cuidado en la recoleccin de la orina y su entrega rpida en el laboratorio, son cruciales para obtener una informacin ptima. La orina debe ser colectada en un recipiente limpio, estril, que tenga un cierre seguro para prevenir posibles derramamientos, evaporacin o contaminacin. Estos recipientes deben rotularse con el nombre del paciente, fecha y hora de recoleccin. Para que los datos del uroanlisis sean precisos, es esencial que la orina sea examinada dentro de las dos horas siguientes a su recoleccin o preservada de alguna manera, usualmente por refrigeracin (2 a 8 C). Se pueden usar fijadores o preservativos adecuados, siempre y cuando se entiendan claramente sus efectos sobre la orina y sobre los ensayos en ella realizados. Si la orina es recolectada sin preservativos y permanece a temperatura ambiente se empezar a descomponer. Los preservativos actan impidiendo los cambios qumicos asociados a la descomposicin y previniendo el crecimiento y metabolismo de los microorganismos. El tolueno, fenol, timol y preservativos cidos son usados frecuentemente para los anlisis qumicos de la orina. Otras formas de preservacin incluyen el ajuste del pH y la proteccin de la luz. Para preservar las

estructuras celulares puede emplearse etanol (95%), hay tambin disponibles fijadores comerciales como Mucolex . Los laboratorios son responsables de la seleccin adecuada del tipo y cantidades de preservativo de la de orina necesarios para preservar las estructuras celulares.(6) Para cuantificar diversos aspectos de la funcin renal, frecuentemente se emplean anlisis de orina recolectada durante un determinado perodo de tiempo. La orina debe reflejar la excrecin en un intervalo de tiempo medido con precisin. Estos especmenes no deben incluir la orina que se encuentra en la vejiga antes de la iniciacin de la recoleccin. En la toma de muestras de orina de 24 horas, se debe desechar la orina de la primera miccin de la maana del da en el cual se inicia la recoleccin y recolectar toda la orina producida durante 24 horas, incluyendo la primera orina de la maana del segundo da. La primera orina de la maana es usualmente la mejor para el anlisis porque es la orina ms concentrada. Las muestras deben estar libres de secreciones vaginales u otra clase de partculas extraas. Este procedimiento puede modificarse si no es necesario el examen bacteriolgico de la muestra. La recoleccin del chorro medio sin el lavado previo y sin usar un envase estril, proporciona una muestra satisfactoria para el examen de rutina. (20) 4.2 REACTIVO Reactivo (Tincin de Sternheimer-Malbin) comercial TINCIN DE STERNHEIMER MALBIN Para sedimento urinario. Facilita la identificacin de las clulas. Mtodo Se vuelve a suspender el sedimento en el tubo de centrifuga y se aade una gota del colorante; se espera tres minutos. Luego se pone una gota sobre un portaobjetos, se cubre y se examina al microscopio. Resultados Hemates: Leucocitos: Granulaciones: Clulas brillantes:

Clulas renales: Clulas vesicales: Clulas epiteliales

Color rosado Prpura oscuro con ncleo rojo oscuro. Citoplasmticas violetas. Son leucocitos neutrfilos incoloros o de color azul claro. Son caractersticos de polinefritis. Ncleo prpura oscuro, con un estrecho citoplasma de color prpura-anaranjado. Ncleo azul oscuro y citoplasma azul claro.

de descamacin: Cilindros hialinos: Cilindros finamente granulosos: Cilindros grasos: Cilindros hemticos: Cilindros creos:

Ncleo prpura, citoplasma rosado o violeta. Rosado o prpura claro. Cilindros rosados, con granulaciones de color prpura. Color rosado, gotas de grasa incoloras. Cilindro rosado, hemates incoloros o lila claro. Prpura claro u oscuro.

4.3 EQUIPO Microscopio ptico. Centrfuga clnica. EQUIPO DE UROANALISIS SPIN LAB

Nota: El alumno debe consultar el manual del microscopio ptico y centrifuga para saber cuales son las instrucciones de operacin, datos y caractersticas de funcionamiento de los instrumentos. 4.4 MATERIAL Envases desechables para orina. 1 probeta graduada de 50 ml. 4 tubos para centrifuga de 13 x 100mm. 2 tubos de ensayo de 13 x 100mm. 4 portaobjetos. 4 cubreobjetos. 2 pipetas serolgicas graduadas de 10 ml. 2 pipetas Pasteur. 2 bulbos de goma. Tiras reactivas comerciales. Colorante de Sternheimer-Malbin. 5.0 PROCEDIMIENTO EXAMEN FSICO DE LA ORINA Volumen. El volumen urinario est influenciado por la ingesta de lquidos; por los solutos excretados, principalmente, sodio y urea; por la prdida de fluidos en la transpiracin y la respiracin; y por el estado de los sistemas cardiovascular y renal. Normalmente un adulto excreta de 750 a 2000 mL en 24 horas. Aunque el

volumen de orina de un espcimen recolectado al azar no tiene importancia clnica, el volumen del espcimen recibido debe ser anotado para efectos de documentacin y estandarizacin.(6) Olor. Una orina normal fresca no tiene mal olor. Un olor desagradable, puede indicar que el espcimen es demasiado viejo para obtener un anlisis preciso. Un olor ftido en un espcimen recolectado desde hace ms de dos horas (y no preservado o refrigerado) indica que el espcimen es inadecuado. El olor puede tambin dar seales de ciertas anormalidades de la orina. Un olor parecido al amoniaco, es sugestivo de presencia de bacterias degradadoras de la urea, un olor a frutas indica la presencia de acetona (cetonas), un olor dulce es sugestivo de la presencia de glucosa u otros azcares, un olor ftido es sugestivo de pus o inflamacin. El olor es importante en la deteccin clnica de la enfermedad llamada orina de miel de maple (un defecto metablico congnito).(6) Apariencia (color y turbidez). El color de la orina esta determinado, en gran medida, por su grado de concentracin. Las orinas normales varan ampliamente de colores, desde incoloras hasta amarillo oscuro. La interpretacin del color es subjetiva y vara segn el laboratorio que la examine. Para que el analista describa adecuadamente el color de la orina, puede emplear como puntos de referencia una escala estandarizada de colores, evitando el uso de trminos ambiguos como pajizo o sangriento. La orina roja es, tal vez, la coloracin de mayor importancia clnica. Este color puede ser producido por hemoglobina urinaria o mioglobina, eritrocitos intactos, eritrocitos hemolisados, o hemoglobina libre (hemlisis). En la glomerulonefritis aguda el color caracterstico de la orina es pardo rojizo. Normalmente una orina fresca es clara. Cuando la orina se deja reposar, se precipitan cristales amorfos, generalmente uratos, produciendo turbidez. La turbidez de la orina debe ser registrada y explicada mediante la evaluacin microscpica.(6) Gravedad especfica. La gravedad especfica de la orina es una medida parcial de la capacidad del rin para concentrar orina. Su rango normal es de 1.003 a 1.035 g/mL. Los valores iguales o superiores a 1.020 indican una buena funcin renal y la excrecin de una cantidad aumentada de solutos disueltos excretados por los riones. Valores de densidad especfica iguales o superiores a 1.035 indican la presencia de solutos extraos, lo cual debe ser investigado. Una disminucin de la gravedad especfica se observa en pacientes quienes usan diurticos. Las sustancias de alto peso molecular afectan la gravedad especfica en un grado mayor que la producida por simples cristaloides. Esto es importante cuando la orina contiene molculas grandes como glucosa, protenas o medios de contraste radiogrficos. Cuando se presentan niveles elevados de glucosuria o proteinuria, es necesario aplicar factores de correccin para ajustar la gravedad especfica a un valor ms representativo; se debe restar 0.004 por cada 10 g/l de

glucosa y 0.003 por cada 10 g/l de protena. Valores de 1.040 o superiores estn asociados con la presencia de medios de contraste radiogrficos o preservativos. La gravedad especfica se puede medir empleando un hidrmetro y un recipiente apropiado. El uso de los hidrmetros tiene varias limitaciones: 1) requieren un volumen grande de orina (10 a 15 mL); 2) estn calibrados para ser usados a 20 si la orina no est a esta temperat ura de referencia se deben C, aplicar factores de correccin; 3) los hidrmetros no pueden ser recalibrados. Por estas razones, los laboratorios ya no emplean estos elementos. La mayora de los laboratorios poseen refractmetros que relacionan la densidad de una solucin con la gravedad especfica. El uso de estos refractmetros tiene algunas ventajas: 1) requieren solo una o dos gotas de orina; 2) tienen la temperatura compensada; 3) las lecturas estn menos afectadas por la densidad que las de los urinmetros; y 4) poseen un tornillo para calibrar a cero. Su gran desventaja es el costo. Mtodo de la tira reactiva. Las tiras reactivas disponen de un mtodo colorimtrico indirecto para medir la gravedad especfica. Este mtodo usa una tira que contiene un electrolito pretratado que muestra un cambio de pH de acuerdo a la concentracin inica de la orina. Este ensayo es rpido, sencillo y no requiere equipos adicionales.(6) Osmolalidad. El rin normal es capaz de producir orina con un rango de 50 a 1200 mOs/Kg. Los rangos de la osmolalidad en orina oscilan desde 1/6 a cuatro veces la osmolalidad del suero normal (280-290 mOs/Kg). La osmolalidad es medida por un osmmetro. La osmolaridad est determinada por el nmero de partculas por unidad de masa, mientras la gravedad especfica es un reflejo de la densidad (tamao o peso) de las partculas en suspensin Generalmente la gravedad especfica y la osmolaridad son directamente proporcionales de un modo lineal, aunque hay excepciones importantes. Por ejemplo, si a un paciente se le administran medios de contraste yodados por pielografa intravenosa, la gravedad especfica puede elevarse hasta 1.070 o 1.080, mientras que la osmolalidad permanecer dentro de los lmites normales. Las partculas de contraste tienen una masa lo suficientemente grande para elevar la gravedad especfica, pero hay muy pocas molculas presentes que puedan producir un notable incremento en la osmolalidad.(6) EXAMEN QUMICO DE LA ORINA Anlisis por tira reactiva. Los anlisis por tira reactiva han permitido a los laboratorios de uroanlisis producir resultados qumicos semicuantitativos de una manera rpida, exacta y eficiente. En general, los anlisis de orina adecuadamente realizados por medio de tiras reactivas, son sensibles, especficos y econmicos. Los anlisis realizados por medio de tiras reactivas deben efectuarse en orinas bien mezcladas y equilibradas a la temperatura ambiente. Cada parmetro

qumico debe ser evaluado en un intervalo de tiempo especfico, de acuerdo a lo indicado en las instrucciones del fabricante. Deben tomarse del envase, solamente el nmero de tiras requerido para los anlisis inmediatos y el envase debe taparse nuevamente asegurando que la tapa quede bien ajustada. Las tiras reactivas deben ser almacenadas en un lugar fresco (no refrigeradas). El medio ambiente debe estar libre de humedad. Nunca se deben usar tiras para orina caducadas o expuestas al aire. Despus de sumergir la tira reactiva en la orina, se debe remover el exceso de orina golpeando la tira suavemente en el borde del recipiente que contiene el especimen. Se debe comparar individualmente la reaccin de cada zona reactiva con su correspondiente en la carta de colores, bajo una iluminacin adecuada. Los resultados positivos de las tiras reactivas pueden requerir confirmaciones por mtodos qumicos y microscpicos. La informacin proporcionada por los fabricantes debe ser revisada para identificar fuentes de inhibidores y resultados falsos positivos y negativos.(20) pH Urinario. Aunque el mtodo estndar para la medicin del pH emplea electrodos de vidrio, el pH urinario, usualmente, es medido con indicador de papel, debido al hecho de que pequeos cambios en el pH son de poca importancia clnica. La mayora de los laboratorios de uroanlisis emplean tiras reactivas multitest con dos indicadores, rojo de metilo y azul de bromotimol. Estos indicadores proporcionan un rango de pH de 5.0 a 9.0, el cual se manifiesta por un cambio de color de naranja(cido) a verde y azul (alcalino). El rango de pH urinario es 4.7 a 7.8. Las muestras de orina extremadamente cidas o alcalinas, usualmente indican especmenes mal recolectados. El pH es importante para el manejo clnico de las piedras o cristales.(20) Protenas. Las personas sanas pueden tener una excrecin diaria de protenas de 100 mg/da, una fraccin muy pequea del contenido de protenas plasmticas. La mayora de la protena en la orina es albmina que pasa la membrana glomerular, pero tambin pueden estar presentes protenas de peso molecular pequeo como las globulinas. Una vez filtradas las protenas son casi completamente reabsorbidas en el tbulo proximal. La proteinuria, por lo tanto, puede ser el resultado tanto de un incremento en la filtracin como de una disminucin en la reabsorcin (funcin tubular). Las tiras reactivas son un procedimiento de tamizaje para la proteinuria. Como la especificidad de las tiras reactivas est limitada a la deteccin de albmina, es altamente recomendable que el laboratorio procese simultneamente una prueba por tira reactiva y una prueba de precipitacin por cido para la deteccin de todos los tipos de protenas. Las tiras reactivas son sensibles al pH y dependen de la presencia de protenas para la generacin de color. La presencia de la protena en la tira cambia el pH del medio de contraste impregnado en la zona reactiva, producindose el cambio de color pH 3 Azul de tetrabromofenol Resultados positivos (azul verdoso)

Protena pH 3 Azul de tetrabromofenol Resultados negativos (amarillo) Sin protena

Un resultado positivo o dbilmente positivo debe ser confirmado por otros mtodos ms especficos como el cido tricloroactico o el cido sulfosaliclico. Un resultado dbilmente positivo y uno fuertemente positivo pueden indicar la presencia de frmacos o protenas de Bence Jones.(6) Azcares. 1.Ensayos enzimticos. El ensayo de la tira reactiva es un excelente anlisis especfico para glucosa. Detecta la oxidacin de la glucosa a cido glucnico:

Glucosa oxidasa Glucosa + Oxgeno del aire ambiental Acido glucnico y perxido de hidrgeno Peroxidasa Perxido de Hidrgeno + Cromgeno Cromgeno oxidado + H2O Una clase de tira reactiva emplea o-toluidina como el cromgeno indicador de la reaccin. 2. Reduccin del Cobre Calor Iones Cpricos + Glucosa (o sustancias reductoras) lcali Oxido cuproso + Hidrxido cuproso (rojo) (amarillo)

La tableta Clinitest (Ames Division) brinda la posibilidad de detectar otros azcares. Este es un ensayo basado en la reduccin del cobre que mide el total de sustancias reductoras presentes en la orina. Adems de glucosa, el Clinitest puede detectar azcares como galactosa, lactosa y pentosa.(6) Cetonas. El trmino cuerpos cetnicos incluye tres componentes qumicos diferentes pero muy relacionados: cido acetoactico, cido beta hidroxibutrico y acetona. Los ensayos realizados por medio de tiras reactivas emplean la reaccin de

nitroprusiato de sodio que detecta acetona y cido acetoactico pero no beta hidroxibutrico, el cuerpo cetnico primario. Es importante saber que el reactivo de nitroprusiato de sodio reacciona principalmente con el cido acetoactico; la acetona tiene solo un 20% de reactividad comparada con el cido acetoactico: pH alcalino Acido acetoactico + Nitroprusiato de sodio + Glicina Color prpura

La determinacin de cetonas es importante en el monitoreo de la diabetes y de la cetoacidosis y debe realizarse siempre que se determinen azcares.(6) Sangre y mioglobina. Una orina roja indica usualmente la presencia de eritrocitos, hemoglobina o mioglobina. La hematuria, a menudo, representa una combinacin de eritrocitos intactos (ms de 5 por campo de alto poder), eritrocitos fragmentados y hemoglobina libre. La hematuria gruesa o macroscpica implica hemorragia o sangrado fresco, lo que en un medio de orina cida, da como resultado una apariencia de roja a parda, turbia, o ahumada. El mtodo empleado por la tira reactiva para determinar hemoglobina o mioglobina se fundamenta en una actividad semejante a la de las peroxidasas: Mioglobina o hemoglobina Perxido de Hidrgeno (H2O2) + Cromgeno Cromgeno oxidado (azul) + H2O

Un ensayo positivo indica la presencia de hematuria, hemoglobinuria o mioglobinuria, siendo necesario un anlisis microscpico para confirmar la presencia de eritrocitos. La presencia en la orina de agentes oxidantes como los yoduros y bromuros, puede causar resultados falsos positivos; grandes cantidades de cido ascrbico (usado en algunos antibiticos) pueden producir resultados falsos positivos en algunas tiras reactivas. La mioglobina es una porfirina ferrosa similar a la hemoglobina; se encuentra, comnmente, en la orina en pacientes con traumas severos que involucran destruccin muscular. Cuando la mioglobina es liberada a la circulacin, es rpidamente excretada por el rin. Al igual que la hemoglobina, su presencia producir orinas de apariencia rosada a roja.(6) Bilirrubina. Orinas espumosas, de color amarillo a pardo, u oscuras son sugestivas de la presencia de bilirrubina conjugada. La orina normal no contiene bilirrubina. Los pacientes ictricos con enfermedad hepatocelular como hepatitis o enfermedad obstructiva como cirrosis biliar pueden tener bilirrubina conjugada en la orina. El mtodo empleado por las tiras reactivas para determinar bilirrubina se basa en la reaccin de diazoacin.

cido Bilirrubina glucornido + Sal de diazonio Azobilirrubina (pardo)

Los resultados negativos de orinas sospechosas y los resultados positivos cuestionables provenientes de orinas coloreadas, deben ser confirmados empleando tabletas de Ictotest (Ames Division, Miles Laboratories). El Ictotest emplea la misma reaccin de diazoacin que las tiras reactivas. Se pueden encontrar resultados falsos negativos, en orinas no frescas porque la bilirrubina urinaria puede hidrolizarse u oxidarse por accin de la luz.(6) Urobilingeno. El urobilingeno es un compuesto coloreado, resultado de la reduccin de la bilirrubina por accin de las bacterias en el intestino. Las orinas normales contienen pequeas cantidades de urobilingeno. El urobilingeno se encuentra disminuido en nios deficientes en bacterias intestinales; en pacientes despus de la administracin de antibiticos que reducen la flora intestinal, y en pacientes con enfermedades obstructivas hepticas. Se encuentra un aumento del urobilingeno en pacientes con anemias hemolticas (aumento de formacin de bilirrubina) y disfuncin heptica. El mtodo empleado por las tiras reactivas para la determinacin del urobilingeno vara segn el fabricante. Algunos emplean la reaccin de Erlich, usando p-dimetilaminobenzaldehdo en una reaccin simple de color con el profobilingeno. Esta reaccin no es especfica para urobilingeno, pudindose encontrar resultados falsos positivos con otros compuestos que tambin reaccionan con el reactivo de Ehrlich. Otros emplean una reaccin especfica para el urobilingeno: el urobilingeno reacciona con un compuesto de diazonio producindose un color rojo. Para la determinacin del urobilingeno es necesario un espcimen fresco porque el compuesto es sensible a la luz. El espcimen preferido par la determinacin cuantitativa del urobilingeno urinario es una orina recolectada durante las dos primeras horas de la tarde. Este tiempo de recoleccin se debe a los patrones de excrecin diurna del urobilingeno.(6) Nitritos. El ensayo de nitritos es empleado en los laboratorios de uroanlisis para detectar bacteriuria. El mtodo empleado en las tiras reactivas para determinar nitritos se basa en la reduccin de nitratos a nitritos por la accin enzimtica de ciertas bacterias presentes en la orina. En un pH cido los nitritos reaccionan con el cido p-arsanlico formando un compuesto de diazonio, el cual a su vez reacciona con N-(1- naftil) etilndiamina produciendo un color rojo. El ensayo de nitritos debe ser realizado en especmenes recolectados en la primera orina de la maana o en una muestra de orina que haya sido recolectada despus de 4 horas o ms, a partir de la ltima evacuacin de la vejiga, con el fin de permitir que durante este tiempo los microorganismos metabolicen el nitrato dentro de la vejiga. En orinas pasadas o viejas, el ensayo de nitritos puede ser positivo como resultado de la contaminacin con bacterias despus de la miccin. La prueba de nitritos es especfica para organismos gram negativos, sin embargo, se pueden

obtener resultados falsos negativos si estn presentes microorganismos como enterococos, estreptococos o estafilococos.(6) Esterasa leucocitaria. La presencia de leucocitos (piuria) es un indicador de inflamacin clnicamente importante. El mtodo empleado para la determinacin de leucocitos intactos y lisados en las tiras de orina est basado en la presencia de esterasas intracelulares. Estas enzimas catalizan la hidrlisis de los steres, liberando componentes que son luego empleados en una reaccin de color. La intensidad de la reaccin de color es directamente proporcional a la cantidad de leucocitos presentes en el espcimen. La presencia de tricomonas y agentes oxidantes pueden producir falsos positivos.(6) Melanina. Las orinas normales no contienen melanina. La melanina se encuentra en orinas de pacientes con melanoma maligno. Los pacientes con esta neoplasia maligna excretan precursores incoloros de melanina (melangenos), los cuales al ser expuestos al aire se polimerizan formando un pigmento oscuro de melanina. Los anlisis para tamizaje emplean cloruro frrico que oxida los melangenos a melanina, la cual vuelve la orina a un color pardo oscuro.(6) EXAMEN MICROSCPICO DE ORINA Una identificacin microscpica precisa del sedimento urinario es importante para el reconocimiento temprano de infecciones, procesos inflamatorios, y neoplasias que pueden afectar el tracto urinario. Est en debate s todos los especmenes de orina se deben someterse rutinariamente al anlisis microscpico, el cual exige mayor inversin de tiempo. En su lugar, la mayora de los trabajadores del laboratorio, estn de acuerdo en que el examen microscpico de orina solo debe practicarse a pacientes sintomticos, cuando el mdico lo requiera especficamente y cuando se encuentre un anlisis macroscpico anormal, es decir, cuando se encuentre hematuria, proteinuria o piuria (resultado de nitratos o esterasa positivos).(21) Microscopa de campo claro de una orina no teida. La microscopa de campo claro no coloreada emplea luz reducida para delinear los elementos ms translcidos de la orina, como, cilindros hialinos, cristales y filamentos de moco. La identificacin precisa de leucocitos, macrfagos, clulas del epitelio tubular renal, y clulas que contienen inclusiones virales puede ser muy difcil en preparaciones no coloreadas. Para confirmar los resultados deben emplearse tcnicas citolgicas y preparaciones teidas.

Procedimiento La orina debe examinarse mientras est fresca, algunas clulas y cilindros pueden desintegrarse en un lapso de una a tres horas. La refrigeracin de 2 a 8 C por 48 horas, usualmente previene la desintegracin de las clulas y entidades patolgicas. Con propsitos de estandarizacin, cada espcimen de orina debe concentrarse de diez a veinte veces. El examen se realiza de la siguiente manera: 1. Mezcle bien el espcimen. 2. Ponga un volumen fijo (10, 12, 15 mL) de orina en un tubo de centrfuga graduado. 3. Centrifugue a 1500 rpm o aproximadamente 80 G por 5 minutos. 4. Extraiga el sobrenadante por decantacin cuidadosa o aspiracin hasta un volumen fijo: 1ml y 0.4 mL, son los ms comunes. Resuspenda el sedimento golpeando suavemente en el fondo del tubo. 5. Ponga una gota el sedimento resuspendido en un rea de una lmina estandarizada. 6. Examine con bajo poder (100x) y luz atenuada. Ajuste el enfoque fino permanentemente mientras se explora al azar el rea cubierta. Durante la revisin evale el espcimen en busca de clulas epiteliales transicionales y escamosas, cristales, moco, bacterias, levaduras y artefactos. Elabore el reporte de acuerdo a los protocolos del laboratorio. La identificacin posterior de cilindros, clulas epiteliales renales, eritrocitos y leucocitos debe ser refinada empleando el objetivo de alto poder. 7. Examine, al menos, diez campos empleando luz tenue. Asegrese de examinar los bordes porque a menudo los cilindros se encuentran a lo largo de los bordes del cubre objeto. Los cristales anormales, cuando estn presentes, deben contarse con el objetivo de bajo poder. Una bacteriuria visible en bajo poder debe ser reportada, por lo menos, con 2+. 8. Examine, al menos, diez campos con alto poder (440x) y reporte con valores numricos eritrocitos, leucocitos, y clulas del epitelio tubular renal. 9. Reporte todos los conteos (promedio de 10 campos) y evale cualitativamente de acuerdo a la terminologa estandarizada.(21) Microscopa de campo claro con tinciones supravitales. El detalle celular se realiza en sedimentos teidos. Es frecuente el uso de un colorante de cristal violeta-safranina O para la evaluacin rpida de ciertos elementos celulares. Procedimiento 1. Aadir una o dos gotas de colorante violeta-safranina O a, aproximadamente, 1 mL de sedimento de orina precentrifugado y concentrado a ese volumen.

2. Mezclar con una pipeta y poner una gota de esta suspensin en una laminilla. Muchos laboratorios de uroanlisis recomiendan el uso de la microscopa de contraste de fases para una mejor deteccin de los elementos formados ms translcidos del sedimento urinario. Los cilindros hialinos, moco, y bacterias pueden escapar a la deteccin empleando la microscopa convencional, no teida, bajo campo claro. La microscopa de contraste de fases tiene la ventaja de endurecer los contornos inclusive de los elementos ms efmeros, haciendo ms sencilla su deteccin. Siempre se logra un detalle morfolgico mejor de los elementos formados (notablemente en cilindros y clulas) con el uso de un microscopio de contraste de interferencias.(21) Cristales. Los cristales urinarios son vistos comnmente. Usualmente los cristales no estn presentes en orinas frescas recin obtenidas y en general, la formacin de los cristales es considerada como un artefacto del sistema de recoleccin. Los cristales se forman cuando varios constituyentes qumicos llegan a saturarse o sufren un cambio en su solubilidad, cuando la orina es almacenada a temperaturas ms bajas. Ciertas sustancias qumicas, como la albmina, previenen la cristalizacin. Cuando la orina se calienta a 37 la mayora de los C, cristales desaparecen. Aquellos cristales que todava permanecen, tienen importancia diagnstica, cuando se correlacionan con sntomas clnicos. Los tipos de cristales urinarios dependen del pH de la orina fresca. La cistina, cido rico, leucina, y tirosina son los cristales de mayor importancia diagnstica y por tanto deben ser identificados. Debido a la limitada relevancia clnica de los cristales, algunos laboratoristas estn de acuerdo en que no debe desperdiciarse tiempo en su identificacin especfica. La formacin de muchos cristales est inducida por varios medicamentos y su importancia clnica no es clara an.(21) Organismos. En un espcimen de orina bien recolectado y procesado, la presencia de organismos es importante desde el punto de vista clnico. Se reportan, frecuentemente, bacterias, hongos, parsitos, y clulas infectadas con virus. Los organismos vistos en un espcimen de orina son microscpicamente reconocibles como estructuras intra o extracelulares. Con la microscopa de campo claro se detectan fcilmente bacterias, hongos y parsitos. La deteccin de bacterias intracelulares fagocitadas y hongos, organismos de Toxoplasma, y cuerpos de inclusin viral, usualmente requieren procedimientos citolgicos. La identificacin exacta de los organismos ayuda en el diagnstico clnico diferencial de infecciones del sistema urinario. Las preparaciones coloreadas son importantes en la evaluacin de organismos, identificacin de clulas inflamatorias

asociadas, en la valoracin de la exfoliacin epitelial, y en la formacin de cilindros renales con el fin de identificar su localizacin. Se deben emplear tcnicas microbiolgicas para confirmar y clasificar completamente algunos organismos urinarios.(21) Bacterias. La orina de individuos normales es estril y no contiene bacterias. Algunas bacterias pueden estar presentes por contaminacin durante la recoleccin o por almacenamiento prolongado. Se puede determinar una concentracin de menos de 103 bacterias/mL, cuando se han visto bacterias en un espcimen de orina centrifugado pero no en el espcimen sin centrifugar. La presencia de bacterias en un espcimen sin centrifugar indica que hay una concentracin mayor de 103 bacterias/mL. La presencia de 105 bacterias/ml o ms sugiere una infeccin de tracto urinario. Este nmero corresponde a 10 o ms bacterias por campo de alto poder. La identificacin de bacterias, cocos o bacilos puede hacerse por microscopa de campo claro o por contraste de fases. Ocasionalmente hay dificultad en diferenciar bacterias de cristales amorfos.(21) Hongos. Las infecciones del tracto urinario (ITU) producidas por hongos son comunes en pacientes diabticos, en aquellos que toman medicamentos desde el nacimiento, o en aquellos que han recibido terapia intensiva con antibiticos o terapia inmunosupresora. En la mayora de las ITUs de pacientes no inmunocomprometidos, se ha observado un patrn inflamatorio asociado. Candida albicans es el hongo ms comn, identificndose como levadura o micelio. En general, la apariencia de gemacin de levadura indica que el hongo ha coexistido con el husped, mientras que la forma micelar aparece durante la invasin al tejido. Las levaduras de Candida albicans son altamente retractiles y miden de 3 a 5 m. Suelen ser confundidas con eritrocitos. A diferencia de los eritrocitos, las levaduras no son lisadas por cidos.(21) Parsitos. La presencia de parsitos en la orina indica contaminacin fecal o vaginal. La Trichomona vaginalis, un flagelado, es el parsito que ms comnmente se observa en la orina. La incidencia de este tipo de parsito en mujeres es muy alta pudiendo producir vaginitis severa. En el hombre, el parsito causa una uretritis asintomtica. Debido a la motilidad de este organismo oval, la microscopa de campo claro es empleada como la forma ms sencilla y rpida de identificacin. Los tricomnidos inmviles pueden ser confundidos con leucocitos o clulas epiteliales. Se han encontrado huevos de helmintos (Enterovius vermicularis) en la orina de nios por contaminacin fecal. Morfolgicamente un huevo de helminto est rodeado por una cpsula con dos capas, transparente y delgada, pudindose ver, enrollado dentro de ella, un embrin. En la orina, tambin pueden encontrarse huevos de trematodos.(21)

Clulas infectadas de virus. Con una frecuencia cada vez mayor, se encuentran cambios celulares inducidos por virus en el sedimento de orina de pacientes inmunocomprometidos. Se deben emplear tcnicas citolgicas para asegurar la identificacin de citomegalovirus, herpes simplex y Polyomavirus, los cuales producen clulas con inclusiones intranucleares diagnsticas, siendo estas las infecciones virales ms comunes del sistema urinario. Las clulas de inclusin viral deben distinguirse de las clulas de inclusin provenientes de fuentes no virales, como la exposicin a metales pesados (plomo y cadmio) y de cambios celulares degenerativos no especficos.(21) Eritrocitos. Una orina normal, examinada con objetivo de alto aumento, no debe contener ms de unos cuantos eritrocitos. Estas clulas aparecen en la orina despus de lesiones vasculares o trastornos del rin o del tracto urinario inferior. La presencia de eritrocitos acompaada de cilindros hemticos o eritrocitos dismrficos es sugestiva de sangrado del parnquima renal o del glomrulo. La deteccin urinaria de eritrocitos dismrficos, especialmente acantocitos, es un marcador morfolgico importante de sangrado glomerular o tubular. Su cuantificacin ayuda en el diagnstico y manejo del paciente. Cuando se examinen orinas de mujeres, es importante evitar la contaminacin con sangre menstrual. Los eritrocitos miden, aproximadamente, 7 m de dimetro, tienen forma de discos biconcavos los cuales aparecen de un color amarillo plido cuando se examinan bajo microscopa de campo claro. En ocasiones, las tiras reactivas pueden detectar hemoglobina en ausencia de eritrocitos en el examen microscpico. Una posible explicacin de esta discrepancia es la presencia de orinas alcalinas o hipotnicas, ambas pueden causar lisis de los eritrocitos. En ausencia de estas condiciones, es muy sugestivo que el pigmento que aparece en la orina (puede ser hemoglobina o mioglobina) se origine por filtracin desde la sangre.(21) Leucocitos. La velocidad de excrecin normal de eritrocitos en la orina es de 1 leucocito por cada 3 campos con objetivo de alto aumento, 3000 clulas/mL, o ms de 200,000 clulas/hora. Un elevado nmero de leucocitos (piuria) est asociado a numerosos procesos inflamatorios e infecciosos del tracto urinario. La mayora de los leucocitos vistos por microscopa de campo claro son neutrfilos segmentados. La identificacin de linfocitos, clulas plasmticas, y eosinfilos requiere de coloraciones especiales. Se ha mostrado que una velocidad de excrecin en exceso de 400,000 clulas/hora siempre indica una infeccin del tracto urinario. Esta velocidad corresponde a ms de 10 neutrfilos por campo de alto poder. Los pacientes con infecciones activas del tracto urinario superior tienen, frecuentemente, ms de 50

neutrfilos por campo de alto poder o una velocidad de excrecin de leucocitos que excede 2 o an 3 millones/hora.(21) Clulas del epitelio tubular renal. En el nefrn estn alineados varios tipos de clulas del epitelio tubular renal y las clulas enfermas o viejas estn constantemente siendo arrojadas a la orina. Aunque ellas representan la exfoliacin renal real, la presencia de ms de dos clulas del epitelio tubular renal por campo de alto aumento indican dao o lesin activa de los tbulos renales. Hay grandes dificultades en la identificacin precisa de las clulas de los tbulos renales, especialmente, para diferenciarlas de las clulas mononucleares comnmente encontradas en la orina. Por microscopa de campo claro, las clulas tubulares renales son poligonales y de tamao ligeramente menor que los leucocitos.(21) Cuerpos grasos ovales. Los cuerpos grasos ovales son clulas del epitelio tubular renal que estn llenas de lpidos absorbidos o que han sufrido cambios degenerativos celulares. A menudo los cuerpos grasos ovales son asociados con proteinuria y lipiduria y son caractersticos del sndrome nefrtico y diabetes mellitus.(21) Clulas epiteliales de transicin. En la orina normal se pueden encontrar unas pocas clulas de transicin (uroteliales). Un gran nmero de clulas transicionales puede indicar procesos inflamatorios de la vejiga, cateterizacin o estados patolgicos malignos Por microscopa de campo claro, las clulas transicionales aparecen redondas u ovaladas, miden de 40 a 60 m, y tienen un ncleo localizado centralmente. Los bordes citoplsmicos de esas clulas aparecen engrosados y rgidos. Cuando los ncleos de las clulas transicionales llegan a agrandarse o a tornarse irregulares, se recomienda emplear tcnicas citolgicas con el fin de detectar enfermedades malignas del sistema urinario.(21) Clulas epiteliales escamosas. Las clulas epiteliales escamosas se alinean en la porcin distal del tracto urinario inferior y en el tracto genital femenino. Las clulas escamosas son las clulas ms grandes encontradas en la orina. Tienen un citoplasma grande y plano con un ncleo pequeo. Frecuentemente, una o ms hileras de esas clulas pueden plegarse. La presencia de clulas escamosas en la orina usualmente indica contaminacin (vaginal, en mujeres y uretral en hombres no circuncidados) o metaplasia escamosa de la vejiga, y representan el tipo menos importante de clulas epiteliales encontradas en la orina.(21) Fragmentos de tejidos en la orina.

En la orina, pueden observarse algunos conglomerados o fragmentos de material de apariencia slida. Debido a su gran tamao, este material es identificado en la inspeccin inicial de la orina. Es de color generalmente blanco o bronceado. Es muy importante establecer la identidad de este material para un diagnstico seguro. Esto implica transferirlo a un fijador apropiado con el fin de preservarlo para una evaluacin citolgica o histolgica. La necrosis papilar renal o los tumores de la vejiga son las entidades mas frecuentemente responsables de desprender grandes fragmentos de tejido en la orina.(21) Espermatozoides. Los espermatozoides pueden ser fcilmente reconocidos en la orina de un hombre despus de la eyaculacin o en la orina de una mujer por contaminacin vaginal despus del coito. Su identificacin es de limitada importancia clnica y la presencia de espermatozoides, generalmente, no es reportada.(21) Cilindros renales. Los cilindros renales (urinarios) son estructuras cilndricas que se organizan en el nefrn y su importancia proviene de su localizacin. Estn formados por uromucoide (mucoprotena de Tamm-Horsfall), que est siempre presente en la orina, usualmente en suspensin. Este uromucoide es producido por las clulas del epitelio tubular renal de la seccin ascendente del asa de Henle. Los cilindros se forman como consecuencia del estancamiento de la orina y de la precipitacin del uromucoide. El incremento en la concentracin de protenas, sales, y un pH urinario bajo son algunos de los factores que contribuyen a su formacin. Debido a que la precipitacin de esta protena depende de la concentracin y composicin de la orina, los cilindros se forman ms fcilmente en la porcin distal del nefrn y en los ductos colectores del rin, donde la orina es ms concentrada. En pacientes con protena de Bence Jones (mieloma mltiple), los cilindros pueden formarse en los tbulos convolucionados proximales. Estas formaciones cilndricas presentes en la orina reflejan las formas (largas o cortas) y dimetros (delgados y gruesos) de los lmenes de los tbulos renales en donde se formaron. Su nmero y propiedades cuantificables aportan valiosos indicios sobre la naturaleza de la enfermedad del parnquima renal. Microscpicamente, los cilindros se caracterizan por la apariencia de su matriz (hialina, granular, crea), por los constituyentes celulares (eritrocitos, leucocitos, o clulas del epitelio tubular renal) o por el tipo de material particulado embebido en la matriz (grnulos finos, gruesos o fibrina). La identificacin exacta de los cilindros, especialmente de los tipos celulares, es difcil cuando se hace en preparaciones hmedas no coloreadas visualizadas en microscopios bajo la luz directa o campo claro. Se necesita un microscopista hbil para evitar las interpretaciones errneas. La visualizacin de los cilindros mejora con el empleo de microscopios con contraste de fases, de filtros de contraste o coloraciones especiales. Para propsitos diagnsticos de enfermedad renal, los cilindros se han clasificado como fisiolgicos o patolgicos.(21)

Grasas. Las grasas se encuentran en la orina de pacientes quienes han presentado embolismo graso despus de lesiones severas con aplastamiento seo, degeneracin grasa del rin o sndrome nefrtico. La grasa aparecer en la superficie de la orina recolectada en la ltima parte de la miccin. En el sedimento urinario se pueden encontrar clulas epiteliales vacuoladas. La identificacin de las gotas de grasa se facilita empleando coloraciones especiales para grasa como Oil Red O o Sudn III.(21)

UNIDAD III METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y LPIDOS 3.1 GLUCOSA Mtodo enzimtico (GOD-PAD) 1.0 INTRODUCCIN Los carbohidratos se definen como aldehdos y cetonas polihidroxlicos (aldosas y cetosas, respectivamente). Los carbohidratos simples como la glucosa se denominan monosacridos. Dos monosacridos ligados por un puente llamado glucosdico forman un disacrido. Ms de dos monosacridos unidos por puentes glucosdicos se denomina polisacrido. Los carbohidratos de la dieta consisten de monosacridos tales como la glucosa, fructosa y galactosa; de disacridos tales como la sacarosa, lactosa y maltosa y de polisacridos tales como el almidn. Las enzimas intestinales convierten a los disacridos y polisacridos en monosacridos. La principal funcin bioqumica de la glucosa es la de proporcionar energa para los procesos de la vida. El adenosn trifosfato ("ATP") es la fuente de energa universal para las reacciones biolgicas. La oxidacin de la glucosa por las vas glucoltica y del cido ctrico es la fuente principal de energa para la biosntesis del ATP. El sistema para regular los niveles de glucosa sangunea funciona para lograr dos fines. El primero es para almacenar glucosa en exceso en relacin a las necesidades corporales inmediatas en un reservorio compacto (glucgeno) y el segundo es para movilizar la glucosa almacenada de manera que mantenga el nivel de glucosa sangunea. La regulacin de la glucosa sangunea es esencial para mantener al cerebro, cuya fuente energtica primaria es la glucosa, abastecido por una cantidad constante de la misma. La funcin de la insulina es desviar la glucosa extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular en la forma de macromolculas (como el glucgeno, lpidos y protenas). Es as que la glucosa es almacenada en tiempos de abundancia para los momentos de necesidad. En respuesta a la baja glucosa en sangre, como en perodos de ayuno, una serie de agentes hiperglucemiantes acta en las vas metablicas intermediarias para formar glucosa a partir de las macromolculas almacenadas. De esta forma las protenas y el glucgeno son metabolizados para formar glucosa-6-fosfato (gluconeognesis), la cual es hidrolizada a glucosa en el hgado y liberada a la sangre para mantener los niveles de glucosa sangunea. Los agentes hiperglucemiantes ms importantes son el glucagn, la epinefrina, el cortisol, la tiroxina, la hormona de crecimiento y ciertas hormonas intestinales. El comportamiento de cada uno de estos agentes es diferente en la regulacin de la glucosa sangunea; mientras que la insulina favorece el metabolismo anablico (sntesis de macromolculas), estas hormonas, en parte, inducen el metabolismo catablico para romper grandes molculas.(6) Cuando se tiene un exceso de glucosa en la sangre por arriba del lmite superior normal para una edad, se presenta la hiperglucemia. Aunque los valores altos de glucosa srica en ayunas se relacionan con suma frecuencia con la

presencia de diabetes sacarina, el numero de enfermedades y trastornos fisiolgicos que pueden llevar a incrementos mayores es vasto. El aumento de la concentracin de glucosa srica se dan en: respuesta a la tensin, enfermedad de Cushing, diabetes mellitus, acromegalia, hipertiroidismo, pancreatitis crnica, administracin de algunos frmacos como diurticos clorotiacdicos porque suprimen la secrecin de insulina, coma hiperosmolar no cetnico. La hipoglucemia es un trastorno caracterizado por una concentracin de glucosa en ayunas, menor al lmite inferior normal para el grupo de edad y esto sucede en: enfermedad heptica, desnutricin, posgastrectoma, tolerancia deficiente a la glucosa, administracin excesiva de insulina, hipoglucemia funcional o espontnea, ingestin de alcohol en ayunas. Debido a que la concentracin de glucosa srica por lo general se vuelve anormal slo cuando hay un trastorno grave de esta interaccin, el verificar la glucosa srica ayuda a evaluar la funcin e integridad del sistema.(15) La prueba de glucosa en ayunas evala de modo aproximado la capacidad del cuerpo para regular la glucosa y proporciona informacin acerca de la clase de anormalidad, si es que la hay. No se tomarn alimentos ni bebidas, excepto agua, cuando menos por ocho horas antes de tomar la muestra.(5) 2.0 0BJETIVOS

Destacar la importancia de la glucosa en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas. Determinar la concentracin de glucosa en estado basal y posprandial en una muestra biolgica mediante el mtodo enzimtico colorimtrico.

3.0 FUNDAMENTO DEL MTODO La enzima glucooxidasa cataliza la oxidacin de glucosa a gluconato y perxido de hidrgeno. La concentracin de glucosa es proporcional al H2O2, este puede medirse aparendolo con un indicador de peroxidasa. La determinacin de glucosa se efecta mediante el mtodo de Trinder segn las siguientes reacciones: GOD Glucosa + O2 + H2O POD 2H2O2 + Fenol + 4-AF Abreviaturas: GOD = Glucosa oxidasa Quinona + 4H2O . H2O2 + Gluconato

POD = Peroxidasa 4-AF = 4-aminofenazona.(14) 4.0 PREPARACIN

4.1 MUESTRA CLNICA: Suero o plasma venoso. La muestra debe recolectarse en ayuno excepto por el agua, durante ocho horas cuando menos antes de la prueba. La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapn rojo para suero el cual no contiene anticoagulante, o de color lila el cual contiene EDTA anticoagulante para obtener plasma. La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 min para separar el suero y plasma.(9) La glucosa en suero o plasma es estable al menos 3 das a 2-8C.(14) Nota: Los anticoagulantes de uso corriente como la EDTA, oxalato, heparina o fluoruro no afectan los resultados. La hemlisis hasta 0,3 g/dL de hemoglobina no interfiere.(14) La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si la identificacin es inadecuada. c) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. d) Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis permisible.(9) No se han observado interferencias por hemoglobina(4 g/L); bilirrubina (20mg/L); creatinina (100mg/L), galactosa (1g/L).(14) 4.2 REACTIVOS

REACTIVO 1 Tampn REACTIVO 2 Vial de enzimas

TRIS pH 7.4 Fenol

92 mmol/L 0.3 mmol/L

Glucosa oxidasa 15000 U/L Peroxidasa 1000 U/L 4-Aminofenazona 2.6 mmol/L ESTNDAR Sol. Glucosa 100 mg/L CONTROL NORMAL Spinreact. Preparacin: Disolver los enzimas del R.2 en el contenido del R.1. Esta solucin monorreactiva es estable 1 mes a 2-8C 7 das a 15 25C, al abrigo de la luz.

Nota: Cada reactivo deber ser etiquetado: colocar las iniciales de la persona que lo prepar, contenido, concentracin, nmero de lote, fecha de preparacin, fecha de caducidad y requerimientos de almacenamiento. No usar reactivos fuera de la fecha indicada. No pipetee los reactivos con la boca y evite el contacto con piel y ojos.(14) 4.3 EQUIPO Espectrofotmetro o analizador para lecturas de 490-550 nm. Centrifuga. 4.4 MATERIAL 5 Tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla. 5.0 PROCEDIMIENTO

5.1 CONDICIONES DE ENSAYO Longitud de onda: 505nm (490-550) Temperatura: 30/37C Cubeta: 1cm. Paso de luz Ajuste a cero con blanco de reactivo. 5.2 DESARROLLO DE LA PRCTICA: 1. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Estndar -Muestra -Muestra Control -Reactivo 1.0mL Estndar 10L --1.0mL Muestra -10L -1.0mL Muestra Control --10L 1.0mL

2. Mezclar e incubar 10 min a 37C 30 min a temperatura ambiente. 3. Leer la absorbancia (A) a 505nm. 4. Coloracin estable 30 minutos a temperatura ambiente.(14) 6.0 RESULTADOS 6.1 CLCULOS:

Abs. Muestra mg /dL Glucosa = Abs. Estndar x Conc. estndar.

mg/dL x 0.0555 = mmol Concentracin del estndar: 100 mg/dL.(14) 6.2 LINEALIDAD DEL MTODO: El mtodo es lineal hasta valores de 500 mg/dL. Si la concentracin de glucosa es superior, diluir la muestra a 1:2 con solucin salina 0.9% y multiplicar el resultado por 2.(14) 7.0 VALORES DE REFERENCIA mg/dL 55-110 30-60 mmol/L 3.05 - 6.11 1.07-3.3 (14)

Suero o plasma Neonato nacido a trmino

3.2 COLESTEROL TOTAL Mtodo enzimtico (GOD-PAD) 1.0 INTRODUCCIN El colesterol es una sustancia hidrfoba, insoluble en medio acuoso y por tanto insoluble en el plasma sanguneo. El colesterol se sintetiza sobre todo en el hgado, pero tambin en la piel, intestino, glndulas suprarrenales, el ovario, el testculo, el rin y el pulmn. Todas las sustancias que en el organismo producen cido actico pueden ser precursoras del colesterol (cidos grasos, glucosa, algunos aminocidos, etc.). El colesterol es esencial para el funcionamiento normal del organismo ya que es: Componente estructural esencial de membranas de todas las clulas animales y partculas subcelulares. Precursor de cidos biliares. Precursor de hormonas esteroides. Precursor de vitamina D. Debido a la atencin que se ha dado a los alimentos libres de colesterol, es interesante observar que el organismo produce la mayor parte del colesterol en forma endgena. Las fuentes dietticas aportan tan slo de 150 a 300 mg diarios mientras que el hgado sintetiza 1.5 g al da. De hecho el exceso de carbohidratos y protenas de la dieta se utiliza para producir molculas de acetato, que posteriormente sirven para producir colesterol y cidos grasos. Los lpidos endgenos que genera el hgado son transportados posteriormente en forma de lipoprotenas para su uso en todo el cuerpo. La circulacin sistemtica de colesterol es posible gracias a la formacin de complejos solubles por unin a protenas, las lipoprotenas sricas y entre ellas las de tipo low density lipoproteins (LDL) son las que representan el mayor porcentaje, con aproximadamente un 60-70% del total. El colesterol es un constituyente primario de las lipoprotenas de baja densidad (LDL), pero puede encontrarse tambin en lipoprotenas de alta densidad (HDL) y en las de muy baja densidad (VLDL). Las diversas lipoprotenas y apoprotenas asociadas, cuando se analizan directa o indirectamente, producen datos diagnsticos tiles para el analista, ya que es posible determinar el riesgo de coronariopata. Clnicamente es importante, ya que existe una relacin entre la concentracin del colesterol plasmtico y la presencia de problemas cardacos coronarios. Los mtodos analticos que se emplean actualmente utilizan colesterolesterasa para el colesterol y permite examinar lotes grandes de muestras con exactitud y rapidez.(5) Las concentraciones sricas de colesterol disminuyen en: desnutricin, esteatorrea, hepatitis, hipertiroidismo, personas con infeccin aguda y anemia, cncer. Las concentraciones sricas de colesterol aumentan en: hiperlipoproteinemia, cncer de la cabeza del pncreas, hipotiroidismo, sndrome nefrtico, el tercer trimestre del embarazo, predisposicin gentica.(15)

2.0 OBJETIVOS Explicar la importancia del colesterol en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas. Determinar la concentracin de colesterol en una muestra biolgica mediante el mtodo enzimtico colorimtrico. 3.0 FUNDAMENTO DEL MTODO La colesterol esterasa hidroliza los steres de colesterol presentes en la muestra dando colesterol libre y cidos grasos, en una posterior oxidacin enzimtica mediante la colesterol oxidasa se forma H2O2 y colesterona. El H2O2 se valora por la reaccin Trinder, mediante un cromgeno, fenol y 4Aminoantipirina, en presencia de Peroxidasa, formando una quinonimina cuya coloracin, encarnada, es proporcional a la concentracin de colesterol presente en la muestra.
Colesterol Esterasa

steres de colesterol + H2O

Colesterol oxidasa

Colesterol + cidos grasos. 4-colesterona + H2O2

Peroxidasa

Colesterol + O2

2H2O2 + 4-amino-antipirina + fenol

Quinonimina + H2O.(14) 4.0 PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA

El paciente debe encontrarse en un estado fisiolgico regular (sin ejercicio vigoroso) y bajo su dieta ordinaria del da anterior a la prueba. Suero. La muestra debe recolectarse en ayuno total excepto agua, durante un lapso de 12 a 14 horas antes de la prueba. La muestra debe recolectarse en tubo recolector al vaco de tapn rojo el cual no contiene anticoagulante. La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm para separar el suero. La estabilidad de la muestra es de una semana guardada, tapada y a 2-8 C 3 meses congelada a -20 (9) C. Nota: La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si la identificacin es inadecuada.

c) Si existe hemlisis. d) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. e) Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis permisible. f) Si existen interferencias No interfieren en el ensayo los siguientes compuestos y concentraciones: Ac. Urico 1.5 mmol/L Ac. Saliclico 3.6 mmol/L Paracetamol 0.66 mmol/L Fenobarbital 0.4 mmol/L Glucosa 28 mmol/L Cafena 52 mol/L Ac. Nicotnico 0.16 mmol/L Cortisona 5 mmol /L El c. Ascrbico por enzima de 300 mol/L interfiere negativamente.(14) 4.2 REACTIVOS

REACTIVO 1 REACTIVO 2 Vial enzimas

Tampn pH 6.9 90mmol/L Fenol 26 mmol/L

Peroxidasa 1250 U/L Colesterol esterasa Colesterol oxidasa 300 U/L 4-Aminoantipirina 0.4 mmol/L ESTNDAR Solucin Colesterol 200 mg/dL CONTROL NORMAL Spinreact. Preparacin: Disolver con agitacin suave el contenido del vial de enzimas R.2 con un poco de R.1 amortiguador, una vez disuelto el liofilizado retornar al frasco original del amortiguador, homogeneizar la solucin. Esta solucin es estable 4 meses en refrigeracin 2-8C 40 das a 1525C protegido de la luz.

Nota: Cada reactivo deber ser etiquetado: las iniciales de la persona que lo prepar, el contenido, la concentracin, el nmero de lote, la fecha de preparacin, la fecha de caducidad y requerimientos de almacenamiento. No se debern usar reactivos fuera de la fecha indicada. No se pipetearn los reactivos con la boca y evitar el contacto con piel y ojos.(14) 4.3 EQUIPO

Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 500-550nm. El alumno debe consultar el manual del espectrofotmetro que va a utilizar para saber cuales son las instrucciones de operacin y los datos y caractersticas de funcionamiento del instrumento. Centrifuga. Bao de agua a 25 o 37 C. 4.4 MATERIAL 5 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 1Micropipetas de 1mL 1Micropipeta de 10L Puntas para micropipeta. Gradilla. 5.0 PROCEDIMIENTO 5.1 CONDICIONES DE ENSAYO Longitud de onda.505nm (500-550) Cubeta.1 cm paso de luz Temperatura.25 37C Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. 5.2 DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco ---1.0mL Estndar 10L --1.0mL Muestra -10L -1.0mL Muestra Control --10L 1.0mL

Estndar Muestra Muestra Control Reactivo al uso

2. Mezclar e incubar 5 minutos a 37C 10 min a temperatura ambiente. 3. Ajustar el aparato a cero con el blanco de reactivos. 4. Leer a 505nm (500-550) la densidad ptica del estndar y de la muestra. 5. La coloracin ser estable durante 60 min. Nota: Se deber procesar junto con las muestras algn suero control valorado con niveles normal y anormal, que le permitir tener un control de la exactitud y precisin de los resultados.(14)

6.0 RESULTADOS 6.1 CLCULOS Abs de la muestra Abs del estndar X Concentracin del estndar (200 mg/dl)= Concentracin de colesterol.

Factor de conversin: mg/dL x 0.0258 = mmol/L (SI).

6.2 LINEALIDAD DEL MTODO Hasta valores de 600 mg/dL o 15.4 mmol/L. Para concentraciones superiores la muestra se diluye 1:2 con solucin salina 0.9%, multiplicando el resultado por 2.(14) 7.0 VALORES DE RIESGO

Valores sospechosos desde 220 mg/dL o 5.7 mmol/L. Valores elevados desde 260 mg/dL o 6.7 mmol/L.(14)

3.3 TRIGLICRIDOS Mtodo enzimtico (GOD-PAD) MTODO ENZIMTICO 1.0 INTRODUCCIN Las fuentes de lpidos pueden ser exgenas o endgenas, sus vas metablicas hacia todas las reas del organismo y procedentes de ellas constituyen una red compleja de reacciones qumicas en las que participan molculas individuales y lipoprotenas de gran tamao. Los triglicridos estn constituidos por glicerol y cidos grasos. Estos forman parte de las 5 clases de lipoprotenas que transportan a los lpidos en el plasma: quilomicrones, constituidos casi totalmente por triglicridos dietticos; lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL); lipoprotenas de densidad intermedia (IDL); lipoprotenas de baja densidad (LDL), conocidas tambin como lipoprotenas beta y lipoprotenas de alta densidad (HDL), tambin conocidas como lipoprotenas alfa. Aproximadamente del 40% del consumo de caloras en la dieta consta de lpidos y alrededor del 35% provienen de lpidos animales y el 5% de lpidos vegetales poli-insaturados. Los triglicridos constituyen una porcin importante del (98 a 99%) de los lpidos animales y el resto son colesterol y otros lpidos.(6) Los padecimientos en los cuales predominan los triglicridos son: xantoma eruptivo, lipemia retiniana, organomegalia, pancreatitis, intolerancia a la glucosa, hiperuricemia, aterosclerosis prematura, diabetes mellitus insulinopnica, disglobulinemia, lupus eritematoso, embarazo, uso de hormonas, enfermedad por almacenamiento de glucgeno, alcoholismo, enfermedad de Gaucher, mieloma. Los incrementos en los valores de triglicridos en el infarto miocrdico pueden durar un periodo tan prolongado como de un ao. Las concentraciones de triglicridos en si, tienen poco valor de prediccin y aumentan despus de la ingestin de grasa.(15) 2.0 OBJETIVOS Realizar la determinacin de triglicridos sricos en una muestra biolgica con un mtodo enzimtico. Destacar la importancia de los triglicridos en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas. 3.0 FUNDAMENTO DEL MTODO

Los triglicridos son hidrolizados enzimticamente a glicerol, el cual, mediante Glicerol cinasa y Glicerol-P-oxidasa, libera el perxido de hidrgeno que se valora mediante la reaccin de Trinder, de acuerdo a las siguientes reacciones.
LPL

Trigliceridos + H2O
GK

Glicerol + Acidos grasos. Glicerol-3-P + ADP.

GPO

Glicerol + ATP Glicerol-3-P + O2 H2O2 + 4-AF + p-clorofenol

Dihidroxiacetona-P + H2O2.
POD

Quinona + H2O.

La cantidad de la quinona formada es proporcional a la concentracin de triglicridos. Abreviaturas: LPL = Lipoproteinlipasa; GK = Glicerol Cinasa ; GOP = GlicerolP-oxidasa; POD = Peroxidasa.(14) 4.0 PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA Suero El paciente deber encontrarse en un estado fisiolgico regular (sin ejercicio vigoroso) y bajo su dieta ordinaria del da anterior a la prueba. La muestra debe recolectarse en ayuno total de 12 a 14 horas antes de la prueba, excepto agua. La muestra debe recolectarse en tubo recolector al vaco de tapn rojo el cual no contiene anticoagulante. Para separar el suero la muestra debe centrifugarse durante 10 minutos a 3500rpm.(9) Nota: Los triglicridos son estables en suero 3 das a 2-8C o una semana a 1525C.(14) La muestra ser inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si la identificacin es inadecuada. c) Si existe hemlisis. d) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. e) Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis permisible.(9) 4.2 REACTIVOS

REACTIVO 1 Tampn REACTIVO 2 Vial enzimas

Tampn GOOD pH 7.5 p-clorofenol Lipoproteinlipasa Glicerol Kinasa Glicerol-P-oxidasa Peroxidasa 4-Aminofenazona ATP ESTNDAR Sol. Triglicridos CONTROL NORMAL Spinreact.

50mmol/L 2mmol/L 150000 U/L 500 U/L 2500 U/L 440 U/L 0.1 mmol/L 0.1 mmol/L 200 mg/dL

Preparacin: Disolver el contenido del vial enzimas R.2 en el frasco de solucin tampn R.1 Nota: El reactivo al uso es estable 6 semanas a 2-8C o una semana a 15-25C. Cada reactivo deber ser etiquetado con los siguientes datos: iniciales de la persona que lo prepar, contenido, concentracin, nmero de lote, fecha de preparacin, fecha de caducidad y requerimientos de almacenamiento. Los reactivos no debern utilizarse fuera de la fecha indicada. No se debern pipetear los reactivos con la boca y se debe evitar el contacto con piel y ojos.(14) 4.3 EQUIPO Espectrofotmetro o analizador para lecturas a 500-550nm. El alumno deber consultar el manual del espectrofotmetro que va a utilizar para aplicar correctamente las instrucciones de operacin, datos y caractersticas de funcionamiento del instrumento. Centrifuga. Bao de agua a 25 o 37 C. 4.4 MATERIAL 5 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 1 Micropipetas de 1mL 1 Micropipeta de 10L Puntas para micropipeta. Gradilla. 5.0 PROCEDIMIENTO 5.1 CONDICIONES DE ENSAYO Longitud de onda.505nm (490-550)

Temperatura: 25/ 30/37C Cubeta.1 cm paso de luz Ajustar el espectrofotmetro a cero frente a agua destilada. 5.2 DESARROLLO DE LA PRCTICA: 1. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Estndar Estndar -10L Muestra --Muestra Control --Reactivo al uso 1.0mL 1.0mL

Muestra -10L -1.0mL

Muestra Control --10L 1.0mL

2. Mezclar e incubar 5 min a 37C 10 min a temperatura ambiente. 3. Medir la densidad ptica a 505 nm (490-550), frente al blanco de reactivos. 4. El color ser estable durante 30 min.(14)

6.0 RESULTADOS 6.1 CLCULOS Absorbancia de la muestra X Conc. del estndar = Conc. muestra Absorbancia del estndar Factor de conversin: mg/dL X 0.0113 = mmol/L Conc. Estndar: 200mg/dL.

6.2 LINEALIDAD DEL MTODO El mtodo es lineal hasta valores de 1000mg/dL (11.3mmol/L). Para concentraciones superiores se deber diluir la muestra a 1:2 con solucin salina 0.9%, multiplicando el resultado por 2.(14) 7.0 VALORES DE REFERENCIA Valores sospechosos a partir de 150 mg/dL (1.7 mmol/L). Valores elevados a partir de 200 mg/dL (2.26 mmol/L).(14) UNIDAD IV

UNIDAD IV METABOLISMO OSEO Y MINERAL 4.1 CALCIO Mtodo Colorimtrico 1.0 INTRODUCCIN El calcio y el metabolismo mineral representan un delicado y complejo proceso biolgico que comprende muchos componentes interrelacionados. El metabolismo homeosttico normal depende de la disponibilidad de los substratos minerales y de las interacciones de los tejidos como los del hueso, el rin y el tracto gastrointestinal con las hormonas calciotrpicas HPT, calcitonina (CT). El calcio es el quinto elemento ms abundante en el cuerpo humano. El cuerpo humano contiene cerca de 1200 g de calcio en las personas adultas y aproximadamente 28 g en los neonatos (recin nacidos a trmino). Casi todo el calcio del cuerpo (99%) reside en el hueso. El remanente reside en los fluidos del cuerpo y tiene un papel crtico muy importante en un sin nmero de procesos fisiolgicos incluyendo la contraccin muscular, la neurotransmisin, el transporte de membrana, las reacciones enzimticas, la secrecin hormonal y la coagulacin sangunea. En la circulacin, el calcio existe en tres formas: 45% del calcio srico total es la forma biolgicamente activa de calcio inico, 45% est unido a la protena principalmente albmina y 10% est unido a complejos aninicos (fosfato, lactato, citrato). La acidez gstrica, la aportacin suficiente de vitamina D, son factores que regulan la absorcin y retencin del calcio. En el adulto, el calcio diettico es absorbido por el intestino mediante protenas especficas unidas al calcio. Este proceso est bajo el control activo de la vitamina D. La mayora del calcio que se absorbe se deposita en los huesos. La principal ruta de excrecin de calcio en el cuerpo es a travs de los riones.(18) Se encuentran valores altos de calcio en el hiperparatiroidismo, lesiones osteolticas, acidosis tubular renal y se encuentra disminuido en el hipoparatiroidismo, raquitismo, insuficiencia renal.(15) 2.0 OBJETIVOS Determinar la concentracin de calcio en una muestra biolgica mediante el mtodo analtico colorimtrico cresolftalena complexona. Conocer la importancia del calcio en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas.

3.0 FUNDAMENTO DEL MTODO El calcio con la cresolftalena en un medio alcalino forma un complejo violeta, cuya intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de calcio existente en la muestra.(14)

4.0PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA Suero La muestra debe recolectarse en ayuno. La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapn rojo. La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 min para separar el suero.(9) El calcio en suero permanece estable durante: 10 das a 2-8C durante 8 meses a 20 (14) C. Nota: Se recomienda utilizar material de plstico de un solo uso para evitar contaminaciones. En caso de utilizar material de vidrio deber lavarse con cido ntrico diluido a la mitad con agua destilada, enjuagar varias veces con agua destilada y secar antes de su uso. Trazas de detergente utilizados en el laboratorio pueden quelar la reaccin e invalidarn la determinacin. No se deben emplear plasmas obtenidos con agentes anticoagulantes que se complejan con el calcio, como EDTA, oxalato,.. Al obtener el suero se deber separar el cogulo lo antes posible, para evitar el trasiego de iones calcio hacia los hemates.(14) La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si la identificacin es inadecuada. c) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis d) permisible.(9) 4.2 REACTIVOS REACTIVO 1 Tampn etanolamina 500 mmol/L REACTIVO 2 Cresolftalena 0.62 mmol/L Cromgeno 8-hidroxiquinolena 69 mmol/L STANDAR Sol. Calcio 10 mg/dL CONTROL NORMAL Spinreact. Preparacin: Mezclar segn la proporcin: 50 vol. de R.1 y 1 vol. de R.2. La estabilidad del reactivo es de 5 das a 2-8C. Nota: En refrigeracin ambos reactivos pueden permanecer estables hasta su fecha de caducidad, indicada en el envase.

Cada reactivo deber ser etiquetado con los siguientes datos: las iniciales de la persona que lo prepar, el contenido, la concentracin, el nmero de lote, la fecha de preparacin, la fecha de caducidad y requerimientos de almacenamiento. No se debern usar reactivos fuera de la fecha indicada. No se pipetearn los reactivos con la boca y debe evitar el contacto con piel y ojos.(14) 4.3 EQUIPO Espectrofotmetro o analizador para lecturas de 550-590 nm. El alumno deber consultar el manual del espectrofotmetro que va a utilizar para la aplicacin correcta de las instrucciones de operacin, datos y caractersticas de funcionamiento del instrumento. Centrifuga. 4.4 MATERIAL 5 Tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla.

5.0 PROCEDIMIENTO 5.1 CONDICIONES DE ENSAYO Longitud de onda: 570nm (550-590) Temperatura: 25/ 30/37C Cubeta: 1cm. Paso de luz Ajuste a cero con blanco de reactivo. 5.2 DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Estndar -Muestra -Muestra Control -R.1 Tampn 1.0ml R.2 Color 1 gota Estndar 10L --1.0ml 1 gota Muestra -10L -1.0ml 1gota Muestra Control --10L 1.0ml 1gota

2. Mezclar y esperar 5 min. a temperatura ambiente. 3. Leer frente a blanco de reactivos.

4. Coloracin estable 40 minutos.(14) 6.0 RESULTADOS 6.1 CLCULOS Abs. Muestra mg /dL Calcio = Abs. Estndar x Conc. Estndar.

mg/dL

x 0.25 = mmol.(14)

6.2 LINEALIDAD DEL MTODO El mtodo es lineal hasta valores de 15 mg/dL. Si la concentracin de calcio es superior, diluir la muestra a 1:2 con solucin salina 0.9% y multiplicar el resultado por 2.(14) 7.0 VALORES DE REFERENCIA Suero recin nacidos 8.0-13.0 mg/dL (2.00-3.25 mmol/L). Nios 10.0-12.0 mg/dL (2.50-3.00 mmol/L). Adultos 9.0-11.0 mg/dL (2.25-2.75 mmol/L).(14)

4.2 FSFORO 1.0 INTRODUCCIN El hueso en humanos contiene de 80 a 85% del fsforo corporal total; aparentemente 9% se encuentra en msculo y el resto est en las vsceras y lquido extracelular. La concentracin intracelular de fsforo (fosfatos y fsforo inorgnico) es mayor que la de los niveles extracelulares. El fsforo abunda en el organismo como anin intracelular y extracelular. Intracelularmente, existe en forma de fosfato orgnico en combinacin con lpidos y protenas. En forma de fosfolpidos y fosfoprotenas, el fsforo es esencial para la integridad estructural de la membrana celular y es un componente importante de los cidos nucleicos y de los nucletidos de alta energa como ATP. La mayor parte del fosfato extracelular

(850) % se localiza en los huesos, donde se combina con el calcio en la hidroxiapatita. Casi 85% del fosfato srico existe como monofosfato inorgnico o fosfato dicido. En estas formas acta como principal amortiguador del sistema urinario para facilitar la excrecin de H+. El restante 12 a 15% est enlazado con protenas. El fsforo del suero existe principalmente en forma de fosfato inorgnico.(18) La hiperfosfatemia es muy a menudo el resultado de la disminucin de la excrecin renal de los iones fosfatos, como ocurre en la insuficiencia renal aguda y crnica, particularmente cuando la relacin de la filtracin glomerular est reducida en menos del 25% de lo normal. La hiperfosfatemia tambin puede resultar de un aumento de la carga de fosfato corporal, la cual puede en turno resultar de los enemas y los laxantes conteniendo fosfatos, transfusiones de sangre o hiperalimentacin, como el resultado de la destruccin masiva celular posterior a la lisis por terapia citotxica (sndrome de lisis tumoral), o por lesiones de tejido (hipertermia, hipoxia, o lesiones por choque), las cuales resultan en randomiolsis y hemlisis. La reabsorcin tubular renal de fosfatos es responsable de la hiperfosfatemia observada en el hipoparatiroidismo, hipertiroidismo, hipogonadismo y exceso de hormona de crecimiento. La hipofosfatemia moderada, la cual se define como la concentracin de fsforo en suero entre 10 y 25 mg/L en los adultos, es generalmente asintomtica. En los nios, las concentraciones de fsforo en suero por abajo de 40 mg/L son a menudo consideradas anormales. La hipofosfatemia puede resultar de una disminucin en la reabsorcin intestinal de fosfato o por un aumento en la prdida urinaria de fosfatos y un desplazamiento endgeno del fsforo inorgnico de los compartimientos de los fluidos extracelulares a los intracelulares.(6)

2.0 OBJETIVOS Determinar la concentracin de fsforo en una muestra biolgica mediante el mtodo analtico fosfomolibdato UV. Conocer la importancia del fsforo en el metabolismo humano y su relacin con diversas patologas. 3.0FUNDAMENTO DEL MTODO El fsforo es cuantificado segn la reaccin siguiente: Molibdato amonico + Sulfrico Complejo fosfomolibdato La absorcin mxima del complejo se mide a 340 nm.(14) 4.0PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA

Suero La muestra debe recolectarse en ayuno. La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapn rojo. La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 min para separar el suero.(9) El fsforo en suero es estable durante 10 das a 2-8C 8 meses a 20 (14) C. Nota: Se recomienda utilizar material de plstico de un solo uso para evitar contaminaciones. La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio. b) Si el suero presenta hemlisis. c) Si la identificacin es inadecuada. d) Si el tubo de recoleccin no es el adecuado. e) Cuando se haya excedido el tiempo mximo de anlisis permisible.(9) 4.2 REACTIVOS Los reactivos son proporcionado por la casa comercial SPINREACT, cdigo 1001155. Acido sulfrico 210 mM Molibdato amnico 0.40 mM Detergente ESTNDAR Sol. Fsforo 5.0 mg/dL CONTROL NORMAL Spinreact. Nota: El reactivo est preparado para su uso. Cada reactivo deber ser etiquetado con los siguientes datos: las iniciales de la persona que lo prepar, el contenido, la concentracin, el nmero de lote, la fecha de preparacin, la fecha de caducidad y requerimientos de almacenamiento. No se debern usar reactivos fuera de la fecha indicada. No se pipetearn los reactivos con la boca y se evitar el contacto con piel y ojos.(14) 4.3 EQUIPO Espectrofotmetro o analizador para lecturas de 340nm. El alumno deber consultar el manual del espectrofotmetro que va a utilizar para aplicar correctamente las instrucciones de operacin, datos y caractersticas de funcionamiento del instrumento. Centrifuga. REACTIVO

4.4 MATERIAL 5 ubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla. 5.0 PROCEDIMIENTO 5.1 CONDICIONES DE ENSAYO Longitud de onda: 340 nm Temperatura: 25/ 30/37C Cubeta: 1cm. Paso de luz Ajuste a cero con blanco de reactivo. 5.2 DESARROLLO DE LA PRCTICA 1. Pipetear en tubos de ensayo: Blanco Estndar Estndar -10L Muestra --Muestra Control --Reactivo 1.0mL 1.0mL

Muestra -10L -1.0mL

Muestra Control --10L 1.0mL

2. Mezclar e incubar exactamente 5 min a 25/ 30/37C. 3. Leer frente a blanco de reactivos.(14) 6.0 RESULTADOS

6.1 CLCULOS Abs. muestra X conc. estndar = concentracin de fsforo Abs. estndar

mg/dL

x 0.323 = mmol/ L

Conc. estndar : 5.0 mg/dL (1.8 mmol/L).(14) 6.2 LINEALIDAD DEL MTODO El mtodo es lineal hasta valores de 15 mg/dL (4.84 mmol/L). Si la concentracin de la muestra es superior, se diluir a 1:2 con agua destilada y el resultado final se multiplicar por 2.(14) 6.3 Lmite de seguridad biolgica Mujeres 1.5-6.8 mg/dL (0.48-2.19 mmol/L). Hombres 2.1-5.6 mg/dL (0.68-1.80 mmol/L). Nios 4.0-7.0 mg/dL (1.29-2.26 mmol/L).(14)

UNIDAD V PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO HEPTICO

El hgado es el rgano principal que se encarga del metabolismo de los carbohidratos, protenas, lpidos, porfirinas y cidos biliares. Es capaz de sintetizar la mayora de las protenas del cuerpo con excepcin de las inmunoglobulinas, producidas por el sistema de las clulas plasmticas linfocticas. El hgado es tambin el sitio principal para el almacenamiento del hierro, glucgeno, lpidos y vitaminas. El hgado juega un papel importante en la desintoxicacin de los xenobiticos y la excrecin de los productos metablicos finales como bilirrubina, amonaco y urea. Alteraciones de la funcin heptica durante la enfermedad Ictericia La ictericia es una condicin general provocada por el metabolismo anormal o la retencin de la bilirrubina. La ictericia le produce una coloracin amarilla a la piel, membranas mucosas y escleras. Se puede observar la ictericia tpicamente con niveles de bilirrubina srica de aproximadamente 50 mg/dL. Los tres tipos principales de ictericia son: la preheptica, la heptica y la postheptica. La ictericia preheptica es el resultado de las anemias hemolticas agudas o crnicas. La ictericia heptica incluye los trastornos del metabolismo de la bilirrubina y los defectos en el transporte tales como: la enfermedad de CriglerNajer, el sndrome de Dubin-Johnson y la enfermedad de Gilbert, as como la ictericia fisiolgica del recin nacido y enfermedades que provocan la injuria o la destruccin hepatocelular.

Cada una de las enfermedades especficas del metabolismo de la bilirrubina representa un defecto en una de las etapas del procesamiento heptico de la bilirrubina srica. Por lo tanto, la enfermedad de Gilbert es causada por un defecto en el transporte de la bilirrubina de la albmina plasmtica al hepatocito. Aunque se presentan niveles elevados de bilirrubina no conjugada en este desorden familiar, no se elevan los niveles de bilirrubina conjugada. Un dao en la conjugacin con el UDP- glucornido, causada por una deficiencia de la enzima UDP-glucoroniltransferasa tambin provocar un incremento grande en la bilirrubina no conjugada. Cuando la deficiencia congnita, se conoce como la enfermedad de Crigler-Najer. Sin embargo, las deficiencias en la glucoronil transferasa se encuentran con mayor frecuencia en la ictericia neonatal o fisiolgica. La actividad de esta enzima es una de las ltimas funciones que se activan en la vida prenatal, ya que la bilirrubina no conjugada formada por el feto es eliminada por la placenta a la sangre materna. La ltima etapa en el procesamiento heptico de la bilirrubina es la etapa de postconjugacin en la cual se excreta el glucornido de bilirrubina de los microsomas hepticos a los canalculos. La dificultad en realizar este proceso, llamado el sndrome de Dubin-Johnson, provoca grandes incrementos en la bilirrubina conjugada srica y la orina muestra presencia de bilirrubina. Se ha promocionado la medicin de la bilirrubina delta como una mejor manera de evaluar la hiperbilirrubinemia resultante de la enfermedad heptica obstructiva. La fraccin tiene una vida media srica mayor que las otras fracciones. Si se encuentra elevada en concentraciones significativas, puede provocar un descenso aparentemente ms lento en la cada de la bilirrubina srica dando una falsa impresin de una falta de progreso a medida que la enfermedad heptica responde al tratamiento. La ictericia heptica incluye los desrdenes caracterizados por dao hepatocelular o necrosis, tales como hepatitis o cirrosis. La ictericia postheptica es causada generalmente por una enfermedad obstructiva biliar provocada por espasmos o contracciones del tracto biliar, la oclusin dctil por clculos o compresin por enfermedad neoplsica. Puesto que en estas enfermedades las funciones hepticas de transporte y conjugacin de la bilirrubina son normales, el incremento mayor en la bilirrubina srica implica a la fraccin conjugada. Debido a la imposibilidad de ser excretada adecuadamente por el hgado, en estos desrdenes aumenta la fraccin de bilirrubina conjugada en el suero, con el resultado de la aparicin de bilirrubina en la orina. Si la enfermedad hepatocelular es suficientemente severa para provocar ictericia, se aumentan tanto las fracciones de bilirrubina conjugadas como no conjugadas. La razn es el dao general en el metabolismo de la bilirrubina

5.1 BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA. MTODO DMSO

1. INTRODUCCIN La bilirrubina se origina por degradacin del grupo hem de la hemoglobina, que a su vez aparece en el plasma como consecuencia de la destruccin de los glbulos rojos en el sistema retculo endotelial. La hemoglobina, una vez liberada en el interior del eritrocito, se combina con las haptoglobinas, protenas plasmticas especficas para su transporte. En una primera etapa y tras su liberacin de la haptoglobina, se forma, por accin de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrlico del hem, formndose el compuesto denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por accin de una reductasa se transforma en bilirrubina. Desde un punto de vista analtico y clnico, interesa conocer los niveles de bilirrubina total y diferenciar cuantitativamente la "bilirrubina libre" o preheptica que aumenta principalmente en procesos de tipo hemoltico, de la "bilirrubina conjugada" o heptica que est incrementada en la disfuncin heptica y ms concretamente en fallos de los mecanismos de su eliminacin, a travs del sistema biliar, cuyo primer paso es introducirse del hepatocito a los canalculos biliares. 2. OBJETIVOS Demostrar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de bilirrubina en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la bilirrubina total y directa y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de bilirrubina en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO Casi todas las tcnicas de cuantificacin de la bilirrubina se basan en la reaccin de Malloy-Evelyn, que valora colorimtricamente por la formacin de azobilirrubina, de color rojo cereza, cuando a la bilirrubina se la hace reaccionar en determinadas condiciones con el cido sulfanlico diazotado. La bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona en medio acuoso con el reactivo de diazotacin, por lo que se le llam directa, pues al poner en contacto el suero y el reactivo apareca directamente el color. Sin embargo, la bilirrubina libre, poco polar, no da directamente la reaccin y es preciso aadir un tercer reactivo -que inicialmente fue el metanol- para que produzca la reaccin de diazotacin con la consiguiente aparicin del color; por este motivo se llam bilirrubina indirecta.

4. PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLINICA Suero La estabilidad de la muestra, una vez separada de los hemates y protegida de la luz, es de 3 meses a -20C, 4 das a 2-8C o un da de 20 a 25C 4.2 REACTIVOS Y MATERIAL Material necesario 5 ubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 200L. Puntas para micropipeta. Gradilla. Fotmetro termoestable a 37C con filtro de 546 nm. Acido sulfanlico 30 mmol/L (BD) Bilirrubina directa Acido clorhdrico 150 mmol/L Reactivo 2 Acido sulfanlico 30 mmol/L (BT) Bilirrubina total Acido clorhdrico 50 mmol/L Dimetilsulfxido 7 mol/L (DMSO) Reactivo 3 Nitrito de sodio 29 mmol/L PREPARACION Y ESTABILIDAD Todos los reactivos estn listos para su uso. Son estables hasta su fecha de caducidad indicada en el envase. 5. PROCEDIMIENTO Reactivo 1

5.1TCNICA Longitud de onda BT Total 546 nm BD Directa 578 nm Temperatura 25/30/37C Cubeta 1 cm paso de luz Lectura frente a aire o agua destilada Blanco Total Directa R.1 Bilirrub. directa -- -- 1.5 mL 1.5 mL R.2 Bilirrub. total 1.5 mL 1.5 mL R.3 Nitrito sdico -50 L 50 L Muestra 100 L 100 L Mezclar y esperar 5 min exactamente a temperatura ambiente. Leer las densidades pticas. 6. RESULTADOS

6.1Clculo (Total o Directa) Con calibrador Abs muestra - Abs blanco muestra X conc. Calibrador = mg/dL de bilirrubina Abs calibrador - Abs blanco calibrador Con factor Abs muestra - Abs (blanco muestra) x factor* = mg / dL de bilirrubina en la muestra
*Factor: Concentracin del calibrador Abs calibrador - Abs blanco calibrador Factor terico: Bilirrubina (T) = 19.1; Bilirrubina (D) = 14 Factor de conversin: mg/dL x 17.1 = mol / L.

6.2Linearidad Este mtodo es lineal hasta valores de 20 mg/dL Para valores superiores diluir la muestra 1:2 con solucin salina y repetir la determinacin multiplicando el resultado por 2. 6.3 Lmites de Seguridad Biolgica Bilirrubina total: hasta 1.0 mg/dL (17.1 mol/L) Bilirrubina directa: hasta 0.3 mg/dL (5.1 mol/L) Recin nacido: Bilirrubina total: mayor 5.8 mg/dL (<100 mol/L) CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y Patolgico.

5.2 ALBMINA MTODO COLORIMTRICO VERDE DE BROMOCRESOL

1. INTRODUCCIN La albmina es una protena globular que puede ser definida por cinco caractersticas: 1) es soluble en sulfato de amonio 2.03 mol/L a 23C y a pH superior a 6, cuando es dializada contra agua destilada; 2) la migracin de la protena en un campo electrofortico es 6.0 unidades de movilidad de Tiselius buffer de barbital en el cual una unidad de movilidad es 10-5 cm2.V-1.seg-1; 3) el peso molecular es aproximadamente 66,000 daltons y sedimenta a una velocidad de 4.5 S; 4) no posee carbohidratos y 5) la albmina es el componentes principal del suero humano normal. La albmina humana ha sido aislada y purificada hasta el punto de poder determinar su secuencia. Est formada por 584 aminocidos y el peso molecular calculado para esta secuencia es 66,248 daltons. La protena tiene diversas funciones; desempea un papel importante en el mantenimiento de la presin osmtica coloide de la sangre, en el transporte de varios iones, cidos y hormonas y en la nutricin. Los valores bajos de albmina pueden explicar la toxicidad de algunos frmacos en niveles bajos cuando slo se mide la concentracin total de stos en suero. En los sueros hipoalbuminmicos, la forma libre (activa) de la droga puede ser mucho mayor que en los sueros con niveles normales de albmina, debido a la gran diferencia en la capacidad de unin entre los dos tipos de sueros. La mayor cantidad de droga libre puede causar entonces, una respuesta txica. En la desnutricin, los niveles plasmticos de albmina disminuyen mucho ms que los de la gammaglobulina. Otras de las funciones importantes de la albmina es el mantenimiento del 75% de la presin osmtica coloide del plasma. Las alteraciones de los niveles sricos de albmina pueden tener origen en un gran nmero de secuelas patlogicas y en consecuencia no son especficas, aunque s resultan tiles para evaluar el estado del paciente. La hiperalbuminemia usualmente es atribuible a deshidratacin o hemoconcentracin. La hipoalbuminemia en general se debe a 1) hemodilucin, 2) sntesis inferior a la prdida y 3) enfermedades que causan una gran prdida de albmina. La hemodilucin puede ser causada por el desequilibrio de electrlitos. La menor sntesis puede ser atribuida a la incapacidad para obtener nutrientes debido a una desnutricin, malabsorcin o a una incapacidad del hgado para la sntesis de albmina ocasionadas por enfermedades como hepatitis crnica o aguda. Con frecuencia los niveles bajos de albmina son debidos a grandes prdidas como en el caso de sndrome nefrtico, enteropata con prdida proteica o lesiones

cutneas exudativas. Si grandes reas de la superficie cutnea estn destruidas se producen severas prdidas por ellas. El esfuerzo fsico, hipertensin, infeccin del tracto urinario y la enfermedad cardaca congestiva puede tambin aumentar la excrecin urinaria de albmina. Los mtodos de fijacin de colorantes son los ms usados para la determinacin de albmina srica. La albmina tiene la propiedad de fijarse a una amplia variedad de aniones orgnicos, incluyendo molculas complejas de colorantes. Las tcnicas de fijacin de colorantes, se basan en un desplazamiento del mximo de absorcin del colorante cuando est unido a la albmina. Este desplazamiento permite que el color resultante sea medido en presencia de un exceso de colorante, lo cual junto con la alta afinidad de fijacin con la albmina permite que todas las molculas de esta protena tomen parte de la reaccin. Se ha empleado una gran variedad de colorantes incluyendo naranja de metilo, cido 2-(4hidroxiazobenceno)benzoico, verde de bromocresol y prpura de bromocresol. La reaccin con verde de bromocresol se lleva a cabo usualmente a pH 4.2-4.5 y se mide a 620 630 nm. La Asociacin Americana de Qumica Clnica recomend un mtodo con verde de bromocresol. En este procedimiento la absorbancia del verde de bromocresol unido a la albmina se mide a 628 nm en un buffer de succinato. La prpura de bromocresol reacciona con la albmina a pH 5.2 y su desplazamiento de color se mide a 603 nm. Existen tambin refractmetros clnicos que cuentan con escalas graduadas para medir la concentracin de protenas totales. . 2. OBJETIVOS Demostrar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de albmina en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la albmina y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de albmina en una muestra biolgica

3. FUNDAMENTO DEL MTODO Prueba colorimtrica en la que la albmina se combina con el verde de bromocresol a determinado pH producindose un cambio de color del indicador, de amarillo verdoso a verde azulado. 4. PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLNICA Suero o plasma 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipeta de 1.0 mL.

1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla. EQUIPO Fotmetro con filtro de lectura de: 630 nm. Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo Solucin de Verde Bromocresol a pH 4.2 Estndar Albmina 5.0 g/dL PREPARACIN Y ESTABILIDAD El reactivo est listo para su uso. Ser estabe hasta su fecha de caducidad. Se recomienda protegerlo de la luz. 5. PROCEDIMIENTO 5.1TCNICA Muestra 5 L 1.0 mL

Blanco Standard Muestra Reactivo

Standard 5 L 1.0 mL

1.0 mL

Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente. Ajustar el aparato a cero con el blanco y efectuar las lecturas de las densidades pticas del estndar y muestra a 630 nm. La coloracin es estable durante 1 hora. 6. RESULTADOS 6.1Clculo Albmina (g/dL) = Abs muestra X Conc. Estndar (g/dL) Abs estndar

6.2 Linearidad Hasta valores de 6.0 g/dL Valores superiores se diluirn a la 1:2 con solucin salina. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica Suero: de 3.5 a 5.0 g/dL CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y Patolgico. Sueros control valorados.

5.3 PROTENAS TOTALES MTODO COLORIMTRICO - "BIURET". 1. INTRODUCCIN Protenas sricas en la evaluacin de la funcin heptica. Para la sntesis de las protenas sricas se requiere un hgado sano en plenas funciones, excepto en el caso de las gamma globulinas. El hgado tiene la capacidad de duplicar la produccin y salida de protenas durante las enfermedades asociadas con prdida de protenas. En consecuencia, no debe sorprender que las mediciones de protenas totales no se alteren sino hasta que haya ocurrido una disminucin extensiva de la funcin heptica. La albmina se disminuye en la enfermedad heptica crnica y generalmente se acompaa por un incremento en las globulinas beta y gamma, debido a la produccin de IgG e IgM en la hepatitis crnica activa y de la IgM e IgA en la cirrosis biliar o alcohlica respectivamente. Se debe hacer nfasis en que estas inmunoglobulinas no son producidas en el hgado sino por las clulas plasmticas del sistema reticuloendotelial. Se puede facilitar la identificacin de estas subclases de gamma globulinas mediante la inmunoelectroforesis. Sin embargo, una disminucin en la albmina srica no es especfica para la enfermedad heptica, puesto que la albmina tambin disminuye en la malabsorcin, la desnutricin, la enfermedad renal, el alcoholismo y las enfermedades malignas. La fraccin alfa1 de las globulinas sricas se disminuye en la enfermedad heptica crnica y cuando esta fraccin est ausente, o casi, indica que una deficiencia en la alfa1-antitripsina puede ser la causa de la enfermedad heptica. Las protenas sricas, globulina alfa2 y beta se aumentan en la ictericia obstructiva. Este incremento en la alfa2-globulina y la beta globulina en la ictericia obstructiva est asociada con interferencias en el metabolismo normal de las lipoprotenas. Por consiguiente, no se puede hacer claramente el fenotipo de un desorden lipdico en presencia de enfermedad heptica. El uso del colesterol de alta densidad para evaluar el riesgo de la enfermedad coronaria se obvia en los pacientes con enfermedad heptica alcohlica, obstruccin biliar y necrosis heptica aguda. El hgado produce los factores de coagulacin y estos pueden disminuir significativamente en la presencia de enfermedad heptica. El fibringeno plasmtico est presente normalmente en una concentracin de 2 a 4 g/L. Una disminucin en el fibringeno plasmtico indica una enfermedad heptica severa y est asociada con concentraciones disminuidas de otros factores de coagulacin, especialmente la protrombina. Puesto que la sntesis de la protrombina ocurre en el hgado, y requiere de la vitamina liposoluble K, se puede incrementar el tiempo de protrombina, en la enfermedad obstructiva biliar, la cirrosis o necrosis heptica, la falla heptica, el sndrome de Reye, los abscesos hepticos, la deficiencia de vitamina K y la hepatitis. Se puede diferenciar la enfermedad intraheptica asociada con una disminucin en el factor de coagulacin, de la enfermedad obstructiva intraheptica con una absorcin disminuida de vitamina K, observando la respuesta del tiempo de protrombina a la administracin exgena de vitamina K.

2. OBJETIVOS Demostrar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de protenas en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de protenas y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de protenas. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO Los grupos -CO-NH- unidos entre s dan una reaccin con formacin de color violeta con las sales cpricas en medio alcalino, siendo la ms representativa y simple la que da con el Biuret -NH2-CO-NH-CO-NH2. Es en la actualidad el mtodo colorimtrico ms exacto y simple para la determinacin de protenas totales.

4. PREPARACIN 4.1 Suero, plasma. 4.2 Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla. MATERIAL Y REACTIVOS MUESTRA CLINICA

Fotmetro termostable a 37C con filtro de 540 CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tartrato K-Na 15 mmol/L Yoduro sdico 100 mmol/L Yoduro de potasio 5 mmol/L Sulfato de cobre II 5 mmol/L Standard Sol. Protenas 7 g/dL

nm.

ESTABILIDAD A temperatura ambiente la estabilidad es hasta la fecha de caducidad indicada en el envase.

5. PROCEDIMIENTO 5.1TECNICA Muestra 25 L 1.0 mL

Blanco Estndar Muestra R.1 Biuret

Estndar 25 L 1.0 mL

1.0 mL

Mezclar e incubar 15 min a 30-37C. Dejar enfriar 5 minutos a temperatura ambiente. Leer, frente al blanco de reactivo, a 540 nm. Coloracin estable 30 minutos.

6. RESULTADOS 6.1Clculo Abs muestra X 7 (Conc. Estndar) = g/L de protenas totales Abs estndar 1 g/ dL = 10 g/L 6.2 Linealidad El mtodo es lineal hasta valores de 15 g/dL (150 g/L) 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica Recin nacidos : 5.2 - 9.1 g/dL Nios (hasta 3 aos) : 5.4 - 8.7 g/dL Adultos : 6.7 - 8.7 g/dL CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

5.4 ENZIMAS DE INTRES CLNICO Las enzimas biolgicas permiten que las reacciones metablicas procedan con rapidez. Las enzimas con significado clnico funcionan en forma intracelular. Cuando se produce algn dao a los tejidos por enfermedades o lesiones, se liberan enzimas a la circulacin y su actividad puede medirse como indicador de dichos daos. La actividad enzimtica vara de acuerdo con la ubicacin celular. Por lo tanto, el patrn de elevacin enzimtica es til para detectar y diferenciar diversas enfermedades. Adems existen varias isoenzimas en las que se observa una leve diferencia estructural de la enzima que depende del tejido primario en el cual se sintetiza. Esta diferencia estructural permite separar las enzimas totales en todas sus formas isoezimticas. Por este motivo, en vez de la determinacin de una sola enzima, las bateras de pruebas enzimticas que constan del anlisis de dos o ms enzimas o isoenzimas en vez de la determinacin de una sola enzima, ofrecen una mayor sensibilidad y especificidad diagnsticas para la deteccin de afecciones. La batera enzimtica caracterstica para diversas afecciones cardiacas estn conformadas de anlisis de CK, isoenzima CK, LDH, isoenzima LDH y AST. La isoenzima CK-MB y el patrn isoenzimtico invertido de LDH proporcionan mayor informacin diagnstica para detectar el infarto al miocardio. Las enzimas que se solicitan para el diagnstico de afeciones hepticas incluyen AST, ALT, GGT y ALP. De ellas la AST y la ALT se elevan ms en afecciones hepatocelulares, mientras que la GGT y la ALP indican, con mayor frecuencia, afecciones hepatobiliares. La batera de pruebas enzimticas para afecciones pancreticas estn conformadas de anlisis de AMS y LPS; la CK total y la CK-MN son los indicadores ms especficos de afecciones musculares. A medida que se cuente con tecnologa ms avanzada, los anlisis enzimticos ofrecern una sensibilidad y especificidad diagnsticas an mayores, con capacidad para distinguir y detectar mejor las isoenzimas y las isoformas de las mismas. La importancia radica indudablemente en la seleccin adecuada de las metodologas ms modernas, especficas y sensibles, para evaluar las enzimas presentes. Para las determinaciones enzimticas se pueden emplear fundamentalmente dos clases de mtodos: directos e indirectos. En los primeros se mide la desaparicin de los sustratos enzimticos o la aparicin de uno de los productos de la reaccin, por ejemplo:

Fosfatasa a) p-nitrofenilfosfato Lactato + NAD

La actividad de la fosfatasa puede determinarse directamente dentro del rango de la luz visible ( 504 = nm) midiendo la intensidad del color del p-nitrofenol liberado por hidrlisis del p-nitrofenilfosfato, como resultado de la accin de la fosfatasa. En este caso, uno de los productos formados, (p-nitrofenol) por ser colorido permite medir directamente la actividad enzimtica. b) La desaparicin de un compuesto no colorido, por transformarse en otro tambin incoloro. Este tipo de reacciones debe medirse a longitudes de onda especficas para el compuesto cuya desaparicin se est controlando, por ejemplo: LDH Piruvato + NADH2 Lactato + NAD MDH Oxalacetato + NADH2 Malato + NAD HBDH Hidroxibutirato + NAD Cetobutirato + NADH2 en estas reacciones lo que se mide es la oxidacin de la coenzima en su forma reducida (NADH2), que absorbe especficamente a 340 nm. Por la accin de las deshidrogenasas anteriores, la coenzima pasa a su forma oxidada (NAD) que se absorbe a 340 nm sino a 260 nm (mtodo UV). .En los mtodos indirectos, como su nombre lo indica, la actividad de la enzima se determina slo en forma indirecta. Para ello es necesario acoplar dos o ms reacciones, en una de las cuales intervenga la enzima que se desea determinar. Esta cataliza generalmente la transformacin de un sustrato a un metabolito intermedio (producto de la reaccin), cuya concentracin se determina por la accin de una segunda enzima, de la cual ese metabolito es sustrato. La segunda enzima llamada enzima auxiliar, debe adicionarse generalmente durante la determinacin, en tal forma que al final de la reaccin lo que se mide es el resultado del acoplamiento de dos reacciones enzimticas. Como ejemplo de este tipo de determinaciones por mtodos indirectos podemos mencionar las determinaciones de ALT, AST y CK, por mtodos (UV). A diferencia de los mtodos colorimtricos directos, como en el caso de la ALT, no se determina el piruvato formado, sino que ste se emplea a su vez como sustrato de una enzima auxiliar (LDH), que como se indic debe adicionarse en la reaccin: ALT 1) Cetoglutarato + L-alanina LDH 2) Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ Glutamato + Piruvato

En este caso se han acoplado las reacciones 1 y 2 midiendo la transformacin de NADH y H+ a NAD, que como puede verse slo est relacionada indirectamente con la enzima ALT.

En el caso de la creatinina fosfocinasa (CPK) o creatinina cinasa (CK) como tambin se le denomina, no solo se acoplan dos reacciones sino tres: CK 3) Creatinina fosfato + ADP Creatinina + ATP HK 4) ATP + Glucosa ADP + Glucosa 6-Fosfato G-6PDH 5) Glucosa 6-Fosfato + NADP 6 Fosfogluconato + NADPH + H+ Para medir la actividad de la enzima que cataliza la fosforilacin del ADP en ATP, es decir creatinina cinasa, es necesario emplear el ATP resultante, como donador de grupos fosfato que requiere la hexocinasa (HK) para formar glucosa 6-fosfato. Este compuesto tiene que ser empleado todava en una tercera reaccin como sustrato de otra enzima auxiliar, la deshidrogenasa de glucosa 6-fosfato (G6FDH). Esta segunda enzima auxiliar es la que a su vez reduce la coenzima NADP (en su forma oxidada) hasta NADPH2 y es la que puede ser medida a una longitud de onda a 340 nm.

Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1). ALP La fosfatasa alcalina realmente es un grupo de enzimas que hidrolizan los steres de monofosfatos a un pH alcalino. El pH ptimo para estas enzimas es generalmente de aproximadamente 10. No se conocen los substratos naturales para la fosfatasa alcalina. La enzima ha sido identificada en la mayora de los tejidos corporales y se localiza generalmente en las membranas celulares. La actividad ms alta de la fosfatasa alcalina se observa en el hgado, los huesos, el intestino, el rin y la placenta, y se han identificado por lo menos 11 isoformas diferentes de la fosfatasa alcalina en el suero. Puesto que la fosfatasa alcalina contiene normalmente cantidades significativas de cido silico, la mayora de estas formas mltiples de la enzima son el resultado de diferentes grados de sialacin. Se sabe que la enzima producida por la placenta tiene una composicin proteica diferente de las otras composiciones enzimticas. La medicin de la fosfatasa alcalina srica es til para diferenciar la enfermedad hepatobiliar de la enfermedad osteognica. La actividad de la fosfatasa alcalina aumenta mucho (10 veces) como resultado de una sntesis localizada en la membrana despus de una obstruccin extrahepatobiliar tal como la colestasis o los clculos biliares. La obstruccin biliar intraheptica tambin se ve acompaada por una elevacin de la actividad de la fosfatasa alcalina srica, pero el grado de incremento es mucho menor (2 a 3 veces). La enfermedad heptica que produce necrosis de las clulas del parnquima no eleva la fosfatasa alcalina srica a menos que la enfermedad heptica est asociada con dao a los canalculos o con estasis biliar. Es muy complicada la interpretacin de la medicin de la fosfatasa alcalina srica, debido a que la actividad de la enzima puede aumentar en ausencia de enfermedad heptica. Los desrdenes ms comunes que producen una elevacin

de la fosfatasa alcalina son las enfermedades seas, como la enfermedad de Paget, el raquitismo y la osteomalacia. Tambin se incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina srica durante la pubertad debido al crecimiento acelerado de los huesos y durante el tercer trimestre del embarazo debido a la liberacin de la fosfatasa alcalina por la placenta. Gama-glutamiltransferasa (EC 2.3.2.2). GGT La GGT (o GT) es una enzima localizada en la membrana que juega un papel importante en el metabolismo del glutatin y en la reabsorcin de los aminocidos del filtrado glomerular y de la luz intestinal. El glutatin (g-glutamilcisteinilglicina) en presencia de la GGT y un aminocido o pptido transfiere el glutamato al aminocido formando un enlace pptido en el cido g- carboxlico, dando, por consiguiente, cisteinilglicina y el pptido g-glutamil correspondiente. Aunque la mayor actividad de la GGT se presenta en el tejido renal, la elevacin de la GGT es generalmente el resultado de la enfermedad heptica. La GGT srica se eleva antes que las otras enzimas hepticas en enfermedades como la colecistitis aguda, la pancreatitis aguda, la necrosis heptica aguda y subaguda, y neoplasias de sitios mltiples que cursan con metstasis hepticas. Puesto que la GGT es una enzima microsomal heptica, la ingestin crnica de alcohol o drogas como los barbitricos, los antidepresivos tricclicos y los anticonvulsionantes inducen la produccin de enzimas microsomales. Estas elevaciones inducidas por drogas preceden cualquier otro cambio en las enzimas del hgado, y si se suspende la ingestin de la droga en ese momento los cambios del hgado son generalmente reversibles. La GGT permite la diferenciacin de las enfermedades hepticas de otras condiciones en las cuales se eleva la fosfatasa alcalina srica puesto que los niveles de GGT son normales en la enfermedad de Paget, el raquitismo y la osteomalacia y en los nios y mujeres embarazadas sin enfermedad heptica. Puesto que la prstata tiene una actividad significativa de GGT, la actividad srica es mayor en hombres sanos que en mujeres. La mayor utilidad de la GGT est en el diagnstico de colestasis causadas por la ingestin crnica de alcohol o drogas, colestasis mecnicas o virales, metstasis hepticas, desrdenes seos con elevaciones de la fosfatasa alcalina. 5-Nucleotidasa (EC3.1.3.5).NTD La 5-Nucelotidasa (NTD) es una enzima localizada en los microsomas y las membranas celulares que cataliza la hidrlisis de los steres 5-fosfato nuclesidos. La enzima srica tiene un pH ptimo aparente de 7.5: NTD Nuclesido-5-monofosfato + H2O Nuclesido + Pi

Al igual que la GGT, la NTD srica se eleva en las enfermedades hepatobiliares tales como: obstruccin por clculos del ducto biliar, colestasis biliar, cirrosis y enfermedad obstructiva causada por crecimiento neoplsico. Sin embargo, la NTD no se eleva generalmente en dao heptico inducido por drogas.ref Por esto es til medir la NTD junto con la GGT para seguir el curso de la quimioterapia en neoplasias del hgado. Puesto que la NTD no se eleva en la enfermedad sea, al

igual que la GGT es til para diferenciar las causas hepticas para la elevacin en la fosfatasa alcalina, derivadas de otros factores, tales como las enfermedades seas, el embarazo y crecimiento normal. Deshidrogenasa lctica (EC 1.1.1.27). LDH La deshidrogenasa lctica est presente en muchos tejidos. La LDH cataliza la interconversin de piruvato y lactato: LDH NAD + H + Lactato
+

Piruvato + NADH+ H+

La mayor actividad de la LDH se presenta en el rin y el corazn, y la menor en el pulmn y el suero. La LDH se localiza en el citoplasma celular y es por lo tanto liberada al suero, cuando las clulas se daan o necrosan. Cuando solamente est implicado un rgano especfico, como el hgado, la medicin de la LDH total puede ser til. La LDH se incrementa en las hepatitis virales o txicas, en la obstruccin biliar extraheptica, en la necrosis aguda del hgado y en la cirrosis del hgado. Sin embargo, en condiciones en las que puedan estar implicadas varios rganos la medicin del LDH total es menos til que la medicin de las isoenzimas de la LDH. Las isoenzimas LDH5 y LDH4 son las responsables de la actividad primaria del hgado, mientras que las isoenzimas LDH1 y LDH2 son las responsables por la actividad predominante de la LDH en el corazn y el rin. Puesto que los glbulos rojos tambin contienen mucha LDH1, se debe evitar el anlisis de muestras de suero bemolizadas. En las condiciones hepticas, la electroforesis de la LDH muestra que la elevacin en la LDH total se debe a la liberacin de LDH4 y LDH5 al suero. Aspartato aminotransferasa (EC 2.6.1.1) y alanino aminotransferasa (EC 2.6.1.2). Las transaminasas ASAT y ALAT catalizan la conversin de aspartato y alanina a oxaloacetato y piruvato respectivamente. En el hgado se encuentran los niveles ms altos de ALAT, mientras que la ASAT se encuentra presente en el corazn, msculo esqueltico e hgado en cantidades similares. La actividad en el suero tanto de la ASAT como de la ALAT aumentan rpidamente durante el comienzo de la ictericia viral y permanecen elevadas por 1 a 2 semanas. En las hepatitis txicas tambin se elevan la ALAT y la ASAT, pero la LDH se eleva mucho ms, como resultado de la necrosis celular heptica. En los pacientes con hepatitis crnica activa tambin se observan aumentos en la ASAT y ALAT. La necrosis heptica aguda se acompaa por incrementos significativos en las actividades de tanto la ALAT como de la ASAT. El aumento en la actividad de la ALAT es generalmente mayor que el incremento en la actividad de la ASAT. En la cirrosis del hgado, las actividades de las transaminasas sricas generalmente no se elevan por encima de 300 U/L, sin importar la causa de la enfermedad cirrtica. Las elevaciones de las ALAT y ASAT sricas observadas en el sndrome de Reye, son atribuibles directamente al dao heptico, y el incremento de la ALAT es generalmente mayor que el incremento en la ASAT. Tambin se incrementan las transaminasas en la actividad neoplsica.

En el diagnstico de la enfermedad del hgado, la medicin de los niveles sricos de ASAT y ALAT es valiosa. Sin embargo, la mejor manera de usar estos anlisis es junto con otros anlisis de enzimas como la LDH y la creatina cinasa, y con otras mediciones de la funcin renal y heptica como la urea sangunea, la creatinina, el amonaco y la bilirrubina. Esto es importante cuando se establece el diagnstico, puesto que la ALAT y la ASAT estn presentes en otros tejidos adems del hgado, y la actividad srica de estas enzimas puede reflejar una enfermedad orgnica en tejidos distintos al hgado. Las actividades sricas de la ALAT y la ASAT se elevan en el infarto del miocardio, infarto renal, distrofia muscular progresiva y otro gran nmero de enfermedades que solamente afectan al hgado de una manera secundaria, como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Niemann-Pick, la mononucleosis infecciosa, la leucemia mieloctica, la cetoacidosis diabtica y el hipertiroidismo. Otros compuestos analizados para hgado Bilirrubina El anlisis de la bilirrubina srica es til para diferenciar la causa de la ictericia. La ictericia preheptica es el resultado de un incremento grande de la bilirrubina no conjugada debido a la liberacin y el metabolismo aumentado de la hemoglobina despus de la hemlisis. Se observa un incremento nulo o moderado en la bilirrubina conjugada debido a que el transporte de la bilirrubina al hgado y la formacin del conjugado con el glucornido limitan el proceso. Adicionalmente, debido a los niveles de bilirrubina conjugada que son excretados por el hgado, se elevan las concentraciones de urobilingeno urinario y urobilina fecal, pero la bilirrubina urinaria (la cual es nicamente la forma conjugada libremente soluble) est ausente. En contraste la ictericia postheptica obstructiva se caracteriza por grandes aumentos en la bilirrubina conjugada srica. La bilirrubina delta, bilirrubina unida covalentemente a la albmina, tambin se eleva en este desorden. La medicin de la bilirrubina delta, como prueba diagnstica no ha logrado una aceptacin generalizada. La acumulacin de la bilirrubina en el suero se produce como consecuencia de una excrecin biliar disminuida despus de la conjugacin de la bilirrubina, ms que por una carga aumentada de bilirrubina causada por hemlisis. La excrecin heptica de los metabolitos de la bilirrubina es baja y se puede evidenciar usualmente la bilirrubina urinaria. La ictericia heptica presenta un patrn intermedio en el cual las bilirrubinas sricas conjugadas y no conjugadas se incrementan al mismo grado con presencia de bilirrubina conjugada en la orina. Sin embargo, la concentracin fecal de urobilina est disminuida. Colesterol. El colesterol srico est compuesto de: colesterol libre y el esterificado. Puesto que la esterificacin se realiza en el hgado la enfermedad intraheptica o la obstruccin biliar se caracterizan por un incremento del colesterol libre y ocasionalmente por un desplazamiento en el perfil de cidos grasos libres del suero, aunque el colesterol total permanece usualmente sin modificar. El

colesterol total puede disminuir hasta valores inferiores al rango de referencia en la enfermedad crnica asociada con la destruccin del parnquima celular. cidos biliares. En la enfermedad se altera la secrecin y produccin de cidos biliares. El suero contiene 1 a 2 mg/mL de cidos biliares en el adulto sano. En la enfermedad hepatobiliar, las concentraciones de cidos biliares sricos se pueden elevar hasta 1000 veces. Tambin se pueden elevar significativamente en otras enfermedades como hepatitis, cirrosis, enfermedad heptica inducida por drogas y el hepatoma. Las concentraciones de cidos biliares sricos se encuentran normales en la enfermedad de Gilbert, la hemocromatosis y la enfermedad poliqustica del hgado. La medicin de los cidos biliares es til para el diagnstico de la disfuncin heptica mnima cuando los otros parmetros aun estn sin modificar. Triglicridos. Los triglicridos sricos se deben medir en una muestra en ayunas. Los incrementos son relativamente inespecficos; la disfuncin heptica causada por hepatitis, obstruccin biliar extraheptica y cirrosis se asocia con un incremento en los triglicridos sricos, pero as sucede tambin en enfermedades como la pancreatitis aguda, infarto del miocardio, falla renal, gota, anemia perniciosa y diabetes mellitus. Los cidos grasos libres tambin son no especficos. Estn disminuidos en la hepatitis crnica, la falla renal crnica y la fibrosis qustica. Las concentraciones de cidos grasos libres se elevan en el sndrome de Reye, la encefalopata heptica y la hepatitis crnica activa, pero tambin en el infarto del miocardio, la falla renal aguda, el hipertiroidismo y el feocromocitoma.

Protenas sricas en la evaluacin de la funcin heptica. Se requiere un hgado sano en pleno funcionamiento para la sntesis de las protenas sricas, excepto las gamma globulinas. El hgado tiene la capacidad de duplicar la produccin y salida de protenas durante las enfermedades asociadas con prdida de protenas. En consecuencia, no debe sorprender que las mediciones de protenas totales no se alteren, sino hasta que haya ocurrido una disminucin extensiva de la funcin heptica. La albmina se disminuye en la enfermedad heptica crnica y generalmente se acompaa por un incremento en las globulinas beta y gamma, debido a la produccin de IgG e IgM en la hepatitis crnica activa y de la IgM e IgA en la cirrosis biliar o alcohlica respectivamente. Se debe hacer nfasis en que estas inmunoglobulinas no son producidas en el hgado, sino por las clulas plasmticas del sistema reticuloendotelial. Se puede facilitar la identificacin de estas subclases de gamma globulinas mediante la inmunoelectroforesis. Sin embargo, una disminucin en la albmina srica no es especfica para la enfermedad heptica puesto que la albmina tambin disminuye en la malabsorcin, la desnutricin, la enfermedad renal, el alcoholismo y las enfermedades malignas.

La fraccin alfa1 de las globulinas sricas se disminuye en la enfermedad heptica crnica y cuando esta fraccin est ausente, o casi, indica que una deficiencia en la alfa1-antitripsina puede ser la causa de la enfermedad heptica. Las protenas sricas, globulina alfa2 y beta se aumentan en la ictericia obstructiva. Este incremento en la alfa2-globulina y la beta globulina en la ictericia obstructiva est asociada con interferencias en el metabolismo normal de las lipoprotenas. Por consiguiente, no se puede hacer claramente el fenotipo de un desorden lipdico en presencia de enfermedad heptica. El uso del colesterol de alta densidad para evaluar el riesgo de la enfermedad coronaria se obvia en los pacientes con enfermedad heptica alcohlica, obstruccin biliar y necrosis heptica aguda. El hgado produce los factores de coagulacin y stos pueden disminuir significativamente en la presencia de enfermedad heptica. El fibringeno plasmtico est presente normalmente en una concentracin de 2 a 4 g/L. Una disminucin en el fibringeno plasmtico indica una enfermedad heptica severa y est asociada con concentraciones disminuidas de otros factores de coagulacin, especialmente la protrombina. Puesto que la sntesis de la protrombina ocurre en el hgado, y requiere de la vitamina liposoluble K, se puede incrementar el tiempo de protrombina, en la enfermedad obstructiva biliar, la cirrosis o necrosis heptica, la falla heptica, el sndrome de Reye, los abscesos hepticos, la deficiencia de vitamina K y la hepatitis. Se puede diferenciar la enfermedad intraheptica asociada con una disminucin en el factor de coagulacin, de la enfermedad obstructiva intraheptica con una absorcin disminuida de vitamina K, observando la respuesta del tiempo de protrombina a la administracin exgena de vitamina K. Urea y amonaco en la evaluacin de la funcin heptica. La concentracin sangunea de amoniaco es superior en los infantes que en los adultos, debido a que el desarrollo de la circulacin heptica se termina despus del nacimiento. La hiperamonemia es una entidad que resulta poco frecuente debido a defectos congnitos en el ciclo de la urea. El error innato del metabolismo ms comn es la deficiencia en ornitina transcarbamilasa. La hiperalimentacin es una causa mucho ms frecuente de hiperamonemia en infantes. Con frecuencia, se diagnostica el sndrome de Reye por un amoniaco sanguneo elevado en ausencia de otra causa demostrable. Los pacientes adultos muestran concentraciones elevadas de amonaco sanguneo en las etapas terminales de la cirrosis heptica, la falla heptica, y la necrosis del hgado aguda y subaguda. Se presagia el comienzo de la encefalopata heptica por una elevacin en el amonaco sanguneo. Se ha demostrado que la medicin en lquido cefalorraqudeo (LCR) de la glutamina, correlaciona bien con el desarrollo de la encefalopata heptica. Tambin se puede usar la medicin de la glutamina en el LCR, para diferenciar la encefalopata heptica de la sptica. Sin embargo, no es comn la medicin de la glutamina en el LCR. La excrecin de amonaco urinario se eleva en la acidosis y se disminuye en la alcalosis, puesto que la formacin de sales de amonio es un mecanismo importante para excretar el exceso de iones hidrgeno. Daos en los tbulos renales distales, tal como ocurre en la falla renal, la glomerulonefritis, el hipercorticoidismo y la enfermedad de Addison, conllevan a una excrecin de

amonaco disminuida sin presentar cambios en los niveles sanguneos de amonaco. Puesto que la urea se sintetiza en el hgado, se presenta nitrgeno ureico srico bajo, en la enfermedad heptica sin dao en la funcin renal, aunque la relacin urea a creatinina se puede conservar normal. La elevacin en el nitrgeno ureico srico no implica necesariamente dao renal, puesto que la deshidratacin puede llevar a concentraciones de nitrgeno ureico tan altas como 600 mg/L, y los infantes que reciben una frmula alta en protenas pueden tener niveles de nitrgeno ureico de 250 a 300 mg/L. Naturalmente, enfermedades como la glomerulonefritis aguda, la nefritis crnica, el rin poliqustico y la necrosis renal elevan el nitrgeno ureico.

5.5 FOSFATASA ALCALINA METODO CINTICO OPTIMIZADO. 1. INTRODUCCIN La fosfatasa alcalina se encuentra ampliamente distribuida en los del cuerpo humano. Su fuente de importancia clnica incluye hgado, hueso, placenta, intestino, bazo y rion. Aunque se desconoce su funcin biolgica precisa, aparentemente participa en el transporte de membrana, ya que est unida a la membrana celular. En el hgado, la actividad de la ALP se localiza en la membrana celular que une el borde sinoidal de las clulas del prenquima a los canliculos biliares. En los huesos la actividad de la ALP se localiza en la menbrana celular que une el borde sinoidal de las clulas del parnquima a los canalculos. En los huesos, su actividad se confina a los osteoblastos. El aumento de actividad de fosfatasa alcalina en suero se observa en diversas afecciones; sin embargo, su significado clnico se relaciona principalmente con la deteccin de enfermedades seas y hepticas. La actividad de la ALP es til para el diagnstico diferencial de enfermedades hepticas. La fosfatasa alcalina suele elevarse ms en caso de afecciones de los conductos biliares, que en las que se produce principalmente la lesin hepatocelular. Por lo tanto en la enfermedad heptica colsttica u obstruccin hepatobiliar, la ALP suele incrementarse hasta 10 o 15 veces ms que los valores normales, pero en general slo se observan leves elevaciones de 2 a 3 veces los valores normales en afecciones hepatocelulares como hepatitis. Adems, la sntesis de esta enzima se estimula por la colestasis. Otras afecciones hepticas que tambin incrementan la actividad de la fosfatasa alcalina son: la mononucleosis infecciosa, la colangiolitis, la cirrosis total, carcinoma hepatocelular primario y carcinoma heptico metasttico secundario, tambin incrementan la actividad de la fosfatasa alcalina. La ALP tambin se sintetiza en las clulas osteoblsticas, en donde se produce la formacin de hueso. Por tanto, en afecciones seas con incremento de actividad osteoblstica, en general los niveles de fosfatasa alcalina se elevan.

En algunas afecciones que incluyen hipotiroidismo, escorbuto, hipofosfatemia, Kwashiorkor (nio rojo), cratinismo y anemia grave, se observa reduccin de la actividad de fosfatasa alcalina. Es muy complicada la interpretacin de la medicin de la fosfatasa alcalina srica, debido a que la actividad de la enzima puede aumentar en ausencia de enfermedad heptica. Tambin se incrementa la actividad de la fosfatasa alcalina srica durante la pubertad debido al crecimiento acelerado de los huesos y, durante el tercer trimestre del embarazo debido a la liberacin de la fosfatasa alcalina por la placenta

2. OBJETIVOS Demostrar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la enzima fosfatasa alcalina ALP en una muestra biolgica Establecer los valores normales de referencia de la actividades de esta enzima y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de estas enzimas en una muestra biolgica.

3. FUNDAMENTO DEL MTODO Se mide la actividad de la fosfatasa alcalina con un mtodo cintico que utiliza un tampn de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). En la reaccin, la fosfatasa alcalina cataliza la hidrlisis del sustrato incoloro ster de fosfato orgnico, el pnitrofenilfosfato, a un producto de color amarillo (p-nitrofenol y fosfato). Esta reaccin ocurre a un pH alcalino de 10.3. ESQUEMA DE LA REACCIN QUMICA

ALP p-Nitrofenilfosfato + H2O pH 10,3, Mg++ (incoloro)

p-Nitrofenol + Fosfato (amarillo)

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4. PREPARACIN 4.1MUESTRA CLNICA

Suero, plasma heparinizado. La actividad del enzima debe ser determinada rpidamente o bien separar el suero de los hemates. La prdida de la actividad enzimtica es menor de un 10% entre 2 a 3 das a 1525C o durante 1 mes a -20C.

4.3 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 50L. Puntas para micropipeta. Gradilla Equipo Fotmetro termostable a 37C con filtro de 405 nm. Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tampn dietanolamina (DEA) pH 10,4 1 mmol/L Tampn Cloruro de magnesio 0.5 mmol/L Reactivo 2 p-nitrofenilfosfato pNPP) 10 mmol/L Comprimidos/polvo 5. PROCEDIMIENTO 5.1TECNICA Longitud de onda . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 nm Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37C Cubeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Lectura . . . . . . . . . . . . . . . frente aire o agua destilada Macro-test Semimicro-test Reactivo al uso 3.0 mL 1.2 mL Muestra 50 L 20 L Mezclar y anotar la extincin. Poner en marcha el cronmetro. Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos. Calcular el valor medio = E/min

6. RESULTADOS Clculo

E/min x 3300 = U/L Linealidad Si el E/min, es superior a 0.250 se repetir la determinacin diluyendo la muestra a 1:10 con solucin salina 0.9%. Lmite de Seguridad Biolgica 25C / 30C / 37C Nios < 400 U/L < 480 U/L < 645 U/L Adultos 60-170 U/L 73-207 U/L 98-279 U/L Factores de conversin de temperaturas Temp. Temperatura deseada Reaccin 25C 30C 37C 25C 1.00 1.22 1.64 30C 0.82 1.00 1.33 37C 0.61 0.75 1.00 CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

5.6 GAMMA GLUTAMIL TRANSFERASA GT MTODO CINTICO. SUSTRATO CARBOXILADO. 1. INTRODUCCIN La GGT (o -GT) es una enzima localizada en la membrana que juega un papel importante en el metabolismo del glutatin y en la reabsorcin de los aminocidos del filtrado glomerular y de la luz intestinal. El glutatin (-glutamilcisteinilglicina) en presencia de la GGT y un aminocido o pptido transfiere el glutamato al aminocido formando un enlace pptido en el cido - carboxlico, formando, por consiguiente, cisteinilglicina y el pptido -glutamil correspondiente. Aunque la mayor actividad de la GGT se presenta en el tejido renal, la elevacin de la GGT generalmente es un indicador de la enfermedad heptica. La GGT srica se eleva antes que las otras enzimas hepticas en enfermedades como la colecistitis aguda, la pancreatitis aguda, la necrosis heptica aguda y subaguda, y neoplasias de sitios mltiples que cursan con metstasis hepticas. Puesto que la GGT es una enzima microsomal heptica, la ingestin crnica de alcohol o drogas como los barbitricos, los antidepresivos tricclicos y los anticonvulsivantes inducen la produccin de enzimas microsomales. Estas elevaciones inducidas por drogas preceden cualquier otro cambio en las enzimas del hgado y si se suspende la ingestin de la droga en ese momento, los cambios del hgado son generalmente reversibles. La GGT permite la diferenciacin de otras enfermedades hepticas en las cuales por sus condiciones se eleva la fosfatasa alcalina srica, puesto que los niveles de GGT son normales en la enfermedad de

Paget, el raquitismo y la osteomalacia y en los nios y mujeres embarazadas sin enfermedad heptica. Asimismo, puesto que la prstata tiene una actividad significativa de GGT, la actividad srica es mayor en hombres sanos que en mujeres. La mayor utilidad de la GGT est en el diagnstico de colestasis causadas por la ingestin crnica de alcohol o drogas, colestasis mecnicas o virales, metstasis hepticas, desrdenes seos con elevaciones de la fosfatasa alcalina, pero en los que la GGT es normal y desrdenes de msculo esqueltico en los cuales la transaminasa ASAT est elevada pero la GGT est normal.

2. OBJETIVOS Demostrar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la gama glutamiltrasferasa en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la enzima GGT y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de GGT en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO Se mide la actividad de la -glutamil transferasa mediante un mtodo cintico enzimtico. En la reaccin, la -glutamil transferasa cataliza la transferencia de un grupo gamma-glutamil desde el sustrato incoloro gamma-glutamil-p-nitroanilina, al aceptor, glicilglicina, y genera un producto coloreado, la p-nitroanilina. ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

-glutamil-p-nitroanilina + glicilglicina

GGT

-glutamil-glicilglicina + p-nitroanilina
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4. PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLINICA Solamente utilizar suero. No utilizar plasma. La -GT es estable en el suero 8 horas a 15-25C, 3 das a 2-8C y un mes congelado a -20C. 4 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 200L. Puntas para micropipeta. Gradilla

Equipo Fotmetro termostable a 37C con filtro de 405 nm. Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Sol. Tampn TRIS pH 8.25 100 mmol/L Reactivo 2 Glicilglicina 100 mmol/L Comprimidos/ L--glutamil-3-carboxiPolvo p-nitroanilida 3 mmol/L La estabilidad del monoreactivo es de 21 das a 2-8C o 5 das a temperatura ambiente. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 TCNICA Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . .. 405 nm Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37C Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . ..1 cm. paso de luz. Lectura: . . . . . . . . . . . . . . ..frente aire o agua destilada Macro-test Semimicro-test Reactivo al uso 2.0 mL 1.0 mL Suero 200 L 100 L Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en marcha el cronmetro. Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos. Calcular el valor medio de los incrementos de extincin por minuto. (E/min) 6. RESULTADOS Clculo A 405 nm E/min x 1190 = (U/L) Linealidad El mtodo es lineal hasta actividades de 250 U/L. Para valores superiores, se diluir la muestra a 1:10 con solucin salina 0.9%. Lmite de Seguridad Biolgica 25C Mujeres 4-18 U/L Hombres 6-28 U/L

30C 5-25 U/L 8-38 U/L

37C 7-32 U/L 11-50 U/L

Factores de conversin de temperaturas Temp. Temperatura deseada Reaccin 25C 30C 25C 1.00 1.37 30C 0.73 1.00 37C 0.56 0.77

37C 1.79 1.30 1.00

NOTAS La hemlisis interfiere en el test. CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

5.7 ASPARTATO AMINOTRANSFERASA GOT (AST) MTODO CINTICO U.V. 1. INTRODUCIN Aspartato aminotransferasa y alanino aminotransferasa Las transaminasas ASAT y ALAT catalizan la conversin de aspartato y alanina a oxaloacetato y piruvato respectivamente. En el hgado se encuentran los niveles ms altos de ALAT, mientras que la ASAT se encuentra presente en el corazn, msculo esqueltico e hgado en cantidades similares. La actividad en el suero de tanto la ASAT como la ALAT aumenta rpidamente durante el comienzo de la ictericia viral y permanece elevada por 1 a 2 semanas. En las hepatitis txicas tambin se elevan la ALAT y la ASAT, pero la LDH se eleva mucho ms como resultado de la necrosis celular heptica. En los pacientes con hepatitis crnica activa tambin se observan aumentos en la ASAT y ALAT. La necrosis heptica aguda se acompaa por incrementos significativos en las actividades tanto la ALAT y la ASAT. El aumento en la actividad de la ALAT es generalmente mayor que el incremento en la actividad de la ASAT. En la cirrosis del hgado las actividades de las transaminasas sricas generalmente no se elevan por encima de 300 U/L, sin importar la causa de la enfermedad cirrtica. Las elevaciones en las ALAT y ASAT sricas observadas en el sndrome de Reye, son atribuibles directamente al dao heptico, y el incremento en la ALAT es generalmente mayor que el incremento en la ASAT. Tambin se incrementa la actividad de las transaminasas en la actividad neoplsica. En el diagnstico de la enfermedad del hgado, la medicin de los niveles sricos de ASAT y ALAT es valiosa. Sin embargo, la mejor manera de usar estos anlisis es junto con otros anlisis de enzimas como la LDH y la creatina cinasa, y con otras mediciones de la funcin renal y heptica como la urea sangunea, la creatinina, el amonaco y la bilirrubina. Esto es importante cuando se establece el diagnstico puesto que la ALAT y la ASAT estn presentes en otros tejidos adems del hgado y la actividad srica de estas enzimas puede reflejar una enfermedad orgnica en tejidos distintos al hgado. Las actividades sricas de la ALAT y la ASAT se elevan en el infarto del miocardio, infarto renal, distrofia muscular progresiva y otro gran nmero de enfermedades que solamente afectan al hgado de una manera secundaria, como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Niemann-Pick, la mononucleosis infecciosa, la leucemia mieloctica, la cetoacidosis diabtica y el hipertiroidismo.

2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la aspartato aminotransferasa en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la enzima AST y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de AST en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO Se mide la actividad de la aspartato aminotransferasa mediante un mtodo cintico enzimtico. En la reaccin, la aspartato aminotransferasa cataliza la transaminacin reversible de L-aspartato y -cetoglutarato a oxaloacetato y Lglutamato. Luego, el oxaloacetato se reduce a malato en presencia de malato deshidrogenasa (MDH), con la oxidacin concurrente de dinucletido de nicotinamida adenina reducida (NADH) a dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

L-Aspartato + -cetoglutarato Oxaloacetato + NADH + H+

AST MDH

Oxaloacetato + L-glutamato Malato + NAD+

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4. PREPARACION

4.1 MUESTRA CLINICA Suero o plasma heparinizado. 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS

Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 200L.

Puntas para micropipeta. Gradilla Equipo Fotmetro termostable a 37C con filtro de 340 nm. centrfuga Cronmetro CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tampn TRIS pH 7.8, 80 mmol/L Tampn L-Aspartato 200 mmol/L Reactivo 2 NADH 0.18 mmol/L Comprimido LDH 800 U/L MDH 600 U/L -cetoglutarato 12 mmol/L

PREPARACIN Y ESTABILIDAD El monoreactivo es estable 72 horas a 18-25C 21 das a 2-8C.

5. PROCEDIMIENTO 5.1 TCNICA Temperatura : . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37C Longitud de onda : . 340 nm Hg334 nm Hg 365 nm Cubeta : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz. Lectura frente aire o agua destilada. Macrotest Semimicrotest Reactivo al uso 2.0 mL 1.0 mL Muestra 200 L 100 L Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en marcha el cronmetro. Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos. Calcular el valor medio de los incrementos de extincin por minuto ( E/min)

6. RESULTADOS 6.1 Clculos 340 nm E/min x 1750= U/L 334 nm E/min x 1790= U/L 365 nm E/min x 3240= U/L 6.2 Linealidad Si la E/min a 340 nm 334 nm es superior a 0.150 bien

a 365 nm es superior a 0.080, la muestra deber diluirse a 1:10 con solucin salina 0.9%. Deber tenerse en cuenta esta dilucin al hacer el clculo. Lmite de Seguridad Biolgica 25C / 30C / 37C Hombres hasta 19 U/L 26 U/L 38 U/L Mujeres hasta 16 U/L 22 U/L 31 U/L Factores de conversin de temperaturas Temp. Temperatura deseada reaccin 25C 30C 25C 1.00 1.37 30C 0.73 1.00 37C 0.48 0.65 OBSERVACIONES La hemlisis interfiere en la determinacin . CONTROL DE CALIDAD SPINTROL Normal y Patolgico.

37C 2.08 1.54 1.00

5.8 ALANINA AMINOTRANSFERASA (GPT) ALT MTODO CINTICO U.V. 1. INTRODUCCIN Los valores de alanina aminotransferasa se utilizan en el diagnstico y tratamiento de ciertas enfermedades hepticas (p. ej., hepatitis viral y cirrosis) y cardacas.

2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la alanina aminotransferasa en una muestra biolgica Establecer los valores de referencia de la enzima ALT y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de alt en una muestra biolgica

3. FUNDAMENTO DEL MTODO

Se mide la alanina aminotransferasa con un mtodo cintico. En la reaccin, la alanina aminotransferasa cataliza la transaminacin reversible de un grupo amino de la L-alanina al -cetoglutarato con formacin de piruvato y L-glutamato. Luego, el piruvato se reduce a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) con la oxidacin concurrente de alfa-dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) a dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

L-alanina + a-cetoglutarato Piruvato + NADH + H+

ALT LDH

Piruvato + L-glutamato Lactato + NAD+

S015177L.EPS

La oxidacin de NADH a NAD es directamente proporcional a la actividad de GPT. 4. PREPARACION 4.1 MUESTRA CLINICA Suero o plasma heparinizado. 4.2 MATERIAL Y REACTIVO Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 200L. Puntas para micropipeta. Gradilla Equipo Fotmetro termostatable a 37C con filtro de 340 nm. Cronmetro Centrfuga CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tampn TRIS pH 7.8, 100 mmol/L Tampn L-Alanina 500 mmol/L Reactivo 2 NADH 0.18 mmol/L Comprimidos LDH 1200 U/L -cetoglutarato 15 mmol/L 5. PROCEDIMIENTO 5.1TCNICA

Temperatura :.......................... 25/30/37C Longitud de onda:.....................340 nm Hg334 nm. Hg 365nm Cubeta :....................................1 cm. paso de luz. Lectura frente aire o agua destilada. Macrotest Semimicrotest Reactivo al uso 2.0 mL 1.0 mL Muestra 200 L 100 L Mezclar, esperar 1 minuto. Anotar la lectura y poner en el cronmetro. Repetir la lectura a 1, 2 y 3 minutos. Calcular el valor medio de los incrementos de extincin por minuto ( E/min)

6. RESULTADOS 6.1 Clculos 340 nm E/min x 1750= U/L 334 nm E/min x 1790= U/L 365 nm E/min x 3240= U/L

6.2 Linealidad Si la E/min a 340 nm 334 nm es superior a 0.150 bien a 365 nm es superior a 0.080, la muestra deber diluirse en proporcin de 1:10 con una solucin salina 0.9%. Deber tenerse en cuenta esta dilucin al hacer el clculo. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica 30C 37C 29 U/L 40 U/L 22 U/L 32 U/L

Hombres hasta Mujeres hasta

25C 22 U/L 18 U/L

Factores de conversin de temperaturas Temp. Temperatura deseada Reaccin 25C 30C 25C 1.00 1.32 30C 0.76 1.00 37C 0.55 0.72 OBSERVACIONES La hemlisis interfiere en el test. CONTROL DE CALIDAD SPINTROL Normal y Patolgico.

37C 1.82 1.39 1.00

5.9 LACTATO DESHIDROGENASA LDH. MTODO CINTICO U.V 1. INTRODUCCIN Cuando solamente est implicado un rgano especfico, como el hgado, la medicin del la LDH total puede ser til. La LDH se incrementa con las hepatitis virales o txicas, en la obstruccin biliar extraheptica, en la necrosis aguda del hgado y en la cirrosis del hgado. Sin embrago, en condiciones en las que puedan estar implicadas varios rganos, la medicin del LDH total es menos til que la medicin de las isoenzimas de la LDH. Las isoenzimas LDH5 y LDH4 son las responsables de la actividad primaria del hgado, mientras que las isoenzimas LDH1 y LDH2 son las responsables por la actividad predominante de la LDH en el corazn y el rin. Puesto que los glbulos rojos tambin contienen mucha LDH1, se debe evitar el anlisis de muestras de suero bemolizadas. En las condiciones hepticas, la electroforesis de la LDH muestra que la elevacin en la LDH total se debe a la liberacin de LDH4 y LDH5 al suero. La mayor actividad de la LDH se presenta en el rin y el corazn, y la menor en el pulmn y el suero. La LDH se localiza en el citoplasma celular y es por tanto liberada al suero cuando las clulas se daan o necrosan. Los valores de lactato deshidrogenasa se utilizan en el diagnstico y tratamiento de enfermedades hepticas tales como la hepatitis viral aguda, la cirrosis y el carcinoma heptico metastsico, tambin en enfermedades cardacas como el infarto del miocardio, y tumores de pulmn o de rin. 2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la lactato deshidrogenasa en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la enzima LDH y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de LDH en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO El reactivo LDH se utiliza para medir la actividad de la lactato deshidrogenasa con un mtodo cintico enzimtico. En la reaccin, la LDH cataliza la oxidacin reversible de L-lactato a piruvato con la reduccin concurrente de dinucletido de nicotinamida adenina (NAD) a dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH). La deshidrogenasa lctica est presente en muchos tejidos. La LDH cataliza la interconversin de piruvato y lactato:

ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

L-Lactato + NAD+

LD

Piruvato + NADH + H+
S015239L.EPS

Slo para uso en diagnstico in vitro. La oxidacin de NADH a NAD+ acompaada por una disminucin de absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de LDH. 4. PREPARACION 4.1 MUESTRA CLINICA Suero. 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipetas de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 50L. Puntas para micropipeta. Gradilla Equipo Pipetas de 2 mL y 200 L Fotmetro termostatable a 37C con filtro de 340 nm. Cronmetro CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tris pH.7.5, 50 mmol/L Tampn Piruvato 0.6 mmol/L Reactivo 2 Comprimidos NADH 0.18 mmol/L

El reactivo de trabajo es estable 5 das a 2-8C 24 horas a temperatura ambiente. La muestra puede ser conservada 48 horas a 2-8 C. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 TCNICA Longitud de onda: . . . 340 nm o 334 365 nm Temperatura: . . . . . . . 25/30/37C Cubeta: . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz.

Lectura: . . . . . . . . . . . . frente aire o agua destilada 25 C /30C /37C Reactivo al uso 3.0 mL 1.5 mL Muestra 100 L 50 L Mezclar y esperar 1 minuto. Verter la mezcla en la cubeta, leer la extincin y poner en marcha el cronmetro. Repetir la lectura a 1,2 y 3 minutos despus. Calcular (E/min)

6. RESULTADOS 6.1 Clculo A 25 y 30C 340 nm (E/min) x 4925 = U/L 334 nm (E/min) x 5020 = U/L 365 nm (E/min) x 9120 = U/L A 37C 340 nm (E/min) x 9690 = U/L 334 nm (E/min) x 9880 = U/L 365 nm (E/min) x 17950 = U/L 6.2 Linealidad Si el E/min a 340 nm es superior a 0.150 bien si a 365 nm es superior a 0.080, repetir la prueba diluyendo la muestra a 1:10 con solucin salina 0.9%. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica 30C 37C 160-320 U/L 230-460 U/L

25C 120-240 U/L

Temp. Reaccin 25C 30C 37C

25C 1.00 0.75 0.52

Factores de conversin de temperaturas Temperatura deseada 30C 37C 1.33 1.92 1.00 1.43 0.70 1.00

NOTAS La hemlisis interfiere en test.

CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

UNIDAD VI FUNCIN GSTRICA, PANCREATICA E INTESTINAL 6.1 AMILASA AMY PRUEBA CINTICA- CNPG3 1. INTRODUCCIN El pncreas puede ser la glndula maestra del cuerpo si se consideran los graves trastornos digestivos y metablicos que aparecen cuando se pierden sus funciones exocrinas y endocrinas. El principal trastorno al que conduce la prdida de la funcin endocrina es la diabetes mellitus, que cuenta con mayor morbilidad y mortalidad que todas las otras enfermedades pancreticas juntas. Las pruebas de laboratorio importantes a este respecto, son la determinacin de glucosa en sangre, fructosamina y hemoglobina A1c con objeto de conocer el control glucmico a corto y largo plazo. La prdida de la funcin exocrina es comn en la fibrosis qustica y en algunos sujetos con ataques repetidos de pancreatitis generalmente causados por el abuso crnico del alcohol. El pncreas tiene una gran reserva y la prdida de la funcin produce sntomas slo despus de que 85% de las clulas acinares se ha perdido. Existen algunas pruebas de funcin pancretica que junto con la de grasa en materia fecal son las ms importantes. Las pruebas en suero, como la tripsina inmunorreactiva, son las menos sensibles y menos especficas a pesar de ser las ms fciles de realizar. La pancreatitis aguda es una de las principales emergencias mdicas; el alcoholismo y las enfermedades del tracto biliar son las causas predominantes, aunque slo tenemos algunas evidencias conjeturales de cmo se inicia una pancreatitis. Los cambios observados en las enzimas pancreticas como amilasa y lipasa pueden ser de moderados a intensos, desafortunadamente slo es posible obtener una estimacin gruesa de la gravedad del padecimiento con los estudios de laboratorio. La pancreatitis crnica generalmente es la secuela de mltiples brotes de la enfermedad aguda y los resultados de laboratorio normalmente no son muy tiles para el diagnstico. El adenocarcinoma de pncreas, la forma comn de la enfermedad maligna, es funesta para casi todos los pacientes debido a la naturaleza invasiva del cncer y su progresin rpida y silenciosa. No existen pruebas adecuadas de escrutinio para el cncer pancretico y la muerte se presenta tpicamente de seis meses a un ao del diagnstico. Las neoplasias de los islotes de Langerhans son un reto bioqumico para su diagnstico. Excepto los gastrinomas que producen el sndrome de Zollinger-Ellison, la mayora de estos tumores no son malignos pero pueden poner en peligro la vida debido a la liberacin no controlada de factores endocrinos y la estimulacin a sus rganos blancos. Para establecer el diagnstico se requiere realizar pruebas que determinen las hormonas normalmente producidas en las clulas del islote de Langerhans y otros factores.

La amilasa alfa (AMS) es una metaloenzima que requiere calcio y pertenece a la clase de hidrolasas. La reaccin enzimtica que cataliza la amilasa alfa es la hidrlisis aleatoria de enlaces glicosdicos alfa-1,4 internos del almidn, glucgeno y otros polmeros de la glucosa. Los productos de digestin de la amilasa, que es una mlecula de almidn lineal que contiene slo enlaces alfa 1,4, son maltosa, maltotrinosa y otras dextrinas. Las principales fuentes tisulares de esta enzima son las glndulas salivales y las clulas acinares del pncreas. La actividad de amilasa alfa no es especfica para estos tejidos, ya que tambin se encuentra en el epitelio intestinal, trompas de Falopio, mucosa del cuello uterino, endometrio y tejido del seno durante la lactancia. La principal funcin de la amilasa alfa se debe a la fraccin pancretica, que ayuda a la digestin del almidn, glucgeno y sus productos de descomposicin en el intestino delgado. La AMS de la saliva inicia la digestin de almidn en la cavidad oral, pero su accin termina con rapidez a consecuencia del pH cido del jugo gstrico durante la deglucin. Durante aos los niveles de -amilasa en suero nos han evidenciado la necesidad de su determinacin para el diagnstico de pancreatitis aguda. Las primeras tcnicas estaban basadas en los cambios de la absorcin mxima del complejo entre el almidn y el yodo, ya que la -amilasa degrada al almidn. Otros mtodos estn basados en la produccin de p-nitrofenol a partir de sustratos oligosacridos especficos con grupos bloqueantes en el azcar terminal. Estos mtodos utilizan una variedad de enzimas para hidrolizar la corta cadena de oligosacridos para producir p-nitrofenol. Estas enzimas contienen una actividad residual de -amilasa que reducen significativamente la estabilidad del reactivo. El mtodo que presentamos no utiliza enzimas, evitando as este problema de estabilidad. Se han desarrollado ensayos de apareamiento enzimtico que permiten condiciones de hidrlisis ms controladas y congruentes, y que tambin pueden adaptarse a instrumentos automatizados. 2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la amilasa en una muestra biolgica Establecer los valores de referencia de la enzima AMY y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de AMY en una muestra biolgica. 3. FUNDAMENTO DEL MTODO Se mide la actividad de la amilasa con un mtodo cintico enzimtico. En la reaccin, la amilasa cataliza la hidrlisis del sustrato definido (maltotetraosa) a maltosa. La velocidad de formacin de maltosa se mide mediante el uso de tres reacciones relacionadas que catalizadas por la maltosa fosforilasa (MP), la

-fosfoglucomutasa (PGM), y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), dan como resultado la produccin de -dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) a partir de -dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). ESQUEMA DE LA REACCIN QUMICA

Maltotetraosa + H2O Maltosa + fosfato Glucosa-1-fosfato

Amilasa MP PGM

2 maltosa

glucosa + glucosa-1-fosfato glucosa-6-fosfato

G6PDH

Glucosa-6-fosfato + NAD+

6-fosfogluconato + NADH + H+
S015182L.EPS

La cantidad de CNP formado puede ser detectado espectrofotomtricamente a 405 nm dando una medida directa de la actividad de la -amilasa de la muestra. La reaccin no est inhibida por factores endgenos.

4. PREPARACION 4.1 MUESTRAS CLINICAS Suero, plasma heparinizado u orina. Otros anticoagulantes como el citrato o EDTA no son recomendables. Una vez efectuada la extraccin, centrifugar y separar el suero lo antes posible. La -amilasa es estable en la muestra durante una semana a temperatura ambiente (20-25C) y varios meses cua ndo la muestra se guarda bien tapada y refrigerada a 2-8C.

4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipeta de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 20L. 1 Micropipeta de 200 L Puntas para micropipeta. Gradilla Pipeta de 2 mL Equipo Fotmetro termostable a 37C con filtro de 405 nm. Cronmetro COMPOSICIN DEL REACTIVO MES tampn pH 6.0, 100 mmol/L

2-Cl-4-Nitrofenil--D-maltotriosido (CNPG3) 2.25 mmol/L Cloruro de sodio 350 mmol/L Acetato de calcio 6 mmol/L Tiocianato de potasio 900 mmol/L Azida de Sodio 0.095% PREPARACIN Y ESTABILIDAD El reactivo est listo para su utilizacin. Si el frasco no se ha abierto y se ha guardado a 2-8 el reactivo ser estable C, hasta la fecha de caducidad. Una vez abierto el reactivo ser estable 60 das siempre y cuando se tape inmediatamente despus de su uso diario y se guarde a 2-8 C. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 TECNICA Longitud de onda . . . . . . . . . 405 nm Temperatura . . . . . . . . . . . ..37 C Cubeta . . . . . . . 1 cm de paso de luz Cero frente a agua destilada Reactivo 1.0 mL Muestra o control 20 L Orina 10 L Mezclar y leer. Medir el incremento de la absortividad por minuto durante 1, 2 y 3 minutos A/min

6. RESULTADOS 6.1 CALCULO Calcular la actividad de la -amilasa de la muestra usando el siguiente factor: Suero, plasma Actividad (U/L)= A/min x 3954 Orina Actividad (U/L)= A/min x 7908 Unidades SI: U/L X 0.01667= kat/L 6.2 LINEALIDAD Este mtodo es lineal hasta 2000 U/L. Si la muestra es superior, debe diluirse la muestra con solucin salina 1:2 y repetir el ensayo, multiplicando el resultado por 2. 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica Suero, plasma < 90 U/L

Orina <450 U/L Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia dependiendo de la localizacin. . NOTAS: Debido al contenido en -amilasa de la saliva y el sudor, para reducir la posibilidad de contaminacin, no pipetear el reactivo con la boca, ni tener en contacto la muestra y el reactivo con la piel. No se deben procesar muestras hemolizadas. Contiene tiocianato de potasio. Evitar su inhalacin o contacto del reactivo con la piel y los ojos. Si ocurre lavar la piel y los ojos con abundante agua y consultar al mdico.

CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

6.2 LIPASA 1. INTRODUCCIN La lipasa (LPS) es una enzima que pertenece a las hidrolasas, hidroliza los steres de glicerol de triglicridos de cidos grasos de cadena larga. La lipasa hidroliza preferencialmente los enlaces estricos de los carbonos 1 y 3 de la molcula de triglicridos y produce dos molculas de cido graso y una molcula de 2-monoglicrido. Se observa actividad de lipasa en pncreas mucosa intestinal, estmago, leucocitos y tejido adiposo. Sin embargo, slo la lipasa pancratica tiene significado clnico; su principal funcin consiste en hidrolizar los triglicridos de la dieta que han sido emulsificados por cidos biliares y ayudan as a la absorcin de grasas en el intestino delgado. Como la lipasa se produce principalmente las clulas acinares del pncreas, su utilidad clnica se relaciona casi de manera exclusiva con el diagnstico de laboratorio de pancreatitis aguda. Otras afecciones en las cuales se incrementa la actividad de lipasa incluyen intoxicacin aguda con alcohol y traumatismos accidentales o quirrgicos del abdomen.

2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la lipasa en una muestra biolgica. Establecer los valores de referencia de la enzima LPS y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar.

Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de LPS en una muestra biolgica

3. FUNDAMENTO DEL MTODO La lipasa pancretica en presencia de colipasa, desoxicolato, adems de iones calcio, hidroliza el sustrato 1-2-O-dilauryl-rac-glycerol-3-glutrico acido-(6' metilresorufina)-ester, segn la secuencia de las siguientes reacciones: 1-2-O-dilauryl-rac-glycero-3-glutrico cido-(6' -metilresorufina)-ester >1-2-O-dilauril-rac-glycerol + glutricoacido-6'-metilresorufina ester (no estable) > cido glutrico + Metilresorufina

4. PREPARACION 4.1 MUESTRA CLINICA Suero fresco no hemolizado o plasma. 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario 5 tubos de ensaye de 13 X100mm. 1 Micropipeta de 1.0 mL. 1 Micropipeta de 10L. Puntas para micropipeta. Gradilla Equipo: Fotmetro termostable a 37C con filtro de 580 nm. Cronmetro CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Tampn TRIS pH: 8.4, 40 mmol/L Colipasa 40 000 U/L Desoxicolato 1.8 mmol/L Estabilizante Reactivo 2 Tartrato pH: 4.0, 1.6 mmol/L Sustrato 0.24 mmol/L Cloruro de calcio 0.1 mmol/L Detergente Estndar Lipasa PREPARACIN Y ESTABILIDAD R.1 y R.2, ambos reactivos estn listos para su uso. Agitar suavemente el R.2 antes de su uso. Estndar: reconstituir el vial con 1 mL de agua bidestilada. La estabilidad es de 10 das a 2-8 C 3 meses congelado a -20C. Se recomienda congelar alcuotas.

5. PROCEDIMIENTO 5.1 TECNICA Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . 580 nm Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . 37C Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Blanco 10 L Estndar 10 L 1.0 mL 100 L 1.0 mL 100 L 10 L 1.0 mL 100 L Muestra

Agua destilada Estndar Muestra R.1 R.2

Mezclar e incubar 1 minuto a 37C. Efectuar una lectura inicial al primer minuto y repetir lecturas despus de 1 y los 2 minutos siguientes. Calcular el incremento de extincin (E/min) del blanco, estndar y muestra.

6. RESULTADOS 6.1 Clculo Restar a las lecturas (E/min) efectuadas del estndar y muestras, el incremento del blanco (E/min). E/min muestra x actividad estndar = U/L Lipasa E/min estndar 6.2 Linealidad El mtodo es lineal hasta actividades de: 250 U/L 6.3 Lmite de Seguridad Biolgica U/L metilresorufin a 37C : < 30 U/L

NOTAS: La actividad de la lipasa en U/L metilresorufin a 37C, puede ser convertida en U/L turbidimtrico a 37C con triolena como sustrato, multiplicando el resultado por 6.2. A fin de evitar contaminaciones se recomienda no utilizar las cubetas y utensilios que se hayan usado para la determinacin de triglicridos. CONTROL DE CALIDAD SPINTROL. Normal y patolgico.

UNIDAD VII PRUEBAS DE FUNCIONAMIENTO CARDIOVASCULAR 1. INTRODUCCIN El metabolismo altamente anaerbico del corazn le permite usar como combustible muchos substratos normalmente presentes en el plasma, y la absorcin cardaca de la mayora de estos substratos es proporcional a su concentracin arterial una vez que ciertos niveles son excedidos. En trminos generales, el corazn usa los cidos grasos libres como su combustible predominante. Tambin consume importantes cantidades de glucosa y lactato, as como cantidades ms pequeas de piruvato, cuerpos cetnicos y aminocidos. La mayor parte de la energa para la funcin cardaca se obtiene de la descomposicin de metabolitos a travs del ciclo del cido ctrico y la fosforilacin oxidativa. Estas vas enzimticas se encuentran principalmente en las mitocondrias, representando aproximadamente un 35% del volumen total del msculo cardaco. Enzimas en las clulas miocardiacas Varias enzimas encontradas en el tejido miocrdico son clnicamente importantes debido a que su liberacin en el torrente sanguneo puede estar relacionada con el dao y la muerte de las clulas miocrdicas. Creatina cinasa La enzima responsable de la regeneracin del ATP es la creatina cinasa.Tiene un peso molecular de 85,000 daltones y existe en diversas formas isoenzimticas. La creatina cinasa (CC) es un dmero, compuesto de las dos subunidades M (msculo) y B (cerebro). Las tres isoenzimas formadas a partir de estas subunidades se encuentran en el citosol. Estas isoenzimas se abrevian como MM, MB, y BB. Si comparamos la actividad de la enzima en varios tejidos, el msculo esqueltico tiene por mucho la mayor actividad, poseyendo unas 50,000 veces la concentracin de la CC srica. La isoenzima esqueltica predominante es la isoenzima MM, con slo trazas de las isoenzimas MB y BB en la mayora de las fibras musculares. El componente MB, sin embargo, est incrementado en ciertos trastornos musculares, particularmente en la distrofia muscular tipo Duchenne y en la polimiositis. La actividad de CC del msculo esqueltico medida en unidades internacionales es aproximadamente de 2000 U/g, comparada con la actividad del msculo cardaco de 500 U/g. En suero normal, por lo menos el 95% de la CC presente es del tipo MM que probablemente se deba principalmente a fugas del msculo esqueltico, particularmente durante la actividad fsica. Debido a esto, la actividad de la CC srica en personas activas saludables muestra una distribucin asimtrica inclinada hacia valores ms altos. Adems, los valores son ms bajos en las mujeres que en los hombres y son ms bajos en la maana que en la noche. Los valores tienden a ser ms bajos en pacientes hospitalizados,

posiblemente debido a que el reposo en cama reduce la cantidad de enzimas liberadas del msculo. Isoformas de CC Las isoenzimas CC-MM y CC-MB en suero pueden ser fraccionadas en subtipos o isoformas mediante tcnicas de alta resolucin, tales como electroforesis de alto voltaje o enfoque isoelctrico. Las isoformas de CC-MM y CC-MB se forman en la sangre mediante la ruptura enzimtica irreversible del aminocido del COOH terminal, un residuo de lisina, de la subunidad M o de las subunidades de las isoenzimas del tejido. Para la CC-MM, esta ruptura involucra la remocin sucesiva de los residuos terminales de lisina de cada subunidad M, dando lugar a tres isoformas llamadas MM3 (forma tisular, o Mlisina Mlisina), MM2 (o MlisinaM), y MM1 (o MM). La CC-MB, que tiene una sola subunidad M, consiste de dos isoformas en la circulacin, la llamada MB2 (forma de tejido, o MlisinaB), y MB1 (o MB). Es de notar que la secuencia amino terminal de la subunidad B de la CC es similar al de la subunidad M, sin embargo, la ruptura de la lisina terminal de la subunidad B de la CC-MB permanece controversial. Lactato deshidrogenasa La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima tisular ubicua que cataliza la reduccin de piruvato a lactato usando nicotinamida adenina dinucletido (NAD). La LDH de un peso molecular de aproximadamente 140,000 daltones y es un tetrmero compuesto de cuatro subunidades con peso molecular de 35,000 daltones cada una. Las subunidades, que son de dos tipos, H (corazn) y M (msculo), se combinan para formar las cinco isoenzimas de LDH. La principal isoenzima (HHHH) tiene una actividad mxima en presencia de bajas concentraciones de piruvato, pero se inhibe por exceso de piruvato. Por contraste, la principal isoenzima muscular (MMMM) exhibe actividad mxima en presencia de una mayor concentracin de piruvato y se inhibe menos por exceso de piruvato. El corazn metaboliza los cidos grasos y los carbohidratos a una velocidad aproximadamente constante con oxidacin completa del piruvato a travs del ciclo de Krebs del cido ctrico. Por lo tanto, el corazn tiene una baja concentracin tisular de piruvato y lactato y rpidamente convierte el lactato del plasma en piruvato. Por contraste, el msculo, con rpidas demandas de incrementos de energa durante el ejercicio, tiene que contender con rpidos incrementos en piruvato y lactato de tejido causados por el metabolismo anaerbico. La LDH se encuentra en el citosol de todas las clulas humanas y por lo tanto tendra poca especificidad para el diagnstico a no ser por el hecho de que las isoenzimas estn presentes en diferentes proporciones en cada tejido. El corazn y los eritrocitos contienen principalmente LDH1 y LDH2, mientras que el msculo esqueltico y el hgado contienen LDH5 y en menor grado LDH4. El suero normal contiene principalmente LDH2, con menores cantidades de LDH1 y de las otras isoenzimas. Si las enzimas son liberadas del tejido cardaco al suero, a menudo vemos un cambio en la proporcin de LDH1 a LDH2. La vida media de la LDH es diferente para cada isoenzima; la isoenzima 1 (HHHH), tiene una vida media de aproximadamente 100 horas, mientras que la isoenzima 5 (MMMM) tiene una vida

media de slo 10 horas. La importancia de esto es evidente en la discusin de la liberacin de las enzimas durante el infarto al miocardio. Aspartato aminotransferasa La aspartato aminotransferasa (ASAT) cataliza la transferencia de un grupo amino entre el cido asprtico y el piruvato para formar oxaloacetato (alfa cetoglutarato) y alanina. Esta enzima ubicua es esencial en el metabolismo intermedio y permite que los aminocidos cido asprtico y cido glutmico se degraden en el ciclo de Krebs. La enzima existe en dos formas estructuralmente diferentes; una se encuentra principalmente en el citoplasma y la otra en las mitocondrias. La forma citoslica es la que se encuentra en el suero. Su vida media en el suero es probablemente de alrededor de 20 horas. El hgado tiene la mayor actividad enzimtica, con aproximadamente 85 U/g de tejido, mientras que el corazn posee 75 U/g y el msculo esqueltico cerca de 50 U/g. Protenas contrctiles Los marcadores bioqumicos ms comnmente usados para lesin del miocardio estn involucrados con el metabolismo de las clulas, son solubles y estn localizados en el compartimento citoslico de las clulas. Debido a estas propiedades, una gran proporcin de estos marcadores citoslicos son liberados rpidamente en la circulacin despus de una lesin celular. Por contraste, la naturaleza y funcin de las protenas estructurales determina que sean solubles; por consiguiente una proporcin relativamente pequea est libre en el citosol y disponible para su rpida liberacin poco despus de una lesin celular. A esta pequea proporcin disponible para liberacin se le denomina el reservorio citoslico. A pesar de la desventaja terica de su insolubilidad, se ha generado bastante inters en las siguientes protenas estructurales: troponina I, troponina T, y las cadenas ligeras de miosina. La base de este inters clnico surge de la identificacin y purificacin de formas cardacas de estas protenas con alta especificidad tisular, que se discuten adelante con mayor detalle, han permitido el desarrollo de ensayos inmunolgicos para la determinacin de lesiones miocrdicas. Miosina, actina y troponina Las protenas miosina y actina forman la mayor parte del aparato contrctil de las clulas musculares. Juntas constituyen el 80% de la protena de las clulas musculares. Las protenas reguladoras troponina y tropomiosina, en asociacin con la actina polimerizada, forma los filamentos delgados del sarcmero. La troponina consiste de un complejo de tres subunidades: troponina C, troponina I, y troponina T. Troponina T (TnT) La protena troponina T, de 37 kilodaltones, tiene un reservorio citoslico que constituye cerca del 6% de su concentracin intracelular total. A pesar de encontrarse tanto en el tejido esqueltico como en el corazn, la TnT est siendo usada exitosamente como un marcador para la enfermedad cardaca isqumica

debido a que un subtipo encontrado en el tejido miocrdico tiene una homologa de solamente 60% con la forma del msculo esqueltico. Se han desarrollado anticuerpos altamente especficos que discriminan entre los subtipos de los msculos cardacos y esquelticos. Troponina I (TnI) Al igual que la TnT, la TnI es parte integrante del aparato contrctil estructural tanto del msculo esqueltico como del miocrdico. Se cree que el reservorio citoslico de TnI es el mismo que el de TnT, esto es, cerca del 6% de la concentracin total de TnI de las clulas. La TnI, con un peso molecular de 21 kilodaltones, es ligeramente ms pequea que la TnT. El subtipo cardaco de la TnI tiene varias regiones de aminocidos que difieren substancialmente de la forma del msculo esqueltico. Estas regiones sirven como base para los inmunoensayos cardacos especficos. Cadenas ligeras de Miosina (CLMs) La miosina es una molcula de filamentos largos (540 kD) compuesta por seis cadenas de pptidos, dos de las cuales son pesadas (230 kD) y cuatro son ligeras (CLMs), con pesos moleculares en el rango de 26 kD. Las CLMs estn formadas por dos componentes, la cadena ligera de miosina-1 y la cadena ligera de miosina2, que juntas constituyen el filamento grueso del aparato contrctil en el msculo esqueltico y miocrdico. Las CLMs de fuentes cardacas y no cardacas pueden ser diferenciadas usando anticuerpos especficos para CLMs cardacas. Debe notarse que el reservorio citoslico para las CLMs es de 0.5% de la cantidad total de clulas, y solamente cerca del 10% del reservorio citoslico para TnT o TnI.

7.1Creatin-kinas Creatincinasa Mtodo cintico UV. NAC activado 1. INTRODUCCIN

Se encuentra ms abundancia de CK en el msculo esqueltico. Las otras fuentes en que se encuentra, por orden de mayor a menor actividad, son: cerebro, recto, estmago, vejiga, colon, tero, prstata, intestino delgado y rin. Se detectan cantidades despreciables en hgado, placenta y tejido tiroideo. La CK se eleva principalmente cuando hay afecciones o enfermedades que afectan el tejido msculo esqueltico, el miocardio o el cerebro. Se observan notables incrementos de CK total en infarto agudo al miocardio, en afecciones del msculo esqueltico y despus de un choque o colapso circulatorio. En general la CK se eleva en infarto agudo al miocardio y es de gran utilidad clnica para detectarlo. La CK total comienza a incrementarse despus de 15 horas de ocurrir un infarto agudo al miocardio. La actividad mxima se observa a las 24 horas y regresa a la normalidad a los 3 das. La miocarditis tambin provoca actividad notablemente alta de CK durante la fase inflamatoria de la afeccin.

La CK se eleva adems en diversas enfermedades o lesiones del msculo esqueletico. Los valores de creatincinasa y sus isoenzimas se utilizan en el diagnstico y tratamiento de los infartos de miocardio y de miopatas como la distrofia muscular progresiva tipo Duchenne. La creatincinasa (CK) es una enzima del citoplasma y la mitocondria que cataliza tanto la formacin de ATP como la fosforilacin reversible de creatinina, con el ATP como grupo donador de fosfato. La CK requiere activadores metlicos, particularmente Mg2+ , para que la enzima alcance toda su actividad cataltica. CK Creatinina + ATP Fosfato de creatinina + ADP

La actividad de CK es de particular importancia en el tejido muscular, en donde cataliza la sntesis de fosfato de creatinina, una molcula que almacena enlaces de alta energa. Para efectuar una contraccin muscular se utiliza el grupo fosfato para formar ATP a fin de proporcionar de inmediato energa a los msculos. Hay diversos mtodos analticos para determinar la actividad de CK ya sea mediante la reaccin hacia la derecha (creatinina fosfato de creatinina) o la reaccin inversa. Estos mtodos son anlisis de punto final o cinticos, en los que se emplean tcnicas de espectrofotometra, fluorescencia o bioluminiscencia. El mtodo de referencia para el anlisis de CK es el de Oliver y Rosalki, un anlisis cintico en el que se emplea la secuencia de reaccin inversa. CK Fosfato de creatinina + ADP HK ATP + glucosa Glucosa-6-fosfato + ADP
+

Creatinina + ATP

G-6-PDH

Glucosa-6-fosfato + NADP

6-fosfatogluconato + NADPH + H+

En donde HK = hexocinasa y G-6-PDH = deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato.

2. OBJETIVOS Aplicar el manejo adecuado de la tcnica para la determinacin de la Creatin cinasa Establecer los valores de referencia de la enzima CK y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar. Definir cuales son las principales patologas que se presentan si tenemos valores altos o bajos de CK. 3. FUNDAMENTO DE LA METODOLOGA

Se mide la actividad de la creatincinasa mediante un mtodo cintico 1,2,3,4 enzimtico. En la reaccin, la creatincinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato del sustrato fosfato de creatina al difosfato de adenosina (ADP). La subsiguiente formacin de trifosfato de adenosina (ATP) se mide mediante el uso de dos reacciones asociadas, catalizadas por la hexocinasa (HK) y la glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G6PDH), lo que produce dinucletido de nicotinamida adenina reducida (NADH) a partir del dinucletido de nicotinamida adenina (NAD). El ensayo (CK) contiene el activador monotioglicerol. ESQUEMA DE LA REACCIN QUMICA

Fosfato de creatina + ADP ATP + glucosa HK

CK

Creatina + ATP

Glucosa-6-fosfato + ADP G6PDH 6-Fosfogluconato + NAD+ + H+

S015197L.EPS

Glucosa-6-fosfato + NAD+

4. PREPARACIN 4.1 MUESTRA CLINICA Suero, plasma heparinizado con EDTA. 4.2 MATERIAL Y REACTIVOS Material necesario Pipetas de 2 mL y 200 L Fotmetro termostable a 37C con filtro de 340 nm. Cronmetro CONTENIDO DEL EQUIPO Reactivo 1 Imidazol pH 6.7, 100 mmol/L Tampn Glucosa 20 mmol/L Acetato Magnesio 10 mmol/L EDTA 2 mmol/L Reactivo 2 ADP 2 mmol/L Comprimidos AMP 5 mmol/L Diadenosin-5-P 10 mmol/L NADP+ 2 mmol/L Hexoquinasa (HK) 2500 U/L G-6-PDH 1500 U/L N-acetilcisteina 20 mmol/L

Creatin-fosfato 30 mmol/L La estabilidad del monoreactivo es de 5 das a 2-8C 24 horas a temperatura ambiente. La actividad de la CK en suero disminuye un 10% al cabo de un da a 2-6C 1 hora a 15-25C. 5. PROCEDIMIENTO 5.1 TECNICA Longitud de onda . . . . . . 340 nm ,334 nm, 365 nm Temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25/30/37C Cubeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz Lectura . . . . . . . . . . . . . . frente aire o agua dest. 25-30 C 2.5 mL 100 L 37 C 2.5 mL 50 L

Reactivo al uso Muestra Mezclar e incubar 2 minutos.

Verter la solucin a la cubeta, leer la extincin y poner en marcha el cronmetro. Repetir la lectura a 1,2 y 3 minutos. Calcular E/min.

6. RESULTADOS 6.1 Clculo A 25/30C 340 nm E/min x 4127 = U/L 334 nm E/min x 4207 = U/L 365 nm E/min x 7429 = U/L A 37C 340 nm E/min x 8095 = U/L 334 nm E/min x 8260 = U/L 365 nm E/min x 14751 = U/L 6.2 Linealidad A 334 nm y 340 nm hasta E/min de 0.250 A 365 nm hasta E/min de 0.140 Para valores superiores, se diluir la muestra a 1:10 con solucin salina 0.9%

25C

6.3 Lmite de Seguridad Biolgica 30C 37C

Hombres Mujeres

10-80 U/L 10-70 U/L

15-130 U/L 15-110 U/L

24-195 U/L 24-170 U/L

Factores de conversin de temperaturas Temp. Temperatura deseada Reaccin 25C 30C 25C 1.00 1.56 30C 0.64 1.00 37C 0.41 0.63

37C 2.44 1.56 1.00

NOTAS La hemlisis interfiere en la prueba a concentraciones superiores a 200 mg/dL de hemoglobina.

UNIDAD VIII EQUIPO AUTOMATIZADO UTILIZADO EN QUMICA CLNICA 1.0 INTRODUCCIN El trmino automatizacin se refiere a la tcnica, mtodo o sistema para hacer funcionar o controlar un proceso mecnico o productivo por medios automticos como dispositivos electrnicos. Cuando se aplica a la qumica clnica, la palabra automatizacin se refiere a un mtodo mecnico para llevar a cabo procesos analticos. La mayora de los instrumentos analticos automticos se disean para efectuar los pasos repetitivos en la determinacin de diversas concentraciones de analitos o sustancias problema en muestras de pacientes, principalmente suero, con un mnimo de intervencin del operador. Existe gran cantidad de instrumentos automatizados y cada uno de ellos tiene algo que ofrecer para mejorar el funcionamiento del laboratorio, por lo que es necesario valorar con exactitud las necesidades especficas del laboratorio y sus objetivos. Cada sistema automatizado incluye diversos pasos, que reflejan los que se llevan a cabo en el anlisis manual. Necesidad de informacin del mdico Paciente Laboratorio Obtencin de la muestra Preparacin de la muestra Preparacin del reactivo Transporte del reactivo (R) R+M Reaccin Medicin Datos Identificacin de muestra Muestreo (M)

Tipos de errores Confusin de muestras: Muestras etiquetadas equivocados. en el rea administrativa con nmeros de entrada

Sueros transferidos a tubos mal marcados en el rea de preparacin de muestra. Cuando una muestra se sac de la rueda de muestras del autoanalizador, y al introducir una muestra de urgencia se anota un nmero incorrecto de la copa y se asignan valores falsos a todas las muestras en la rueda. Intercambio de tubos analticos durante la toma de muestra con pipeta, o colocacin errnea de pipetas en los soportes de las mismas de las cuatro posiciones del espectrofotmetro. Fallas tcnicas de los aparatos Lecturas de cuadros incorrectas: Lecturas incorrectas de los mximos del autoanalizador Lecturas incorrectas de la curva estndar Lectura de la curva estndar asignada a una muestra equivocada Lecturas de la curva estndar equivocada Dilucin y errores de clculo: Olvidos de los analistas para corregir los resultados en la dilucin. Muestras diluidas por el analista de primer turno y analizadas por un analista del segundo turno, que no fue informado de la dilucin anterior. Reactivo y solucin estndar: Agua destilada en lugar de amortiguadora, para preparar un reactivo. Medidor de un pH estandarizado con amortiguador equivocado. Reactivo contaminado. Uso de sustrato o solucin estndar caducado.

Problemas por instrumentos: Reloj lento para una reaccin medida. Registrador no calentado adecuadamente; lectura blanco inestable. Utilizacin de balanzas descalibradas para pesar cualquier sustancia, estndares. Otros: Muestras dejadas a temperatura ambiente. El analista del primer turno deja muestras para ser analizada por el analista del segundo turno y este ltimo no se presenta a trabajar. El anlisis de la muestra queda pendiente para el siguiente da, lo que por otra parte dependiendo de la muestra obligar a tomar la decisin de realizar o no el anlisis. La exposicin prolongada de la luz de la habitacin puede destruir constituyentes como la bilirrubina. 2.0 OBJETIVOS Qu el alumno maneje correctamente el equipo automatizado y realice las determinaciones correspondientes a la asignatura de anlisis clnicos (dependiendo de los reactivos en stock). Que el alumno lleve a cabo las cartas de control de calidad y las interprete. 3.0 FUNDAMENTO Los equipos por su moderna tecnologa se ajustan adecuadamente a las necesidades: flexibilidad, seguridad y economa. Asimismo, las caractersticas y diseo hacen de los autoanalizadores adaptables a mltiples usos. Pueden utilizarse como auto-analizadores principales en la Qumica Clnica diaria o bien como analizadores de inmunoprotenas y en el anlisis de drogas. Los autoanalizadores en general, integran un diseo ptimo superior de gran precisin junto con un bajo mantenimiento y un volumen inferior de reactivos.

Qumica Clnica. Protenas especiales. Drogas de abuso. Monitorizacin de drogas teraputicas Electrlitos. 180 tests/hora. 300 tests con mdulo ISE. Autonoma de 4.5 horas. Incorporacin de sensores de nivel Random acces. Carga continua.

Test de incompatibilidad. Identificacin por cdigos de barras.

Sencillez: mayor facilidad de manejo gracias al nuevo sistema de software integrado basado en el sistema Windows. Instrucciones de mantenimiento integradas en el software. Aprendizaje fcil y rpido. Control de calidad: los resultados del control de calidad se almacenan en la memoria y pueden visualizarse fcilmente en la pantalla. El software efecta el clculo de la desviacin principal y el coeficiente de variacin. Validacin de los resultados mediante sistema Westgard. Integracin: Se integra perfectamente en su laboratorio. La conexin bidireccional al servidor permite recibir instrucciones y transmitir resultados al sistema principal. CARACTERSTICAS TCNICAS Dependiendo de la marca y modelo los autoanalizadores cuentan con: SISTEMA DE REACTIVOS

Rotor con 24 posiciones para contenedores de 25 L y 8 posiciones para contenedores de 5 L. Todas las posiciones pueden ser asignadas como R1 o R2. Se incluyen adaptadores para los contenedores de 5 L en las posiciones de 25 L. 5 pares de posiciones para 25 L pueden usarse con contenedores de 50 L. Volumen de reactivo 1 entre 110 y 400 L. Volumen de reactivo 2 entre 0 y 180 L. Rotor de reactivos refrigerado aprox.12 por debajo de la temperatura ambiente. Cnula de reactivos atemperada con sensor de nivel y agitador integrados. Consumo medio de reactivo por test: 250 L.

SISTEMA DE MUESTRAS

Rotor de muestras que contiene en el segmento exterior 51 posiciones para muestras y/o calibradores y 24 posiciones interiores para: 3 urgencias, 1 blanco, 9 calibraciones, 5 muestras peditricas, 4 controles, 1 solucin lavado y 1 activador ISE. Carga continua. Todas las posiciones pueden contener tubos primarios de 5 L o copas de muestra. Disponibles rotores especiales (opcional) para tubos KADE y SARSTEDT. Volumen de muestra entre 1 y 30 L por test. Cnula de muestra con sensor de nivel y agitador integrados.

CAPACIDAD Modo mono:

Hasta 180 test/hora (modo mono) Hasta 300 test/hora con unidad ISE.

Modo dual:

Hasta 133 test/hora (modo dual) Hasta 220 test/hora con unidad ISE.

PREDILUCIN MUESTRAS (solo modo dual)

Diluciones programables: 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 con 3 diluyentes posibles.

SISTEMA DE PIPETEO

Jeringas Hamilton y vlvula de bloqueo. Jeringa de reactivo: 1000 L. Jeringa de muestra: 100 L.

ROTOR DE REACCIN

Rotor semi-desechable con 48 posiciones de lectura. Paso de luz de 7 mm. Volumen mnimo de medicin de 220 L. Temperatura de trabajo 37C controlado por elementos Peltier.

ESTACIN DE LAVADO

Lavado de cubetas con 4 x 500 L de agua. La unidad est equipada con sensor de lquido.

FUENTE DE LUZ

Lmpara de cuarzo-ioduro 12V-20W. (Puede variar de acuerdo al modelo).

LONGITUDES DE ONDA

Seleccin automtica mediante una rueda de filtros (340, 405, 436, 505, 546, 578, 620 nm). Ancho medio de banda de 8 a 12 mm.

RANGO FOTOMTRICO

-0.1 a 3.0 Absorbancia.

MODOS ANALTICOS

Medicin cintica con chequeo de linealidad. Medicin bicromtica de punto final con o sin blanco de reactivo bicromtico y/o correcin por blanco de muestra. Medicin a dos puntos. Grfica de los puntos de medicin. Curvas de calibracin no-lineales.

CONDICIONES DE TRABAJO

15-32C Humedad mxima 80%.

CAPACIDAD DE MEDICIN (MODO MONO) (Puede haber variacin de acuerdo al modelo)

Absorbancia de reactivo (bicromtica) antes de la adicin de la muestra. Cintica durante 7 minutos despus de la adicin de la muestra. Punto final (bicromtico) 11.5 minutos despus de la adicin de la muestra. Cinticas a 2 puntos.

CAPACIDAD DE MEDICIN (MODO DUAL) (Puede haber variacin de acuerdo al modelo)

Absorbancia de reactivo (bicromtica) antes de la adicin de la muestra. Cintica 1 a 4.5 minutos despus de la adicin de la muestra (puede usarse como blanco muestra en cintica 2). Cintica 2 a 4 minutos despus de la adicin del reactivo 2. Cintica 1+2 a 8.5 minutos despus de la adicin de la muestra. Blanco de muestra (bicromtico) antes de reactivo 2.

Punto final (bicromtico) 4.5 o 11.5 minutos despus de la adicin de la muestra. Cintica 1, Cintica 2 o Cintica 1+2 que pueden medir en un tiempo mnimo o bien 2 mediciones para las determinaciones a 2 puntos.

MODOS DE CLCULO

Chequeo de efecto prozona para determinaciones inmunolgicas. Definicin de cut-off.

CONTROL DE CALIDAD

Pueden definirse hasta 15 controles, 3 por test. Reglas Westgard Grficos de Levey-Jennings.

STANDARDS

CE, Certificado CB.

IDIOMAS

Ingls, Alemn, Espaol, Francs, Italiano y Holands.

DIMENSIONES (Varan de acuerdo al modelo)

115 x 49 x 56.

OPCIONAL PC(requisitos mnimos)

Pentium 133 Mhz; 32 MB RAM VGA Monitor 640 x 480 pixels Hard disk: 1GB Floppy: 3.5" (1.44 MB) CD Rom Drive Windows 95 o 98 2 puertos serie: 1 para el instrumento y otro para el HOST. 1 puerto para la impresora.

IMPRESORA

El programa puede trabajar con 2 impresoras: una para informeas y otra para datos de calibracin y del sistema.

Pueden usarse las impresoras compatibles con Windows.

OTROS

Lector de cdigo de barras. Contenedor para desechos concentrados.

4.0 PREPARACIN Depender del autoanalizador. 5.0 PROCEDIMIENTO El equipo cuenta con un software integrado con las indicaciones de trabajo, o parmetros.

ANEXO GLOSARIO Acidosis. pH del fluido corporal anormalmente bajo. Respiratoria -causada por una PCO2 anormalmente alta; Metablica-causada por una concentracin de bicarbonato anormalmente baja. Acidosis lctica. Acidosis (pH sanguneo bajo) causado por exceso de cido. Adipsia. Ausencia de sed. Aditivo. Sustancia qumica que al aadirse a una muestra causa uno o ms cambios en sus propiedades fsicas o qumicas. Adsorber. Acoplamiento de una sustancia qumica a una superficie slida. Aerosol. Una fina niebla producida por la atomizacin de un lquido. Agua corporal total (ACT). Toda el agua contenida en el cuerpo, tanto dentro como fuera de las clulas, incluyendo aquellas contenidas en los sistemas gastrointestinal y genito-urinario. Agua extracelular (AEC). Agua externa a las membranas; anatmica: toda agua externa a las membranas celulares; fisiolgica: plasma y agua corporal en la cual pequeos solutos pueden difundirse; excluye la porcin transcelular del agua anatmica extracelular; incluye el plasma y el fluido intersticial. Agua intracelular (AIC). Agua contenida en las clulas del cuerpo; agua dentro de las membranas celulares. Agua libre. Agua que no contiene soluto. Agua transcelular. La porcin de agua extracelular que est rodeada por una membrana epitelial, cuyo volumen y composicin se determinan por la actividad celular de esa membrana. Alcalosis. pH del fluido corporal anormalmente alto; respiratoria: causada por una PCO2 anormalmente baja; metablica: causada por una concentracin de bicarbonato anormalmente alta.

Albuminuria. Incremento en la concentracin de albmina en la orina. Aldosterona. Hormona mineralocorticoide secretada por la corteza adrenal que influye en el metabolismo del sodio y el potasio. Alcuota. Una pequea parte de una determinada muestra, la cual tiene la misma composicin qumica. Aminoaciduria. Exceso de uno o ms aminocidos en la orina. Anlisis bicromtico. Monitoreo espectrofotomtrico de una reaccin a dos longitudes de onda. Usado para corregir el color de fondo. Anlisis cintico. Anlisis en el cual el cambio del parmetro que se est controlando con respecto al tiempo est relacionado con la concentracin, como el cambio de absorbancia por minuto. Las mediciones son hechas muy tempranamente en el perodo de reaccin. Anlisis hmedo de orina. Prueba de tamizaje de la orina que combina una valoracin fisicoqumica y un examen del sedimento urinario en una preparacin hmeda no coloreada. Anlisis de orina por tira hmeda. Examen qumico de la orina empleando tiras reactivas de prueba para la determinacin de albmina, glucosa, cetonas, bilirrubina, hemoglobina, bacterias, leucocitos, y otros constituyentes qumicos. Anlisis de punto final. Monitoreo de una reaccin despus de que sta se ha completado esencialmente. Anlisis por tira reactiva. Uso de tiras de prueba conteniendo reactivos qumicos para determinar si hay concentraciones patolgicas de diversas sustancias en la orina. Anastamsis. Conexin de dos vasos sanguneos. Angiognesis. Una complicacin de la diabetes mellitus. Proliferacin anormal de los vasos sanguneos en un tejido tal como las lentes del ojo. Angiopata. Una complicacin de la diabetes mellitus que se manifiesta como un dao en las membranas basales de los vasos sanguneos. Angiotensina. Polipptido vasopresor producido por la accin enzimtica de la renina sobre el angiotensingeno. Una enzima convertidora del pulmn extrae dos aminocidos C-terminales del decapptido inactivo angiotensina I para formar el octapptido biolgicamente activo angiotensina II. ANSI (American Nacional Standard Institute). Miembro de la organizacin internacional para la estandarizacin. Anticoagulante. Una sustancia que puede suprimir, retrasar o evitar la coagulacin de la sangre impidiendo la formacin de fibrina. Anticuerpos de las clulas de los islotes (ACI). Anticuerpos frecuentemente encontrados en la diabetes tipo I que sugieren un origen autoinmune. Antisptico. Una sustancia qumica la cual reduce el nmero de bacterias. Arterial. Relacionado con o derivado de las arterias, los vasos que conducen sangre del corazn a los tejidos del cuerpo. Bacteriuria. Presencia de bacterias en la orina. Bilirrubinuria. Presencia de bilirrubina en la orina. Blanco de muestra. Muestra ms diluyente; usada para corregir la absorbancia de la mezcla completa de reaccin para el color endgeno de la muestra.

Blanco de reactivo. La mezcla de reaccin menos la muestra: usado para restar el color del reactivo endgeno de la absorbancia de la reaccin completa (ms la muestra). Clculos. Concreciones anormales, usualmente compuestos de sales, presentes en el sistema urinario u otros tejidos; una piedra renal. Capilar. Relacionado con un vaso sanguneo muy delgado en los tejidos donde los nutrientes son depositados y los productos de desecho son removidos por la sangre. Catter. Un tubo de hule o plstico que conecta una cavidad del cuerpo con la superficie del cuerpo. Cateterizacin. Insercin de un instrumento delgado, flexible y tubular en la vejiga o urter para obtener o sacar orina. Clulas plidas. Neutrfilos de tincin tenue, hinchados y degenerados, que se encuentran en la orina diluida, los cuales tienen grnulos citoplasmticos que presentan un movimiento browniano caracterstico. Cetoacidosis diabtica. Una complicacin de la diabetes mellitus caracterizada por hiperglucemia, hiperosmolaridad, pH bajo, cetonuria y cetonemia, y letargo o coma. Cetona. Cualquier compuesto que contiene un grupo carbonilo -CO- y grupos de hidrocarburos unidos al carbono del grupo carbonilo. Cetonemia. Exceso en la sangre, de cetonas y de derivados de cetocidos. Cetonuria. Exceso en la orina, de cetonas y de cetocidos derivados. Presencia de cetonas en la orina, las cuales son un producto intermedio del metabolismo de las grasas, como ocurre en la diabetes mellitus. Cilindros. Estructura cilndrica formada como resultado de conglutinacin de clulas y precipitacin de protenas en el lumen de los tbulos convolucionados distales y ductos colectores del nefrn, los cuales son expulsados en el sedimento urinario. Cilindros hialinos. Cilindros transparentes formados de mucoprotena. Cilindruria. Presencia de cilindros en la orina. Cirrosis. Enfermedad progresiva del hgado caracterizada por el dao a las clulas del parnquima heptico. Citodiagnstico de orina. Anlisis especializado de orina que combina una valoracin fisicoqumica y un examen del sedimento urinario concentrado teido para Papanicolaou. CLIA o CLIA88. La Reforma para el Mejoramiento de los Laboratorios Clnicos (CLIA88 por sus siglas en ingls), reglamenta el funcionamiento de los laboratorios clnicos en los Estados Unidos. Esta ley se interpreta mediante regulaciones administrativas desarrolladas por organizaciones certificadoras. Cogulo. Agregacin de clulas sanguneas unidas por fibrina, una protena polimerizada. Coma no cetsico heperglucmico hiperosmolar (CNHH). Una complicacin de la diabetes mellitus caracterizada por hiperglucemia, heperosmolaridad, pH bajo, niveles normales de cetocidos y letargo o coma. Control de la calidad externo. Programa en el cual una institucin externa provee muestras desconocidas para su anlisis. (Vea: Survey o proficiency testing specimen. Encuesta o especmenes para ensayos de aptitud).Los resultados son

remitidos a los laboratorios participantes con una evaluacin de rendimiento: aceptable o no aceptable. En el CLIA88 este proceso se conoce con el nombre de ensayos de aptitud. Control de calidad interno. Programa analtico que verifica la aceptabilidad y estabilidad de los resultados del laboratorio, mediante la utilizacin de muestras controles. Correccin de Allen. Anlisis multicromtico de una reaccin para corregir la absorbancia de fondo. Adems de la Amax (absorbancia mxima) del cromforo, se monitorean dos longitudes de onda para restar la absorbancia de fondo promedio. Cristales amorfos. Precipitado de sales no cristalino, granular, sin importancia patolgica. Desviacin estndar usual (DEU). Es el promedio de los valores de las desviaciones estndar de 3 a 6 meses, basados en datos consecutivos de control de calidad. Es un estimado de la precisin, que un sistema analtico es capaz de alcanzar. Desviacin estndar (DE). Es un indicador descriptivo de la extensin de la dispersin de una poblacin de resultados de ensayos o de un conjunto de datos. Desviacin estndar mensual. Desviacin estndar calculada con los valores de control de la calidad diarios durante un mes. Diabetes inspida. Excrecin crnica de grandes cantidades de orina hipoosmtica causada por la incapacidad de concentrar la orina debido a la carencia de la produccin, secrecin o efecto de la hormona antidiurtica, HAD. Diabetes gestacional. Intolerancia a la glucosa que ocurre en algunos embarazos. Diferencia significativa. Aquella que se demuestra estadsticamente que est ms all del lmite de variabilidad esperado; clnicamente es una diferencia suficientemente grande para influir en una decisin mdica; operacionalmente es una diferencia estadsticamente significativa que el personal que realiza el ensayo y los supervisores consideran suficientemente grande para requerir una investigacin. Disacrido. Dos monosacridos ligados por una unin glucosdica. Diurtico. Un agente que promueve la produccin de orina. EDTA. cido etilendiaminotetraactico, es un agente quelante de calcio, de uso comn. Acta como anticoagulante y preservativo, uniendo calcio y otros cationes. Por sus propiedades quelantes, es capaz de inactivar varias enzimas necesarias para la formacin del cogulo y para la degradacin de protenas y lpidos en sangre. Eritrocituria. Presencia de eritrocitos en orina. Eritrocituria dismrfica. Presencia de fragmentos de eritrocitos en el sedimento de orina indicativos de hematuria renal (glomerular y tubular). Estndar primario. Substancias qumicas de la ms alta pureza conocida, que pueden ser usadas para producir calibradores para sistemas analticos. Estasis. Una disminucin en el flujo de sangre en una parte del cuerpo. Evaporacin. Transformacin de agua en vapor Extracelular. Fuera de las clulas.

Flebotoma. Puncin de una vena con una aguja con el propsito de obtener una muestra de sangre. Fluido intersticial (FI). Agua extravascular, extracelular. Fuera de control. Condicin en la cual un sistema de anlisis es rechazado para ser utilizado en la atencin de los pacientes, debido a los resultados de control de la calidad o a otros indicadores. Esta circunstancia debe ser declarada formalmente por el director del laboratorio o por el supervisor tcnico. Funguria. Presencia de hongos en la orina. Glucoltico. Relacionado con el proceso del metabolismo de la glucosa. Gluconeognesis. Produccin de glucosa a partir de cido pirvico. Glucosa. Un aldehdo polihidroxlico de seis carbonos; fuente principal de energa en los organismos. Su metabolismo produce adenosn trifosfato. Glucosilacin. Reaccin en la cual la glucosa se une covalentemente a la protena. Glucosuria. Cantidades excesivas de glucosa urinaria. Gravedad especfica. El peso de una sustancia comparada con un volumen igual de otra sustancia tomada como estndar. Grupo semejante. Cuando se utiliza en programas de control externo, indica el grupo de laboratorios que utilizan mtodos iguales o similares. HDL. Lipoprotenas de alta densidad. Estos complejos lipo-proteicos se llaman tambin alfa-lipoprotenas y son las ms densas de las lipoprotenas. Su acrnimo ms usado es HDL por "High-Density Lipoprotein." Hematuria. Presencia de sangre en la orina. Hemoconcentracin. El proceso de incremento en la concentracin de las clulas, protenas y ocasionalmente otros compuestos analizados en sangre a travs de la prdida de agua, ya sea in vitro o in vivo. Hemoglobinuria. Presencia de hemoglobina libre en la orina. Hemlisis. Ruptura de glbulos rojos, liberando al suero o plasma los contenidos en ellos. Heparina. Un anticoagulante el cual inhibe directamente la formacin de fibrina. Hidrmetro. Instrumento empleado en medir la gravedad especfica de un fluido. Hiperaldosteronismo. Trastorno causado por la secrecin excesiva de aldosterona y caracterizada por alcalosis hipopotasmica, debilidad muscular, hipertensin, poliuria, polidipsia y concentraciones normales o elevadas de sodio plasmtico. Hipercloremia. Concentracin anormalmente alta de cloruro plasmtico. Hipernatremia. Concentracin anormalmente alta de sodio plasmtico. Hiperosmtica. Que denota una presin osmtica efectiva mayor que la del plasma. Hiperpotasemia. Concentracin anormalmente alta de potasio plasmtico. Hipertnica. Que denota una presin osmtica terica mayor que la del plasma. Hiponatremia. Una concentracin anormalmente baja de sodio plasmtico; por dilucin: hiponatremia causada por un exceso de agua (con respecto al sodio) en el compartimento extracelular. Hipopotasemia. Concentracin anormalmente baja de cloruro plasmtico. Hiposmtico. Que denota una presin osmtica efectiva menor que la del plasma.

Hipotnico. Que denota una presin osmtica terica menor que la del plasma. Hormona antidiurtica (/HAD). Hormona peptdica de la neurohipfisis que acta en el tbulo colector del rin para permitir un incremento de la reabsorcin de agua y por lo tanto una disminucin de la excrecin de agua libre por el rin. Tambin se conoce como vasopresina. Ictericia. Referente al color anaranjado impartido a la muestra debido a la presencia de bilirrubina. IDL. Lipoprotenas de densidad intermedia. Este complejo lipoproteico tiene una densidad entre VLDL y LDL, es de una vida media relativamente corta y en la sangre de una persona sana estn en muy bajas concentraciones. En personas con disbetalipoproteinemia su concentracin en sangre es elevada. Su acrnimo ms usado es IDL por "Intermediate-Density Lipoprotein." Infradiano. Cambios en la concentracin de compuestos analizados que ocurren con menos frecuencia que una vez al da. Interferente. Cualquier fenmeno qumico o fsico que pueda interferir o detener una reaccin o proceso. Intraindividual. Dentro de una sola persona. Intravenoso. Dentro de una vena; generalmente se refiere a los fluidos intravenosos, en donde el agua contiene medicamentos, glucosa, o electrlitos que son administrados a un paciente a travs de un catter insertado en una vena. In Vitro. Literalmente, en vidrio; ocurre en una situacin artificial, como en un tubo de ensaye. In vivo. Ocurre en un organismo vivo. LDL. Lipoprotenas de baja densidad. Este complejo lipoproteico es tambin llamado beta-lipoprotena y es el producto final del catabolismo de la VLDL. Es el mayor transportador del colesterol. Su acrnimo ms usado es LDL por "LowDensity Lipoprotein." Levadura. Microorganismo unicelular nucleado que se reproduce por gemacin. Lmites de accin. Rangos de valores establecidos para las mezclas de control de calidad. Si los resultados estn por fuera de estos lmites puede existir un deterioro en la calidad de los sistemas analticos, que debe ser investigado por el tcnico. Lmites de control. Lmites numricos, (expresados en las unidades de los ensayos), dentro de los cuales deben hallarse los valores de una muestra de control, para que el ensayo pueda ser considerado vlido o dentro de control. Lipemia. Presencia de partculas de lpidos (generalmente lipoprotenas de muy baja densidad) en la muestra, que le dan a la muestra un aspecto turbio. Lipoprotenas. Complejo lpido (apoprotena)-protena correspondiente a unas familias de macromolculas con conocidas propiedades fsicas qumicas y fisiolgicas conocidas. Materiales de referencia certificados (MRC). Un material de referencia, que tiene uno o ms de sus valores garantizados por un procedimiento vlido. Est acompaado o respaldado por un documento expedido por un organismo certificador. El material tiene una alta pureza del componente especificado. Mtodo. El principio metodolgico usado en la elaboracin de un ensayo: el fundamento qumico o fsico del mismo.

Mtodo de referencia. Un mtodo investigado profundamente, en el cual se da una descripcin precisa y clara de los procedimientos y condiciones necesarias para la determinacin exacta de uno o ms valores. La exactitud y precisin documentadas para al mtodo se corresponden con la utilizacin del mtodo para evaluar la exactitud de otros mtodos, para medir valores de la misma propiedad, o para asignar valores a materiales de referencia. Mtodo definitivo. El mtodo analtico que ha sido sometido a la investigacin y evaluacin de todas las fuentes de inexactitud incluyendo la inespecificidad. La magnitud de la imprecisin final del mtodo y el sesgo, expresados en la declaracin de incertidumbre, son compatibles con el propsito e implementacin final del mismo. El valor final de un mtodo definitivo es tomado como valor verdadero. Mioglobinuria. Presencia de hemoglobina en la orina, esta es una protena que se combina con el oxgeno de las clulas musculares. Monosacrido. Un aldehdo o acetona polihidroxlico tal como la glucosa,fructosa o manosa. Nefritis. Inflamacin del rin. Neuropata. Una complicacin de la diabetes mellitus atribuida al dao de los glomrulos y capilares asociados con el glomrulo. Oliguria. Excrecin anormalmente baja de orina, o sea, menor de 400 mL/ da en un adulto. Osmol. El nmero total de moles de un soluto en solucin despus de su disociacin. Osmolaridad. Concentracin osmtica expresada en osmoles o miliosmoles de soluto por litro de solvente. Osmosis. Movimiento de agua a travs de una membrana semipermeable de una solucin con baja concentracin de partculas de soluto a una solucin con alta concentracin de partculas de soluto. Piuria. Cantidad anormal de leucocitos en orina. Plasma. La parte lquida de la sangre en el torrente sanguneo; es una muestra obtenida de sangre mediante la colecta con un anticoagulante, con una centrifugacin posterior de la muestra. Polidipsia. Consumo excesivo de fluido secundario a una sed extrema; polidipsia psicognica secundaria a un trastorno psiquitrico, sin una lesin orgnica demostrable.Un sntoma de la diabetes mellitus. Polifagia. Hambre constante. Un sntoma de la diabetes mellitus. Polisacrido. Un carbohidrato compuesto de ms de dos monosacridos unidos por puentes glucosdicos. Poliuria. Prdida urinaria excesiva. Un sntoma de la diabetes mellitus. Porfirinas. Un grupo de derivados del pirrol libres de hierro o magnesio que se encuentran universalmente en todas las clulas. Estos compuestos constituyen la base de los pigmentos respiratorios en animales y plantas. Postprandial. Despus de comer. Presin osmtica coloidal. La presin osmtica efectiva del plasma y el fluido intersticial a travs del endotelio capilar, mayormente resultante de la presencia de protena.

Procedimiento. Grupo de instrucciones para utilizar un mtodo, que genera un resultado analtico. Proteinuria. Incremento en la concentracin de protena en la orina. Protelisis. El proceso de degradacin de las protenas, el cual puede ocurrir por reacciones qumicas o procesos enzimticos. Pseudohiperpotasemia. Concentracin plasmtica de potasio anormalmente alta en una muestra obtenida de un paciente, en ausencia de una verdadera elevacin de la concentracin plasmtica de potasio en ese paciente. Quelacin. El proceso de unin de una molcula orgnica (quelante) con mltiples iones metlicos. Quilomicrones. Grandes complejos lipoproteicos formados en el intestino y que tienen una importante funcin en el transporte de grasas (mayormente triglicridos dietarios). Rechazo falso. Rechazo de una serie porque los resultados de control de la calidad indican un problema analtico que no est realmente presente. Rechazo verdadero. Rechazo de una corrida analtica porque los especmenes de control indican que existe un problema real. Recuento de Addis. Anlisis cuantitativo del sedimento urinario, en el cual se cuantifica el nmero de eritrocitos, leucocitos y cilindros en un espcimen de orina recolectado en un determinado tiempo. Revisin delta. Comparacin de la concentracin de un compuesto analizado en la muestra de un individuo, con la misma concentracin existente en la muestra anterior, de la misma persona. Semipermeable. Permeable a ciertas molculas pero no a otras; generalmente permeable al agua. Separador de suero. Un componente mecnico que separa fsicamente el suero y las clulas (los separadores de plasma separan plasma de las clulas), previniendo los cambios en la concentracin de los compuestos analizados sricos debido al metabolismo celular. Sndrome de secrecin inapropiada de la hormona antidiurtica. Conjunto de hallazgos, incluyendo la hipotonicidad del plasma, hiponatremia e hipertonicidad de la orina con excrecin continuada de sodio, el cual es producido por una excesiva secrecin de HAD y que mejora con la restriccin de agua. Suero. La parte lquida de la sangre que queda despus de que se ha formado un cogulo. Tendencia. Cambio gradual en los resultados de las muestras de control de la calidad, que sugiere un problema con el sistema analtico o con el material de control. Torniquete. Un dispositivo mecnico (como una banda ancha de hule) usada en la superficie de una extremidad la cual comprime las venas, hacindolas aparecer ms grandes mediante la prevencin del retorno de sangre al corazn y pulmones. Turbidez. Dispersin de luz en un lquido que contiene partculas suspendidas. Ultradiano. Cambios en la concentracin de los compuestos analizados los cuales ocurren en un perodo de tiempo mucho menor que un da. Urobilingeno. Grupo de compuestos incoloros formados por la reduccin de la bilirrubina conjugada por la accin de bacterias intestinales. Cerca del 1% del total del urobilingeno producido pasa a la orina.

Valor asignado. Es el valor medio, establecido para un compuesto analizado en una mezcla de control de calidad. Variabilidad inherente. Los valores de las mediciones repetidas de un mismo material varan alrededor de una media. La desviacin estndar mide la magnitud de esta variabilidad. Variacin cclica. Cambios en concentracin de compuestos analizados los cuales ocurren repetitivamente, en una forma predecible, durante un perodo dado de tiempo. Variacin circadiana. Cambios en la concentracin de compuestos analizados la cual ocurre durante el transcurso de un da. Variacin preanaltica. Factores que alteran los resultados de una prueba de laboratorio y que ocurren antes de realizar la prueba. Virus. Agente que se autorreplica, consta de una estructura fundamental de cidos nucleicos encapsulados por una cubierta de protenas. Este microorganismo puede multiplicarse solamente dentro de las clulas de su hospedero. VLDL. Lipoprotenas de muy baja densidad tambin llamadas pre-beta lipoprotena.(1)

5. BIBLIOGRAFA:

1. TERRS Speziale Arturo M; Clnica y Laboratorio: Ciencia y Tecnologa; 2 ed; ed. Graphimedic S.A. de C.V; Mxico 2002. 2. PRESIDENCIA DE LA REPBLICA; CGEA, Gua tcnica para la elaboracin de manuales de procedimientos; Coleccin guas tcnicas, serie organizacin y mtodos nm. 9. 3. Mxico, Secretara de Salud, Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos, Diario Oficial de la federacin, ao 2000. Internet: http://www.salud.gob.mx/ 4. El gerenciamiento del laboratorio de anlisis clnicos con la visin de la calidad total. Internet: http://www.sarda.org.ar/Revista%20sard%c3%A1/2002/28-33.pdf 5. ANDERSON, Shauna C, Susan Cockayne; Qumica Clnica; 1 ed; trad. Ma. Teresa Aguilar; ed. Interamericana-McGraw-Hill; Mxico, 1995. 6. KAPLAN, A. Lawrence, Amadeo J. Pesce; Qumica Clnica Teora, anlisis y correlacin; 3 ed; trad. Tania Carren Valencia; ed. Javier Ortega Cesea; Mxico 1996.

7. GONZLEZ Buitrago J.M., Arilla Ferreriro E., Rodrguez-Segada M., Sanchez Pozo A; Bioqumica Clnica; 1 ed; ed. McGraw-Hill; Mxico, 1998. 8. Examen de sangre. Internet:http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/100 26.htm 9. MORN Villatoro Luis; Obtencin de muestras sanguneas de Calidad analtica; 1 ed; ed. Mdica Panamericana S.A. de C.V; Mxico D.F. 2001. 10. BECTON, DICKINSON DIAGNOSTICS; BD Vacutainer Oder of Draw for Multiple Tube Collections. Internet: www.bd.com/vacutainer. 11. A.A. Madrid, C.S.C.;Laboratorio Clnico, Manual de Flebotoma. Internet: www.ilustrados.com/documentos/manualflebotomia.doc 12. Norma-Oficial Mexicana Nom-087-ECOL-SSA1-2002 Proteccin AmbientalSalud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-Infecciosos-Clasificacin y especificaciones de manejo. Internet:http://www.salud.gob.m/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html 13. WHITEHEAD T.P.; Manual, Principios de Control de Calidad (Lab/76.1); Organizacin Mundial de la Salud; Qumica Clnica 1984. 14. Reactivos para diagnostico clnico, Bioqumica Clnica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/ 15. TRESELER Kathleen Morrison; Laboratorio clnico y pruebas de diagnstico; 3 ed; trad. Dr. Jorge Mrigo; ed. El manual moderno; Mxico, D.F, 1998. 16. AYRES H. Gilbert; Anlisis Qumico Cuantitativo;2 ed;ed. Harla S.A de C.V.; Mxico 1970. 17. FLASCHKA H.A.; Qumica Analtica Cuantitativa; 9.ed; trad. Antonio Eroles Gmez; ed. Continental S.A. de C.V; Mxico 1984. 18. GRAW Allan, Cowan Robert A; Bioqumica Clnica; 2a. ed; ed. A.Hamabata;Mxico D.F. 2003. 19. BAYER; Manual de usuario Rapidchem 744/754. 20. GRAFF Sister Laurine; Anlisis de Orina, Atlas a color; 1 ed; trad. Pablo Rubn Koval; ed. Mdica Panamericana S.A; Mxico 1983. 21. ALTHOF Klinder Heintz; Panamericana; Mxico 2003. Sedimento Urinario; 6.ed; ed. Mdica