PI Lipa HBV Genotyping

INNO-LiPA HBV Genotyping
Manufactured by: INNOGENETICS N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belgium +32-9 329 13 29 BTW BE 0427.550.660 RPR Gent Distributed by: INNOGENETICS GmbH Lembecker Strae 19 46359 Heiden (Westfalen) Germany +49-2867 99 07 0 INNOGENETICS S.r.l Via del Mare 36 00040 Pomezia (Roma) Italy +39-06 911 80 375 INNOGENETICS N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belgium +32-9 329 13 29 INNOGENETICS s.a.r.l. Les Conqurants, Bt. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques 91940 Les Ulis France +33-1 69 07 48 34 INNOGENETICS Diagnstica Iberia, S.L.U. Calle Tarragona 161, Planta 14 08014 Barcelona Spain +34-93 270 53 00
0459
2007 Innogenetics Group
25976 v6 2007-04-17
INNOGENETICS* TABLE OF CONTENTS
Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 English Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 Test principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9 Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 Description, preparation for use and recommended storage conditions . . .10 Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 Specifically for amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11 Specifically for LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 Specimen collection and handling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13 Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13 Test procedure for amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 Amplification protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14 Results for amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 Visualization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 Quality control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 Test procedure for LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 Denaturing the samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16 Hybridizing the samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 Washing the strips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17 Developing the color . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 Automated test procedure: Auto-LiPA and Auto-LiPA 48 . . . . . . . . . . . . . . . . . .18 Results for LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 Reading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 Quality control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 Interpretation of the results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19 Limitations of the procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Sensitivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Accuracy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 Precision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Franais But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 Ractifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 Description, prparation et conditions de conservation . . . . . . . . . . . . . . . .23 Matriel ncessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Matriel spcifique pour l'amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Matriel spcifique pour LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Scurit et environnement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Recueil et manipulation des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27 Remarques et prcautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
*INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.
INNO-LiPA HBV Genotyping Procdure d'amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Protocole d'amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28 Rsultats de l'amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Visualisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Contrle de qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Procdure de test pour LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Dnaturation des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 Hybridation des chantillons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Lavage des bandelettes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31 Rvlation colore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Procdure automatise: Auto-LiPA et Auto-LiPA 48 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 Rsultats pour LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Lecture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Contrle de qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Interprtation des rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 Limites des procdures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 Sensibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35 Exactitude . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35 Reproductibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Deutsch Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37 Beschreibung, Vorbereitung und empfohlene Lagerung . . . . . . . . . . . . . . .37 Zustzliche bentigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind . . .39 Speziell fr die Amplifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39 Speziell fr LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39 Sicherheits- und Umwelthinweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 Proben (Sammeln und Handhabung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Hinweise und Vorsichtsmanahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41 Testverfahren fr die Amplifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 Amplifikationsprotokoll . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42 Ergebnisse der Amplifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 Visualisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 Qualittskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44 Testverfahren fr LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Denaturierung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Hybridisierung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45 Waschen der Teststreifen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 Entwicklung der Farbe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 Automatisches Testverfahren: Auto-LiPA und Auto-LiPA 48 . . . . . . . . . . . . . . . .47 Ergebnisse fr LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 Ablesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 Qualittskontrolle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 Interpretation der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 Grenzen der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
INNOGENETICS
Leistungsfhigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Sensitivitt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Genauigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49 Przision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 Italiano Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51 Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52 Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53 Materiale specifico per l'amplificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53 Materiale specifico per LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54 Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54 Raccolta e manipolazione campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55 Procedura di amplificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Protocollo di amplificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56 Risultati dell'amplificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58 Visualizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58 Controllo qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Procedura LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Denaturazione dei campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Ibridazione dei campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59 Lavaggio delle strip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60 Sviluppo del colore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60 Procedura di test automatizzata: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 . . . . . . . . . . . . . . .61 Risultati LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61 Lettura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61 Controllo qualit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61 Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62 Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 Sensibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 Accuratezza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63 Precisione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64 Espaol Uso al que est destinado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Principio del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65 Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Descripcin, preparacin para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66 Materiales necesarios pero no suministrados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Especficamente para la amplificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Especficamente para LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68 Recoleccin y manipulacin de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
INNO-LiPA HBV Genotyping Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70 Procedimiento de ensayo para la amplificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Protocolo de amplificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71 Resultados para la amplificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 Visualizacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 Procedimiento de ensayo para LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 Desnaturalizar las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73 Hibridar las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74 Lavar las tiras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74 Revelado del color . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75 Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LiPA y Auto-LiPA 48 . . . . . . . . .76 Resultados para LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Lectura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Interpretacin de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76 Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77 Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 Exactitud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78 Precisin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
Portugus Utilizao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79 Princpio do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79 Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 Descrio, preparao para utilizao e condies de conservao recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80 Material necessrio no fornecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 Especificamente para amplificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 Especificamente para LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82 Segurana e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83 Recolha e manipulao de amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Observaes e precaues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .84 Procedimento do teste para amplificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 Protocolo de amplificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85 Resultados da amplificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87 Visualizao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87 Controlo de qualidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .87 Procedimento do teste para o LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88 Desnaturao das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88 Hibridizao das amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88 Lavagem das tiras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88 Revelao da cor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .89 Procedimento de teste automatizado: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 . . . . . . . . . . .90 Resultados do LiPA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 Leitura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 Controlo de qualidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90
INNOGENETICS
Interpretao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .90 Limites dos procedimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Desempenho do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 Preciso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .92 Preciso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93 Symbols used Manufacturer Fabricant Hersteller Fabbricante Fabricante In Vitro Diagnostic Medical Device Dispositif mdical de diagnostic in vitro In-Vitro-Diagnostikum Dispositivo medico-diagnostico in vitro Producto sanitario para diagnstico in vitro Dispositivo mdico para diagnstico in vitro Batch code Code du lot Chargenbezeichnung Codice del lotto Cdigo de lote Cdigo do lote Catalogue number Rfrence du catalogue Bestellnummer Numero di catalogo Nmero de catlogo Referncia de catlogo Use By Utiliser jusque Verwendbar bis Utilizzare entro Fecha de caducidad Prazo de validade Consult Instructions for Use Consulter les instructions dutilisation Gebrauchsanweisung beachten Consultare le istruzioni per l'uso Consulte las instrucciones de uso Consulte as instrues de utilizao
7 Temperature limitation Limites de temprature Temperaturbegrenzung Limiti di temperatura Lmite de temperatura Limites de temperatura
Contains sufficient for <n> tests Contenu suffisant pour n tests Inhalt ausreichend fr <n> Prfungen Contenuto sufficiente per n saggi Contenido suficiente para <n> ensayos Contedo suficiente para n ensaios Amplification (AMP) reagents/Ractifs d'amplification (AMP):/Amplifizierungsreagenzien (AMP):/Reagenti di amplificazione (AMP):/Reactivos de amplificacin (AMP):/Reagentes de amplificao (AMP): Outer Primer Mix Mlange amorce externe uerer Primer Mix Miscela primer esterno Mezcla de cebadores externos Mistura de iniciadores exteriores Nested Primer Mix Mlange amorce interne Nested Primer Mix Miscela primer interno Mezcla de cebadores internos Mistura de iniciadores aninhados LiPA reagents:/Ractifs LiPA:/LiPA-Reagenzien:/Reagenti LiPA:/ Reactivos LiPA:/Reagentes LiPA: Strips Bandelettes Teststreifen Strip Tiras Denaturation Solution Solution de Dnaturation Denaturierungslsung Soluzione di denaturazione Solucin de desnaturalizacin Soluo de desnaturao
INNOGENETICS Hybridization Solution Solution d'hybridation Hybridisierungslsung Soluzione di ibridazione Solucin de hibridacin Soluo de hibridizao Stringent Wash Solution Solution de Lavage Stringent Stringent-Waschlsung Soluzione lavaggio stringente Solucin de lavado astringente Soluo de lavagem rigorosa Rinse Solution 5x Solution de Rinage 5x 5x konzentrierte Spllsung Soluzione di risciacquo 5x Solucin de lavado 5x Soluo de lavagem 5x Conjugate Diluent Diluant Conjugu Konjugatverdnner Diluente del coniugato Diluyente de conjugado Diluente de conjugado Conjugate 100x Conjugu 100x 100x konzentriertes Konjugat Coniugato 100x Conjugado 100x Substrate Buffer Tampon Substrat Substratpuffer Tampone substrato Tampn sustrato Tampo substrato Substrate BCIP/NBT 100x Substrat BCIP/NBT 100x 100x konzentriertes BCIP/NBT-Substrat Substrato BCIP/NBT 100x Sustrato BCIP/NBT 100x
9 English Intended use
The INNO-LiPA HBV Genotyping assay is a line probe assay designed to identify hepatitis B virus (HBV) genotypes A to H by detection of type-specific sequences in the HBV polymerase gene domain B to C. HBV Genotype Assay (LiPA) is not intended to be used as a screening test for HBV or as a diagnostic test to confirm the presence of HBV. Test principle Hepatitis B virus (HBV) is a partially double stranded DNA virus that replicates through an RNA intermediate. The first step is the isolation of the viral DNA from the sample. The purified DNA is then amplified over two rounds of PCR using biotinylated PCR primers. The outer primers (first round of PCR) used in this test will amplify part (domain B and C) of the HBV polymerase gene. By heating, the two strands of the DNA helix are separated (denaturation) to expose the target to the outer primers. These oligonucleotide primers are complementary to very conserved regions flanking the target region. Therefor, upon cooling to a specified temperature, the primers will bind to their specific sequence (annealing at 45C). At an elevated temperature, in the presence of dNTP's, the thermostable DNA polymerase will extend the annealed primers along the target template (extension). An exact copy of the template is produced after one cycle of denaturation, annealing, and extension. The process is repeated for 40 cycles, thus yielding a multi-fold amplified target sequence of 409 bp. Because the amount of amplification product is generally not sufficient, a nested (second round) PCR is needed. The principle of this amplification is identical to the first with the exception that the DNA is replaced by amplified product of the first round PCR, and that the outer primers are replaced by biotinylated nested primers. The process of denaturation, annealing and extension is repeated for 35 cycli, yielding an amplified sequence of 342 bp. We advise to check on gel if outer or nested amplified product should be used. After amplification, the biotinylated DNA material generated from the HBsAg open reading frame is hybridized with specific oligonucleotide probes immobilized as parallel lines on membrane-based strips. After hybridization, unhybridized DNA is washed from the strip, streptavidin labeled with alkaline phosphatase is added and bound to any biotinylated hybrid previously formed. Incubation with BCIP/NBT chromogen results in a purple/brown precipitate. The INNO-LiPA HBV Genotyping strip contains one red marker line, 2 control lines, and 14 parallel probe lines. The conjugate control line is a control for the color development reaction and the amplification control line contains universal HBV probes to check the presence of amplified HBV genomic material.
INNOGENETICS Reagents Description, preparation for use and recommended storage conditions
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REMARK: AMP reagents and LiPA reagents should be stored immediately after arrival: AMP reagents in the pre-amplification area and LiPA reagents in the post-amplification area. If stored at 2 - 8C, opened or unopened, the reagents are stable until the expiry date. Do not use the reagents beyond the expiry date. In order to avoid contamination, it is recommended to aliquot amplification reagents after first use. The reagents should be stored isolated from any source of contaminating DNA, especially amplified products. Disposable tubes and pipette tips (preferably cotton-plugged) should be used. All reagents should be brought to room temperature (20 - 25C) approximately 30 minutes before use and should be returned to the refrigerator immediately after use. Briefly vortex and spin down all reagents before opening the vials. Close the vials immediately after use. Alterations in physical appearance of the kit reagents may indicate instability or deterioration. To minimize the possibility that strips curl before use, it is recommended to store the tube horizontally.
Reagents supplied:
Component AMP reagents: Outer Primer Mix Nested Primer Mix LiPA reagents: Strips 1 x 20 58321 1 plastic tube containing INNO-LiPA HBV Genotyping strips marked with a red marker line. 56718 Alkaline solution containing EDTA. CAUTION: The vial containing the Denaturation Solution should be closed immediately after use; prolonged exposure of this solution to air leads to rapid deterioration. 1 x 0.08 ml 58322 Containing biotinylated primers and 0.05% NaN3 as preservative. 1 x 0.08 ml 58324 Containing biotinylated primers and 0.05% NaN3 as preservative. Quantity Ref. Description
Denaturation Solution 1 x 1 ml
Hybridization Solution 1 x 80 ml 57420 Containing SSC-buffer with detergents and preservatives. The Hybridization Solution should be pre-warmed to a temperature of at least 37C and must not exceed 49C (all crystals should be dissolved before use). Stringent Wash Solution1 x 200 ml 57421 Containing SSC-buffer with detergents and preservatives. The Stringent Wash Solution should be pre-warmed to a temperature of at least 37C and must not exceed 49C (all crystals should be dissolved before use).
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Conjugate 100x

1 x 0.8 ml 56952 Streptavidin labeled with alkaline phosphatase in Tris-buffer containing protein stabilizers and 0.01% MIT/0.098% CAA as preservative, to be diluted 1/100 in Conjugate Diluent before use. Prepare 2 ml conjugate working solution for each test trough + 2 ml in excess. For Auto-LiPA, make 10 ml in excess. The conjugate working solution is stable for 24 hours at room temperature (20 - 25C) when stored in the dark. 1 x 80 ml 56951 Phosphate-buffer containing NaCl, Triton, protein stabilizers and 0.01% MIT/0.1% CAA as preservatives.
Conjugate Diluent
Substrate BCIP/NBT 1 x 0.8 ml 56954 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate and 4-nitro-blue 100x tetrazolium in dimethylformamide, to be diluted 1/100 in Substrate Buffer before use. Prepare 2 ml substrate working solution for each test trough + 2 ml in excess. For Auto-LiPA, make 10 ml in excess. The substrate working solution is stable for 24 hours at room temperature (20 - 25C) when stored in the dark. Substrate Buffer Rinse Solution 5x 1 x 180 ml 56953 Tris-buffer containing NaCl, MgCl2 and 0.01% MIT/ 0.1% CAA as preservatives. 1 x 80 ml 56721 Phosphate-buffer containing NaCl, Triton and 0.01% MIT/ 0.1% CAA as preservatives, to be diluted 1/5 (1 part + 4 parts) in distilled or deionized water before use. Prepare 8 ml rinse working solution for each test trough + 10 ml in excess. For Auto-LiPA, prepare 12 ml Rinse working solution per test trough + 20 ml in excess. Rinse working solution is stable for 2 weeks at 2 - 8C. Containing 8 troughs each. For identification of positive probes. For interpretation of results. For storage of developed strips.
Incubation trays Reading card Interpretation chart
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Data reporting sheet 2
Materials required but not provided Disposable gloves. Disposable sterile pipette tips (preferably cotton-plugged). Sterile microtubes. Microtube racks. Microtube centrifuge. Pipettes adjustable to deliver 1 - 20 l, 20 - 200 l and 200 - 1000 l. Autoclaved distilled water.
Specifically for amplification For the amplification, Taq DNA polymerase and Taq amplification buffer provided by Stratagene are recommended for use. DNA thermal cycler and equipment. dNTP's (25 mM). 10x Taq buffer (containing 100 mM Tris-HCl pH 8.8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0.01% (w/v) gelatin, and stabilizers, Stratagene). Taq DNA polymerase (Taq DNA Polymerase, Stratagene).
INNOGENETICS Specifically for LiPA -
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Aspiration apparatus. Calibrated thermometer. Tweezers. Graduated cylinders (10, 25, 50 and 100 ml). Timer (2 hours 1 minute). Vortex mixer or equivalent. Water bath with shaking platform (80 rpm; inclined lid; temperature adjustable to minimum 49C 0.5C). Orbital shaker (160 rpm) or rocker shaker (50 rpm).
Optional materials: Dispensing multipipette (Multipipette, Eppendorf or equivalent). Equipment for automation of strip processing steps. For details, contact your distributor. Safety and environment Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) and product labelling for information on potentially hazardous components. The most recent MSDS version is available on the website www.innogenetics.com.
R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Toxic! Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. May cause harm to the unborn child. Wear suitable protective clothing and gloves. In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label if possible). Avoid exposure - obtain special instructions for use. Restricted to professional users. Contains Dimethylformamide, 5-Bromo-4-chloro3-indolyl phosphate p-Toluidine salt: Substrate BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37 Irritant! May cause sensitization by skin contact. Avoid contact with skin. Wear suitable gloves. Contains 2-Chloroacetamide: Stringent Wash Solution, Hybridization Solution, Rinse Solution, Substrate Buffer and Conjugate Diluent.
R34, S28-36/37/39-45 Corrosive! (C) Causes burns. After contact with skin, wash immediately with plenty of soap and water. Wear suitable protective clothing, gloves, and eye/face protection. In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible). Contains sodium hydroxide: Denaturation Solution.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Specimens should always be handled as potentially infectious. Therefore, all blood components and biological materials should be considered as being potentially infectious and should be handled as such. Only adequately trained personnel should be permitted to perform the test procedure. All blood components and biological materials should be disposed of in accordance with established safety procedures. Autoclave for at least 15 minutes at 121C. Incinerate disposable material. Mix liquid waste with sodium hypochlorite so that the final concentration is 1% sodium hypochlorite. Allow to stand overnight before disposal. CAUTION: Neutralize liquid waste that contains acid before adding sodium hypochlorite. Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety spectacles when manipulating dangerous or infectious agents. Waste should be handled according to the institution's waste disposal guidelines. All federal, state, and local environmental regulations should also be observed.
Specimen collection and handling Use extracted DNA from HBV positive samples freshly isolated or frozen at or below 20C, preferably never thawed). Amplified material of the HBV-pol gene domain B to C can be generated. Use then 10 l of HBV amplified product for the LiPA process. Remarks and precautions For professional use only. All pipette tips and tubes for the amplification process should be autoclaved. Pipette tips with cotton plugs are recommended. Use only disposable lab materials. Use a new sterile pipette tip for each aliquoted specimen. Do not mix reagents between kits, unless the components have identical lot numbers. To prevent PCR contamination, maximize the physical separation of the pre- and post-amplification steps. Do not return samples, equipment, or reagents to the area where you performed the previous step. If you need to return to a previous work area, first perform the appropriate decontamination steps. Use tweezers to handle strips. Do not touch strips with your hands as the oils from your hands could interfere with hybridization and color development. Use only pencil to write on the strips. The assay reagents may remove ink from the strips. For accurate results, use a water bath for the hybridization and wash steps and measure that the temperature is 49C 0.5C. Do not use a hot air shaker. Use a calibrated thermometer, as strict temperature control is necessary. Always close the lid of the water bath to maintain the temperature. If the temperature is too low, the assay may yield false positive results; if the temperature is too high you may observe very weak signals or false negative results. Use a shaking water bath with inclined lid for optimal temperature control. The motion generated by the shaking water bath during hybridization and stringent wash and by the orbital or rocker shaker during color development is critical.
INNOGENETICS
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Adjust the speed of these instruments carefully to maximize the movement of the reagents over the strip without splashing solutions between troughs in the tray. Avoid splashing water from the water bath into the tray. Adjust the water level in the water bath so that it is between one-third and one-half the height of the tray. Prevent the tray from sliding by immobilizing it using weights. Do not allow the strips to dry between steps. Keep each strip in the same trough throughout the procedure. Aspirate liquid from a trough using a pipette that may be attached to a vacuum aspirator.
Test procedure for amplification DNA extraction protocol: High Pure PCR Template preparation Kit (Roche Diagnostics). See protocol of mentioned kit. Other DNA extraction procedures can be used. Amplification protocol The following protocols (Outer and Nester amplification) were designed for optimal amplification, using Taq polymerase (5U/l, Stratagene), 10x Taq buffer (containing 100mM Tris-HCl pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0.01% gelatin, stabilizers, Stratagene), MicroAmp PCR tubes (0.2 ml thin-walled tubes) and PE-2400 or PE-9600 (Perkin Elmer Cetus) thermal cyclers. This protocol can be used with most commercial types of thermal cyclers, but may require some modifications provided by the manufacturer of the cycler. Take the necessary precautions to avoid non-specific amplification, which may impair the results: thaw the components listed below and place them on ice perform all pipetting steps on ice and without delay. Outer amplification 1. 2. 3. Determine the number of vials to be prepared (N) as: N = Number of samples + 1 Negative Control + 1 Positive Control + 1. Using cotton-plugged pipette tips, prepare Master Mix in an autoclaved nucleasefree microcentrifuge tube: Prepare Master Mix 1 containing: (N x 32.4 l) autoclaved distilled water + (N x 5.0 l) 10x Taq Amplification buffer (Stratagene) + (N x 0.4 l) dNTP mix (25 mM) + (N x 2.0 l) Outer Primer Mix + (N x 0.2 l) Taq DNA Polymerase 5U/l (Stratagene) Vortex briefly and aliquot 40 l of this Master Mix 1 into (N-1) autoclaved amplification tubes.
15 4. 5.
INNO-LiPA HBV Genotyping Pipette 10 l of purified DNA, or 10 l of distilled water (no DNA to the Negative Control). REMARK: Mix briefly and spin the mix to collect the liquid at the bottom of the tube. Place the samples into the calibrated thermal block (see instructions provided by the manufacturer of the thermal cycler). Start the amplification program designed for the INNO-LiPA HBV Genotyping outer amplification. INNO-LiPA HBV Genotyping outer amplification profile for a PE-2400 or PE-9600 thermal cycler:
Step 1 2 3 4 5 6 Denature Denature Anneal primers Extend primers Elongate Cool to 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Time 4 min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min Repeat cycle steps 2 - 4, 40 times
6.
After this process, use the samples immediately for the nested amplification or store at -15/-25C. NOTE: Do not store the amplified DNA products together with amplification reagents or extracted DNA.
Nested amplification 1. Determine the number of vials to be prepared (N) as: N = Number of outer amplified samples + Outer amplified Negative Control + 1 Negative Control + 1 Positive Control + 1. Using a cotton-plugged pipette tip, prepare the Master Mix 2 in an autoclaved tube: (N x 40.4l) autoclaved distilled water + (N x 0.4 l) dNTP mix (25 mM) + (N x 5.0 l) 10x Taq Amplification buffer (Stratagene) + (N x 2.0 l) Nested Primer Mix + (N x 0.2 l) Taq DNA polymerase 5 U/l (Stratagene) Vortex briefly and aliquot 48 l of this Master Mix into (N-1) autoclaved amplification tubes. Pipette 2 l of the outer amplified products, or 2 l distilled water (no DNA to the Negative Control) REMARK: Mix briefly and spin the mix to collect the liquid at the bottom of the tube. Place the samples into the calibrated thermal block (see instructions provided by the manufacturer of the thermal cycler). Start the amplification program designed for the INNO-LiPA HBV Genotyping nested amplification.
2. 3.
INNOGENETICS INNO-LiPA HBV Genotyping nested amplification profile for a PE-2400 or PE-9600 thermal cycler:
Step 1 2 3 4 6 7 Denature Denature Anneal primers Extend primers Elongate Cool to 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Time 4 min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min Repeat cycle steps 2 - 4, 35 times
16
4.
After this process, analyse 5 l of both outer and nested amplified product on 2% agarose gel or store at -15/-25C. It is advised based upon in-house observations, that if the outer amplified product gives a band of 409 bp, an interpretable result should be given by the LiPA assay. If no band is visible for the outer amplified product, use the nested amplified product with the INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTE: Do not store the amplified DNA products together with amplification reagents or extracted DNA.
Results for amplification Visualization The presence of the amplified product can be checked on a 2% agarose gel. Load 5 l of amplified product per slot. The nested amplicon should appear as a band with a length of 342 bp. The outer amplicon should appear as a band with a length of 409 bp.
Quality control Include at least one blank for extraction. Include at least one positive and one negative control each time amplification is performed. As with any new laboratory procedure, the inclusion of additional positive and negative controls should be considered until a high degree of confidence is reached in the ability to correctly perform the procedure. If the addition of a positive control is desirable, use a known positive sample. If a positive band is obtained in the gel for the negative control, the entire run should be discarded and the complete procedure should be repeated.
Test procedure for LiPA Denaturing the samples CAUTION: Using a calibrated thermometer, ensure that the temperature of the shaking water bath is 49C 0.5C, and adjust the temperature if necessary before adding a sample tray.
17 1. 2. 3.
INNO-LiPA HBV Genotyping Equilibrate a shaking water bath to 49C 0.5C. Place the Hybridization Solution and Stringent Wash Solution in a water bath at 37 to 49C to dissolve all crystals. Ensure that the water bath does not exceed 49C. Mix by shaking the bottle before use. Using tweezers, remove one strip for each sample. With a pencil, write an identification number above the red marker line on the strip. Always include a strip for the negative control (amplified product of an HBV negative sample). NOTE: Do not place the strip in the trough until step 2 in Hybridizing the samples. Place one trough for each sample/strip in the tray. Add 10 l Denaturation Solution to the upper corner of each trough. NOTE: Immediately close the vial containing the Denaturation Solution after each use. Prolonged exposure to air causes the solution to deteriorate. Add 10 l sample or negative control to the Denaturation Solution in each trough. Carefully mix by pipetting up and down. Allow denaturation to proceed for 5 minutes at room temperature.
4. 5.
6. 7.
Hybridizing the samples 1. 2. 3. 4. Carefully add 2 ml Hybridization Solution to each trough, taking care not to contaminate other troughs. Gently shake the trough to mix reagents. Immediately place a strip with the marker line facing up into a trough. NOTE: Wear disposable gloves and use tweezers when handling the strips. Ensure that the strip is completely submerged in the solution. Do not cover the troughs with microplate sealers so as to avoid cross-contamination. Place the tray into the 49C 0.5C shaking water bath and immobilize the tray between two heavy weights. Set the water bath to approximately 80 rpm, close the lid, and incubate the tray for 60 minutes. Ensure that each strip remains completely submerged and floats freely. When hybridization incubation is complete, remove the tray from the water bath.
5.
Washing the strips CAUTION: Hold the tray at a low angle so the liquid accumulates at one end of a trough, above the marker line on the strip, for easy removal. Do not damage the surface of the strip. Avoid splashing or transferring solutions between troughs. 1. 2. Aspirate the solution from the trough using a pipette, preferably attached to a vacuum aspirator. Add 2 ml Stringent Wash Solution to each trough and rinse the strip by rocking the tray 1 minute at 20 - 25C. Aspirate the solution from each trough. NOTE: A multipipette is useful for dispensing the Stringent Wash Solution. Repeat the wash by adding 2 ml Stringent Wash Solution to each trough and rinsing the strip by rocking the tray for 1 minute at 20 - 25C. Aspirate the solution from each trough.
3.
INNOGENETICS 4.
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5.
Add 2 ml Stringent Wash Solution to each trough, place tray into the 49C 0.5C shaking water bath and immobilize the tray between two heavy weights. Set the water bath to approximately 80 rpm, close the lid and incubate the tray for 30 1 minutes. Prepare the rinse working solution and conjugate working solution (See Reagents).
Developing the color CAUTION: Hold the tray at a low angle so the liquid accumulates at one end of a trough, above the marker line on the strip, for easy removal. Do not damage the surface of the strip. Avoid splashing or transferring solutions between troughs. 1. 2. Aspirate the solution from the trough using a pipette. Add 2 ml rinse working solution to each trough and wash the strip by rocking the tray for 1 minute at room temperature. Aspirate the solution from each trough. Repeat this step once. 3. Add 2 ml conjugate working solution to each trough, place the tray on a shaker (orbital at 160 rpm or rocker at 50 rpm) at 20 - 25C, and incubate for 30 1 minutes. NOTE: Prepare the substrate working solution about 10 minutes before the end of the conjugate incubation (See Reagents). 4. When the incubation is complete, remove the tray from the shaker and aspirate the solution from each trough using a pipette. 5. Add 2 ml rinse working solution to each trough and wash the strip by rocking the tray for 1 minute at 20 - 25C. Aspirate the solution from each trough. Repeat this step once. 6. Add 2 ml Substrate Buffer to each trough and wash the strip by rocking the tray for 1 minute at 20 - 25C. Aspirate the solution from each trough. 7. Add 2 ml substrate working solution to each trough, place on shaker at 20 - 25C, and incubate for 30 1 minutes. 8. When the incubation is complete, stop the color development by washing the strips: remove the tray from the shaker, aspirate the solution from each trough, and then add 2 ml distilled water to each trough and place the tray on the shaker for at least 3 minutes. Repeat this step once. 9. Using tweezers, remove each strip from its trough and place the strip with the marker line facing up on absorbent paper. 10. Dry the strips completely before reading the results. Store the developed and dried strips in the dark. Automated test procedure: Auto-LiPA and Auto-LiPA 48 The LiPA test procedure is extremely well suited for automation. Therefore, the Auto-LiPA and Auto-LiPA 48 are designed to fully handle hybridization, stringent wash and color development steps. The Auto-LiPA and Auto-LiPA 48 are featured as a walk-away system with automated heating and cooling, and with automated aspiration and pipetting. For more information and specific protocols on Auto-LiPA and Auto-LiPA 48, please contact your local distributor.
19 Results for LiPA Reading
Figure 1 illustrates the position of the different oligonucleotide probes on the INNOLiPA HBV Genotyping strip. A line is considered positive when a clear purple/brown band appears at the end of the test procedure.
10 - Genotype D 11 12 - Genotype E 13 14 - Genotype F 15 16 - Genotype G Marker line 1 - Conj. control 2 - Amp. control 34 - - Genotype A 56- Genotype B 78- Genotype C 9-
Fig. 1:
Location of the red colored marker line, the conjugate control line (Conj. control), the amplification control line (Amp. control) and the 14 probe lines on the INNO-LiPA HBV Genotyping strip.
Quality control The uppermost red line is the marker line. This line allows correct orientation of the strip. The first positive line should be lined up with the "Conj. control line on the plastic reading card. This line controls for the addition of reactive Conjugate and Substrate Solution during the detection procedure. It should always be positive and should have approximately the same intensity on each strip in the same test run. The second positive line ("Amp. control" on reading card) controls for the addition of amplified material for hybridization. If HBV is present in the sample and correct sample processing and amplification has occurred, then the target amplicon hybridizes to this "Amp. control line. The Negative Control strip should be blank except for the conjugate control line. This demonstrates no contamination during the assay performance.
Interpretation of the results Use the interpretation chart AT ALL TIMES for correct interpretation of the HBV genotype. NOTE: Isolates from different genotypes can cross react with the same probe line. Please, check carefully on the interpretation chart which probe line patterns apply to each individual genotype. REMARK: (patterns not present on the interpretation chart): Interpretation of mixed infections: The existence of mixed genotype infections in chronic HBV carriers has been documented. When multiple genotype infections are detected by using the INNO-LiPA HBV Genotyping assay, the results should be interpreted as follows: If multiple genotype specific lines show for different genotypes, a mixed genotype should be reported.
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For example, positive lines 6 - 7 together with positive lines 8 - 9 is reported as a B/C co-infected sample. For HBV genotype G, it has been shown that this genotype is co-infected with HBV genotype A in a majority of cases. For example, a reactivity pattern where the genotype G specific line 16 is present together with at least 2 positive genotype A lines should be reported as an A/G co-infected sample. If multiple genotype specific lines show for one genotype, together with a single positive line for a second genotype, this should be reported as a single genotype. The genotype reported should be the one with the multiple lines positive. Please note that a single line 16 is indicative for the presence of a genotype G.
Indeterminate results: Indeterminate (IND) results should be reported in the following cases: Single reactive lines for more than one genotype in conjunction with a positive amplification control line (line 2). Please note that a single line 11 and a single line 15 reactivity should be interpreted as genotype H. Absence of positive genotype-specific lines in conjunction with a positive amplification control line (line 2). All lines positive.
For any support on the interpretation, contact your distributor. Limitations of the procedures Use of this kit should be limited to personnel who are trained in the techniques of HBV nucleic acid extraction and amplification. Good laboratory practice and careful performance of the procedure previously specified allow specific amplification. Because of the occasional very high load of HBV infected samples, extreme caution should be taken to avoid contamination. Polymerase inhibition (e.g. by heparin haemoglobin) might be the reason for complete failure of the assay. Powder from disposable gloves and sodium hypochlorite have an inhibiting effect on amplification. HBV infections with mixed viral genotype can occur. The primers amplify all genotypes simultaneously. In a sample with mixed infection and low viral load, it is possible that not all genotypes will be detected due to PCR competition. This assay is based on the sequence variability in the HBV polymerase gene domains B and C, allowing differentiation between HBV genotypes A to H. Due to some sequence heterogeneity of the HBV genome, indeterminate patterns or false-reacting probe lines may occasionally be produced. Results showing weak reactivity on all lines are occasionally observed and yield an indeterminate result. Samples showing this pattern should be re-amplified or re-extracted.
21 Test performance
The test performance of the INNO-LiPA HBV Genotyping assay was evaluated at one French and one Dutch center on HBV-positive clinical samples from, respectively, 100 and 273 HBV-infected subjects. Moreover, 54 HBV-positive samples classified as genotype C, F, G, or H by sequencing were tested at Innogenetics. Sensitivity Positive test results as indicated by a positive amplification control line were obtained in 415 of the 427 specimens after initial amplification, resulting in an initial sensitivity of 97.2%. Re-amplification of 10 of the 12 specimens was performed and found to be successful for all 10 specimens resulting in a sensitivity of 100% (425/425) after repeat testing. Accuracy Among the 425 specimens tested on INNO-LiPA HBV Genotyping, an indeterminate result was observed for 8 samples (1.9%). For 415 samples, a genotype result was obtained both with LiPA and with sequencing. For 92% (382/415) of the specimens, LiPA detected the same genotype as sequencing. For 19 samples (4.6%), LiPA detected a co-infection while sequencing identified only one of the genotypes. A different genotype with each method was obtained for 14 samples (3.4%). The following table provides an overview of the results.
Genotype LiPA A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Total Sequencing A B 126 29 1 1 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 Total C D 6 E 1 F G H IND 1 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
Nine samples with a different result from sequencing and 10 of the samples with a mixed genotype result were further analyzed using different techniques. The LiPA results could be confirmed for 15 of these 19 samples while for 2 samples the LiPA result was found to be, at least partially, incorrect. For the other 2 samples with a mixed genotype result on LiPA, only one of the genotypes was confirmed upon additional testing. Upon combining all test results, the LiPA genotype result was confirmed in 99% (397/401) of the cases.
INNOGENETICS Precision
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A panel of 9 plasmid samples was tested by 3 different operators in triplicate on 2 lots of INNO-LiPA HBV Genotyping strips. A 100% concordance (162/162) at the genotype level was obtained. In addition, a six-member dilution panel ranging between 10 000 and 375 copies/ml and derived from one clinical sample with genotype A was tested eight times. Each panel member was extracted, amplified using outer and nested primers, and tested on one lot of INNO-LiPA HBV Genotyping strips on different days by 2 different operators at 2 different locations. A 100% concordance (48/48) at the genotype level was achieved. Eight samples (genotypes A to H) were extracted and amplified using the amplification reagents. Amplified products were run in duplicate on the INNO-LiPA HBV Genotyping strips using 3 lots of LiPA kits. A 100% concordance (48/48) at the genotype level was achieved. Franais But du test INNO-LiPA HBV Genotyping est un test dhybridation molculaire sur bandelettes conu pour identifier les gnotypes A H du virus de l'hpatite B (HBV) par la dtection de squences spcifiques de type dans les domaines B C du gne de la polymrase HBV. HBV Genotype Assay (LiPA) n'est pas destin tre utilis comme test de dpistage d'HBV ou de confirmation de la prsence d'HBV. Principe du test Le virus de l'hpatite B (HBV) est un virus ADN partiellement double brin qui se rplique via un intermdiaire ARN. La premire tape consiste isoler l'ADN viral de l'chantillon. L'ADN purifi est ensuite amplifi par deux cycles de PCR l'aide d'amorces PCR biotinyles. Les amorces externes (premier cycle de PCR) utilises dans ce test amplifient la partie (domaine B et C) du gne de la polymrase HBV. Les deux brins de l'hlice d'ADN sont spars (dnaturation) par chauffage afin d'exposer la cible aux amorces externes. Ces amorces oligonuclotidiques sont complmentaires de rgions trs conserves encadrant la rgion cible. En outre, au refroidissement une temprature spcifie, les amorces se lient leurs squences spcifiques (annealing 45C). A une temprature leve, en prsence de dNTP, lADN polymrase thermostable prolonge la squence des amorces sur la matrice cible (extension). Une copie exacte de la squence matrice est produite aprs un cycle de dnaturation, annealing et extension. Ce processus est rpt pendant 40 cycles, de manire obtenir une squence cible multi-amplifie de 409 bp. La quantit de produit d'amplification n'tant gnralement pas suffisante, on utilisera la technique dite nested-PCR (PCR interne, deuxime cycle). Le principe de cette
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amplification est identique, la diffrence que l'ADN est remplac par le produit amplifi du premier cycle PCR et que les amorces externes sont remplaces par des amorces biotinyles internes. Le processus de dnaturation, annealing et extension est rpt pendant 35 cycles, de manire obtenir une squence amplifie de 342 bp. Il est conseill de vrifier en gel quel type damplicon (externe ou interne) sera utilis. Aprs amplification, lADN biotinyl gnr par le cadre de lecture ouvert HbsAg est hybrid l'aide de sondes oligonuclotidiques spcifiques immobilises en bandes parallles sur bandelettes. Aprs hybridation, l'ADN non hybrid est limin par lavage de la bandelette et de la streptavidine marque une phosphatase alcaline est ajoute, qui se fixe aux hybrides biotinyls prcdemment forms. L'incubation avec un chromogne BCIP/NBT entrane la formation d'un prcipit violet/brun. La bandelette INNO-LiPA HBV Genotyping comporte une ligne de repre rouge, 2 bandes de contrle et 14 bandes sondes parallles. La bande de contrle Conjugu fournit un contrle du dveloppement de la coloration, et la bande de contrle d'amplification contient des sondes HBV universelles permettant de contrler la prsence de matriel gnomique HBV. Ractifs Description, prparation et conditions de conservation REMARQUE: Les ractifs AMP et LiPA doivent tre stocks ds leur arrive: les ractifs AMP dans la zone de pr-amplification et les ractifs LiPA dans la zone de post-amplification. Tous les ractifs ouverts ou ferms sont stables jusqu' la date de premption s'ils sont conservs 2 - 8C. Ne pas utiliser les ractifs aprs la date de validit. Afin d'viter toute contamination, il est recommand d'aliquoter les ractifs d'amplification aprs la premire utilisation. Les ractifs doivent tre conservs l'cart de toute source d'ADN contaminant, en particulier des produits amplifis. Utiliser des tubes et des cnes pour pipettes (de prfrence filtre coton) jetables. Tous les ractifs doivent tre ramens la temprature ambiante (20 - 25C) 30 minutes environ avant l'utilisation, et replacs au rfrigrateur immdiatement aprs l'utilisation. Vortexer et centrifuger brivement tous les ractifs avant d'ouvrir les flacons. Refermer les flacons immdiatement aprs usage. Une altration de l'apparence physique des ractifs du kit peut indiquer une instabilit ou une dtrioration. Pour minimiser le risque de voir les bandelettes s'enrouler avant utilisation, il est recommand de conserver le tube l'horizontale.
INNOGENETICS Ractifs fournis

Composant Ractifs AMP: Mlange amorces externes Mlange amorces internes Ractifs LiPA: Bandelettes Solution de Dnaturation 1 x 20 1 x 1 ml Quantit Rf. Description
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1 x 0,08 ml 58322 Contient les amorces biotinyles et 0,05% NaN3 comme conservateur. 1 x 0,08 ml 58324 Contient les amorces biotinyles et 0,05% NaN3 comme conservateur. 58321 1 tube en plastique contenant des bandelettes INNO-LiPA HBV Genotyping marques d'une ligne de repre rouge. 56718 Solution alcaline contenant EDTA. ATTENTION: Le flacon contenant la Solution de Dnaturation doit tre immdiatement referm aprs usage. Une exposition prolonge l'air de cette solution conduit une rapide dtrioration de son pouvoir dnaturant. 57420 Contient un tampon SSC avec dtergents et conservateurs. La Solution d'Hybridation doit tre prchauffe une temprature d'au moins 37C sans dpasser 49C (tous les cristaux doivent tre dissous avant utilisation).
Solution d'Hybridation 1 x 80 ml
Solution de Lavage Stringent
1 x 200 ml 57421 Contient un tampon SSC avec dtergents et conservateurs. La Solution de Lavage Stringent doit tre prchauffe une temprature d'au moins 37C sans dpasser 49C (tous les cristaux doivent tre dissous avant utilisation). 1 x 0,8 ml 56952 Streptavidine marque la phosphatase alcaline en tampon Tris contenant des protines stabilisatrices et 0,01% MIT/ 0,098% CAA, diluer au 1/100 en Diluant Conjugu avant utilisation. Prparer 2 ml de Solution de travail de Conjugu par compartiment + 2 ml supplmentaires. Pour l'Auto-LiPA, prparer 10 ml supplmentaires. La Solution de travail de Conjugu est stable 24 heures temprature ambiante (20 - 25C) et l'obscurit. 1 x 80 ml 56951 Tampon phosphate contenant NaCl, Triton, protines stabilisatrices et 0,01% MIT/0,1% CAA comme conservateurs.
Conjugu (100x)
Diluant Conjugu
Substrat BCIP/NBT 100x
1 x 0,8 ml 56954 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate et 4-nitrobleu tetrazolium en dimthylformamide, diluer au 1/100 en Tampon Substrat avant utilisation. Prparer 2 ml de Solution de travail de Substrat par compartiment + 2 ml supplmentaires. Pour l'Auto-LiPA, prparer 10 ml supplmentaires. La Solution de travail de Substrat est stable 24 heures temprature ambiante (20 - 25C) et l'obscurit. 1 x 180 ml 56953 Tampon Tris contenant NaCl, MgCl2 et 0,01% MIT/ 0,1% CAA comme conservateurs. 56721 Tampon phosphate contenant NaCl, Triton et 0,01% MIT/ 0,1% CAA comme conservateurs, diluer au 1/5 (1 part + 4 parts) en eau distille ou dsionise avant utilisation. Prparer 8 ml de Solution de travail de Rinage par compartiment + 10 ml supplmentaires. Pour l'Auto-LiPA, prparer 12 ml de Solution de travail de Rinage par
Tampon Substrat
Solution de Rinage 5x 1 x 80 ml
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compartiment + 20 ml en excs. La Solution de travail de Rinage est stable 2 semaines 2 - 8C.
Supports pour incubation Carte de lecture Table dinterprtation Feuille de rsultats
3 1 1 2
Contenant 8 compartiments chacun. Pour l'identification des sondes positives. Pour l'interprtation des rsultats. Pour la conservation des bandelettes dveloppes.
Matriel ncessaire non fourni Gants jetables. Cnes pour pipettes striles jetables (de prfrence filtre coton). Microtubes striles. Racks pour microtubes. Centrifugeuse pour microtubes. Pipettes ajustables 1 - 20 l, 20 - 200 l et 200 - 1000 l. Eau distille autoclave.
Matriel spcifique pour l'amplification Pour l'amplification, il est recommand d'utiliser la Taq ADN polymrase et le tampon d'amplification Taq fournis par Stratagene. Thermocycleur ADN et quipement. dNTP (25 mM). Tampon Taq 10x (contenant 100 mM Tris-HCl pH 8,8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (w/v) glatine et stabilisateurs, Stratagene). Taq ADN polymrase (Taq DNA Polymerase, Stratagene).
Matriel spcifique pour LiPA Systme d'aspiration. Thermomtre calibr. Pinces. Cylindres gradus (10, 25, 50 et 100 ml). Minuteur (2 heures 1 minute). Vortex ou quivalent. Bain-marie avec plate-forme agitante (80 tr/min; couvercle inclin; temprature rglable minimum 49C 0,5C). Agitateur orbital (160 tr/min) ou basculant (50 tr/min).
En option: Multipipette (de type Eppendorf ou quivalent). Equipement pour automatisation du traitement des bandelettes. Pour plus de dtails, contacter votre distributeur. Scurit et environnement Veuillez vous rfrer la Fiche de Donnes de Scurit (FDS) et l'tiquetage des produits pour toute information sur les composants potentiellement dangereux. La version la plus rcente de la FDS est disponible sur notre site web www.innogenetics.com.
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R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Toxique! Nocif par inhalation et par contact avec la peau. Irritant pour les yeux. Risque pendant la grossesse d'effets nfastes pour l'enfant. Porter un vtement de protection et des gants appropris. En cas d'accident ou de malaise, consulter immdiatement un mdecin (montrer l'tiquette si possible). Eviter toute exposition - Se procurer les instructions spciales d'utilisation. Limit un usage par des professionnels. Contient du dimthylformamide, 5bromo-4-chloro-3-indolylphosphate sel de p-toluidine: Substrat BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37 Irritant! Peut causer des irritations par contact avec la peau. viter le contact avec la peau. Porter des gants appropris. Contient 2-chloroactamide: Solution Lavage Stringent, Solution d'Hybridation, Solution de Rinage, Tampon Substrat et Diluant Conjugu.
R34, S28-36/37/39-45 Corrosive! (C) Provoque des brlures. Aprs contact avec la peau, se laver immdiatement et abondamment avec du savon et de l'eau. Porter un vtement de protection, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage appropris. En cas d'accident ou de malaise, consulter immdiatement un mdecin (montrer l'tiquette si possible). Contient de l'hydroxyde de sodium: Solution de Dnaturation. Les chantillons doivent toujours tre manipuls comme potentiellement infectieux. Tout constituant driv du sang, ainsi que tout matriel biologique, doit donc tre considr comme potentiellement infectieux et devra tre manipul avec les prcautions d'usage. Seul le personnel qualifi doit tre autoris raliser le test. Tous les drivs sanguins et matriels biologiques doivent tre limins selon les procdures de scurit en vigueur: Autoclaver au moins 15 min 121C. Incinration des matriels jetables. Mlanger les dchets liquides avec de l'hypochlorite de sodium une concentration finale d'environ 1%. Laisser en contact une nuit avant l'vacuation. ATTENTION: Les liquides contenant de l'acide doivent tre neutraliss avant ajout d'hypochlorite de sodium. L'utilisation d'un quipement de protection personnel est ncessaire: gants et crans lors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux. Les dchets doivent tre traits en accord avec les rgles d'limination des dchets en vigueur dans l'institution. Toutes les rglementations fdrales, nationales et locales doivent galement tre observes.
27 Recueil et manipulation des chantillons
Utiliser l'ADN d'chantillons HBV positifs frachement recueillis ou congels -20C ou plus, (de prfrence jamais dcongels). Ceci permet de gnrer du matriel amplifi du gne de la polymrase HBV, domaine B C. Utiliser alors 10 l du produit HBV amplifi pour le processus LiPA. Remarques et prcautions A usage professionnel exclusivement. Tous les cnes pour pipettes et tubes utiliss pour le processus d'amplification doivent tre autoclavs. Il est recommand d'utiliser des cnes filtre coton pour pipettes. Utiliser exclusivement du matriel de laboratoire jetable. Utiliser un nouveau cne pour pipette strile pour chaque chantillon aliquot. Ne pas mlanger les ractifs de kits diffrents, moins que les composants ne portent le mme numro de lot. Pour viter toute contamination PCR, sparer physiquement au maximum les tapes de pr- et post-amplification. Ne pas rapporter les chantillons, l'quipement ou les ractifs dans les zones o l'tape prcdente a t effectue. S'il est ncessaire de revenir dans une zone de travail prcdente, appliquer d'abord les mesures de dcontamination appropries. Utiliser des pinces pour manipuler les bandelettes. Ne pas manipuler les bandelettes mains nues: les graisses des mains peuvent interfrer avec l'hybridation et la rvlation colore. Utiliser exclusivement un crayon pour identifier les bandelettes. Les ractifs peuvent effacer l'encre des bandelettes. Pour des rsultats prcis, utiliser un bain-marie pour l'hybridation et le lavage, et rgler la temprature 49C 0,5C. Ne pas utiliser de systme d'incubation agitant air chaud puls. Utiliser un thermomtre calibr, car un contrle strict de la temprature est indispensable. Toujours fermer le couvercle du bain-marie pour maintenir la temprature Une temprature trop basse peut causer des rsultats faussement positifs; Une temprature trop leve peut entraner des signaux trs faibles ou des rsultats faussement ngatifs. Utiliser un bain-marie agitant avec couvercle inclin pour un contrle optimal de la temprature. Le mouvement gnr par le bain-marie agitant pendant l'hybridation et le lavage stringent et par l'agitateur orbital ou basculant pendant la rvlation colore a une importance critique. Rgler la vitesse de ces instruments avec soin pour maximiser le mouvement des ractifs sur la bandelette sans crer de projections des solutions entre les compartiments du support. Eviter de projeter de l'eau du bain-marie dans le support. Rgler le niveau d'eau dans le bain-marie entre le tiers et la moiti de la hauteur du support. Empcher le support de glisser en l'immobilisant l'aide de poids. Ne pas laisser scher les bandelettes entre les tapes. Maintenir chaque bandelette dans le mme compartiment pendant toute la procdure. Pour aspirer le liquide d'un compartiment, utiliser une pipette, ventuellement branche sur une pompe vide.
INNOGENETICS Procdure d'amplification Protocole d'extraction de l'ADN: High Pure PCR Template preparation Kit (Roche Diagnostics). Voir le protocole du kit indiqu. D'autres procdures d'extraction de l'ADN peuvent tre utilises. Protocole d'amplification
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Les protocoles suivants (amplification externe et interne) ont t conus pour permettre une amplification optimale, avec Taq Polymerase (5U/l, Stratagene), Tampon Taq 10x (contenant 100 mM Tris-HCl pH 8,8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (w/v) glatine, stabilisateurs, Stratagene) Tubes PCR MicroAmp (0,2 ml) et Thermocycleurs PE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus). Ce protocole peut tre utilis avec la plupart des types de thermocycleurs du commerce mais peut demander certaines modifications fournies par le fabricant. Prendre les prcautions ncessaires pour viter toute amplification non spcifique qui risque de compromettre les rsultats: dcongeler les composants indiqus ci-dessous et les placer sur glace effectuer le pipetage sur glace et sans dlai. Amplification externe 1. 2. 3. Dterminer l'aide de la formule suivante le nombre (N) de flacons prparer: N = nombre d'chantillons + 1 contrle ngatif + 1 contrle positif + 1. A l'aide de cnes filtre coton, prparer un mastermix dans un microtube centrifuger autoclav dpourvu de nuclease . Prparer un mlange matre 1 contenant: (N x 32,4 l) eau distille autoclave + (N x 5,0 l) Tampon d'amplification Taq 10x (Stratagene) + (N x 0,4 l) mlange dNTP (25 mM) + (N x 2,0 l) Mlange amorce externe + (N x 0,2 l) Taq DNA Polymerase 5U/l (Stratagene) Vortexer brivement et aliquoter 40 l de ce mlange matre 1 dans (N-1) tubes d'amplification autoclavs. Pipeter 10 l d'ADN purifi ou 10 l d'eau distille (sans ADN pour le Contrle Ngatif). REMARQUE: Mlanger et centrifuger brivement le mlange pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Placer les chantillons dans le bloc chauffant calibr (voir les instructions du fabricant du thermocycleur). Lancer le programme d'amplification spcifique l'amplification externe INNO-LiPA HBV Genotyping. Profil d'amplification externe INNO-LiPA HBV Genotyping pour un thermocycleur PE-2400 ou PE-9600:
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5.
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Etape 1 2 3 4 5 6 Dnaturation Dnaturation Annealing Extension Elongation Refroidir 4C Temp. 94C 94C 45C 72C 72C Dure 4 min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min
Rpter les tapes 2 4 du cycle, 40 fois
6.
Aprs ce processus, utiliser immdiatement les chantillons pour l'amplification interne, ou les conserver -15/-25C. NOTE: Ne pas conserver les produits ADN amplifis avec les ractifs d'amplification ou de l'ADN extrait.
Amplification interne 1. Dterminer l'aide de la formule suivante le nombre (N) de tubes prparer: N = nombre d'chantillons amplifis externes + Contrle Ngatif amplifi externe + 1 Contrle Ngatif + 1 Contrle Positif + 1. A l'aide d'un cne filtre coton, prparer le mlange matre 2 dans un tube 1,5 ml autoclav: (N x 40,4 l) eau distille autoclave + (N x 0,4 l) mlange dNTP (25 mM) + (N x 5,0 l) Tampon d'amplification Taq 10x (Stratagene) + (N x 2,0 l) Mlange amorce interne + (N x 0,2 l) DNA polymrase Taq 5 U/l (Stratagene) Vortexer brivement et aliquoter 48 l de ce mlange matre dans (N-1) tubes d'amplification autoclavs. Pipeter 2 l des produits amplifis externes, ou 2 l d'eau distille (pas d'ADN pour le Contrle Ngatif) REMARQUE: Mlanger et centrifuger brivement le mlange pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Placer les chantillons dans le bloc chauffant calibr (voir les instructions du fabricant du thermocycleur). Lancer le programme d'amplification spcifique l'amplification niche INNO-LiPA HBV Genotyping. Profil d'amplification interne INNO-LiPA HBV Genotyping pour un thermocycleur PE-2400 ou PE-9600:
Etape 1 2 3 4 6 7 Dnaturation Dnaturation Annealing Extension Elongation Refroidir 4C Temp. 94C 94C 45C 72C 72C Dure 4 min 30 sec 30 sec 30 sec 10 min Rpter les tapes 2 4 du cycle, 35 fois
2.
3.
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Aprs ce processus, analyser 5 l des produits amplifis externe et interne en gel d'agarose 2%, ou conserver -15/-25C. Des observations en interne indiquent que si le produit amplifi externe rvle une bande de 409 bp, il est possible d'obtenir un rsultat interprtable l'aide du test LiPA. Si aucune bande n'est visible pour le produit amplifi externe, utiliser le produit amplifi interne avec le test INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTE: Ne pas conserver les produits ADN amplifis avec les ractifs d'amplification ou de l'ADN extrait.
Rsultats de l'amplification Visualisation La prsence du produit amplifi peut tre vrifie en d'agarose 2%. Charger 5 l de produit amplifi par fente. L'amplicon interne doit apparatre comme une bande d'une longueur de 342 bp. L'amplicon externe doit apparatre comme une bande d'une longueur de 409 bp.
Contrle de qualit Inclure au moins un blanc pour l'extraction. Inclure au moins un contrle ngatif et un contrle positif chaque fois qu'une amplification est excute. Comme dans toute procdure de laboratoire, il est indiqu de prvoir des contrles positifs et ngatifs supplmentaires jusqu' acquisition d'une prcision satisfaisante dans l'excution de la procdure. S'il est souhaitable d'inclure un contrle positif supplmentaire, utiliser un chantillon positif connu. La prsence sur le gel d'une bande positive pour le contrle ngatif indique que l'ensemble du test doit tre rejet et que la procdure doit tre entirement recommence.
Procdure de test pour LiPA Dnaturation des chantillons ATTENTION: A l'aide d'un thermomtre talonn, contrler que la temprature du bainmarie agitant est de 49C 0,5C, et la rgler le cas chant avant dy placer la plaque. 1. 2. 3. Chauffer le bain-marie agitant 49C 0,5C. Placer la Solution d'Hybridation et la Solution Lavage Stringent dans un bain-marie 37 49C pour dissoudre tous les cristaux. Veiller ce que la temprature du bainmarie ne dpasse pas 49C. Mlanger en agitant le flacon avant utilisation. A l'aide de pinces, retirer une bandelette pour chaque chantillon. A l'aide d'un crayon, inscrire un numro d'identification au-dessus de la ligne repre rouge de la bandelette. Toujours inclure une bandelette pour le contrle ngatif. NOTE: Ne pas dposer la bandelette dans le compartiment avant l'tape 2 de la section Hybridation des chantillons. Placer dans le support un compartiment pour chaque chantillon/bandelette.
4.
31 5.
INNO-LiPA HBV Genotyping Dposer 10 l de Solution de Dnaturation dans le coin suprieur de chaque compartiment. Note: Aprs chaque utilisation, refermer immdiatement le flacon contenant la Solution de Dnaturation. Une exposition prolonge l'air conduit la dtrioration de son pouvoir dnaturant. Ajouter 10 l d'chantillon ou de contrle ngatif la Solution de Dnaturation dans chaque compartiment. Mlanger soigneusement l'aide d'une pipette, par flux et reflux. Laisser dnaturer pendant 5 minutes temprature ambiante.
6. 7.
Hybridation des chantillons 1. 2. Dposer soigneusement 2 ml de Solution d'Hybridation dans chaque compartiment, en veillant ne pas contaminer les autres compartiments. Agiter doucement le compartiment pour mlanger les ractifs. Placer immdiatement dans le compartiment une bandelette, ligne repre rouge vers le haut. NOTE: Porter des gants jetables et utiliser des pinces pour manipuler les bandelettes. Veiller ce que les bandelettes soient compltement immerges dans la solution. Ne pas couvrir les compartiments l'aide de feuilles adhsives pour microplaques pour viter toute contamination croise. Placer le support dans le bain-marie agitant 49C 0,5C et l'immobiliser entre deux poids pesants. Rgler le bain-marie environ 80 tr/min, fermer le couvercle et incuber 60 minutes. Contrler que chaque bandelette reste compltement immerge et flotte librement. Aprs l'tape d'hybridation, retirer le support du bain-marie.
3. 4.
5.
Lavage des bandelettes ATTENTION: Maintenir le support lgrement inclin pour permettre au liquide de s'accumuler une extrmit du compartiment, au-dessus de la ligne repre rouge de la bandelette, de manire pouvoir l'liminer facilement. Ne pas endommager la surface de la bandelette. Eviter de projeter ou de transfrer les solutions entre les compartiments. 1. 2. Aspirer le liquide de chaque compartiment l'aide d'une pipette, de prfrence branche sur une pompe vide. Dposer 2 ml de Solution Lavage Stringent dans chaque compartiment et rincer la bandelette en agitant le support pendant 1 minute 20 - 25C. Aspirer la solution de chaque compartiment. NOTE: Utiliser une multipipette pour dposer la Solution Lavage Stringent. Rpter le lavage: dposer 2 ml de Solution Lavage Stringent dans chaque compartiment et rincer la bandelette en agitant le support pendant 1 minute 20 - 25C. Aspirer la solution de chaque compartiment. Dposer 2 ml de Solution Lavage Stringent dans chaque compartiment, placer le support dans le bain-marie agitateur 49C 0,5C et l'immobiliser entre deux
3. 4.
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poids pesants. Rgler le bain-marie environ 80 tr/min, fermer le couvercle et incuber 30 1 minutes. Prparer la solution de travail de rinage et la solution de travail de conjugu (voir Ractifs).
Rvlation colore ATTENTION: Maintenir le support lgrement inclin pour permettre au liquide de s'accumuler une extrmit du compartiment, au-dessus de la ligne repre rouge de la bandelette, de manire pouvoir l'liminer facilement. Ne pas endommager la surface de la bandelette. Eviter de projeter ou de transfrer les solutions entre les emplacements. 1. 2. A l'aide d'une pipette, aspirer la solution de chaque compartiment. Dposer 2 ml de solution de travail de rinage dans chaque compartiment et laver la bandelette en agitant le support pendant 1 minute temprature ambiante. Aspirer la solution de chaque compartiment. Rpter cette tape une fois. 3. Dposer 2 ml de solution de travail conjugu dans chaque compartiment, placer le support sur un agitateur (orbital 160 tr/min ou basculant 50 tr/min) 20 - 25C, et incuber 30 1 minutes. NOTE: Prparer la Solution de travail de Substrat 10 minutes environ avant la fin de l'incubation de conjugu. (voir Ractifs). 4. Aprs l'incubation, retirer le support de l'agitateur et aspirer la solution de chaque compartiment l'aide d'une pipette. 5. Dposer 2 ml de solution de travail de rinage dans chaque compartiment et laver la bandelette en agitant le support pendant 1 minute 20 - 25C. Aspirer la solution de chaque compartiment. Rpter cette tape une fois. 6. Dposer 2 ml de Tampon Substrat dans chaque compartiment et laver la bandelette en agitant le support pendant 1 minute 20 - 25C. Aspirer la solution de chaque compartiment. 7. Dposer 2 ml de solution de travail substrat dans chaque compartiment, placer sur un agitateur 20 - 25C et incuber pendant 30 1 minutes. 8. Lorsque l'incubation et termine, arrter la rvlation colore en lavant les bandelettes: retirer le support de l'agitateur, aspirer la solution de chaque compartiment puis dposer 2 ml d'eau distille dans chaque compartiment. Replacer le support sur l'agitateur pendant au moins 3 minutes. Rpter cette tape une fois. 9. A l'aide pinces, retirer chaque bandelette de son compartiment et la dposer sur du papier absorbant, la ligne de repre rouge vers le haut. 10. Laisser scher compltement les bandelettes avant de lire les rsultats. Conservez les bandelettes dveloppes et sches l'obscurit. Procdure automatise: Auto-LiPA et Auto-LiPA 48 C'est ainsi que l'Auto-LiPA et l'Auto-LiPA 48 sont conus pour prendre intgralement en charge les tapes d'hybridation, de lavage stringent et de rvlation colore. L'Auto-LiPA et l'Auto-LiPA 48 sont des systmes ne ncessitant aucune surveillance et pourvus de fonctions de chauffage et refroidissement, aspiration et pipetage automatiques. Pour plus d'informations et pour les protocoles spcifiques de l'Auto-LiPA et de l'Auto-LiPA 48, prendre contact avec votre distributeur.
33 Rsultats pour LiPA Lecture
La Figure 1 illustre la position des diffrentes sondes oligonuclotidiques sur les bandelettes INNO-LiPA HBV Genotyping. Une bande est considre positive lorsqu'une coloration violet/brun apparat clairement la fin de la procdure de test. Fig. 1 (voir page 19): Emplacement de la ligne de repre rouge, de la bande de contrle Conjugu (Conj. control), de la bande de contrle d'amplification (Amp. control) et des 14 bandes sondes sur la bandelette INNO-LiPA HBV Genotyping. Contrle de qualit La ligne rouge suprieure est la ligne de repre. Elle permet d'orienter correctement la bandelette. La premire bande positive doit tre aligne avec la bande "Conj. control" de la carte de lecture en plastique. Elle sert de contrle pour l'addition des solutions Conjugu et Substrat pendant la procdure de dtection. Elle doit toujours tre positive et d'intensit plus ou moins similaire sur chaque bandelette d'un mme test. La deuxime bande positive ("Amp. control" sur la carte de lecture) sert de contrle pour l'addition du matriel amplifi pour l'hybridation. Si HBV est prsent dans l'chantillon et que ce dernier a t correctement trait et amplifi, l'amplicon cible s'hybride sur cette ligne "Amp. control". La bandelette de Contrle Ngatif doit tre blanc, l'exception de la ligne de contrle Conjugu. Ceci indique qu'il n'y a pas eu de contamination au cours du test.
Interprtation des rsultats TOUJOURS utiliser la Table dinterprtation pour une interprtation correcte du gnotype HBV. NOTE: Des isolats de diffrents gnotypes peuvent donner une raction croise avec la mme sonde. Il est important de contrler attentivement dans la Table dinterprtation les profils de sondes correspondant aux diffrents gnotypes. REMARQUE: (profils non prsents dans la Table dinterprtation): Interprtation d'infections mixtes: L'existence d'infections gnotypes mixtes chez les porteurs HBV chroniques a t rapporte. Lorsque ce type d'infection est dtect l'aide du test INNO-LiPA HBV Genotyping, les rsultats doivent tre interprts de la manire suivante: si plusieurs bandes spcifiques de gnotype indiquent l'existence de gnotypes diffrents, on conclura la prsence d'un gnotype mixte. Par exemple, des bandes 6 - 7 positives associes des bandes 8 - 9 positives indiquent un chantillon coinfect B/C. Il a t montr que le gnotype HBV G est coinfect par le gnotype HBV A dans la majorit des cas. Par exemple, une ractivit caractrise par la
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prsence simultane de la bande 16 spcifique du gnotype G et d'au moins 2 bandes gnotype A positives indique un chantillon coinfect A/G. En prsence de plusieurs bandes indiquant la prsence d'un gnotype et d'une seule bande positive dun second gnotype, on conclura la prsence d'un seul gnotype. Le gnotype retenu sera celui correspondant aux bandes positives multiples. Noter quune bande 16 isole indique la prsence d'un gnotype G.
Rsultats indtermins: Les rsultats seront considrs comme indtermins (IND) dans les cas suivants: bande positive isole pour plus dun gnotype, avec bande de contrle d'amplification positive (bande 2); il est noter qu'une ractivit caractrise par une bande 11 isole et une bande 15 isole doit tre interprte comme un gnotype H; absence de bande spcifique de gnotype positive, avec bande de contrle d'amplification positive (bande 2); toutes les bandes positives.
Pour toute aide concernant l'interprtation des rsultats, contacter votre distributeur. Limites des procdures L'utilisation de ce kit doit tre restreinte au personnel ayant reu une formation aux techniques d'extraction et d'amplification de l'acide nuclique HBV. De bonnes pratiques de laboratoire et le strict respect des procdures spcifies permettent une amplification spcifique. En raison de la charge virale parfois trs importante des chantillons infects par HBV, des prcautions extrmement rigoureuses doivent tre prises pour viter toute contamination. L'inhibition de la polymrase (par ex. hmoglobine, l'hparine) peut tre la cause d'un chec complet du test. La poudre des gants jetables et l'hypochlorite de sodium ont un effet inhibiteur sur l'amplification. Il peut se prsenter des cas d'infections HBV gnotype viral mixte. Les amorces amplifient tous les gnotypes simultanment. Dans un chantillon infection mixte et faible charge virale, il est possible que tous les gnotypes ne soient pas dtects en raison de phnomne de comptition lors de la PCR. Ce test repose sur la variabilit de squences des domaines B et C du gne de la polymrase HBV, qui permet la diffrenciation entre les gnotypes HBV A H. En raison d'une certaine htrognit de squences du gnome HBV, des profils indtermins ou des bandes faussement ractives peuvent parfois tre observs. On observe parfois une faible ractivit de toutes les bandes. Le rsultat obtenu est alors indtermin. Les chantillons montrant ce profil doivent tre soumis une nouvelle amplification ou une nouvelle extraction.
Performances Les performances du test INNO-LiPA HBV Genotyping ont t values dans un centre franais et un centre nerlandais sur des chantillons cliniques HBV positifs
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provenant, respectivement, de 100 et 273 patients infects par HBV. De plus, 54 chantillons HBV positifs classifis gnotypes C, F, G ou H par squenage, ont t tests chez Innogenetics. Sensibilit Des rsultats positifs, indiqus par une bande de contrle d'amplification positive, ont t obtenus dans 415 des 427 chantillons aprs amplification initiale, donnant une sensibilit initiale de 97,2%. Une nouvelle amplification de 10 des 12 chantillons a t effectue, avec des rsultats positifs pour les 10 chantillons, rsultant en une sensibilit de 100% (425/425) aprs rptition du test. Exactitude Sur les 425 chantillons tests l'aide d'INNO-LiPA HBV Genotyping, 8 (1,9%) ont donn un rsultat indtermin. Pour 415 chantillons, un rsultat de gnotypage a t obtenu la fois avec LiPA et par squenage. Pour 92% (382/415) des chantillons, LiPA a dtect le mme gnotype que le squenage. Pour 19 chantillons (4,6%), LiPA a dtect une coinfection alors que le squenage n'identifiait qu'un seul des gnotypes. Chaque mthode a dtect un gnotype diffrent dans 14 chantillons (3,4%). Le tableau suivant prsente une synthse des rsultats.
Gnotype Squenage LiPA A B A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Total 126 29 1 1 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 Total C D 6 E 1 F G H IND 1 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
Neuf chantillons prsentant un rsultat diffrent de celui du squenage et 10 des chantillons dans lequel un gnotype mixte avait t identifi, ont t analyss plus en dtail par diffrentes techniques. Les rsultats LiPA ont pu tre confirms pour 15 de ces 19 chantillons; pour 2 des chantillons, les rsultats LiPA se sont rvls incorrects, au moins partiellement. Pour les 2 autres chantillons prsentant un gnotype mixte selon LiPA, seul un des gnotypes a t confirm par des tests complmentaires. Pour l'ensemble de tous les rsultats, les conclusions du test LiPA ont t confirmes dans 99% (397/401) des cas.
INNOGENETICS Reproductibilit
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Un panel de 9 chantillons de plasmides a t test par 3 oprateurs diffrents, en triplicate, sur 2 lots de bandelettes INNO-LiPA HBV Genotyping. Une concordance de 100% (162/162) a t obtenue au niveau des gnotypes. En outre, un panel de dilutions comportant 6 membres se situant entre 10.000 et 375 copies/ml et issu d'un chantillon clinique de gnotype A a t test huit fois. Chaque membre du panel a t extrait, amplifi l'aide d'amorces externes et internes, et test sur un lot de bandelettes INNO-LiPA HBV Genotyping, des jours diffrents, par 2 oprateurs diffrents et dans 2 endroits diffrents. Une concordance de 100% (48/48) a t obtenue au niveau des gnotypes. Huit chantillons (gnotypes A H) ont t extraits et amplifis l'aide des ractifs d'amplification. Les produits amplifis ont t tests en duplicate sur les bandelettes INNO-LiPA HBV Genotyping l'aide de 3 lots de kits LiPA. Une concordance de 100% (48/48) a t obtenue au niveau des gnotypes. Deutsch Verwendungszweck Der INNO-LiPA HBV Genotyping ist ein Line probe assay", der zur Identifizierung von Hepatitis B-Viren (HBV) Genotypen A bis H durch den Nachweis typenspezifischer Sequenzen im HBV-Polymerasegen Dmane B bis C benutzt wird. Der HBV Genotype Assay (LiPA) dient nicht als Screeningtest fr HBV oder als Diagnosetest zum Nachweis von HBV. Funktionsweise des Tests Beim Hepatitis B-Virus(HBV) handelt es sich um ein Virus mit einer teilweise doppelstrangigen DNA, die sich mittels eines RNA-Zwischenstufe repliziert. Der erste Schritt dient der Isolierung der viralen DNA aus der Probe. Die gereinigte DNA wird anschlieend ber zwei PCR-Durchgnge unter Verwendung von biotinylierten PCR-Primern amplifiziert. Die ueren Primer (erster PCR-Durchgang), die in diesem Test verwendet werden, amplifizieren einen Teil (Domne B und C) des HBV-Polymerasegens. Durch Erwrmen werden die beiden Strnge der DNA-Helix getrennt (Denaturierung), damit die Zielsequenzen fr die ueren Primer erreichbar sind. Diese Oligonukleotide sind komplementr zu den hochkonservierten Regionen, welche die Zielsequenzen flankieren. Damit binden sich die Primer, nach dem Abkhlen auf eine spezifische Temperatur, an ihre spezifischen Zielabschnitte (Annealing bei 45C). Bei einer erhhten Temperatur und unter Verwendung der dNTPs verlngert die hitzebestndige DNA-Polymerase die Annealing-Primer entlang der Zielstrnge (Extension). Auf diesem Weg entsteht nach einem Zyklus der Denaturierung, Annealing und Extension eine exakte Kopie der Strnge. Dieser Prozess wird 40 Mal wiederholt, wodurch man eine vielfach amplifizierte Zielsequenz von 409 bp erhlt.
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Da die Menge des Amplifizierungsproduktes in der Regel nicht ausreicht, wird eine NestedPCR (zweiter Durchgang) bentigt. Das Prinzip dieser Amplifizierung ist mit der ersten identisch, mit der Ausnahme, dass die DNA durch das amplifizierte Produkt aus dem ersten Durchgang der PCR ersetzt wird und dass die ueren Primer durch biotinylierte Nested Primer ersetzt werden. Der Prozess der Denaturierung, Annealing und Extension wird fr 35 Zyklen wiederholt, was zu einer amplifizierten Sequenz von 342 bp fhrt. Wir empfehlen, auf einem Gel zu prfen, ob das durch uere Primer oder Nested-Primer amplifiziertes Produkt verwendet werden sollte. Nach der Amplifizierung wird das biotinylierte DNA-Material, das vom HbsAg-offenen Leserahmen generiert wurde, mit spezifischen Oligonukleotidsonden hybridisiert, welche als parallele Linien auf Membranteststreifen immobilisiert wurden. Nach der Hybridisierung wird die nicht hybridisierte DNA vom Teststreifen gewaschen, mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin hinzugefgt und dieses wird dann von den zuvor gebildeten biotinylierten Hybriden gebunden. Die Inkubation mit BCIP/NBT-Chromogen fhrt zu einem violett/braunen Niederschlag. Der Teststreifen enthlt eine rote Markierungslinie, 2 Kontroll-Linien und 14 parallele Sondenlinien. Die Konjugatkontrolllinie dient als Kontrolle fr die Farbentwicklungsreaktion und die Amplifikationskontrolllinie enthlt universelle HBV-Sonden, um das Vorhandensein von amplifiziertem HBV-Genommaterial nachzuweisen. Reagenzien Beschreibung, Vorbereitung und empfohlene Lagerung BEMERKUNG: AMP-Reagenzien und LiPA-Reagenzien mssen umgehend nach dem Erhalt gelagert werden: die AMP-Reagenzien im Pr-Amplifikationsbereich und die LiPA-Reagenzien im Post-Amplifikationsbereich. Alle Testreagenzien sind, geffnet oder ungeffnet, bei 2 - 8C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfallsdatums. Es wird empfohlen, die Amplifikationsreagenzien nach dem ersten Gebrauch zu aliquotieren, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Reagenzien mssen getrennt von kontaminierender DNA, insbesondere von Amplifikationsprodukten, gelagert werden. Es sollten Einweg-Rhrchen und Einweg-Pipettenspitzen (vorzugsweise mit Wattestopfen) verwendet werden. Alle Reagenzien sollten ca. 30 Minuten vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur (20 - 25C) gebracht und unmittelbar nach dem Gebrauch wieder in den Khlschrank gelegt werden. Die aufgetauten Reagenzien vor dem ffnen der Gefe kurz auf dem Vortex-Mixer mischen. Schlieen Sie die Flschchen unmittelbar nach Gebrauch. Vernderungen im Aussehen der im Kit enthaltenen Reagenzien knnen auf eine Instabilitt oder Verschlechterung der Qualitt der Substanzen hinweisen. Um ein Einrollen der Teststreifen vor dem Gebrauch zu verhindern, wird empfohlen, das Rhrchen horizontal zu lagern.
INNOGENETICS Gelieferte Reagenzien:

Komponente AMP-Reagenzien: uerer Primer Mix Nested Primer Mix LiPA-Reagenzien: Teststreifen 1 x 20 1 x 0,08 ml 58322 Enthlt biotinylierte Primer und 0,05% NaN3 als Konservierungsmittel. 1 x 0,08 ml 58324 Enthlt biotinylierte Primer und 0,05% NaN3 als Konservierungsmittel. Menge Ref. Beschreibung
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58321 Enthlt 1 Plastikrhrchen mit INNO-LiPA HBV GenotypingTeststreifen, markiert mit einer roten Markierungslinie. 56718 Alkalische Lsung mit EDTA. ACHTUNG: Das Flschchen mit der Denaturierungslsung muss direkt nach dem Gebrauch wieder verschlossen werden; lngerer Kontakt mit Luft verschlechtert innerhalb kurzer Zeit die Qualitt der Lsung. 57420 Enthlt SSC-Puffer mit Detergentien und Konservierungsmitteln. Die Hybridisierungslsung muss auf mindestens 37C erwrmt werden, darf aber 49C nicht bersteigen (alle Kristalle mssen sich vor dem Gebrauch aufgelst haben).
Denaturierungslsung 1 x 1 ml
Hybridisierungslsung 1 x 80 ml
Stringent- Waschlsung 1 x 200 ml 57421 Enthlt SSC-Puffer mit Detergentien und Konservierungsmitteln. Die Stringent-Waschlsung muss auf mindestens 37C erwrmt werden, darf aber 49C nicht bersteigen (alle Kristalle mssen sich vor dem Gebrauch aufgelst haben). 100x konzentriertes Konjugat 1 x 0,8 ml 56952 Mit alkalischer Phosphatase markiertes Streptavidin in TrisPuffer mit Proteinstabilisatoren und 0,01% MIT/0,098% CAA als Konservierungsmittel, muss vor dem Gebrauch im Verhltnis 1:100 mit Konjugatverdnner verdnnt werden. 2 ml Konjugat-Arbeitslsung fr jede Testwanne vorbereiten + 2 ml berschuss. Fr den Auto-LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her. Die Konjugat-Arbeitslsung bleibt bei Raumtemperatur (20 - 25C) fr 24 Stunden stabil, wenn sie im Dunkeln gelagert wird. 1 x 80 ml 56951 Phosphatpuffer mit NaCl, Triton, Proteinstabilisatoren und 0,01% MIT/0,1% CAA als Konservierungsmittel.
Konjugatverdnner 100x konzentriertes BCIP/NBT-Substrat
1 x 0,8 ml 56954 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat und 4-NitroblauTetrazolium in Dimethylformamid, muss vor Gebrauch im Verhltnis 1:100 in Substratpuffer verdnnt werden. 2 ml Substrat-Arbeitslsung fr jede Testwanne vorbereiten + 2 ml berschuss. Fr den Auto-LiPA stellen Sie bitte 10 ml berschuss her. Die Substratarbeitslsung bleibt bei Raumtemperatur (20 - 25C) fr 24 Stunden stabil, wenn sie im Dunkeln gelagert wird. 1 x 180 ml 56953 Tris-Puffer mit NaCl, MgCl2 und 0,01% MIT/0,1% CAA als Konservierungsmittel. 1 x 80 ml 56721 Phosphatpuffer mit NaCl, Triton, und 0,01% MIT/0,1% CAA als Konservierungsmittel, vor Gebrauch mit destilliertem oder deionisiertem Wasser 1/5 (1 Teil + 4 Teile) verdnnen. 8 ml Splarbeitslsung fr jede Testwanne vorbereiten + 10 ml
Substratpuffer 5x konzentrierte Spllsung
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berschuss. Bei Gebrauch des Auto-LiPA 12 ml WaschArbeitslsung pro Inkubationswanne vorbereiten und zustzlich 20 ml berschu. Die Splarbeitslsung bleibt bei einer Temperatur von 2 - 8C fr 2 Wochen stabil.
Schalen fr Inkubationswannen Ableseschablone Auswertungstabelle Datenblatt
3 1 1 2
Enthlt jeweils 8 Wannen. Fr die Identifizierung positiver Sonden. Fr die Auswertung der Ergebnisse. Fr die Aufbewahrung entwickelter Teststreifen.
Zustzliche bentigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind Einweghandschuhe. Sterile Einwegpipettenspitzen (vorzugsweise mit Wattestopfen). Sterile Mikrogefe. Mikrogefstnder. Mikrogefzentrifuge. Pipetten, einstellbar auf 1 - 20 l, 20 - 200 l und 200 - 1000 l. Autoklaviertes destilliertes Wasser.
Speziell fr die Amplifikation Fr die Amplifikation wird die Verwendung von Taq DNA Polymerase und Taq Amplifikationspuffer empfohlen (von Stratagene). DNA-Thermocycler und Ausrstung. dNTP's (25 mM). 10x Taq Puffer (enthlt 100 mM Tris-HCl pH 8.8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0.01% (w/v) Gelatine und Stabilisatoren, Stratagene). Taq DNA Polymerase (Taq DNA Polymerase, Stratagene).
Speziell fr LiPA Absaugvorrichtung. Kalibriertes Thermometer. Pinzette. Messzylinder (10, 25, 50 und 100 ml). Laborwecker (2 Stunden 1 Minute). Vortex-Mixer oder gleichwertiges Instrument. Wasserbad mit Schttelvorrichtung (80 U/min mit geneigtem Deckel, Temperatur einstellbar auf mind. 49C 0.5C). Orbitalschwenker (160 U/m) oder Schttler (50 U/m).
Optionales Material: Dispensier-Multipipette (Multipipette, Eppendorf oder hnliches). Ausrstung zur Automatisierung der Teststreifenbearbeitung. Fr weitere Informationen kontaktieren Sie Ihren Vertriebshndler.
INNOGENETICS Sicherheits- und Umwelthinweise -
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Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenbltter des Herstellers und die Produktkennzeichnung bezglich potenziell gefhrlicher Substanzen. Die neueste Version dieser Sicherheitsdatenbltter des Herstellers finden Sie unter www.innogenetics.com.
R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Giftig! Gesundheitsschdlich beim Einatmen und bei der Berhrung mit der Haut. Reizt die Augen. Kann das Kind im Mutterleib schdigen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn mglich dieses Etikett vorzeigen). Exposition vermeiden - vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Verwendung nur durch ausgebildetes Personal. Enthlt Dimethylformamid, 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat-pToluidinsalz: 100x konzentriertes BCIP/NBT-Substrat.
R43, S24-37 Reizend! Sensibilisierung durch Hautkontakt mglich. Berhrung mit der Haut vermeiden. Geeignete Schutzhandschuhe tragen. Enthlt 2-Chloracetamid: Stringent-Waschlsung, Hybridisierungslsung, Spllsung, Substratpuffer und Konjugatverdnner.
R34, S28-36/37/39-45 tzend! (C) Verursacht Verbrennungen. Nach Kontakt mit der Haut umgehend mit reichlich Wasser und Seife waschen. Geeignete Schutzkleidung, -handschuhe und brillen/Gesichtsschutz tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn mglich dieses Etikett vorzeigen). Enthlt Natriumhydroxid: Denaturierungslsung. Alle Proben sollten als potentiell infektis angesehen und dementsprechend behandelt werden. Daher sollten alle Blutbestandteile und biologischen Materialien als potentiell infektis angesehen und dementsprechend behandelt werden. Der Test darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal durchgefhrt werden. Alle Blutbestandteile und das biologische Material mssen in bereinstimmung mit den entsprechenden Sicherheitsbestimmungen entsorgt werden. Mindestens 15 Minuten bei 121C autoklavieren. Einwegmaterial verbrennen. Flssigen Abfall mit Natriumhypochlorid zu einer Endkonzentration von 1% Natriumchlorit mischen. Vor der Entsorgung ber Nacht stehen lassen. VORSICHT: Surehaltigen Flssigabfall vor Zugabe von Natriumhypochlorid neutralisieren. Bei der Arbeit mit potentiell gefhrlichen oder infektisen Materialien: geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Abflle mssen entsprechend den Abfallbeseitigungsvorschriften der jeweiligen Einrichtung entsorgt werden. Darber hinaus mssen alle staatlichen und rtlichen Umweltbestimmungen eingehalten werden.
Proben (Sammeln und Handhabung) Verwenden Sie extrahierte DNA von HBV-positiven Proben, die frisch isoliert wurden oder bei oder unter -20C eingefroren waren (vorzugsweise noch nie aufgetaut). Es kann amplifiziertes Material der HBV-Pol Gendomne B bis C generiert werden. Verwenden Sie 10 l des HBV-Amplifikats fr den LiPA-Prozess. Hinweise und Vorsichtsmanahmen Darf nur von Fachpersonal verwendet werden. Alle Pipettenspitzen und Rhrchen, die fr die Amplifikation verwendet werden, mssen autoklaviert werden. Es werden Pipettenspitzen mit Wattestopfen empfohlen. Verwenden Sie nur Einweg-Labormaterialien. Verwenden Sie fr jede Probe eine neue Pipettenspitze. Keine Reagenzien unterschiedlicher Kits mischen, es sei denn, die Bestandteile weisen dieselbe Chargennummer auf. Um eine PCR-Kontaminierung zu vermeiden, die physische Distanz zwischen den Pr- und Post-Amplifizierungsschritten maximieren. Keine Proben, Ausrstungen oder Reagenzien in den Arbeitsbereich zurckbringen, in dem Sie den vorangegangenen Arbeitsschritt durchgefhrt haben. Falls Sie zum vorherigen Arbeitsbereich zurckkehren mssen, zuerst die entsprechenden Anti-Kontaminierungsschritte durchfhren. Teststreifen nur mit Pinzetten bewegen. Teststreifen nicht mit den Hnden berhren, da ansonsten l von Ihren Hnden die Hybridisierung und die Farbentwicklung beeintrchtigen knnte. Zur Beschriftung der Streifen nur einen Bleistift verwenden. Die Testreagenzien knnten Tinte von den Streifen entfernen. Fr genaue Ergebnisse ein Wasserbad fr die Hybridisierung und Waschschritte verwenden und messen, dass die Temperatur bei 49C 0.5C liegt. Verwenden Sie keinen Heiluftinkubator. Verwenden Sie ein kalibriertes Thermometer, da eine genaue Temperaturkontrolle unerlsslich ist. Benutzen Sie immer den Deckel des Wasserbades, um die Temperatur beizubehalten. Ist die Temperatur zu niedrig, kann der Test zu falschen positiven Ergebnissen fhren; ist die Temperatur zu hoch, knnen Sie sehr schwache Signale oder falsche negative Ergebnisse beobachten. Verwenden Sie ein Wasserbad mit Schttelvorrichtung und geneigtem Deckel fr eine optimale Temperaturkontrolle. Die whrend der Hybridisierung und des Waschvorgangs mit Stringent-Waschlsung durch das Wasserschttelbad und durch den Orbitalschttler oder Schttler verursachte Bewegung whrend der Farbentwicklung ist kritisch. Passen Sie die Geschwindigkeit dieser Instrumente vorsichtig an, um die Bewegung der Reagenzien ber die Teststreifen zu maximieren, ohne dass die Lsungen von einer Wanne in die nchste spritzen. Achten Sie darauf, dass kein Wasser vom Wasserbad in die Wanne spritzt. Passen Sie den Wasserstand im Wasserbad an, so dass er bei einem Drittel bis
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der Hlfte der Wannenhhe liegt. Verhindern Sie, dass die Schale wegrutscht, indem Sie diese mit Gewichten fixieren. Die Streifen drfen zwischen den zwei Schritten nicht antrocknen. Belassen Sie jeden Streifen whrend des Verfahrens in derselben Wanne. Saugen Sie mittels einer Pipette, die an einen Vakuumpumpe angeschlossen sein kann, Flssigkeit aus einer Wanne.
Testverfahren fr die Amplifikation DNA-Extraktion: High Pure PCR Template preparation Kit (von Roche Diagnostics). Siehe Protokoll des erwhnten Kit. Es knnen auch andere DNA-Extraktionsverfahren angewendet werden. Amplifikationsprotokoll Die folgenden Protokolle (uere und nested Amplifikation) wurden fr eine optimale Amplifikation entworfen, unter Verwendung von: Taq Polymerase (5U/l, Stratagene), 10x Taq Puffer (enthlt 100 mM Tris-HCl pH 8,8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0.01% Gelatine und Stabilisatoren, Stratagene) MicroAmp PCR-Rhrchen (0.2 ml dnnwandige Rhrchen) und PE-2400 oder PE-9600 (Perkin Elmer Cetus) Thermocycler. Dieses Protokoll kann fr die meisten handelsblichen Thermocycler verwendet werden, kann aber ggf. Modifikationen erfordern, die vom Hersteller der Cycler aufgefhrt werden. Fhren Sie die erforderlichen Schritte durch, um unspezifische Amplifikation zu vermeiden, welche die Ergebnisse beeintrchtigen knnte. tauen Sie die unten aufgefhrten Komponenten auf und legen Sie diese auf Eis fhren Sie alle Pipettierschritte auf Eis und ohne Verzgerung aus. uere-PCR-Amplifikation 1. 2. 3. Die Anzahl der vorzubereitenden Rhrchen (N) bestimmen: N = Anzahl der Proben + 1 Negativkontrolle + 1 Positivkontrolle + 1. Bereiten Sie mittels Pipettenspitzen mit Wattestopfen den Mastermix in autoklavierten, Nuklease-freien Mikozentrifugenrhrchen vor. Bereiten Sie den Mastermix 1 vor, der enthlt: (N x 32.4 l) autoklaviertes destilliertes Wasser + (N x 5,0 l) 10x Taq Amplification-Puffer (Stratagene) + (N x 0.4 l) dNTP Mix (25 mM) + (N x 2.0 l) uerer Primer Mix + (N x 0,2 l) Taq DNA Polymerase 5U/l (Stratagene) Kurz auf dem Vortex-Mixer mischen und 40 l des Master Mix 1 in (N-1) autoklavierten Amplifikationsrhrchen aliquotieren. 10 l der gereinigten DNA oder 10 l destilliertes Wasser (keine DNA auf die Negativkontrolle) pipettieren. BEMERKUNG: Kurz mischen und den Mix zentrifugieren, um die Flssigkeit am Boden des Rhrchens zu sammeln.
4.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Die Proben in den kalibrierten Thermoblock stellen (siehe Anleitung des Herstellers des Thermocyclers). Amplifikationsprogramm fr die INNO-LiPA HBV Genotypinguere Amplifikation starten. Profil einer INNO-LiPA HBV Genotyping Outer Amplifikation fr einen PE-2400 oder PE-9600 Thermocycler:
Schritt 1 2 3 4 5 6 Denaturierung Temp 94C Zeit 4 Min 30 Sek. 30 Sek. 30 Sek. 10 Min Zyklus wiederholen Schritte 2 - 4, 40 x
Denaturierung 94C Annealing der Primer 45C Primer erweitern 72C Verlngern Auf 4C abkhlen 72C
6.
Nach diesem Prozess die Proben umgehend fr die nested-PCR-Amplifikation verwenden oder bei -15/-25C lagern. HINWEIS: Die amplifizierten DNA-Produkte nicht zusammen mit Amplifikationsreagenzien oder extrahierter DNA lagern.
Nested-PCR-Amplifikation 1. Die Anzahl der vorzubereitenden Rhrchen (N) bestimmen: N = Anzahl der outer-PCR-amplifizierten Proben + Outer-PCR-amplifizierten Negativkontrollen + 1 Negativkontrolle + 1 Positivkontrolle + 1. Bereiten Sie den Mastermix 2 mittels einer Pipettenspitze mit Wattestopfen in einem autoklavierten Rhrchen vor: (N x 40.4l) autoklaviertes destilliertes Wasser + (N x 0,4 l) dNTP Mix (25 mM) + (N x 5,0 l) 10x Taq Amplification-Puffer (Stratagene) + (N x 2,0 l) Nested Primer Mix + (N x 0,2 l) Taq DNA Polymerase 5 U/l (Stratagene) Kurz auf dem Vortex-Mixer mischen und 48 l dieses Mastermixes in (N-1) autoklavierte Amplifikationsrhrchen aliquotieren. 2 l des ueren-PCR-amplifizierten Produkts oder 2 l destilliertes Wasser (keine DNA auf die Negativkontrolle) pipettieren. BEMERKUNG: Kurz mischen und den Mix zentrifugieren, um die Flssigkeit am Boden des Rhrchens zu sammeln. Die Proben in den kalibrierten Thermoblock stellen (siehe Anleitung des Herstellers des Thermocyclers). Amplifikationsprogramm fr die INNO-LiPA HBV Genotyping Nested Amplifikation starten.
2.
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Profil einer INNO-LiPA HBV Genotyping Nested-PCR-Amplifikation fr einen PE-2400 oder PE-9600 Thermocycler:
Schritt 1 2 3 4 6 7 Denaturierung Denaturierung Annealing der Primer Primer erweitern Verlngern Auf 4C abkhlen Temp 94C 94C 45C 72C 72C Zeit 4 Min 30 Sek. 30 Sek. 30 Sek. 10 Min Zyklus wiederholen Schritte 2 - 4, 35 x
4.
Nach diesem Prozess 5 l des ueren PCR- und nested-PCRAmplifikationsproduktes auf 2%igem Agarosegel analysieren oder bei -15/-25C lagern. Aufgrund interner Beobachtungen wird empfohlen, dass, wenn das uere PCR-amplifizierte Produkt ein Band von 409 bp zeigt, der LiPA-Test ein auswertbares Ergebnis erbringen sollte. Ist fr das outer-PCR-amplifizierte Produkt kein Band sichtbar, dann das nested-PCR-amplifizierte Produkt mit dem INNO-LiPA HBV Genotyping verwenden. HINWEIS: Die amplifizierten DNA-Produkte nicht zusammen mit Amplifikationsreagenzien oder extrahierter DNA lagern.
Ergebnisse der Amplifikation Visualisierung Das Vorhandensein von amplifiziertem Produkt kann z. B. mit Hilfe eines 2%igen Agarosegels geprft werden. Fllen Sie 5 l des amplifizierten Produktes pro Gelspur ein. Das nested-Amplikon muss als Band mit einer Lnge von 342 bp erscheinen. Das uere Amplikon muss als Band mit einer Lnge von 409 bp erscheinen.
Qualittskontrolle
Fgen Sie mindestens eine Leerprobe fr die Extraktion ein. Bei jeder Amplifikation mindestens eine Negativ- und eine Positivkontrolle hinzufgen. Wie bei jedem neuen Laborverfahren ist das Hinzufgen einer zustzlichen Positiv- und Negativkontrolle ratsam, bis eine hohe Zuverlssigkeit bei der Durchfhrung des Testverfahrens gewhrleistet ist. Ist das Hinzufgen einer zustzlichen Positivkontrolle wnschenswert, verwenden Sie bitte eine bekannte positive Probe. Erhlt man im Gel in der Spur der Negativkontrolle ein positives Signal, muss der gesamte Testlauf abgebrochen und die gesamte Prozedur wiederholt werden.
45 Testverfahren fr LiPA Denaturierung der Proben
VORSICHT: Unter Verwendung eines kalibrierten Thermometers sicherstellen, dass die Temperatur des Wasserbads mit Schttelvorrichtung bei 49C 0.5C liegt, und die Temperatur, wenn erforderlich, vor dem Einlegen der Schale anpassen. 1. 2. 3. Das Schttelwasserbad auf 49C 0.5C einstellen. Legen Sie die Hybridisierungslsung und die Stringet-Waschlsung in ein Wasserbad von 37 - 49C, um alle Kristalle zu lsen. Sicherstellen, dass die Temperatur des Wasserbads nicht 49C bersteigt. Die Flasche vor dem Gebrauch schtteln. Entnehmen Sie mit einer Pinzette einen Teststreifen fr jede Probe. Schreiben Sie mit einem Bleistift eine Identifikationsnummer ber die rote Markierungslinie jedes Teststreifens. Fgen Sie immer einen Teststreifen fr die Negativkontrolle bei (amplifiziertes Produkt einer HBV-Negativprobe). HINWEIS: Legen Sie den Teststreifen erst bei Schritt 2 der Hybridisierung der Proben in die Wanne. Legen Sie eine Wanne fr jede Probe/jeden Streifen in die Schale. Fllen Sie mit einer Pipette 10 l Denaturierungslsung in die obere Ecke jeder Wanne. HINWEIS: Schlieen Sie nach jedem Gebrauch umgehend die Flasche mit der Denaturierungslsung. Ein lngerer Kontakt mit der Luft verursacht eine qualitative Verschlechterung der Lsung. Fgen Sie 10 l Probe oder Negativkontrolle zur Denaturierungslsung in jeder Wanne hinzu. Zum Mischen vorsichtig auf- und abpipettieren. Denaturieren Sie fr 5 Minuten bei Raumtemperatur.
4. 5.
6. 7.
Hybridisierung der Proben 1. 2. Vorsichtig 2 ml Hybridisierungslsung in jede Wanne fllen und dabei darauf achten, die anderen Wannen nicht zu kontaminieren. Vorsichtig die Wannen schtteln, um die Reagenzien zu mischen. Umgehend einen Teststreifen mit der Markierungslinie nach oben in die Wanne legen. HINWEIS: Beim Umgang mit den Teststreifen Einweghandschuhe tragen und Pinzette benutzen. Sicherstellen, dass der Teststreifen vllig in der Lsung eingetaucht ist. Die Wannen nicht mit Abklebefolien fr Mikrotiterplatten versehen, damit keine Kreuzkontamination entsteht. Die Schale in ein Schttelwasserbad von 49C 0.5C legen und die Schale zwischen zwei schweren Gewichten fixieren. Das Wasserbad auf ca. 80 U/m stellen, den Deckel schlieen und die Schale fr 60 Minuten inkubieren. Sicherstellen, dass jeder Teststreifen immer mit Flssigkeit bedeckt ist und frei schwimmt. Nach Ende der Hybridisierungsinkubation die Wanne aus dem Wasserbad nehmen.
3. 4.
5.
INNOGENETICS Waschen der Teststreifen
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VORSICHT: Neigen Sie die Schale leicht, damit die Flssigkeit sich an einem Ende der Wanne, ber der Markierungslinie des Teststreifens sammelt, um leichter aufgesaugt zu werden. Nicht die Membran des Teststreifens beschdigen. Vermeiden Sie Spritzen oder bertragen der Lsungen zwischen den Wannen. 1. 2. Die Flssigkeit wird mittels einer Pipette aus der Wanne entnommen, vorzugsweise sollte die Pipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen sein. 2 ml Stringent-Waschlsung in jede Wanne fllen und den Teststreifen durch Rtteln der Schale 1 Minute bei 20 - 25C splen. Saugen Sie die Lsung aus jeder Wanne. HINWEIS: Eine Multipipette ist ntzlich fr das Dispensieren der Stringent-Waschlsung. Das Waschen wiederholen, indem Sie 2 ml Stringent-Waschlsung in jede Wanne fllen und den Teststreifen durch Rtteln der Schale 1 Minute bei 20 - 25C splen. Saugen Sie die Lsung aus jeder Wanne. 2 ml Stringent-Waschlsung in jede Wanne fllen, die Schale in ein 49C 0.5C warmes Schttelwasserbad legen und die Schale mit zwei schweren Gewichten fixieren. Das Wasserbad auf ca. 80 U/m stellen, den Deckel schlieen und die Schale fr 30 1 Minuten inkubieren. Die Splarbeitslsung und die Konjugat-Arbeitslsung vorbereiten (Siehe Reagenzien).
3. 4.
5.
Entwicklung der Farbe VORSICHT: Neigen Sie die Schale leicht, damit die Flssigkeit sich an einem Ende der Wanne, ber der Markierungslinie des Teststreifens sammelt, um leichter aufgesaugt zu werden. Nicht die Membran des Teststreifens beschdigen. Vermeiden Sie Spritzen oder bertragen der Lsungen zwischen den Wannen. 1. Die Lsung mittels einer Pipette aus der Wanne entfernen. 2. 2 ml Splarbeitslsung in jede Wanne fllen und den Teststreifen durch Rtteln der Schale 1 Minute bei Raumtemperatur waschen. Die Lsung aus jeder Wanne absaugen. Diesen Schritt einmal wiederholen. 3. 2 ml Konjugat-Arbeitslsung in jede Wanne fllen, die Schale in einen Schttler (Orbital bei 160 U/m oder Schttler bei 50 U/m) bei 20 - 25C stellen und fr 30 1 Minuten inkubieren. HINWEIS: 10 Min. vor Ende der Konjugat-Inkubation die Substratarbeitslsung vorbereiten (siehe Reagenzien). 4. Nach Ende der Inkubation die Schale aus dem Schttler nehmen und mit einer Pipette die Lsung aus jeder Wanne entfernen. 5. 2 ml Splarbeitslsung in jede Wanne fllen und den Teststreifen durch Rtteln der Schale 1 Minute bei 20 - 25C waschen. Saugen Sie die Lsung aus jeder Wanne. Diesen Schritt einmal wiederholen. 6. 2 ml Substratpuffer in jede Wanne fllen und den Teststreifen durch Rtteln der Schale 1 Minute bei 20 - 25C waschen. Saugen Sie die Lsung aus jeder Wanne. 7. 2 ml Substratarbeitslsung in jede Wanne fllen, auf einen Schttler bei 20 - 25C stellen und fr 30 1 Minute inkubieren. 8. Nach Ende der Inkubation die Farbentwicklung durch Waschen der Teststreifen stoppen. Die Schale aus dem Schttler entfernen, die Lsung aus jeder Wanne
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entfernen und dann 2 ml destilliertes Wasser in jede Wanne fllen und die Schale fr mindestens 3 Minuten auf den Schttler stellen. Diesen Schritt einmal wiederholen. 9. Jeden Teststreifen mit einer Pinzette aus seiner Wanne entfernen und mit der Markierungslinie nach oben auf absorbierendes Papier legen. 10. Die Teststreifen vollstndig trocknen lassen, bevor Sie die Resultate ablesen. Die entwickelten und trockenen Teststreifen im Dunkeln lagern. Automatisches Testverfahren: Auto-LiPA und Auto-LiPA 48 Daher wurden der Auto-LiPA und Auto-LiPA 48 entwickelt, um die Schritte Hybridisierung, Waschvorgang mit Stringent-Waschlsung und Farbentwicklung vollstndig automatisiert durchzufhren. Auto-LiPA und Auto-LiPA 48 knnen ohne berwachung arbeiten; Heizen, Khlen, Absaugung und Pipettieren werden automatisch durchgefhrt. Weitere Informationen und spezifische Protokolle fr den Auto-LiPA und den Auto-LiPA 48 erhalten Sie von Ihrem lokalen Vertreter. Ergebnisse fr LiPA Ablesen Abbildung 1 zeigt die Position der verschiedenen Oligonukleotidsonden auf den INNO-LiPA HBV Genotyping-Teststreifen. Eine Linie gilt als positiv, wenn ein klares violett-braunes Band am Ende des Testverfahrens zu erkennen ist. Abbildung 1 (siehe Seite 19): Position der rot gefrbten Markierungslinie, der Konjugatkontrolllinie (conj. Control), der Amplifikationskontrolllinie (Amp. Control) und der 14 Sondenlinien auf dem INNO-LiPA HBV Genotyping-Teststreifen. Qualittskontrolle Die oberste rote Linie ist die Markierungslinie. Diese Linie ermglicht die korrekte Ausrichtung des Teststreifens. Die erste positive Linie muss an der "Conjugate Control line auf der Ableseschablone ausgerichtet werden. Diese Linie kontrolliert die Zugabe von reaktivem Konjugat und von Substratlsung whrend des Nachweisverfahrens. Sie sollte immer positiv sein und sollte bei demselben Testlauf auf jedem Streifen nahezu dieselbe Intensitt aufweisen. Die zweite positive Linie ("Amp. control" auf der Ableseschablone) kontrolliert die Zugabe von amplifiziertem Material fr die Hybridisierung. Ist HBV in der Probe vorhanden und hat eine korrekte Probenbearbeitung und Amplifikation stattgefunden, dann hybridisiert das Zielamplikon auf diese Amp control line. Der Negativkontrollstreifen muss leer sein, auer fr die Konjugatkontrolllinie. Dies belegt, dass whrend der Testausfhrung keine Kontamination stattgefunden hat.
Interpretation der Ergebnisse Benutzen Sie IMMER die Auswertungstabelle fr eine korrekte Auswertung des HBVGenotyps.
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HINWEIS: Isolate aus verschiedenen Genotypen knnen mit derselben Sondenlinie ber Kreuz reagieren. Bitte prfen Sie sorgfltig anhand der Auswertungstabelle, welche Sondenlinienmuster zu jedem einzelnen Genotyp gehren. BEMERKUNG (Muster, die nicht in der Auswertungstabelle stehen): Auswertungen Mischinfektionen: Das Vorhandensein von Mischinfektionen mit verschiedenen Genotypen bei chronischer HBV-Erkrankung wurde belegt. Werden multiple Infektionen mit dem INNO-LiPA HBV Genotyping nachgewiesen, mssen die Ergebnisse wie folgt ausgewertet werden: Wenn multiple genotypspezifische Linien unterschiedliche Genotypen anzeigen, muss ein gemischter Genotyp gemeldet werden. Beispiel: positive Linien 6 - 7 zusammen mit positiven Linien 8 - 9 werden als eine B/C-koinfizierte Probe gemeldet. In einem Groteil der Flle wurde fr den HBV-Genotyp G belegt, dass dieser Genotyp koinfiziert ist mit HBV-Genotyp A. Beispiel: ein Reaktionsmuster, bei dem die dem Genotyp G spezifische Linie 16 vorhanden ist zusammen mit mindestens 2 positiven Genotyp A-Linien, muss als eine A/G-koinfizierte Probe gemeldet werden. Wenn multiple genotypspezifische Linien fr einen Genotyp entstehen zusammen mit einer einzelnen positiven Linie fr den zweiten Genotyp, dann sollte dies als ein einziger Genotyp gemeldet werden. Der gemeldete Genotyp sollte derjenige mit den multiplen positiven Linien sein. Bitte beachten Sie, dass eine einzelne Linie 16 als Nachweis des Genotyps G zu betrachten ist. Unbestimmte Ergebnisse: Unbestimmte Ergebnisse (IND) sollten bei folgenden Fllen gemeldet werden: Einzelne reaktive Linien fr mehr als einen Genotyp zusammen mit einer positiven Amplifikationskontrolllinie (Linie 2). Bitte beachten Sie, dass eine einzelne Linie 11 und eine einzelne Linie 15 als Genotyp H zu interpretieren sind. Das Fehlen positiver genotypspezifischer Linien zusammen mit einer positiven Amplifikationskontrolllinie (Linie 2). Alle Linien positiv.
Fr eine Untersttzung bei der Auswertung kontaktieren Sie bitte Ihren Vertriebshndler. Grenzen der Methode Dieses Kit sollte nur von Personal verwendet werden, das mit den Techniken der Extraktion und Amplifikation von HBV-Nukleinsure vertraut ist. Gute Laborpraxis und eine sorgfltige Durchfhrung von zuvor festgelegten Verfahrensschritten sorgen fr eine spezifische Amplifikation. Aufgrund der manchmal sehr hohen Belastung der HBV-infizierten Proben muss grte Vorsicht gewahrt werden, um eine Kontaminierung zu vermeiden. Ein Polymerasehemmer (z. B. Heparin Hmoglobin) kann die Ursache fr das vllige Versagen des Tests sein. Puder von Einweghandschuhen und Natriumhypochlorid wirken sich ebenfalls hemmend auf die Amplifikation aus.
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INNO-LiPA HBV Genotyping HBV-Infektionen mit gemischten viralen Genotypen knnen auftreten. Die Primer amplifizieren alle Genotypen gleichzeitig. In einer Probe mit Mischinfektion und niedriger viraler Belastung kann es mglich sein, dass wegen einer PCRKonkurrenz nicht alle Genotypen nachgewiesen werden. Dieser Test basiert auf der Sequenzvielfalt in den HBV Polymerase-Gendomnen B und C, was eine Differenzierung zwischen den HBV Genotypen A bis H gestattet. Aufgrund von Sequenzheterogenitt der HBV-Genome kann es gelegentlich zu unbestimmten Mustern oder falsch reagierenden Sondenlinien kommen. Ergebnisse, die eine schwache Reaktion auf allen Linien zeigen, werden gelegentlich beobachtet und fhren zu einem unbestimmten Ergebnis. Proben, die dieses Muster zeigen, sollten erneut amplifiziert oder neu extrahiert werden.
Leistungsfhigkeit des Tests Die Leistungsfhigkeit des INNO-LiPA HBV Genotyping-Tests wurde an einem franzsischen und einem niederlndischen Zentrum an HBV-positiven klinischen Proben von jeweils 100 und 273 HBV-infizierten Probanden evaluiert. Darber hinaus wurden 54 HBV-positive Proben, die als Genotyp C, F, G oder H klassifiziert waren, durch Sequenzierung bei Innogenetics getestet. Sensitivitt Positive Testergebisse, die durch eine positive Amplifikationskontrolllinie angezeigt wurden, wurden in 415 der 427 Proben nach anfnglicher Amplifikation erzielt, was einer anfnglichen Sensitivitt von 97,2% entspricht. Eine erneute Amplifikation von 10 der 12 Proben wurde durchgefhrt und waren fr alle 10 Proben erfolgreich, was einer Sensitivitt von 100% (425/425) nach Testwiederholung entspricht. Genauigkeit Unter den 425 Proben, die mit INNO-LiPA HBV Genotyping getestet wurden, ergaben sich fr 8 Proben (1,9%) ein unbestimmtes Ergebnis. Fr 415 Proben wurde ein Genotyp-Ergebnis erzielt, sowohl mit LiPA als auch mit Sequenzierung. Fr 92% (382/415) der Proben konnte durch LiPA derselbe Genotyp nachgewiesen werden wie durch Sequenzierung. Fr 19 Proben (4,6%) konnte mit LiPA eine Koinfektion nachgewiesen werden, whrend die Sequenzierung lediglich einen der Genotypen nachwies. Mit jeder Methode wurde fr 14 Proben (3,4%) ein unterschiedlicher Genotyp nachgewiesen. Die folgende Tabelle bietet einen berblick der Ergebnisse.
INNOGENETICS
Genotyp LiPA A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Gesamt Sequenzierung A B C 126 29 1 1 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 D 6 E 1 F G H IND 1
50
Gesamt 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
Neun Proben mit unterschiedlichen Ergebnissen in der Sequenzierung und 10 Proben mit einem gemischten Genotyp-Ergebnis wurden anschlieend mit anderen Techniken untersucht. Die LiPA-Ergebnisse wurden fr 15 dieser 19 Proben besttigt, whrend sich fr 2 Proben die LiPA-Ergebnisse, zumindest teilweise, als falsch erwiesen. Fr die anderen 2 Proben mit einem gemischten Genotyp-Ergebnis bei LiPA besttigte sich nur einer der Genotypen bei zustzlichen Tests. Fasst man alle Testergebnisse zusammen so wurde das LiPA-Genotyp-Ergebnis in 99% (397/401) aller Flle besttigt. Przision Es wurde ein Panel von 9 Plasmidproben durch drei verschiedene Prfer in dreifacher Ausfhrung mit zwei Chargen der INNO-LiPA HBV Genotyping-Teststreifen durchgefhrt. Es wurde auf Genotypebene eine Konkordanz von 100% (162/162) erreicht. Zustzlich wurde ein sechsteiliges Panel an verdnnten Proben zwischen 10.000 und 375 Kopien/ml und bezogen von einer klinischen Probe mit Genotyp A achtmal getestet. Jede Probe wurde extrahiert, mit ueren und nested-Primern amplifiziert und mit einer Charge von INNO-LiPA HBV Genotyping-Teststreifen an zwei unterschiedlichen Tagen von zwei verschiedenen Prfern an zwei verschiedenen Orten getestet. Es wurde auf Genotypebene eine Konkordanz von 100% (48/48) erreicht. Acht Proben (Genotypen A bis H) wurden extrahiert und mit Amplifikationsreagenzien amplifiziert. Amplifikationsprodukte wurden zweifach mit INNO-LiPA HBV GenotypingTeststreifen unter Verwendung von 3 Chargen des LiPA-Kits getestet. Es wurde auf Genotypebene eine Konkordanz von 100% (48/48) erreicht. Italiano Uso previsto INNO-LiPA HBV Genotyping un test su striscia a sonde allineate progettato per identificare i genotipi da A a H del virus dell'epatite B (HBV) tramite il rilevamento di sequenze tipo-specifiche nei domini B e C del gene della polimerasi dellHBV.
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Il test di genotipizzazione HBV (LiPA) non da utilizzarsi come test di screening per l'HBV o come test diagnostico per confermare la presenza dell'HBV. Principio del test Il virus dell'epatite B (HBV) un virus parzialmente a doppio filamento di DNA che si replica tramite un intermedio a RNA. Il primo passo consiste nell'isolare il DNA virale dal campione. Il DNA purificato viene quindi amplificato con due cicli di PCR usando primer biotinilati. I primer esterni (primo ciclo di PCR) usati in questo test amplificano una parte (dominio B e C) del gene della polimerasi dellHBV. Tramite riscaldamento, i due filamenti dell'elica di DNA vengono separati (denaturazione) per esporre le sequenze target ai primer. Questi primer sono complementari a regioni ben definite a fianco della sequenza target. Quindi, al raffreddamento a una determinata temperatura, i primer si legano alla propria sequenza specifica (riassociazione a 45C). A una temperatura elevata e in presenza di dNTPs, la DNA polimerasi termostabile estende i primers legati alla sequenza target (estensione). Viene cos prodotta una copia esatta della sequenza target dopo un ciclo di denaturazione, riassociazione ed estensione. Il processo viene ripetuto per 40 cicli, producendo cos una sequenza target multiamplificata di 409 bp. Siccome la quantit di prodotto di amplificazione generalmente non sufficiente, necessaria una amplificazione nested (secondo ciclo). Il principio di questa amplificazione identico a quello della prima con l'eccezione che al DNA sostituito il prodotto amplificato del primo ciclo di PCR, e che ai primer esterni si sostituiscono primer biotinilati interni. La procedura di denaturazione, riassociazione ed estensione viene ripetuta per 35 cicli, fino a ottenere una sequenza amplificata di 342 bp. Si consiglia di eseguire una corsa su gel per verificare quale prodotto di amplificazione, esterno o interno deve essere usato. Dopo l'amplificazione, il DNA biotinilato generato dalla open reading frame HBsAg viene ibridato con specifiche sonde oligonucleotidiche fissate come linee parallele sulla membrana della strip. Dopo l'ibridazione, il DNA non ibridato viene eliminato tramite lavaggio, viene aggiunta streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina che si lega a eventuale ibrido biotinilato formatosi in precedenza. L'incubazione con cromogeno BCIP/NBT ha come risultato un precipitato viola/bruno. La strip INNO-LiPA HBV Genotyping contiene una linea di identificazione rossa, 2 linee di controllo, e 14 sonde a DNA sequenza specifiche. La linea di controllo del coniugato serve da controllo per la reazione di sviluppo di colore e la linea di controllo di amplificazione contiene sonde HBV universali per verificare la presenza di materiale genetico amplificato di HBV.
INNOGENETICS Reagenti Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione raccomandate
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NOTA: I reagenti AMP e i reagenti LiPA devono essere conservati immediatamente dopo l'arrivo: i reagenti AMP nell'area di pre-amplificazione e i reagenti LiPA nell'area di post- amplificazione. Se conservati da 2 - 8C, aperti o non aperti, i reagenti sono stabili fino alla data di scadenza. Non usare i reagenti oltre la data di scadenza. Per evitare contaminazione, si consiglia di aliquotare i reagenti di amplificazione dopo il primo uso. I reagenti devono essere conservati isolati da qualsiasi fonte di DNA contaminante, specialmente prodotti amplificati. Si devono usare provette e puntali monouso (preferibilmente con filtro). Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (20 - 25C) circa 30 minuti prima dell'uso e devono essere rimessi nel frigorifero immediatamente dopo l'uso. Vortexare brevemente ed eseguire una breve centrifugata di tutti i reagenti prima di aprire le fiale. Chiudere le fiale immediatamente dopo l'uso. Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicare instabilit o deterioramento. Al fine di minimizzare la possibilit che gli strip si arriccino prima dell'uso, si raccomanda di conservare il tubo in senso orizzontale.
Reagenti in dotazione:
Componente Reagenti AMP: Miscela primer esterni 1 x 0.08 ml 58322 Contenente primer biotinilati e 0.05% NaN3 come conservante. Miscela primer interni 1 x 0.08 ml 58324 Contenente primer biotinilati e 0.05% NaN3 come conservante. Reagenti LiPA: Strip Soluzione di denaturazione 1 x 20 1 x 1 ml 58321 1 tubo di plastica contenente strip per INNO-LiPA HBV Genotyping segnate con una linea di identificazione rossa. 56718 Soluzione alcalina contenente EDTA. ATTENZIONE: La fiala contenente la soluzione di denaturazione deve essere chiusa immediatamente dopo l'uso; una esposizione prolungata di questa soluzione all'aria porta a un rapido deterioramento. 57420 Contiene tampone SSC con detergenti e conservanti. La soluzione di ibridazione deve essere pre-riscaldata a una temperatura di almeno 37C e non deve superare i 49C (tutti i cristalli devono essere disciolti prima dell'uso). Quantit Rif. Descrizione
Soluzione di ibridazione 1 x 80 ml
Soluzione lavaggio stringente
1 x 200 ml 57421 Contiene tampone SSC con detergenti e conservanti. La soluzione di lavaggio stringente deve essere pre-riscaldata a una temperatura di almeno 37C e non deve superare i 49C (tutti i cristalli devono essere disciolti prima dell'uso).
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Coniugato 100x

1 x 0.8 ml 56952 Streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina in tampone Tris contenente stabilizzatori delle proteine e 0,01% MIT/ 0,098% CAA come conservanti, da diluire 1/100 prima dell'uso in Diluente Coniugato. Preparare 2 ml di soluzione di lavoro di coniugato per ciascuna vaschetta + 2 ml in eccesso. Per Auto-LiPA, preparare 10 ml in eccesso. La soluzione di lavoro di coniugato stabile per 24 ore a temperatura ambiente (da 20 - 25C) se conservata al buio. 56951 Tampone fosfato contenente NaCl, Triton, stabilizzatori delle proteine e 0,01% MIT/0,1% CAA come conservante.
Diluente del coniugato 1 x 80 ml Substrato BCIP/NBT 100x
1 x 0.8 ml 56954 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato e 4-nitro-blu tetrazolio in dimetilformamide, da diluire 1/100 nel Tampone Substrato prima dell'uso. Preparare 2 ml di soluzione di lavoro di substrato per ciascuna vaschetta + 2 ml in eccesso. Per Auto-LiPA, preparare 10 ml in eccesso. La soluzione di lavoro di substrato stabile per 24 ore a temperatura ambiente (da 20 - 25C) se conservata al buio. 1 x 180 ml 56953 Tampone Tris contenente NaCl, MgCl2 e 0,01% MIT/ 0,1% CAA come conservante. 1 x 80 ml 56721 Tampone Fosfato contenente NaCl, Triton e 0,01% MIT/ 0,1% CAA come conservante, da diluire 1/5 (1 parte + 4 parti) in acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Preparare 8 ml di soluzione di lavoro di risciacquo per ciascuna vaschetta + 10 ml in eccesso. Per l'utilizzo su Auto-LiPA, preparare 12 ml di Rinse Solution diluita per ogni vaschetta utilizzata, pi 20 ml in eccesso. La soluzione di lavoro di risciacquo stabile per 2 settimane a temperatura compresa tra 2 - 8C. Ciascuna contenente 8 vaschette. Per l'identificazione di sonde positive. Per l'interpretazione dei risultati. Per la conservazione di strip sviluppate.
Tampone substrato Soluzione di risciacquo 5x
Portavaschetta d'incubazione Scheda di lettura Diagramma d'interpretazione Foglio rapporto dati
3 1 1 2
Materiali richiesti ma non forniti Guanti monouso. Puntali sterili monouso (preferibilmente con filtro). Provettine sterili. Portaprovette. Centrifuga per microprovette. Pipette regolabili per erogare 1 - 20 l, 20 - 200 l, e 200 - 1000 l. Acqua distillata autoclavata.
Materiale specifico per l'amplificazione Per l'amplificazione si consiglia l'uso di Taq DNA polimerasi e tampone di amplificazione Taq forniti da Stratagene Termociclatore e accessori. dNTP (25 mM). Tampone Taq 10x (contenenti 100 mM Tris-HCl pH 8.8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (peso/vol) gelatina, e stabilizzanti, Stratagene).
INNOGENETICS Taq DNA polimerasi (DNA polimerasi, Stratagene). Apparato d'aspirazione. Termometro calibrato. Pinzette Cilindri graduati (10, 25, 50 e 100 ml). Timer (2 ore 1 minuto). Vortex o equivalente. Bagnomaria con piattaforma di agitazione (80 rpm; con coperchio inclinato; temperatura regolabile a minimo 49C 0,5C). Agitatore orbitale (160 giri-minuto) o oscillante (50 giri-minuto). Materiale specifico per LiPA
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Materiale opzionale: Multipipetta di erogazione (Multipipetta, Eppendorf o equivalente). Apparecchiatura automatica per processare le strip. Per i particolari, contattare il proprio distributore. Sicurezza e ambiente Per cortesia fare riferimento alla scheda di sicurezza del prodotto (MSDS) e alla etichettatura del prodotto per ottenere informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi. La versione pi recente della MSDS disponibile sul sito Web www.innogenetics.com.
R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Tossico! Nocivo se inalato o messo a contatto con la pelle. Irritante per gli occhi. Pu causare danni al feto. Indossare appropriati abiti protettivi e guanti. In caso di incidente o malore rivolgersi immediatamente ad un medico (mostrando l'etichetta se possibile). Evitare l'esposizione - consultare le speciali istruzioni per l'uso. Uso riservato esclusivamente a utilizzatori professionali. Contiene dimetilformamide, sale p-toluidina 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato: Substrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37 Irritante! Pu causare sensibilizzazione per contatto con la pelle. Evitare il contatto con la pelle. Indossare appropriati guanti protettivi. Contiene 2-Cloroacetamide: Soluzione lavaggio stringente, Soluzione ibridazione, Soluzione risciacquo, Tampone substrato e Diluente coniugato.
R34, S28-36/37/39-45 Corrosivo! (C) Provoca ustioni. In caso di contatto con la pelle, lavare immediatamente con abbondanza di sapone e acqua. Indossare abiti protettivi, guanti e protezioni occhi/viso appropriati. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta ). Contiene idrossido di sodio: Soluzione di Denaturazione.
55 -
INNO-LiPA HBV Genotyping I campioni devono sempre essere manipolati come potenzialmente infettivi. Per questo motivo, tutti i componenti del sangue e i materiali biologici devono essere considerati come potenzialmente infetti e maneggiati come tali. Deve essere permesso di effettuare il test solo a personale adeguatamente preparato. Tutti i componenti di sangue e i materiali biologici dovrebbero essere eliminati in accordo con le procedure di sicurezza stabilite. Autoclavare per almeno 15 minuti a 121C. Incenerire il materiale monouso. Miscelare i liquidi reflui con ipoclorito di sodio in modo che la concentrazione finale sia 1% ipoclorito di sodio. Lasciare riposare tutta la notte prima di smaltirlo. ATTENZIONE: Neutralizzare il liquido di scarto che contiene acido prima di aggiungere ipoclorito di sodio. necessario l'uso di dispositivi di protezione personale: guanti e occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti pericolosi o infettanti. Gli scarti devono essere maneggiati in accordo con le linee guida delle istituzioni in materia. Devono inoltre essere rispettate tutte le norme sull'ambiente federali, statali e locali.
Raccolta e manipolazione campioni Usare DNA estratto da campioni HBV positivi appena isolati o congelati sotto i -20C, preferibilmente mai scongelati. Pu essere generato materiale amplificato dai domini B e C del gene pol-HBV. Quindi usare 10 l di prodotto HBV amplificato per il processo LiPA. Note e precauzioni Esclusivamente per uso professionale. Tutti i puntali e le provette per il processo di amplificazione devono essere autoclavati. Si raccomandano puntali con filtro. Usare solo materiale di laboratorio monouso. Usare un puntale sterile per ciascun campione aliquotato. Non mischiare i reagenti tra i kit a meno che i componenti abbiano numeri di lotto identici. Al fine di prevenire la contaminazione da PCR, massimizzare la separazione fisica delle aree pre- e post-amplificazione. Non riportare campioni, apparecchiature o reagenti nell'area in cui si eseguito il passaggio precedente. Nel caso sia necessario ritornare in un'area di lavoro precedente, eseguire per prima cosa le misure di decontaminazione appropriate. Utilizzare un paio di pinzette per maneggiare le strip. Non toccare le strip con le mani, poich le sostanze oleose presenti sulle mani potrebbero interferire con l'ibridazione e lo sviluppo del colore. Usare esclusivamente delle matite per scrivere sulle strip. I reagenti del test potrebbero rimuovere l'inchiostro dalle strip. Per risultati accurati, usare un bagnomaria per i passaggi di ibridazione e lavaggio e controllare che la temperatura sia di 49C 0.5C. Non usare un agitatore ad aria calda. Usare termometri calibrati, in quanto necessario un rigido controllo della temperatura. Chiudere sempre il coperchio del bagnomaria per mantenere la temperatura. Se la temperatura troppo bassa, il test pu generare risultati falsi
INNOGENETICS
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positivi; se la temperatura troppo alta si possono ottenere segnali molto deboli o risultati falsi negativi. Usare un bagnomaria con agitazione con coperchio inclinato per un controllo ottimale della temperatura. Il movimento generato dal bagnomaria con agitazione durante l'ibridazione e il lavaggio stringente e dall'agitatore orbitale o basculante durante lo sviluppo di colore di importanza critica. Regolare con cura la velocit di questi strumenti portando al massimo il movimento dei reagenti sulla strip senza che vi siano spruzzi di soluzione tra le vaschette del vassoio. Evitare di spruzzare acqua dal bagnomaria nel vassoio. Regolare il livello dell'acqua nel bagnomaria in modo che sia tra un terzo e met del livello del vassoio. Evitare che il vassoio scivoli immobilizzandolo con pesi. Non lasciare che le strip si asciughino tra due lavaggi. Mantenere ciascuna strip nella stessa vaschetta durante l'intera procedura. Aspirare liquido da una vaschetta usando una pipetta, eventualmente collegata a un aspiratore a vuoto.
Procedura di amplificazione Protocollo di estrazione del DNA: High pure PCR template preparation kit (Roche Diagnostics). Vedere il protocollo del kit menzionato. Possono essere usate altre procedure di estrazione DNA. Protocollo di amplificazione I seguenti protocolli (amplificazione interna ed esterna) sono stati progettati per ottenere un'amplificazione ottimale, adoperando: Taq Polimerasi (5U/l, Stratagene), Tampone Taq 10x (contenenti 100 mM Tris-HCl pH 8.8; 500 mM KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (peso/vol) gelatina, e stabilizzanti, Stratagene) Provette PCR MicroAmp (provette da 0,2 ml a parete sottile) e Termociclatori PE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer Cetus). Questo protocollo pu essere usato per la maggior parte dei tipi commerciali di termociclatori, ma potrebbe richiedere alcune modifiche indicate dal produttore dello strumento. Prendere le necessarie precauzioni al fine di evitare una amplificazione non specifica, che potrebbe influenzare i risultati: scongelare i componenti sottoelencati e metterli in ghiaccio eseguire i passaggi di pipettaggio su ghiaccio e senza ritardo. Amplificazione esterna 1. 2. Stabilire in numero di fiale da preparare (N) come: N = Numero di campioni + 1 Controllo negativo + 1 Controllo positivo + 1. Usando puntali sterili con filtro, preparare la master mix in una provetta autoclavata da microcentrifuga senza nucleasi:
57 3.
INNO-LiPA HBV Genotyping Preparare la master mix 1 contenente: (N x 32.4 l) acqua distillata autoclavata + (N x 5.0 l) tampone di amplificazione Taq 10x (Stratagene) + (N x 0.4 l) miscela dNTP (25 mM) + (N x 2.0 l) miscela primer esterni + (N x 0.2 l) Taq DNA polimerasi (5U/l) (Stratagene). Vortexare brevemente e aliquotare 40 l della master mix 1 in (N-1) tubi di amplificazione autoclavati. Pipettare 10 l di DNA purificato, o 10 l di acqua distillata (non mettere DNA nel controllo negativo). ANNOTAZIONE: Miscelare brevemente ed eseguire una breve centrifugata della miscela per raccogliere il liquido in fondo alla provetta. Mettere i campioni nel blocco termico (vedi istruzioni riportate dal produttore del termociclatore). Avviare il programma di amplificazione creato per l'amplificazione esterna INNO-LiPA HBV Genotyping. Profilo di amplificazione esterno INNO-LiPA HBV Genotyping per termociclatore PE-2400 o PE-9600:
Fase 1 2 3 4 5 6 Denaturare Denaturare Riassociazione primer Estensione primer Allungamento Raffreddamento a 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Tempo 4 min. 30 s 30 s 30 s 10 min. Ripetere le fasi 2 - 4, per 40 volte
4. 5.
6.
Dopo questo procedimento, usare i campioni immediatamente per l'amplificazione nested o conservare a -15/-25C. NOTA: Non conservare i prodotti DNA amplificati insieme a reagenti di amplificazione o DNA estratto.
Amplificazione interna 1. Stabilire in numero di fiale da preparare (N) come: N = Numero di campioni di amplificazione esterna + Controllo negativo amplificazione esterna + 1 Controllo negativo + 1 Controllo positivo + 1.
INNOGENETICS Usando un puntale con filtro, preparare la master mix 2 in una provetta autoclavata: (N x 40.4l) acqua distillata autoclavata + (N x 0.4 l) miscela dNTP (25 mM) + (N x 5.0 l) tampone di amplificazione Taq 10x (Stratagene) + (N x 2.0 l) miscela primer interni + (N x 0.2 l) Taq DNA polymerasi 5U/l (Stratagene).
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2. 3.
Vortexare brevemente e aliquotare 48 l di questa Master Mix in (N-1) provette di amplificazione autoclavate. Pipettare 2 l di prodotto di amplificazione esterna, o 2 l di acqua distillata (non mettere DNA nel controllo negativo) ANNOTAZIONE: Miscelare brevemente ed eseguire una breve centrifugata per raccogliere il liquido in fondo alla provetta. Mettere i campioni nel blocco termico (vedi istruzioni riportate dal produttore del termociclatore). Avviare il programma di amplificazione creato per l'amplificazione interna INNO-LiPA HBV Genotyping. Profilo di amplificazione interna INNO-LiPA HBV Genotyping per termociclatore PE-2400 o PE-9600:
Fase 1 2 3 4 6 7 Denaturare Denaturare Riassociazione primer Estensione primer Allungamento Raffreddamento a 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Tempo 4 min. 30 s 30 s 30 s 10 min. Ripetere le fasi 2 - 4, per 35 volte
4.
Dopo questa procedura, analizzare 5 l di prodotto di amplificazione sia interna che esterna su gel di agarosio al 2% o conservare tra -15/-25C. Si consiglia, sulla base di studi interni, che se il prodotto di amplificazione esterna mostra una banda di 409 bp, il test LiPA fornisce un risultato interpretabile. Se non visibile nessuna banda per il prodotto dell'amplificazione esterna, usare il prodotto dell'amplificazione interna con INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTA: Non conservare i prodotti di DNA amplificati insieme a reagenti di amplificazione o DNA estratto.
Risultati dell'amplificazione Visualizzazione La presenza del prodotto amplificato pu essere verificata su un gel di agarosio al 2%. Caricare 5 l del prodotto amplificato per pozzetto. La sequenza amplificata interna deve apparire come una banda della lunghezza di 342 bp. La sequenza amplificata esterna deve apparire come una banda della lunghezza di 409 bp.
59 Controllo qualit -
Includere sempre almeno un bianco per ogni estrazione. Includere almeno un controllo negativo e uno positivo ogni volta che viene eseguita un'amplificazione. Come per ogni nuova procedura di laboratorio, l'inclusione di controlli aggiuntivi positivi e negativi deve essere considerata fino a raggiungere un alto livello di fiducia nella capacit di eseguire correttamente la procedura. Se l'aggiunta di un controllo positivo desiderabile, usare un campione positivo noto. Se si ottiene una banda positiva nel gel per il controllo negativo, l'intera esecuzione deve essere rigettata e la procedura completa ripetuta.
Procedura LiPA Denaturazione dei campioni ATTENZIONE: Usando un termometro calibrato, assicurarsi che la temperatura del bagnomaria con agitazione sia 49C 0.5C, e regolare la temperatura se necessario prima di inserire un portacampioni. 1. 2. 3. Far equilibrare il bagnomaria con agitazione a 49C 0.5C. Mettere la Soluzione di ibridazione e la Soluzione di lavaggio stringente in bagnomaria tra 37 e 49C in modo da dissolvere tutti i cristalli. Assicurarsi che il bagnomaria non ecceda i 49C. Miscelare agitando la bottiglia prima dell'uso. Usando le pinzette, estrarre una strip per campione. Apporre a matita un numero d'identificazione sopra la linea di identificazione rossa sulla strip. Includere sempre una strip per il controllo negativo (prodotto di amplificazione di un campione HBV-negativo). NOTA: Non mettere la strip nella vaschetta prima della fase 2 della sezione Ibridazione dei campioni. Mettere nel vassoio una vaschetta per ciascuna strip/campione Immettere 10 l di soluzione di denaturazione nell'angolo superiore di ciascuna vaschetta. NOTA: Chiudere immediatamente la fiala contenente la Soluzione di denaturazione dopo ciascun uso. L'esposizione prolungata all'aria fa deteriorare la soluzione. Aggiungere 10 l di campione o di controllo negativo alla Soluzione di denaturazione in ciascuna vaschetta. Mescolare con cura pipettando su e gi. Lasciare che la denaturazione proceda per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. 5.
6. 7.
Ibridazione dei campioni 1. 2. Aggiungere con attenzione 2 ml di Soluzione di ibridazione a ciascuna vaschetta, facendo attenzione a non contaminare le altre vaschette. Agitare dolcemente la vaschetta per mescolare i reagenti. Mettere immediatamente una strip con la linea di identificazione rivolta verso l'alto in una vaschetta. NOTA: Indossare guanti monouso e usare le pinzette per manipolare le strip.
INNOGENETICS 3. 4.
60
5.
Assicurarsi che la strip sia completamente immersa nella soluzione. Non coprire le vaschette con adesivi per micropiastra per evitare contaminazione crociata. Mettere il vassoio nel bagnomaria con agitazione a 49C 0.5C e immobilizzare il vassoio tra due pesi. Impostare il bagno a circa 80 giri-minuto, chiudere il coperchio e far incubare il vassoio per 60 minuti. Assicurarsi che ciascuna strip resti completamente immersa e sia libera di galleggiare. A incubazione di ibridazione completa, rimuovere il vassoio dal bagnomaria.
Lavaggio delle strip ATTENZIONE: Tenere il vassoio inclinato in modo che il liquido si accumuli a un'estremit delle vaschette, al di sopra della linea di identificazione delle strip, per una pi facile rimozione. Non danneggiare la membrana della strip. Evitare spruzzi e travasi di liquido tra le vaschette. 1. 2. Aspirare la soluzione dalla vaschetta tramite una pipetta, preferibilmente collegata a un aspiratore a vuoto. Aggiungere 2 ml di Soluzione di lavaggio stringente a ciascuna vaschetta e risciacquare la strip facendo oscillare il vassoio per 1 minuto a 20 - 25C. Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta. NOTA: utile una multipipetta per distribuire la Soluzione di lavaggio stringente. Ripetere il lavaggio aggiungendo 2 ml di Soluzione di lavaggio stringente a ciascuna vaschetta e risciacquando la strip facendo oscillare il vassoio per 1 minuto a 20 - 25C. Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta. Aggiungere 2 ml di Soluzione di lavaggio stringente a ciascuna vaschetta, mettere il vassoio nel bagnomaria con agitazione a 49C 0.5C immobilizzare il vassoio tra due pesi. Impostare il bagnomaria ad approssimativamente 80 rpm, chiudere il coperchio e incubare il vassoio per 30 1 minuto Preparare la soluzione di lavoro di risciacquo e la soluzione di lavoro di coniugato (vedi Reagenti).
3. 4.
5.
Sviluppo del colore ATTENZIONE: Tenere il vassoio inclinato in modo che il liquido si accumuli a un'estremit delle vaschette, al di sopra della linea di identificazione delle strip, per una pi facile rimozione. Non danneggiare la membrana della strip. Evitare spruzzi e travasi di liquido tra le vaschette. 1. 2. 3. Aspirare la soluzione dalla vaschetta usando una pipetta. Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro di risciacquo a ciascuna vaschetta e lavare la strip facendo oscillare il vassoio per 1 minuto a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta. Ripetere questo passaggio una volta. Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro di coniugato a ciascuna vaschetta, mettere il vassoio in un agitatore (orbitale a 160 giri-minuto o oscillante a 50 giri-minuto) a 20 - 25C, e fare incubare per 30 1 minuti. NOTA: Preparare la Soluzione di lavoro di substrato circa 10 minuti prima della fine dell'incubazione del coniugato (vedi Reagenti).
61 4.
Quando l'incubazione completa, rimuovere il vassoio dall'agitatore e aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta con una pipetta. 5. Aggiungere 2 ml di Soluzione di lavoro di risciacquo a ciascuna vaschetta e risciacquare la strip facendo oscillare il vassoio per 1 minuto a 20 - 25C. Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta. Ripetere questo passaggio una volta. 6. Aggiungere 2 ml di Tampone substrato a ciascuna vaschetta e risciacquare la strip facendo oscillare il vassoio per 1 minuto a 20 - 25C. Aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta. 7. Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro di substrato a ciascuna vaschetta, mettere il vassoio in un agitatore a 20 - 25C, e fare incubare per 30 1 minuti. 8. Quando l'incubazione completata, fermare lo sviluppo del colore lavando le strip: rimuovere il vassoio dall'agitatore, aspirare la soluzione da ciascuna vaschetta, quindi aggiungere 2 ml di acqua distillata a ciascuna vaschetta e mettere il vassoio nell'agitatore per almeno 3 minuti. Ripetere questo passaggio una volta. 9. Usando le pinzette, rimuovere ciascuna strip dalla sua vaschetta e mettere la strip con la linea di identificazione rivolta verso l'alto su carta assorbente. 10. Lasciare asciugare completamente le strip prima di leggere i risultati. Conservare le strisce sviluppate e asciugate al buio. Procedura di test automatizzata: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 Perci, l'Auto-LiPA e l'Auto-LiPA 48 sono intesi per gestire completamente l'ibridazione, il lavaggio stringente e i passaggi di sviluppo del colore. L'Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 sono caratterizzati da un sistema di walk-away con riscaldamento e raffreddamento automatizzato e con aspirazione e pipettaggio automatizzati. Per maggiori informazioni e protocolli specifici sull'Auto-LiPA e su Auto-LiPA 48, si prega di contattare il proprio distributore locale. Risultati LiPA Lettura La Figura 1 illustra la posizione delle diverse sonde oligonucleotidiche sulle strisce INNO-LiPA HBV Genotyping. Una linea considerata positiva quando appare una netta banda viola/marrone al termine della procedura del test. Figura 1 (vedere pagina 19): Posizione della linea rossa di identificazione, la linea di controllo del coniugato (Conj. control), la linea di controllo dell'amplificazione (Amp. control) e le 14 sonde sulla strip INNO-LiPA HBV Genotyping. Controllo qualit La linea superiore rossa la linea di identificazione. Questa linea permette un corretto orientamento della striscia. La prima linea positiva dovrebbe essere allineata con la linea di controllo del coniugato "Conj. control" sulla scheda di lettura in plastica. Questa linea serve come controllo per l'aggiunta delle soluzioni reattive di coniugato e substrato durante la procedura di rilevazione. Deve essere sempre positiva e dovrebbe avere all'incirca la medesima intensit su ciascuna striscia nella medesima esecuzione di test.
INNOGENETICS -
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La seconda linea positiva ("Amp. control" sulla scheda di lettura) controlla l'aggiunta di materiale amplificato per l'ibridazione. Se presente HBV nel campione e la lavorazione e amplificazione del campione sono state eseguite correttamente, allora l'amplicone bersaglio ibridato su questa linea "Amp. control". La strip del Controllo negativo deve essere bianca eccetto per la linea di controllo del coniugato. Ci dimostra che non vi stata alcuna contaminazione durante l'esecuzione del test.
Interpretazione dei risultati Usare SEMPRE la scheda di interpretazione per un'interpretazione corretta del genotipo HBV. NOTA: Isolati di genotipi diversi possono avere reazioni crociate con la stessa sonda. Verificare con attenzione sulla scheda di interpretazione quali schemi di sonde reattive corrispondono a ciascun singolo genotipo. NOTA: (schemi non presenti nella scheda di interpretazione): Interpretazione delle infezioni miste: stata documentata l'esistenza di infezioni a genotipo misto nei portatori cronici di HBV. Quando vengono rilevate infezioni da genotipo multiplo usando il test INNO-LiPA HBV Genotyping, i risultati possono essere interpretati come segue: Se si presentano pi linee specifiche per diversi genotipi, si tratta di genotipo misto Per esempio, linee positive 6 - 7 unite alle linee positive 8 - 9 identificano un campione co-infetto B/C. Per il genotipo G dell'HBV, dimostrato che tale genotipo coinfetta con il genotipo A dell'HBV nella maggioranza dei casi. Per esempio, uno schema di reattivit in cui presente la linea 16, specifica del genotipo G, assieme ad almeno due linee specifiche del genotipo A indica un campione co-infetto A/G. Se si presentano pi linee specifiche di un genotipo e una sola linea specifica per un secondo genotipo, si tratta di genotipo singolo. Il genotipo da riportare quello che presenta pi linee positive. Notare che una singola linea 16 indica da sola la presenza del genotipo G. Risultati indeterminati: Riportare risultati indeterminati (IND) nei seguenti casi: Linee reattive singole per pi di un genotipo in congiunzione con una linea di controllo di amplificazione (linea 2) positiva. Notare che una reattivit di sola linea 11 e sola linea 15 deve essere interpretata come genotipo H. Assenza di linee specifiche per un genotipo in congiunzione con una linea di controllo di amplificazione (linea 2) positiva. Tutte le linee positive.
Per assistenza all'interpretazione, contattare il proprio distributore.
63 Limiti della procedura -
L'uso di questo kit deve essere riservato al personale specializzato nelle tecniche di estrazione e amplificazione di acido nucleico dell'HBV. Una buona pratica di laboratorio e un'attenta esecuzione delle procedure specificate in precedenza permette una amplificazione specifica. Data l'occasionale altissima carica virale dei campioni infetti da HBV, bene esercitare la massima cautela per evitare la contaminazione. L'inibizione della polimerasi (p. es. emoglobina eparina) potrebbe essere ragione del completo fallimento del test. Il talco proveniente da guanti monouso e l'ipoclorito di sodio hanno un effetto inibitorio sull'amplificazione. Possono verificarsi infezioni da genotipi misti di HBV. I primer amplificano simultaneamente tutti i genotipi. In un campione a infezione mista e bassa carica virale, possibile che non vengano rilevati tutti i genotipi a causa della competizione della PCR. Questo test basato sulle variazioni di sequenza nei domini B e C della polimerase dellHBV, che permettono differenziazione tra i genotipi HBV da A a H. Date talune eterogeneit di sequenza del genoma HBV, possono occasionalmente prodursi schemi indeterminati o linee con falsa reazione. Possono occasionalmente presentarsi risultati che mostrano una bassa reattivit di tutte le linee e danno un risultato indeterminato. I campioni che presentano queste reattivita devono essere nuovamente amplificati o estratti.
Performance del test Le prestazioni del test INNO-LiPA HBV Genotyping sono state valutate in un centro in Francia e uno in Olanda su campioni clinici HBV-positivi da, rispettivamente, 100 e 273 pazienti infetti da HBV. Inoltre, 54 campioni HBV-positivi classificati come genotipo C, F, G, o H tramite sequenziamento sono stati verificati presso Innogenetics. Sensibilit Sono stati ottenuti risultati di positivit testimoniati da una linea di controllo di amplificazione positiva in 415 su 427 campioni dopo l'amplificazione iniziale, con una sensibilit iniziale risultante del 97,2%. stata eseguita una ri-amplificazione di 10 dei 12 campioni e ha avuto successo per tutti i 10 campioni, per una sensibilit risultante del 100% (425/425) dopo ripetizione. Accuratezza Tra i 425 campioni controllati tramite INNO-LiPA HBV Genotyping, stato osservato un risultato indeterminato per 8 campioni (1.9%). Per 415 campioni stato ottenuto un risultato di genotipo sia tramite LiPA che tramite sequenziamento. Per il 92% (382/415) dei campioni, il LiPA ha rilevato lo stesso genotipo del sequenziamento. Per 19 campioni (4.6%), il LiPA ha rilevato una co-infezione mentre il sequenziamento ha identificato uno solo dei genotipi. stato ottenuto un genotipo diverso per ciascun metodo su 14 campioni (3.4%). La tabella seguente offre un sunto dei risultati.
INNOGENETICS
Genotipo Sequenziamento LiPA A B A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Totale 126 29 1 1 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 Totale C D 6 E 1 F G H IND 1 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
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I nove campioni con risultati diversi rispetto al sequenziamento e 10 dei campioni risultanti a genotipo misto sono stati ulteriormente analizzati con altre tecniche. Sono stati confermati i risultati LiPA per 15 di questi 19 campioni mentre per 2 campioni il risultato LiPA stato riconosciuto, almeno in parte, inesatto. Per gli altri 2 campioni con risultato di genotipo misto su LiPA, solo uno dei genotipi stato confermato con ulteriori test. Combinando tutti i risultati dei test, il risultato di genotipo LiPA stato confermato nel 99% (397/401) dei casi. Precisione stato analizzato un pannello di 9 campioni di plasmidi da 3 diversi operatori in triplice copia su 2 lotti di strip INNO-LiPA HBV Genotyping. stata ottenuta una concordanza del 100% (162/162) a livello di genotipi. Inoltre, un pannello di diluizione a sei componenti tra le 10.000 e le 375 copie/ml derivato da un campione clinico con genotipo A stato sottoposto a test otto volte. Ogni componente del pannello stato estratto, amplificato con primer esterni e interni, e sottoposto a test su un lotto di strip INNO-LiPA HBV Genotyping in giorni diversi da 2 operatori diversi in 2 laboratori diversi. stata ottenuta una concordanza del 100% (48/48) a livello di genotipi. Sono stati estratti otto campioni (genotipi da A a H) e amplificati con i reagenti di amplificazione. I prodotti di amplificazione sono stati verificati in duplice copia su strip INNO-LiPA HBV Genotyping usando tre lotti di kit LiPA. stata ottenuta una concordanza del 100% (48/48) a livello di genotipi.
65 Espaol Uso al que est destinado
El ensayo INNO-LiPA HBV Genotyping es un ensayo de sonda en tira diseado para identificar los genotipos A - H del virus de la hepatitis B (VHB) mediante la deteccin de secuencias especficas en los dominios B y C del gen de la polimerasa de VHB. El ensayo de genotipo de VHB (LiPA) no se destina a ensayos de anlisis de VHB ni a ensayos de diagnstico para confirmar la presencia de VHB. Principio del ensayo El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN parcialmente bicatenario que se replica a travs de un intermediario de ARN. El primer paso es el aislamiento del ADN viral de la muestra. A continuacin, se amplifica el ADN purificado en dos fases de PCR con cebadores de PCR biotinilados. Los cebadores externos (primera fase de PCR) usados en este ensayo amplificarn parte del gen de la polimerasa de VHB (dominios B y C). Mediante calentamiento se separan las dos hebras de la hlice de ADN (desnaturalizacin) para exponer la secuencia diana a los cebadores externos. Estos cebadores de oligonucletidos son complementarios a regiones muy conservadas que flanquean la regin diana. Por tanto, tras enfriar a una temperatura concreta, los cebadores se unirn a su secuencia especfica (anillamiento a 45C). A una temperatura elevada y en presencia de dNTPs, la polimerasa de ADN termoestable extender los cebadores anillados a lo largo del ADN molde (extensin). Se produce una copia exacta del molde tras un ciclo de desnaturalizacin, anillamiento y extensin. Este proceso se repite durante 40 ciclos, con lo que se produce una secuencia de 409 pb amplificada muchas veces. Como generalmente la cantidad de producto de la amplificacin no es suficiente, es necesaria una PCR anidada (segunda fase). El principio de esta amplificacin es idntico al de la primera, con la excepcin de que el ADN se sustituye por el producto amplificado de la PCR de la primera fase y los cebadores externos se sustituyen por cebadores anidados biotinilados. El proceso de desnaturalizacin, anillamiento y extensin se repite durante 35 ciclos y produce una secuencia amplificada de 342 bp. Es recomendable comprobar en gel si se debe usar el producto amplificado externo o anidado. Tras la amplificacin, el material de ADN biotinilado generado a partir de la fase abierta de lectura de HBsAg se hibrida con sondas de oligonucletidos especficos inmovilizados como bandas paralelas en tiras de membrana. Tras la hibridacin, se lava el ADN sin hibridar para retirarlo de la tira, se aade estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina, que se unir con cualquier hbrido biotinilado formado previamente. La incubacin con el cromgeno BCIP/NBT produce un precipitado de color prpura/marrn. La tira de INNO-LiPA HBV Genotyping contiene una lnea de marca de color rojo, 2 bandas de control y 14 bandas paralelas de sonda. La banda de control de
INNOGENETICS
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conjugado es un control para la reaccin de revelado de color y la banda de control de la amplificacin contiene sondas de VHB universales para comprobar la presencia de material genmico de VHB amplificado. Reactivos Descripcin, preparacin para el uso y condiciones de almacenamiento recomendadas OBSERVACIN: en cuanto reciba los reactivos de amplificacin y los reactivos LiPA, almacnelos inmediatamente: los reactivos de amplificacin en el rea de operaciones previas a la amplificacin y los reactivos LiPA en el rea de operaciones posteriores a la amplificacin. Si se almacenan a una temperatura de 2 - 8C, abiertos o sin abrir, todos los reactivos sern estables hasta su fecha de caducidad. No utilice reactivos caducados. Para evitar la contaminacin, es recomendable dividir en partes iguales los reactivos de la amplificacin tras su primer uso. Los reactivos deben almacenarse aislados de fuentes de ADN contaminante, especialmente de productos amplificados. Debe usar tubos y puntas de pipeta (preferiblemente con filtros de algodn) desechables. Todos los reactivos deben ponerse a temperatura ambiente (20 - 25C) unos 30 minutos antes de usarse y devolverse al refrigerador inmediatamente despus de su uso. Agite en vrtex y haga girar todos los reactivos antes de abrir los viales. Cierre los viales inmediatamente despus de usarlos. Cualquier alteracin en la apariencia fsica de los reactivos del kit puede ser signo de inestabilidad o deterioro. Para minimizar la posibilidad de que las tiras se enrrollen antes de usarse es recomendable almacenar el tubo horizontalmente.
Reactivos suministrados:
Componente Reactivos de AMP: Mezcla de cebadores 1 x 0,08 ml 58322 Con cebadores biotinilados y NaN3 al 0,05% como externos conservante. Mezcla de cebadores 1 x 0,08 ml 58324 Con cebadores biotinilados y NaN3 al 0,05% como internos como conservante. Reactivos LiPA: Tiras Solucin de desnaturalizacin 1 x 20 1 x 1 ml 58321 1 tubo de plstico con tiras de INNO-LiPA HBV Genotyping marcadas con una lnea de marca de color rojo. 56718 Solucin alcalina con EDTA. PRECAUCIN: El vial que contiene la solucin de desnaturalizacin debe cerrarse inmediatamente despus de su uso; la exposicin prolongada de esta solucin al aire provoca un rpido deterioro. Cantidad Ref. Descripcin
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Solucin de hibridacin 1 x 80 ml

57420 Contiene un tampn SSC con detergentes y conservantes. La solucin de hibridacin debe precalentarse a una temperatura de al menos 37C y no debe superar los 49C (todos los cristales deben disolverse antes de usarse).
Solucin de lavado astringente
1 x 200 ml 57421 Contiene un tampn SSC con detergentes y conservantes. La solucin de lavado astringente debe precalentarse a una temperatura de al menos 37C y no debe superar los 49C (todos los cristales deben disolverse antes de usarse). 1 x 0,8 ml 56952 Estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina en tampn Tris con estabilizadores de protenas y MIT al 0,01%/ CAA al 0,098% como conservante, que debe diluirse en una proporcin 1/100 en diluyente de conjugado antes de usarse. Prepare 2 ml de solucin de conjugado de trabajo para cada cubeta de ensayo + 2 ml en exceso. Para AutoLiPA, prepare 10 ml en exceso. La solucin de conjugado de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente (20 - 25C) si se almacena en un lugar oscuro. 56951 Tampn fosfato con NaCl, Triton, estabilizadores de protenas y MIT al 0,01%/CAA al 0,1% como conservantes.
Conjugado 100x
Diluyente de conjugado 1 x 80 ml Sustrato BCIP/NBT 100x
1 x 0,8 ml 56954 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato y 4-nitroazul de tetrazolio en dimetilformamida, que deben diluirse en una proporcin 1/100 en tampn Sustrato antes de su uso. Prepare 2 ml de solucin de sustrato de trabajo para cada cubeta de ensayo + 2 ml en exceso. Para Auto-LiPA, prepare 10 ml en exceso. La solucin de sustrato de trabajo se mantiene estable durante 24 horas a temperatura ambiente (20 - 25C) si se almacena en un lugar oscuro. 1 x 180 ml 56953 Tampn Tris con NaCl, MgCl2 y MIT al 0,01%/CAA al 0,1% como conservantes. 56721 Tampn fosfato con NaCl, Triton y MIT al 0,01%/ CAA al 0,1% como conservantes, que deben diluirse en una proporcin 1/5 (1 parte + 4 partes) en agua destilada o desionizada antes de usarse. Prepare 8 ml de solucin de lavado de trabajo para cada cubeta de ensayo + 10 ml en exceso. En caso de uso del aparato Auto-LiPA, prepare 12 ml de solucin de lavado de trabajo para cada cubeta de ensayo + un exceso de 20 ml. La solucin de lavado de trabajo se mantiene estable durante 2 semanas a una temperatura entre 2 - 8C. Cada una contiene 8 cubetas. Para la identificacin de las sondas positivas. Para la interpretacin de los resultados. Para almacenar las tiras reveladas.
Tampn sustrato
Solucin de lavado 5x 1 x 80 ml
Bandejas de incubacin 3 Tarjeta de lectura Tabla de tipaje Hoja de registro de datos 1 1 2
INNOGENETICS Materiales necesarios pero no suministrados -
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Guantes desechables. Puntas de pipeta estriles desechables (preferiblemente con filtro de algodn). Microtubos estriles. Racks de microtubos. Centrfuga de microtubos. Pipetas ajustables que permitan pipetear 1 - 20 l, 20 - 200 l y 200 - 1000 l. Agua destilada esterilizada en autoclave.
Especficamente para la amplificacin Para la amplificacin, se recomienda el uso de la polimerasa de ADN Taq y el tampn de amplificacin Taq proporcionados por Stratagene. Termociclador de ADN y equipamiento. dNTPs (25 mM). Tampn Taq 10x (que contiene 100 mM Tris-HCl con un pH de 8,8; 500 mM de KCl; 15 mM de MgCl2, 0,01% (w/v) de gelatina y estabilizadores de Stratagene). Polimerasa de ADN Taq (de Stratagene).
Especficamente para LiPA Aparato de aspiracin. Termmetro calibrado. Pinzas. Probetas graduadas (10, 25, 50 y 100 ml). Cronmetro (2 horas 1 minuto). Vrtex o equivalente. Bao de agua con plataforma de agitacin (80 rpm; con cubierta inclinada; temperatura ajustable a 49C 0,5C como mnimo). Agitador orbital (160 rpm) o agitador de balanceo (50 rpm).
Materiales opcionales: Multipipeta de distribucin (Multipipeta, Eppendorf o equivalente). Equipo para la automatizacin de los pasos del procesamiento de tiras. Si desea obtener informacin detallada, pngase en contacto con su distribuidor. Seguridad y medio ambiente Consulte la hoja de datos sobre seguridad de materiales (MSDS) y el etiquetado del producto para obtener informacin acerca de componentes potencialmente peligrosos. Encontrar la versin ms reciente de la hoja MSDS en la pgina Web www.innogenetics.com.
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R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Producto txico! Nocivo por inhalacin y en contacto con la piel. Irrita los ojos. Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto. sense indumentaria y guantes de proteccin adecuados. En caso de accidente o si no se siente bien, acuda al mdico de inmediato (muestre la etiqueta si es posible). Evite la exposicin - consulte las instrucciones de utilizacin especiales. Uso limitado al personal especializado. Contiene dimetilformamida, sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro 3-indolil fosfato: Sustrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37 Producto irritante! Puede causar sensibilizacin si entra en contacto con la piel. Evtese el contacto con la piel. sense guantes adecuados. Contiene 2-cloracetamida: solucin de lavado astringente, solucin de hibridacin, solucin de lavado, tampn Sustrato y diluyente de conjugado.
R34, S28-36/37/39-45 Producto corrosivo! (C) Provoca quemaduras. En caso de contacto con la piel, lave inmediata y abundantemente con agua y jabn. Utilice indumentaria y guantes adecuados as como proteccin para los ojos y la cara. En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al mdico (si es posible, mustresele la etiqueta). Contiene hidrxido de sodio: Solucin de desnaturalizacin. Las muestras deben manipularse siempre como productos potencialmente infecciosos. Por lo tanto, toda la sangre y hemoderivados, y los materiales biolgicos, debern considerarse como potencialmente infecciosos y manipularse como tales. nicamente el personal debidamente capacitado debe llevar a cabo el procedimiento de ensayo. Toda la sangre y hemoderivados, y todos los materiales biolgicos, deben desecharse de acuerdo con los procedimientos de seguridad establecidos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos como mnimo a 121C. Incinere el material desechable. Mezcle los residuos lquidos con hipoclorito sdico (leja) hasta obtener una concentracin final de 1% de hipoclorito sdico. Djelos reposar durante toda la noche antes de eliminarlos. PRECAUCIN: neutralice los residuos lquidos que contengan cido antes de aadir el hipoclorito sdico. Es imprescindible el uso de equipo protector personal, como guantes y gafas de seguridad, para manipular agentes peligrosos o infecciosos. Deseche los residuos de acuerdo con las normas de manejo de residuos de su institucin. Asimismo, debe cumplir con todas las normas medioambientales nacionales, autonmicas y locales.
INNOGENETICS Recoleccin y manipulacin de muestras
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Use ADN extrado de muestras infectadas con HBV recin aisladas o congeladas a una temperatura de -20C o inferior, preferiblemente que no se hayan descongelado nunca). Se puede generar material amplificado de los dominios B y C del gen de la polimerasa de VHB. Use a continuacin 10 l de producto amplificado de VHB para el proceso de LiPA. Observaciones y precauciones Para uso profesional exclusivamente. Debe esterilizar en autoclave todas las puntas de pipeta y todos los tubos utilizados en el proceso de amplificacin. Es recomendable usar puntas de pipeta con filtros de algodn. Use nicamente materiales de laboratorio desechables. Utilice una nueva punta de pipeta estril para cada muestra dividida en alicuotas. No mezcle reactivos de kits distintos, a menos que los componentes tengan nmeros de lote idnticos. Para evitar la contaminacin de PCR, maximice la separacin fsica de los pasos previos y posteriores a la amplificacin. No coloque las muestras, el equipo ni los reactivos en la zona en la que realiz el paso anterior. Si tiene que volver a la zona de trabajo anterior, tome las medidas de descontaminacin adecuadas. Utilice pinzas para manipular las tiras. No toque las tiras con las manos, ya que la grasa de sus manos podra interferir con la hibridacin y el revelado de color. Use nicamente un lpiz para escribir en las tiras. (si usa tinta, los reactivos del ensayo podran borrar la tinta de las tiras). Para obtener resultados precisos, use un bao de agua para la hibridacin y las fases de lavado, y asegrese de que la temperatura sea de 49C 0,5C. No use un agitador de aire caliente. Debe usar un termmetro calibrado, ya que hay que controlar la temperatura de forma estricta. Cierre siempre la cubierta del bao de agua para mantener la temperatura. Si la temperatura fuera demasiado baja, el ensayo podra producir falsos positivos; si fuera demasiado elevada, podran observarse seales muy dbiles o falsos negativos. Use un bao de agua de agitacin con la cubierta inclinada para un control ptimo de la temperatura. El movimiento generado por el bao de agua de agitacin durante la hibridacin y el lavado astringente, y por el agitador orbital o de balanceo durante el revelado de color es fundamental. Ajuste la velocidad de estos instrumentos minuciosamente para maximizar el movimiento de los reactivos con la tira evitando salpicaduras de las soluciones de unas cubetas a otras en la bandeja. Evite salpicar la bandeja con agua del bao de agitacin. Ajuste el nivel del agua en el bao de agua de forma que est entre un tercio y la mitad de la altura de la bandeja. Evite que la bandeja se deslice inmovilizndola con objetos pesados. No deje que las tiras se sequen entre las distintas fases. Mantenga cada tira en una misma cubeta durante el procedimiento. Para aspirar el lquido de una cubeta, use una pipeta; puede conectarla a un aspirador de vaco.
71 Procedimiento de ensayo para la amplificacin
Protocolo de extraccin de ADN: High Pure PCR Template preparation Kit (Roche Diagnostics). Consulte el protocolo del kit mencionado. Puede usar otros procedimientos de extraccin de ADN. Protocolo de amplificacin Los siguientes protocolos (amplificacin externa y anidada) se disearon para una amplificacin ptima con: Polimerasa Taq (5U/l, Stratagene). Tampn Taq 10x (con 100mM de Tris-HCl con un pH de 8,8, 500 mM de KCl, 15 mM de MgCl2, 0,01% de gelatina, estabilizadores, Stratagene). Tubos de PCR MicroAmp (tubos de paredes delgadas de 0,2 ml). Termocicladores PE-2400 o PE-9600 (Perkin Elmer Cetus). Se puede usar este protocolo para la mayora de los modelos comerciales de termocicladores, pero en algunos casos puede requerir modificaciones especificadas por el fabricante. Tome las precauciones necesarias para evitar una amplificacin no especfica, que podra afectar a los resultados: descongele los componentes siguientes y colquelos en hielo realice todos los pasos de pipeteado en hielo y sin demora. Amplificacin externa 1. 2. 3. Determine el nmero de viales que deben ser preparados (N) con la frmula siguiente: N = nmero de muestras + 1 control negativo + 1 control positivo + 1. Use puntas de pipeta con filtro de algodn para preparar la mezcla principal en un microtubo sin nucleasas esterilizado en autoclave: Prepare la mezcla principal 1 con: (N x 32,4 l) agua destilada esterilizada en autoclave + (N x 5,0 l) Tampn de amplificacin Taq 10x (Stratagene) + (N x 0,4 l) Mezcla de dNTPs (25 mM) + (N x 2,0 l) Mezcla de cebadores externos + (N x 0,2 l) Polimerasa de ADN Taq 5U/l (Stratagene) Agite en vrtex brevemente y divida en alicuotas de 40 l esta mezcla principal 1 en (N-1) tubos de amplificacin esterilizados en autoclave. Pipetee 10 l de ADN purificado o 10 l de agua destilada (sin ADN para el control negativo). OBSERVACIONES: mezcle brevemente y centrifugue la mezcla para reunir el lquido en la parte inferior del tubo. Coloque las muestras en el bloque trmico calibrado (consulte las instrucciones del fabricante del termociclador). Inicie el programa de amplificacin diseado para la amplificacin externa de INNO-LiPA HBV Genotyping.
4.
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INNOGENETICS
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Perfil de amplificacin externa de INNO-LiPA HBV Genotyping para un termociclador PE-2400 o PE-9600:
Paso 1 2 3 4 5 6 Desnaturalizar Desnaturalizar Anillar cebadores Extender cebadores Elongar Enfriar a 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Tiempo 4 min. 30 seg. 30 seg. 30 seg. 10 min. Repita el ciclo Pasos 2 - 4, 40 veces
6.
Tras este proceso, use inmediatamente las muestras para la amplificacin anidada o almacnelas a -15/-25C. NOTA: No almacene los productos de ADN amplificado junto a reactivos de amplificacin o el ADN extrado.
Amplificacin anidada 1. Determine el nmero de viales que deben ser preparados (N) con la frmula siguiente: N = nmero de muestras amplificadas externas + control negativo amplificado externo + 1 control negativo + 1 control positivo + 1. Use una punta de pipeta con filtro de algodn para preparar la mezcla principal 2 en un tubo esterilizado en autoclave: (N x 40,4 l) Agua destilada esterilizada en autoclave + (N x 0,4 l) Mezcla de dNTPs (25 mM) + (N x 5,0 l) Tampn de amplificacin Taq 10x (Stratagene) + (N x 2,0 l) Mezcla de cebadores internos + (N x 0,2 l) de polimerasa de ADN Taq 5 U/l (Stratagene) Agite en vrtex brevemente y divida la mezcla principal en partes de 48 l en (N-1) tubos de amplificacin esterilizados en autoclave. Pipetee 2 l de los productos amplificados externos o 2 l agua destilada (sin ADN para el control negativo). OBSERVACIONES: mezcle brevemente y centrifugue la mezcla para reunir el lquido en la parte inferior del tubo. Coloque las muestras en el bloque trmico calibrado (consulte las instrucciones del fabricante del termociclador). Inicie el programa de amplificacin diseado para la amplificacin anidada de INNO-LiPA HBV Genotyping.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Perfil de amplificacin anidada de INNO-LiPA HBV Genotyping para un termociclador PE-2400 o PE-9600:
Paso 1 2 3 4 6 7 Desnaturalizar Desnaturalizar Anillar cebadores Extender cebadores Elongar Enfriar a 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Tiempo 4 min. 30 seg. 30 seg. 30 seg. 10 min. Repita el ciclo Pasos 2 - 4, 35 veces
4.
Tras este proceso, visualice 5 l de producto amplificado externo y anidado en un gel de agarosa al 2% o almacnelo a -15/-25C. Segn nuestras observaciones internas, si el producto amplificado externo produce una banda de 409 bp, el ensayo LiPA debera producir un resultado interpretable. Si no hay ninguna banda visible para el producto amplificado externo, use el producto amplificado interno con INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTA: No almacene los productos de ADN amplificado junto a reactivos de amplificacin o el ADN extrado.
Resultados para la amplificacin Visualizacin La presencia del producto amplificado puede comprobarse en un gel de agarosa al 2%. Cargue 5 l de producto amplificado por pocillo. El amplicn anidado debe aparecer como una banda con una longitud de 342 bp. El amplicn externo debe aparecer como una banda con una longitud de 409 bp.
Control de calidad Incluya al menos un blanco de control para la extraccin. Incluya al menos un control positivo y un control negativo cada vez que realice una amplificacin. Al igual que en cualquier procedimiento de laboratorio nuevo, se debe considerar la posibilidad de incluir controles positivos y negativos adicionales hasta que se alcance un elevado grado de confianza en la capacidad de realizar correctamente el procedimiento. Si es necesario aadir un control positivo, use una muestra positiva conocida. Si se obtiene una banda positiva en el gel para el control negativo, debe descartarse todo el ensayo y repetirse el procedimiento completo.
Procedimiento de ensayo para LiPA Desnaturalizar las muestras PRECAUCIN: use un termmetro calibrado para asegurarse de que la temperatura del bao de agua de agitacin es de 49C 0,5C y ajuste la temperatura si es necesario antes de aadir una bandeja de muestras.
INNOGENETICS 1. 2.
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6. 7.
Atempere un bao de agua de agitacin a 49C 0,5C. Coloque la solucin de hibridacin y la solucin de lavado astringente en un bao de agua a una temperatura entre 37 y 49C para disolver todos los cristales. Asegrese de que la temperatura del bao de agua no supera los 49C. Mezcle agitando el recipiente antes de usarlo. Use pinzas para retirar una tira para cada muestra. Escriba con lpiz un nmero de identificacin por encima de la lnea de marca de color rojo en la tira. Incluya siempre una tira para el control negativo (producto amplificado de una muestra negativa de VHB). NOTA: No coloque la tira en la cubeta hasta el paso 2 de Hibridar las muestras. Coloque una cubeta para cada muestra/tira en la bandeja. Aada 10 l de solucin de desnaturalizacin en la esquina superior de cada cubeta. NOTA: Cierre inmediatamente el vial que contiene la solucin de desnaturalizacin despus de cada uso. La exposicin prolongada al aire hace que la solucin se deteriore. Aada 10 l de muestra o control negativo a la solucin de desnaturalizacin en cada cubeta. Mezcle con cuidado, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Permita que contine la desnaturalizacin durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Hibridar las muestras 1. 2. Aada con cuidado 2 ml de solucin de hibridacin a cada cubeta, procurando no contaminar otras cubetas. Agite suavemente la cubeta para mezclar los reactivos. Coloque inmediatamente una tira con la lnea de marca orientada hacia arriba en una cubeta. NOTA: Use guantes desechables y pinzas para manipular las tiras. Asegrese de que la tira est completamente sumergida en la solucin. No cubra las cubetas con selladores de microplaca a fin de evitar la contaminacin cruzada. Coloque la bandeja en el bao de agua de agitacin a 49C 0,5C e inmovilice la bandeja entre dos objetos pesados. Establezca unas 80 rpm para el bao de agua, cierre la cubierta e incube la bandeja durante 60 minutos. Asegrese de que cada tira permanezca completamente sumergida y flote libremente. Cuando se haya completado la incubacin de hibridacin, retire la bandeja del bao de agua.
3. 4.
5.
Lavar las tiras PRECAUCIN: sostenga la bandeja formando un ngulo pequeo para que el lquido se acumule en un extremo de una cubeta, por encima de la lnea de marca de la tira, a fin de extraerlo fcilmente. No dae la superficie de la tira. Evite salpicar o transferir soluciones entre cubetas. 1. Aspire la solucin de la cubeta con una pipeta, preferiblemente conectada a un aspirador de vaco.
75 2.
INNO-LiPA HBV Genotyping Aada 2 ml de solucin de lavado astringente a cada cubeta y aclare la tira balanceando la bandeja 1 minuto a 20 - 25C. Aspire la solucin de cada cubeta. NOTA: Es conveniente usar una multipipeta para distribuir la solucin de lavado astringente. Repita el lavado aadiendo 2 ml de solucin de lavado astringente a cada cubeta y lave la tira balanceando la bandeja durante 1 minuto a 20 - 25C. Aspire la solucin de cada cubeta. Aada 2 ml de solucin de lavado astringente a cada cubeta, coloque la bandeja en un bao de agua en agitacin a 49C 0,5C, e inmovilcela entre dos objetos pesados. Establezca unas 80 rpm para el bao de agua, cierre la cubierta e incube la bandeja durante 30 1 minutos. Prepare la solucin de lavado de trabajo y la solucin de conjugado de trabajo (consulte Reactivos).
3. 4.
5.
Revelado del color PRECAUCIN: sostenga la bandeja formando un ngulo pequeo para que el lquido se acumule en un extremo de una cubeta, por encima de la lnea de marca de la tira, a fin de extraerlo fcilmente. No dae la superficie de la tira. Evite salpicar o transferir soluciones entre cubetas. 1. 2. Aspire la solucin de la cubeta mediante una pipeta. Aada 2 ml de solucin de lavado de trabajo a cada cubeta y lave la tira balanceando la bandeja durante 1 minuto a temperatura ambiente. Aspire la solucin de cada cubeta. Repita este paso una vez. 3. Aada 2 ml de solucin de conjugado de trabajo a cada cubeta, coloque la bandeja en un agitador (orbital a 160 rpm o de balanceo a 50 rpm) a 20 - 25C, e incube durante 30 1 minutos. NOTA: Prepare la solucin de sustrato de trabajo durante unos 10 minutos antes del final de la incubacin de conjugado (consulte Reactivos). 4. Cuando se haya completado la incubacin, retire la bandeja del agitador y aspire la solucin de cada cubeta con una pipeta. 5. Aada 2 ml solucin de lavado de trabajo a cada cubeta y lave la tira balanceando la bandeja durante 1 minuto a 20 - 25C. Aspire la solucin de cada cubeta. Repita este paso una vez. 6. Aada 2 ml de tampn Sustrato a cada cubeta y lave la tira balanceando la bandeja durante 1 minuto a 20 - 25C. Aspire la solucin de cada cubeta. 7. Aada 2 ml de solucin de sustrato de trabajo a cada cubeta, coloque la bandeja en el agitador a 20 - 25C e incube durante 30 1 minutos. 8. Cuando se haya completado la incubacin, detenga el revelado de color lavando las tiras: retire la bandeja del agitador, aspire la solucin de cada cubeta y, a continuacin, aada 2 ml de agua destilada a cada cubeta y coloque la bandeja en el agitador durante al menos 3 minutos. Repita este paso una vez. 9. Use pinzas para retirar cada tira desde su cubeta y coloque la tira con la lnea de marca orientada hacia arriba en el papel absorbente. 10. Seque las tiras completamente antes de leer los resultados. Almacene las tiras reveladas y secas en un lugar oscuro.
INNOGENETICS Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LiPA y Auto-LiPA 48 As, Auto-LiPA y Auto-LiPA 48 estn diseados para controlar completamente los pasos de hibridacin, lavado astringente y revelado de color. Auto-LiPA y Auto-LiPA 48 se ofrecen como sistemas sencillos con calentamiento, enfriamiento, aspiracin y pipeteado automatizados. Para obtener ms informacin y ver los protocolos especficos de Auto-LiPA y Auto-LiPA 48 pngase en contacto con su distribuidor local. Resultados para LiPA Lectura
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En la Ilustracin 1 se muestra la posicin de las distintas sondas de oligonucletidos en las tiras de INNO-LiPA HBV Genotyping. Una sonda se considera positiva si aparece una banda de color morado o marrn claro al final del procedimiento de ensayo. Ilustracin 1 (ver pgina 19): posicin de la lnea de marca de color rojo, la banda de control de conjugado (Conj. control), la banda de control de la amplificacin (Amp. control) y las 14 bandas de sonda de la tira de INNO-LiPA HBV Genotyping. Control de calidad La lnea roja superior es la lnea de marca. Esta lnea permite orientar correctamente la tira. La primera banda positiva debe estar alineada con la banda de "Control de conjugado" en la tarjeta de lectura de plstico. Esta lnea controla la adicin de solucin de Conjugado y de solucin de Sustrato durante el procedimiento de deteccin. Debe ser siempre positiva y tener aproximadamente la misma intensidad en cada tira de un mismo ensayo. La segunda banda positiva ("Amp. control" en la tarjeta de lectura) controla la adicin de material amplificado para la hibridacin. Si VHB est presente en la muestra y se han realizado correctamente el procesamiento y la amplificacin de la muestra, el amplicn diana se hibridar con esta banda de control de amplificacin". La tira de control negativo debe estar en blanco excepto para la banda de control de conjugado. Esto indica que no se ha producido contaminacin durante el ensayo.
Interpretacin de los resultados Use SIEMPRE la tabla de tipaje para interpretar correctamente el genotipo de VHB. NOTA: Cepas aisladas de distintos genotipos pueden producir una reaccin cruzada con la misma banda de sonda. Compruebe cuidadosamente en la tabla de tipaje qu patrones de las bandas de sonda corresponden a cada genotipo individual. OBSERVACIN: (patrones no presentes en la tabla de tipaje): Interpretacin de infecciones mixtas: Se ha documentado la existencia de infecciones de genotipo mixto en portadores crnicos de VHB.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Si se detectan varias infecciones de genotipo mediante el ensayo INNO-LiPA HBV Genotyping, los resultados deben interpretarse de la manera siguiente: Si aparecen varias bandas especficas de genotipo para distintos genotipos, se debe notificar un genotipo mixto. Por ejemplo, las bandas positivas 6 - 7 junto con las bandas positivas 8 - 9 se notifican como una muestra B/C coinfectada. Se ha demostrado que el genotipo G de VHB est coinfectado con genotipo A de VHB en la mayora de los casos. Por ejemplo, un patrn de reactividad en el que una banda especfica 16 del genotipo G est presente junto con al menos 2 bandas positivas del genotipo A deber notificarse como una muestra A/G coinfectada. Si aparecen varias bandas especficas de un genotipo junto con una sola banda positiva para un segundo genotipo, deber notificarse como un genotipo individual. El genotipo notificado debe ser el que tiene varias bandas positivas. Observe que una banda individual 16 indica la presencia de un genotipo G.
Resultados indeterminados: Si se producen resultados indeterminados (IND), debern notificarse en los casos siguientes: Bandas reactivas individuales para ms de un genotipo junto con una banda de control de amplificacin positiva (banda 2). Observe que la reactividad de una banda individual 11 y una banda individual 15 debe interpretarse como un genotipo H. Ausencia de bandas positivas especficas del genotipo junto con una banda de control de amplificacin positiva (banda 2). Todas las bandas son positivas.
Si necesita ayuda para la interpretacin, pngase en contacto con su distribuidor. Limitaciones del procedimiento El uso de este kit debe limitarse a personal entrenado en las tcnicas de extraccin y amplificacin de cidos nucleicos de VHB. Lograr una amplificacin especfica requiere una buena prctica de laboratorio y la realizacin minuciosa del procedimiento especificado. Como ocasionalmente la carga de VHB de las muestras infectadas es muy elevada, debern extremarse las precauciones para evitar la contaminacin. La inhibicin de la polimerasa (p.ej., por heparina o hemoglobina) puede hacer fracasar el ensayo. El polvo de los guantes desechables y el hipoclorito sdico tienen un efecto inhibidor en la amplificacin. Pueden producirse infecciones con VHB de genotipo viral mixto. Los cebadores amplifican todos los genotipos simultneamente. En una muestra con infeccin mixta y carga viral baja, es posible que no se detecten todos los genotipos a causa de la competencia de PCR. Este ensayo se basa en la variabilidad de secuencias en los dominios B y C del gen de la polimerasa de VHB, que permite la diferenciacin entre los genotipos A - H de VHB. A causa de cierta heterogeneidad de la secuencia del genoma de VHB, ocasionalmente pueden producirse patrones indeterminados o bandas de sonda con falsos positivos.
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Ocasionalmente se observan resultados que muestran una reactividad baja en todas las bandas y producen un resultado indeterminado. Las muestras en las que se observa este patrn debern amplificarse o extraerse de nuevo.
Eficacia del ensayo La eficacia del ensayo INNO-LiPA HBV Genotyping se evalu en un centro francs y en otro holands con 100 y 273 muestras clnicas positivas (respectivamente) de pacientes infectados con VHB. Adems, en Innogenetics se ensayaron 54 muestras positivas de VHB clasificadas como de genotipo C, F, G o H mediante secuenciacin. Sensibilidad Se obtuvieron resultados positivos (indicados por una banda de control de amplificacin positiva) del ensayo en 415 de 427 muestras tras la amplificacin externa, por lo que la sensibilidad inicial fue del 97,2%. Se volvieron a amplificar 10 de las 12 muestras con xito para las 10 muestras, con lo que la sensibilidad fue del 100% (425/425) tras repetir el ensayo. Exactitud Entre las 425 muestras sometidas a ensayo en INNO-LiPA HBV Genotyping, se observ un resultado indeterminado para 8 muestras (1,9%). Para 415 muestras se obtuvo un resultado de genotipo mediante LiPA y mediante secuenciacin. Para el 92% (382/415) de las muestras, LiPA detect el mismo genotipo que la secuenciacin. Para 19 muestras (4,6%), LiPA detect una coinfeccin, mientras la secuenciacin slo identific uno de los genotipos. Se obtuvo un genotipo distinto con cada mtodo para 14 muestras (3,4%). En la tabla siguiente se proporciona una descripcin de los resultados.
Genotipo de LiPA A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Total Secuenciacin A B C 126 29 1 1 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 Total D 6 E 1 F G H IND 1 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
Se volvieron a analizar con tcnicas diferentes nueve muestras con un resultado diferente de la secuenciacin y en 10 de las muestras con un resultado de genotipo mixto. Se confirmaron los resultados de LiPA para 15 de estas 19 muestras, mientras
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que para 2 muestras se determin que el resultado de LiPA era incorrecto (al menos en parte). Para las otras 2 muestras con un resultado de genotipo mixto en LiPA, slo se confirm uno de los genotipos mediante ensayos adicionales. Tras combinar todos los resultados del ensayo, el resultado de genotipo de LiPA se confirm en el 99% (397/401) de los casos. Precisin Tres operadores distintos realizaron ensayos con un panel de 9 muestras de plsmidos en 2 lotes de tiras de INNO-LiPA HBV Genotyping. Se obtuvo una concordancia del 100% (162/162) en el nivel de genotipo. Adems, se ensay ocho veces un panel de dilucin de seis miembros en el que haba entre 10.000 y 375 copias/ml, derivado de una muestra clnica con genotipo A. Dos operadores distintos (en 2 ubicaciones distintas) extrajeron cada miembro del panel, lo amplificaron con cebadores externos y anidados, y ensayaron con un lote de tiras de INNO-LiPA HBV Genotyping en das diferentes. Se obtuvo una concordancia del 100% (48/48) a nivel de genotipo. Se extrajeron y amplificaron ocho muestras (genotipos A - H) con los reactivos de la amplificacin. Los productos amplificados se aplicaron por duplicado en las tiras de INNO-LiPA HBV Genotyping con 3 lotes de kits LiPA. Se obtuvo una concordancia del 100% (48/48) a nivel de genotipo. Portugus Utilizao O INNO-LiPA HBV Genotyping um ensaio de sondas em linha concebido para identificar os gentipos do vrus da hepatite B (HBV) de A a H atravs da deteco de sequncias especificas do tipo nos dominios B a C do gene da polimerase do HBV. O HBV Genotype Assay (LiPA) no deve ser utilizado como teste de despiste do HBV ou teste de diagnstico para confirmar a presena do HBV. Princpio do teste O vrus da hepatite B (HBV) um vrus de ADN de cadeia parcialmente dupla replicvel atravs de um RNA intermdio. O primeiro passo o isolamento do ADN viral da amostra. O ADN purificado amplificado em dois ciclos de PCR com iniciadores para PCR biotinilados. Os iniciadores exteriores (para a primeira etapa do PCR) utilizados neste teste amplificam parte (domnios B e C) do gene da polimerase do HBV. As duas cadeias da hlice de ADN so separadas (desnaturao) atravs de um processo de aquecimento para expor o alvo aos iniciadores exteriores. Estes iniciadores oligonucleotdicos so complementares s regies conservadas que flanqueiam a regio alvo. Por isso, aps arrefecimento para uma determinada temperatura, estes iniciadores ligam-se sequncia alvo (emparelhamento a 45C). A uma temperatura elevada, na presena de dNTP, a polimerase de ADN termostvel extende os iniciadores emparelhados ao longo do molde alvo (extenso).
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Produz-se uma cpia exacta da sequncia do molde aps um ciclo de desnaturao, emparelhamento e extenso. O processo repetido durante 40 ciclos, produzindo uma sequncia alvo amplificada multiplas vezes com 409 bp. Como a quantidade de produto de amplificao no geralmente suficiente, necessrio um PCR aninhado (segunda etapa). O princpio desta amplificao idntico ao primeiro com excepo que o ADN substitudo pelo produto amplificado do PCR do primeiro ciclo e que os iniciadores exteriores so substitudos pelos iniciadores aninhados biotinilados. O processo de desnaturao, emparelhamento e extenso repetido durante 35 ciclos, produzindo uma sequncia amplificada de 342 bp. Recomendamos que verifique em gel se o produto de amplifico do PCR aninhado ou exterior deve ser utilizado. Depois da amplificao, o material de ADN biotinilado gerado a partir da estrutura de leitura aberta do gene do HBsAg hibridizado com as sondas oligonucleotdicas especficas imobilizadas como linhas paralelas em tiras baseadas em membranas. Depois da hibridizao, o ADN no hibridizado lavado da tira, adicionada estreptavidina com fosfatase alcalina que se liga a quaisquer hbridos biotinilados formados anteriormente. A incubao com o cromognio BCIP/NBT produz um precipitado prpura/castanho. A tira INNO-LiPA HBV Genotyping contm uma linha de marcao vermelha, 2 linhas de controlo e 14 linhas de sondas paralelas. A linha de controlo do conjugado um controlo da reaco da revelao de cor e a linha de controlo de amplificao contm as sondas HBV universais para verificar a presena de material genmico de HBV amplificado. Reagentes Descrio, preparao para utilizao e condies de conservao recomendadas OBSERVAO: Os reagentes AMP e LiPA devem ser armazenados imediatamente aps a chegada: Os reagentes AMP na rea de pr-amplificao e os reagentes LiPA na rea de ps-amplificao. Se armazenados entre 2 - 8C, os reagentes permanecem estveis at data limite de validade. No utilize os reagentes para alm da data de validade. Para evitar a contaminao, recomendamos que divida os reagentes de amplificao em alquotas aps a primeira utilizao. No deve guardar reagentes junto de qualquer fonte de contaminao do ADN, em especial, de produtos amplificados. Deve utilizar tubos e pontas (de preferncia com filtros de algodo) descartveis. Todos reagentes devem ficar temperatura ambiente (20 - 25C) aproximadamente 30 minutos antes da utilizao e ser colocados no frigorifico imediatamente aps a utilizao. Agite brevemente em vrtex e centrifugue brevemente os reagentes descongelados antes de abrir as suas embalagens. Feche os frascos imediatamente aps a utilizao. Alteraes na aparncia fsica dos reagentes do kit podem indicar instabilidade ou deteriorao. Recomendamos que guarde o tubo horizontalmente para minimizar a possibilidade de enrolamento das tiras antes da utilizao.
81 Reagentes fornecidos:
Componente Reagentes AMP: Quantidade Ref. Descrio
Mistura de iniciadores 1 x 0,08 ml 58322 Contm iniciadores biotinilados e 0,05% de NaN3 como exteriores conservante. Mistura de iniciadores 1 x 0,08 ml 58324 Contm iniciadores biotinilados e 0,05% de NaN3 como aninhados conservante. Reagentes LiPA: Tiras Soluo de desnaturao 1 x 20 1 x 1 ml 58321 1 tubo de plstico com tiras INNO-LiPA HBV Genotyping com uma linha de marcao vermelha. 56718 Soluo alcalina com EDTA. CUIDADO: Deve fechar o frasco com a soluo de desnaturao imediatamente aps a utilizao; a exposio prolongada da soluo ao ar leva a uma rpida deteriorao. 57420 Contm tampo SSC com detergentes e conservantes. Deve pr-aquecer a soluo de hibridizao at pelo menos atingir os 37C, no podendo a temperatura exceder os 49C (Todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utilizao).
Soluo de hibridizao
1 x 80 ml
Soluo para lavagem rigorosa
1 x 200 ml 57421 Contm tampo SSC com detergentes e conservantes. Deve pr-aquecer a soluo de lavagem rigorosa at atingir pelo menos os 37C, no podendo a temperatura exceder os 49C (Todos os cristais devem ser dissolvidos antes da sua utilizao). 1 x 0,8 ml 56952 Estreptavidina com fosfatase alcalina em tampo Tris com estabilizadores proteicos e 0,01% MIT/0,098% CAA como conservantes, a diluir a 1/100 em diluente conjugado antes de utilizar. Prepare 2 ml de soluo de conjugado de trabalho para cada cavidade teste + 2 ml em excesso. Para o Auto-LiPA, prepare mais 10 ml. A soluo de conjugado de trabalho permanece estvel durante 24 horas quando for armazenada num local escuro e temperatura ambiente (20 - 25C).
Conjugado 100x
Diluente de conjugado
1 x 80 ml
56951 Tampo fosfato com NaCl, Triton, estabilizadores proteicos e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes.
Substrato BCIP/NBT 1 x 0,8 ml 56954 5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato e 4-nitro azul de 100x tetrazlio em dimetilformamida, a diluir a 1/100 em tampo de substrato antes de utilizar. Prepare 2 ml de soluo de substrato de trabalho para cada cavidade teste + 2 ml em excesso. Para o Auto-LiPA, prepare mais 10 ml. A soluo de substrato de trabalho permanece estvel durante 24 horas quando for armazenada num local escuro e temperatura ambiente (20 - 25C). Tampo de substrato 1 x 180 ml 56953 Tampo Tris com NaCl, MgCl2 e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes.
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Soluo de lavagem 1 x 80 ml 5x
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56721 Tampo fosfato com NaCl, Triton e 0,01% MIT/0,1% CAA como conservantes, a diluir a 1/5 (1 parte + 4 partes) em gua destilada ou desionizada antes de utilizar. Prepare 8 ml de soluo de lavagem de trabalho para cada cavidade teste + 10 ml em excesso. Para Auto-LiPA, prepare 12 ml de Soluo de trabalho Rinse por teste a realizar, mais 20 ml em excesso. A soluo de lavagem de trabalho permanece estvel durante 2 semanas a uma temperatura de 2 - 8C. Com 8 cavidades cada um. Para a identificao de sondas positivas. Para interpretao de resultados. Para guardar tiras processadas.
Tabuleiro de incubao Carto de leitura Diagrama de interpretao Folha de relatrio de dados
3 1 1 2
Material necessrio no fornecido Luvas descartveis. Pontas de pipetas estreis descartveis (de preferncia enchidas com algodo). Microtubos estreis. Suportes para microtubos. Centrifugadora de microtubos. Pipetas ajustveis para dispensar 1 - 20 l, 20 - 200 l e 200 - 1000 l. gua destilada e esterilizada em autoclave.
Especificamente para amplificao Recomendamos a utilizao da polimerase de ADN Taq e do tampo de amplificao Taq fornecidos pela Stratagene para a amplificao. Equipamento e termociclador de ADN. dNTP (25 mM). Tampo Taq 10x (com 100 mM de Tris-HCl pH 8,8; 500 mM de KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (s/v) de gelatina e estabilizadores, Stratagene). Polimerase de ADN Taq (Polimerase de ADN Taq, Stratagene).
Especificamente para LiPA Aspirador. Termmetro calibrado. Pinas. Provetas graduadas (10, 25, 50 e 100 ml). Cronmetro (2 horas 1 minuto). Agitador Vortex ou equivalente. Banho de gua com plataforma agitadora (80 rpm; tampa inclinada, temperatura ajustvel para um mnimo de 49C 0,5C). Agitador orbital (160 rpm) ou oscilador (50 rpm).
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Materiais opcionais: Multipipeta de dispensao (Multipipetas, Eppendorf ou equivalente). Equipamento para automao de passos de processamento de tiras. Para mais informaes, contacte o distribuidor. Segurana e ambiente Ter em ateno a Folha de Dados de Segurana do Material (MSDS) e os rtulos do produto para informaes sobre componentes potencialmente perigosos. A verso mais recente da MSDS est disponvel no site Web www.innogenetics.com.
R20/21, R36, R61, S36/37, S45, S53 Txico! Nocivo por inalao e em contacto com a pele. Irritante para os olhos. Riscos durante a gravidez com efeitos adversos na descendncia. Usar vesturio de proteco e luvas adequadas. Em caso de acidente ou de indisposio, consultar imediatamente o mdico (se possvel mostrar-lhe o rtulo). Evitar a exposio - obter instrues especficas antes da utilizao. Limitado a utilizadores profissionais. Contm dimetilformamida, sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina: Substrato BCIP/NBT 100x.
R43, S24-37 Irritante! Pode causar sensibilizao em contacto com a pele. Evitar o contacto com a pele. Usar luvas adequadas. Contm 2-cloroacetamida: Soluo de lavagem rigorosa, soluo de hibridizao, soluo de lavagem, tampo de substrato e diluente de conjugado.
R34, S28-36/37/39-45 Corrosiva! (C) Contm cido fosfrico. Provoca queimaduras. Aps o contacto com a pele, lave imediata e abundantemente com sabo e gua. Use vesturio de proteco adequado, luvas e proteco para os olhos/rosto. Em caso de acidente ou indisposio, consulte um mdico de imediato (mostre o rtulo sempre que possvel). Contm hidrxido de sdio: Soluo de desnaturao. As amostras devem ser sempre manipuladas como potencialmente infecciosas. Todos os componentes sanguneos e materiais biolgicos devem ser considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser manipulados em conformidade. Este teste s deve ser efectuado por tcnicos com formao adequada. Todas os componentes sanguneos e materiais biolgicos devem ser eliminados em conformidade com os procedimentos de segurana estabelecidos. Autoclavagem durante 15 minutos a 121C no mnimo. Incinere o material descartvel. Misture os resduos lquidos com hipoclorito de sdio para que a concentrao final seja de 1% de hipoclorito de sdio. Deixar repousar durante a noite antes de eliminar os resduos.
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CUIDADO: Neutralize o lquido residual que contenha cido antes de adicionar o hipoclorito de sdio. Use equipamento de proteco pessoal: luvas e culos de segurana quando manipular agentes perigosos ou infecciosos. Os resduos devem ser manipulados de acordo com as directivas de eliminao de resduos da instituio. Deve cumprir todos os regulamentos ambientais, federais, locais e nacionais.
Recolha e manipulao de amostras Utilize o ADN extrado de amostras positivas para HBV isolado imediatamente aps a colheita das amostras ou de amostras congeladas a uma temperatura igual ou inferior a -20C e preferencialmente nunca descongeladas. Pode gerar material amplificado do gene pol do HBV dos domnios B e C. Utilize 10 l de produto amplificado do HBV para o processo LiPA. Observaes e precaues Apenas para utilizao profissional. Deve esterilizar em autoclavagem todas as pontas de pipetas e tubos. Recomendamos a utilizao de pontas de pipetas com filtro de algodo. Utilize apenas materiais de laboratrio descartveis. Utilize uma ponta de pipeta nova por cada amostra dividida em aliquotas. No misture reagentes de kits diferentes, excepto os componentes com nmeros de lote idnticos. Para evitar a contaminao da PCR, maximize a separao das etapas pr e ps-amplificao. No coloque as amostras, o equipamento ou os reagentes na rea onde executou a etapa anterior. Se for necessrio voltar a uma rea de trabalho anterior, realize as etapas de descontaminao adequadas. Utilize pinas para manipular as tiras. No toque nas tiras com as mos porque a oleosidade das mos pode interferir com a hibridizao e a revelao da cor. Utilize apenas lpis para escrever nas tiras. Os reagentes do ensaio podem remover a tinta das tiras. Para obter resultados precisos, utilize um banho de gua para os passos de lavagem e hibridizao, e verifique se a temperatura 49C 0,5C. No utilize um agitador de ar quente. Utilize um termmetro calibrado para fazer um controlo de temperatura rigoroso. Feche sempre a tampa do banho de gua para manter a temperatura. Se a temperatura for muito baixa, o ensaio pode produzir resultados falsos positivos; se a temperatura for muito elevada, pode produzir sinais fracos ou resultados falsos negativos. Utilize um banho de gua agitado com a tampa inclinada para um controlo de temperatura ptimo. A agitao gerada pelo banho de gua com agitao, durante a hibridizao e a lavagem rigorosa, e pelo agitador orbital ou oscilador, durante a revelao da cor, crtica. Ajuste a velocidade destes instrumentos cuidadosamente para maximizar o movimento dos reagentes na tira sem salpicar as solues entre as cavidades do trabalho. Evite salpicar o tabuleiro com o banho de gua. Ajuste o nvel de gua no banho de gua para que fique entre um tero e metade da altura do tabuleiro. Evite o deslizamento do tabuleiro, imobilizando-o com pesos.
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INNO-LiPA HBV Genotyping No deixe que as tiras sequem entre passos. Deixe ficar cada tira na mesma cavidade durante o procedimento. Aspire o lquido de uma cavidade com uma pipeta que pode ser instalada num aspirador de vcuo.
Procedimento do teste para amplificao Protocolo de extraco de ADN: Kit de preparao do molde PCR de elevada pureza (Roche Diagnostics). Consulte o protocolo do kit mencionado. Pode utilizar outros procedimentos de extraco de ADN. Protocolo de amplificao Os protocolos seguintes (Amplificao aninhada e exterior) foram concebidos para amplificao ptima com: Polimerase Taq (5U/l, Stratagene), Tampo Taq 10x (com 100 mM de Tris-HCl pH 8.8; 500 mM de KCl; 15 mM MgCl2, 0,01% (w/v) de gelatina, estabilizadores, Stratagene). Tubos PCR MicroAmp (Tubos finos de 0,2 ml) e Termocicladores PE-2400 ou PE-9600 (Perkin Elmer Cetus). Este protocolo pode ser utilizado para a maioria dos tipos de termocicladores comerciais, mas pode requerer modificaes fornecidas pelo fabricante do termociclador. Tome as precaues necessrias para evitar uma amplificao no especfica, que pode afectar os resultados: descongele os componentes enumerados em seguida e coloque-os em gelo efectue todos passos de pipetao em gelo de uma forma rpida. Amplificao exterior 1. 2. 3. Determine o nmero de tubos a preparar (N) com a frmula seguinte: N = Nmero de amostras + 1 Controlo negativo + 1 Controlo positivo + 1. Utilize pontas de pipetas com filtro de algodo para preparar a mistura principal num tubo de microcentrfuga livre de nucleases, esterilizado por autoclavagem: Prepare a mistura principal 1 com: (N x 32,4 l) gua destilada esterilizada em autoclavagem + (N x 5.0 l) Tampo de amplificao Taq 10x (Stratagene) + (N x 0,4 l) Mistura dNTP (25 mM) + (N x 2,0 l) Mistura de iniciadores exteriores + (N x 0,2 l) Polimerase de ADN 5U/l (Stratagene) Centrifugue brevemente e divida esta mistura principal em aliquotas de 40 l desta mistura principal 1 para tubos de amplificao esterilizados em autoclavagem (N-1). Coloque 10 l de ADN purificado ou 10 l de gua destilada com uma pipeta (Sem ADN no Controlo negativo). OBSERVAO: Misture e centrifugue brevemente a mistura para recolher o lquido no fundo do tubo.
4.
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Coloque as amostras no bloco trmico calibrado (consulte as instrues fornecidas pelo fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificao concebido para a amplificao exterior INNO-LiPA HPV Genotyping. Perfil da amplificao exterior INNO-LiPA HBV Genotyping para um termociclador PE-2400 ou PE-9600:
Passo 1 2 3 4 5 6 Desnaturao Desnaturao Emparelhar iniciadores Estender iniciadores Alongar Arrefecer para 4C Temp 94C 94C 45C 72C 72C Tempo 4 min. 30 seg. 30 seg. 30 seg. 10 min. Repetir ciclo passos 2 - 4, 40 vezes
6.
Depois deste processo, utilize as amostras imediatamente para a amplificao aninhada ou guarde-as a uma temperatura de -15/-25C. NOTA: No armazene os produtos de de amplificao de ADN junto de reagentes de amplificao ou do ADN extrado.
Amplificao aninhada 1. Determine o nmero de tubos a preparar (N) com a frmula seguinte: N = Nmero de amostras amplificadas exteriores + Controlo negativo amplificado exterior + 1 Controlo negativo + 1 Controlo positivo + 1. Utilize uma ponta de pipeta com filtro de algodo para preparar a mistura principal 2 num tubo esterilizado em autoclavagem: (N x 40,4l) gua destilada esterilizada em autoclavagem + (N x 0,4 l) Mistura dNTP (25 mM) + (N x 5,0 l) Tampo de amplificao Taq 10x (Stratagene) + (N x 2,0 l) Mistura de iniciadores aninhados + (N x 0,2 l) Polimerase de ADN Taq 5U/l (Stratagene) Misture por vrtex brevemente e divida esta mistura principal em alquotas de 48 l para (N-1) tubos de amplificao esterilizados por autoclavagem. Coloque 2 l de produtos amplificados exteriores ou 2 l de gua destilada com uma pipeta (Sem ADN no Controlo negativo) OBSERVAO: Misture por vrtex e centrifugue brevemente a mistura para recolher o lquido no fundo do tubo. Coloque as amostras no bloco trmico calibrado (consulte as instrues fornecidas pelo fabricante do termociclador). Inicie o programa de amplificao concebido para a amplificao aninhada INNO-LiPA HPV Genotyping.
2.
3.
87
INNO-LiPA HBV Genotyping Perfil da amplificao aninhada INNO-LiPA HBV Genotyping para um termociclador PE-2400 ou PE-9600:
Passo 1 2 3 4 6 7 Desnaturao Temp 94C Tempo 4 min. 30 seg. 30 seg. 30 seg. 10 min. Repetir ciclo passos 2 - 4, 35 vezes
Desnaturao 94C Emparelhar iniciadores 45C Estender iniciadores 72C Alongar Arrefecer para 4C 72C
4.
Depois deste processo, analise 5 l de produto amplificado aninhado e exterior em gel de agarose de 2% ou guarde-o a uma temperatura de -15/-25C. Recomendamos, com base nas observaes internas, que se o produto amplificado exterior fornecer uma banda de 409 bp, o ensaio LiPA deve fornecer um resultado interpretvel. Se no for visvel nenhuma banda para o produto amplificado exterior, utilize o produto amplificado aninhado com o INNO-LiPA HBV Genotyping. NOTA: No armazene os produtos de amplificao de ADN junto de reagentes de amplificao ou de ADN extrado.
Resultados da amplificao Visualizao A presena de produtos amplificados pode ser verificada com um gel de agarose de 2%. Coloque 5 l de produto amplificado em cada ranhura. O produto amplificado aninhado deve aparecer como uma banda com um comprimento de 342 bp. O produto amplificado exterior deve aparecer como uma banda com um comprimento de 409 bp.
Controlo de qualidade Inclua pelo menos um branco para extraco. Inclua pelo menos um controlo positivo e um controlo negativo para cada amplificao. Tal como sucede com qualquer outro novo procedimento de laboratrio, at se ter alcanado um grau de confiana mais elevado quanto execuo correcta do procedimento deve ser considerada a incluso de controlos positivos e negativos adicionais. Se for desejvel a incluso de um controlo positivo adicional, utilize uma amostra conhecida como positiva. Se obtiver uma banda positiva no gel para o controlo negativo, deve rejeitar a srie de ensaio inteira e repetir o procedimento do incio.
INNOGENETICS Procedimento do teste para o LiPA Desnaturao das amostras
88
CUIDADO: Utilize um termmetro calibrado para verificar se a temperatura do banho de gua agitado 49C 0,5C, e ajuste a temperatura, se for necessrio, antes de adicionar um tabuleiro de amostras. 1. 2. Equilibre um banho de gua agitado a 49C 0.5C. Coloque a soluo de hibridizao e a soluo de lavagem rigorosa num banho de gua com uma temperatura entre 37 e 49C para dissolver todos os cristais. Certifique-se de que o banho de gua no excede 49C. Agite a garrafa para misturar antes de utilizar. Remova uma tira de cada amostra com as pinas. Escreva um nmero de identificao com um lpis por cima da linha de marcao vermelha da tira. Inclua sempre uma tira para o controlo negativo (produto amplificado de uma amostra negativa do HBV). NOTA: No coloque a tira na cavidade at ao passo 2 da Hibridizao das amostras. Coloque uma cavidade para cada amostra/tira no tabuleiro. Adicione 10 l de soluo de desnaturao no canto superior de cada cavidade. NOTA: Feche imediatamente o frasco com a soluo de desnaturao depois de cada utilizao. A exposio prolongada ao ar provoca a deteriorao da soluo. Adicione 10 l de controlo negativo ou amostra soluo de desnaturao em cada cavidade. Misture cuidadosamente com a pipeta. Deixe ficar a desnaturao durante 5 minutos temperatura ambiente.
3.
4. 5.
6. 7.
Hibridizao das amostras 1. 2. Adicione cuidadosamente 2 ml de soluo de hibridizao em cada cavidade, tendo cuidado para no contaminar as outras cavidades. Agite a cavidade para misturar os reagentes. Coloque imediatamente uma tira com a linha de marcao virada para cima numa cavidade. NOTA: Use luvas descartveis e pinas quando manusear as tiras. Certifique-se de que a tira est completamente submergida na soluo. No cubra as cavidades com selantes de microplacas para evitar a contaminao cruzada. Coloque o tabuleiro no banho de gua agitado a 49C 0.5C e imobilize o tabuleiro entre dois pesos pesados. Defina o banho de gua para cerca de 80 rpm, feche a tampa e incube o tabuleiro durante 60 minutos. Certifique-se de que cada tira permanece completamente submersa e flutua livremente. Quando a incubao da hibridizao terminar, remova o tabuleiro do banho de gua.
3. 4.
5.
Lavagem das tiras CUIDADO: Segure no tabuleiro num ngulo baixo para que o lquido se acumule numa extremidade de uma cavidade, por cima da linha de marcao da tira, para fcil remoo. No danifique a superfcie da tira. Evite salpicar ou transferir solues entre cavidades.
89 1. 2.
INNO-LiPA HBV Genotyping Aspire a soluo da cavidade com uma pipeta, de preferncia ligada a aspirador de vcuo. Adicione 2 ml de soluo de lavagem rigorosa em cada cavidade e agite o tabuleiro durante 1 minuto a 20 - 25C para lavar a tira. Aspire a soluo de cada cavidade. NOTA: Uma multipipeta til para distribuir a soluo de lavagem rigorosa. Repita a lavagem atravs da adio de 2 ml de soluo de lavagem rigorosa em cada cavidade e da agitao do tabuleiro durante 1 minuto a 20 - 25C para lavar a tira. Aspire a soluo de cada cavidade. Adicione 2 ml de soluo de lavagem rigorosa em cada cavidade, coloque o tabuleiro no banho de gua agitado a 49C 0.5C e imobilize o tabuleiro entre dois pesos pesados. Defina o banho de gua para cerca de 80 rpm, feche a tampa e incube o tabuleiro durante 30 1 minutos. Prepare a soluo de lavagem de trabalho e a soluo de conjugado de trabalho (Ver Reagentes).
3. 4.
5.
Revelao da cor CUIDADO: Segure no tabuleiro num ngulo baixo para que o lquido se acumule numa extremidade de uma cavidade, por cima da linha de marcao da tira, para fcil remoo. No danifique a superfcie da tira. Evite salpicar ou transferir solues entre cavidades. Aspire a soluo da cavidade com uma pipeta. Adicione 2 ml de soluo de lavagem de trabalho em cada cavidade e agite o tabuleiro durante 1 minuto temperatura ambiente para lavar a tira. Aspire a soluo de cada cavidade. Repita este passo uma vez. 3. Adicione 2 ml de soluo de conjugado de trabalho em cada cavidade, coloque o tabuleiro num agitador (orbital a 160 rpm ou oscilador a 50 rpm) a 20 - 25C e incube durante 30 1 minutos. NOTA: Prepare a soluo de substrato de trabalho cerca de 10 minutos antes do fim da incubao do conjugado (Ver Reagentes). 4. Quando a incubao terminar, remova o tabuleiro do agitador e aspire a soluo de cada cavidade com uma pipeta. 5. Adicione 2 ml de soluo de lavagem de trabalho em cada cavidade e agite o tabuleiro durante 1 minuto a 20 - 25C para lavar a tira. Aspire a soluo de cada cavidade. Repita este passo uma vez. 6. Adicione 2 ml de tampo de substrato em cada cavidade e agite o tabuleiro durante 1 minuto a 20 - 25C para lavar a tira. Aspire a soluo de cada cavidade. 7. Adicione 2 ml de soluo de substrato de trabalho em cada cavidade, coloque no agitador a 20 - 25C e incube durante 30 1 minutos. 8. Quando a incubao terminar, pare a revelao da cor atravs da lavagem das tiras: remova o tabuleiro do agitador, aspire a soluo de cada cavidade e, em seguida, adicione 2 ml de gua destilada em cada cavidade e coloque o tabuleiro no agitador durante 3 minutos. Repita este passo uma vez. 9. Remova cada tira da cavidade e coloque a tira com a linha de marcao virada para cima em papel absorvente com as pinas. 10. Seque as tiras completamente antes de ler os resultados. Armazene em lugar escuro as tiras secas e processadas. 1. 2.
INNOGENETICS Procedimento de teste automatizado: Auto-LiPA e Auto-LiPA 48
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Deste modo, o Auto-LiPA e Auto-LiPA 48 foram concebidos para realizar totalmente as etapas da hibridizao, da lavagem rigorosa e da revelao da cor. O Auto-LiPA e o Auto-LiPA 48 so concebidos como equipamentos autnomos com aquecimento, refrigerao, aspirao e pipetagem automatizados. Para mais informaes e protocolos especficos para o Auto-LiPA e o Auto-LiPA 48, contacte o distribuidor local. Resultados do LiPA Leitura A figura 1 mostra a posio das diferentes sondas de oligonucleotidos na tira INNOLiPA HBV Genotyping. Uma linha considerada positiva quando aparecer uma faixa de cor prpura/castanho claro no final do teste. Fig. 1 (ver pgina 19): Localizao da linha de marcao vermelha, linha de controlo de Conjugado (controlo de Conjugado), linha de controlo de Amplificao (controlo de Amplificao) e 14 linhas de sondas na tira INNO-LiPA HBV Genotyping. Controlo de qualidade A linha superior vermelha a linha de marcao. Esta linha permite orientar correctamente a tira. A primeira linha positiva deve estar alinhada com a linha "controlo Conj." no carto de leitura de plstico. Esta linha controla a adio da soluo de conjugado e substrato reactiva durante o procedimento de deteco. Esta linha deve estar sempre positiva e ter aproximadamente a mesma intensidade em todas as tiras utilizadas durante a mesma srie de testes. A segunda linha positiva ("controlo de Amplificao" no carto de leitura) controla a adio de material amplificado para hibridizao. Se o HBV estiver presente na amostra e ocorreu a amplificao e o processamento de amostras correctos, a amplificao alvo hibridiza para esta Linha de controlo de Amplificao". A tira de controlo negativo deve estar em branco, excepto para a linha de controlo de conjugado. Isto demonstra que no h contaminao durante a execuo do ensaio.
Interpretao dos resultados Utilize sempre a tabela de interpretao para correcta interpretao do gentipo HBV. NOTA: O isolamento de diferentes gentipos pode fazer uma reaco cruzada na mesma linha de sonda. Verifique cuidadosamente os padres da linha da sonda aplicveis a cada gentipo individual na tabela de interpretao. OBSERVAO: (padres no presentes na tabela de interpretao): Interpretao de infeces mistas: A existncia de infeces de gentipos mistos em portadores crnicos de HBV foi documentada.
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INNO-LiPA HBV Genotyping Quando detectar vrias infeces de gentipos com o ensaio INNO-LiPA HBV Genotyping, deve interpretar os resultados da seguinte forma: Se vrias linhas especficas de gentipos mostrarem diferentes gentipos, deve indicar um gentipo misto. Por exemplo, as linhas 6 - 7 positivas juntamente com as linhas 8 - 9 positivas so indicadas como uma amostra co-infectada B/C. O gentipo HBV G est co-infectado com o gentipo HBV A na maioria dos casos. Por exemplo, um padro de reaco em que a linha especfica 16 do gentipo G est presente juntamente com pelo menos 2 linhas positivas do gentipo A devem ser indicadas como uma amostra co-infectada A/G. Se aparecerem vrias linhas especficas dos gentipos para um gentipo juntamente com uma linha positiva nica para um segundo gentipo, este deve ser comunicado como um gentipo nico. O gentipo indicado deve ser o gentipo com as vrias linhas positivas. No se esquea de que uma linha nica 16 indicativa da presena de um gentipo G.
Resultados indeterminados: Os resultados indeterminados (IND) devem ser indicados nos seguintes casos: Linhas de reaco nica para mais de um gentipo juntamente com uma linha de controlo de amplificao positiva (linha 2). No se esquea de que a reaco da linha nica 11 e da linha nica 15 deve ser interpretada como o gentipo H. Ausncia de linhas especficas do gentipo positivas juntamente com uma linha de controlo de amplificao positiva (linha 2). Todas as linhas positivas.
Para obter suporte para a interpretao, contacte o distribuidor. Limites dos procedimentos A utilizao deste kit deve ser limitada a pessoal com formao em tcnicas de amplificao e extraco de cido nucleico do HBV. Uma boa prtica de laboratrio e a aplicao atenta do procedimento previamente especificado permitem realizar a amplificao especfica com xito. Devido ao elevado nmero ocasional de amostras infectadas de HBV, deve ter muito cuidado para evitar a contaminao. A inibio da polimerase (ex. hemoglobina heparina) pode ser o motivo para a falha completa do ensaio. O p das luvas descartveis e hipoclorito de sdio tm um efeito inibidor sob a amplificao. Podem ocorrer infeces HBV com o gentipo viral misto. Os iniciadores amplificam todos os gentipos em simultneo. Numa amostra com infeco mista e baixa carga viral, possvel que nem todos os gentipos sejam detectados devido competio do PCR. Este ensaio baseia-se na variao de sequncias do gene da polimerase do HBV dos domnios B e C, permitindo a diferenciao entre os gentipos HBV de A a H. Devido a alguma heterogeneidade das sequncias do genoma do HBV, os padres indeterminados ou as linhas das sondas de reaco falsa podem ser produzidos ocasionalmente.
INNOGENETICS -
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Os resultados com fraca reaco em todas as linhas so observados ocasionalmente e produzem um resultado indeterminado. Deve voltar amplificar ou extrair amostras com este padro.
Desempenho do teste O desempenho do teste do ensaio INNO-LiPA HBV Genotyping foi avaliado num centro francs e noutro holands com amostras clnicas positivas HBV de, respectivamente, 100 e 273 pessoas infectadas com HBV. Alm disso, as 54 amostras positivas HBV classificadas como gentipo C, F, G, ou H por sequenciao foram testadas na Innogenetics. Sensibilidade Os resultados dos testes positivos indicados por uma linha de controlo de amplificao positiva foram obtidos em 415 das 427 amostras depois da amplificao inicial, resultando numa sensibilidade inicial de 97,2%. A nova amplificao de 10 das 12 amostras foi efectuada com sucesso para as 10 amostras, resultando numa sensibilidade de 100% (425/425) depois de repetir o teste. Preciso Entre as 425 amostras testadas no INNO-LiPA HBV Genotyping, foi observado um resultado indeterminado em 8 amostras (1,9%). Nas 415 amostras, foi obtido um resultado de gentipo com LiPA e sequenciao. Em 92% (382/415) das amostras, o LiPA detectou o mesmo gentipo que a sequenciao. Em 19 amostras (4,6%), o LiPA detectou uma co-infeco enquanto a sequenciao identificou apenas um dos gentipos. Foi obtido um diferente gentipo com cada mtodo em 14 amostras (3,4%). A tabela seguinte fornece uma viso geral dos resultados.
Gentipo Total LiPA A B C D E F G H A/D A/E A/G D/G A/D/G H/G A/H/G IND Total Sequenciao A 126 1 1 B 29 45 129 1 1 6 9 9 29 2 4 3 1 5 1 2 1 1 1 1 134 1 31 1 46 6 150 8 9 12 33 2 1 C D 6 E 1 F G H IND 1 134 29 46 130 8 10 9 29 8 1 6 4 1 1 1 8 425
Nove amostras com um resultado diferente da sequenciao e dez amostras com um resultado de gentipo misto foram analisadas com diferentes tcnicas. Os resultados do LiPA foram confirmados para 15 das 19 amostras enquanto para 2 amostras o resultado
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do LiPA foi considerado, pelo menos parcialmente, incorrecto. Para as outras 2 amostras com um resultado de gentipo misto no LiPA, apenas um dos gentipos foi confirmado aps teste adicional. Depois de combinar todos os resultados dos testes, o resultado do gentipo do LiPA foi confirmado em 99% (397/401) dos casos. Preciso Um painel de 9 amostras de plasma foi testado por 3 operadores diferentes em triplicado em 2 lotes de tiras INNO-LiPA HBV Genotyping. Foi obtida uma concordncia de 100% (162/162) no nvel do gentipo. Alm disso, um painel de diluio de seis membros entre 10 000 e 375 cpias/ml e derivado de uma amostra clnica com gentipo A foi testada oito vezes. Cada membro do painel foi extrado, amplificado com iniciadores exteriores e aninhados, e testado num lote de tiras INNO-LiPA HBV Genotyping em dias diferentes por 2 operadores diferentes em 2 locais diferentes. Foi obtida uma concordncia de 100% (48/48) no nvel do gentipo. Foram extradas e amplificadas oito amostras (gentipos de A a H) com os reagentes de amplificao. Os produtos amplificados foram trabalhados em duplicado nas tiras INNO-LiPA HBV Genotyping com 3 lotes de kits de LiPA. Foi obtida uma concordncia de 100% (48/48) no nvel do gentipo.
INNOGENETICS
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2007 Innogenetics Group

INNOGENETICS* TABLE OF CONTENTS

*INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.

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9 English Intended use

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Incubation trays Reading card Interpretation chart

Data reporting sheet 2

INNOGENETICS Specifically for LiPA -

19 Results for LiPA Reading

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INNOGENETICS Ractifs fournis

Solution de Lavage Stringent

Substrat BCIP/NBT 100x

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Supports pour incubation Carte de lecture Table dinterprtation Feuille de rsultats

27 Recueil et manipulation des chantillons

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Rpter les tapes 2 4 du cycle, 40 fois

33 Rsultats pour LiPA Lecture

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INNOGENETICS Gelieferte Reagenzien:

Konjugatverdnner 100x konzentriertes BCIP/NBT-Substrat

Substratpuffer 5x konzentrierte Spllsung

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Schalen fr Inkubationswannen Ableseschablone Auswertungstabelle Datenblatt

INNOGENETICS Sicherheits- und Umwelthinweise -

45 Testverfahren fr LiPA Denaturierung der Proben

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INNOGENETICS Waschen der Teststreifen

INNO-LiPA HBV Genotyping

INNO-LiPA HBV Genotyping

INNOGENETICS Reagenti Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione raccomandate

Soluzione lavaggio stringente

INNO-LiPA HBV Genotyping

Diluente del coniugato 1 x 80 ml Substrato BCIP/NBT 100x

Tampone substrato Soluzione di risciacquo 5x

Portavaschetta d'incubazione Scheda di lettura Diagramma d'interpretazione Foglio rapporto dati

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Per assistenza all'interpretazione, contattare il proprio distributore.

63 Limiti della procedura -

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65 Espaol Uso al que est destinado

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Solucin de lavado astringente

Diluyente de conjugado 1 x 80 ml Sustrato BCIP/NBT 100x

Bandejas de incubacin 3 Tarjeta de lectura Tabla de tipaje Hoja de registro de datos 1 1 2

INNOGENETICS Materiales necesarios pero no suministrados -

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INNOGENETICS Recoleccin y manipulacin de muestras

71 Procedimiento de ensayo para la amplificacin

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