Tcnicas de PCR: Aplicaes e Padronizao de Reaes

BSc. Daniel Perez Vieira

(Protozoologia-IMTSP/ Laboratrio de Biologia Molecular-IPEN)

Aula 2 - Caractersticas das Reaes e Padronizao

O advento da PCR foi certamente um dos maiores passos das Cincias Biolgicas durante o Sculo XX. Sem a PCR dificilmente se conseguiria o seqenciamento de genomas, a expresso de genes em sistemas recombinantes, o estudo de gentica molecular, a determinao rpida da paternidade de alguns indivduos, o diagnstico rpido de doenas virais, entre outros processos. Como comparao, o perodo compreendido entre a infeco de uma pessoa por HIV e a capacidade de um mtodo imunolgico detect-la (janela imunolgica) estimado entre 4 meses a 1 ano. Utilizando a PCR, este perodo pode ser reduzido para um valor entre 40 e 70 dias. Ainda pode-se levar em conta os avanos tecnolgicos indiretos impulsionados pela PCR: com o grande volume de amostras genmicas, a indstria computacional foi forada a desenvolver servidores com maiores capacidades de processamento e armazenamento de dados para lidar com a estrondosa quantidade de dados obtidos em grandes projetos de seqenciamento; tcnicas de DNA recombinante foram revolucionadas aps sua conjugao com a PCR; organismos transgnicos so mais facilmente gerados e sua presena facilmente detectada em amostras por PCR... A lista enorme. Sobre o custo, uma reao de PCR completa (extrao de

DNA+PCR+Eletroforese) hoje pode custar muito menos que uma reao sorolgica, devido ao alto preo de alguns anticorpos comerciais. Anlises de

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receptores de membranas celulares, antes restritas citometria de fluxo (altssimo custo) podem ser feitas rapidamente e com baixos gastos por RT-PCR. Por causa de sua alta sensibilidade, fcil realizao e atual baixssimo custo por reao, a PCR adotada como Gold Standard (Padro de Ouro), ou seja, como prova irrevogvel em algumas situaes. Por exemplo: Em ginecologia, quando os exames citolgicos e colposcpicos detectam leses causadas por HPV, o material levado anlise molecular, a fim de se determinar se o vrus desta paciente tem potencial oncognico ou no. Por outro lado, a comunidade cientfica e as grandes indstrias farmacuticas exigem que as reaes de PCR sejam altamente especficas, de total eficincia e total reprodutibilidade. Portanto, para um protocolo padronizado atingir o status descrito acima deve, no mnimo, atender a estas condies. Para garantir estes nveis de confiana, o biologista molecular deve padronizar seu protocolo a fim de se obter a melhor performance possvel. Produtos inespecficos, ausncia de bandas, contaminaes DNA/RNA e RNA/DNA, impureza das amostras, so situaes que podem ser resolvidas de maneiras muito simples tendo-se o conhecimento dos reagentes, processos e aparelhos utilizados. Composio das reaes DNA Polimerase, Buffers (Solues-Tampo) e MgCl2: A DNA polimerase escolhida deve sempre operar sob as condies de reao institudas e mantidas pelos tampes especficos, alm de ser ativada pela presena de um on metlico especfico, e de obrigatoriamente ser termoestvel. A mais utilizada ainda a Taq, porm cada vez mais pura e com maior atividade. Algumas variedades (Gold, da Perkin-Elmer, Platinum, da Life-Technologies) so vendidas em concentraes levemente maiores que o usual (5 ou 10 U/L), apresentando maior eficcia.

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Existem enzimas Taq de origem recombinante, de custo bem menor, mas no recomendadas para uso em PCR (destinadas clonagem de vetores gnicos sem o uso de organismos vivos), apesar de apresentarem bons resultados em algumas reaes. Devido sua popularidade, a Taq a DNA polimerase mais utilizada em reaes convencionais; porm, em alguns protocolos seu uso contra-indicado. Esta enzima classificada com Non-Proofreading, o que quer dizer que pode haver alguns erros na seqncia do fragmento final. Enzimas desta classe percorrem a fita de DNA apenas uma vez, dando chance de que algum erro durante a duplicao no seja reparado. Alm disso, ela ainda adiciona uma adenina extra s extremidades 3 do DNA, o que pode dificultar o uso posterior do amplificado (insero em vetores). Para casos com estes, existem as enzimas da classe Proofreading, que alm de percorrerem a fita me no mnimo 2 vezes (a enzima pode percorrer a cadeia tanto no sentido 5-3 quanto no 3-5), e em geral no adicionam nucleotdeos extras nas bordas das cadeias-filhas. A lista destas enzimas vasta e cresce espantosamente, mas podemos ressaltar a Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis). Todas as enzimas listadas tm temperatura tima entre 72 e 74C, e meia-vida a 95C em torno de 300 minutos, o que as torna apropriadas para PCR. Como so diretamente responsveis pela atividade da enzima, os tampes e o MgCl2 so considerados fatores crticos. Altas atividades levam a bandas inespecficas ou inativao por baixa quantidade relativa de substrato; baixas atividades levam ausncia de produto, as duas situaes regidas principalmente por essas duas solues.

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Primers: Antes das etapas experimentais, deve-se planejar cuidadosamente a seqncia e algumas caractersticas dos primers. Anteriormente concebidos por mtodos manuais, hoje existem programas que desenham oligonucleotdeos e prevem seu comportamento nas reaes. Alm da complementaridade, um ponto importantssimo da natureza deste reagente o seu Ponto de Fuso Mdio, denominado Tm (Temperature of Melting), que a temperatura na qual metade dos iniciadores est anelada s fitas de DNA e a outra livre na soluo.

Fig. 1: Grfico de determinao de Tm. Na temperatura indicada pela seta no eixo x, metade dos primers est anelada s cadeias de DNA-molde.

Para cada par de primers que utilizado, um Tm diferente determinado. Se utilizssemos uma temperatura em que todos os primers estivessem anelados, teramos grande taxa de formao de primer-dimers, que nada mais so primers anelados entre si. A temperatura mdia garante que, enquanto metade deles est

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nas cadeias-me, a outra metade est inteiramente disponvel para o prximo ciclo. Os dois componentes do par (Sense e Antisense Primers) devem possuir Tm igual ou muito prximo para evitar alguns problemas na reao. A partir do valor de Tm podemos determinar o Ta, que a temperatura tima de reao do par de primers. Estas temperaturas so afetadas diretamente pela concentrao do on Na+ na soluo (pode precipitar os primers para o fundo do tubo, prejudicando a cintica da reao;porm necessrio na manuteno do pH e dH da reao) e na presena de agentes adstringentes, que inibem o anelamento (formamida; DMSO=Dimetilsulfxido; Glicerol sob certas condies). A seqncia de bases dos primers deve ser conferida quanto chance de formao de Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense), Self-Dimers (anelamentos Sense/Sense ou Antisense/Antisense) e Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que ela se pareie consigo mesma). DNA Molde: Sua concentrao deve ser adequada s condies da reao. Produtos inespecficos podem indicar excesso de template nas reaes. O ideal utilizar 5 L de uma soluo de 5g/mL de DNA dissolvido em gua ou em algum tampo apropriado (TE = Tris-EDTA; HEPES; NaOH 0,8M em gua, etc.). Estes tampes devem ser escolhidos com cuidado: EDTA pode inibir drasticamente a atividade das DNA polimerases se estiver em excesso (acepta ons metlicos), por exemplo. Portanto, o DNA preferencialmente deve ser diludo em gua deionizada estril, a menos que se pretenda estoc-lo por longos perodos de tempo; neste caso, tampes levemente alcalinos (pH 7,8 a 8,0) so indicados. Contaminaes com RNA ou DNA de outra amostra devem ser levadas em conta e evitadas ao mximo. Usualmente utiliza-se RNAses para a purificao do DNA, e DNAses para a purificao de RNA. Alm disso, a adio de algumas etapas extra aps a extrao no sentido de purificar e dessalinizar a amostra de cido nuclico considerada medida de bom senso. Apesar de ser relativamente termoestvel, o DNA deve ser estocado a 20C, onde pode permanecer sem alterao perceptvel por at 2 anos em tampo apropriado. Recomenda-se o armazenamento do DNA a 80C e nunca em nitrognio lquido (temperaturas baixas demais fazem o DNA adsorver molculas

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de N2 na sua superfcie, impossibilitando o seu uso). Para RNA o armazenamento obrigatrio a 80C. As reaes contm ainda dNTPs e gua. Extrao de cidos Nuclicos. Anteriormente, a extrao de DNA se resumia ao cozimento do material biolgico por alguns minutos em banho-maria, adio de NaCl em altas concentraes (3 a 6M) e etanol, com alguns passos de centrifugamento. Apesar de render quantidades razoveis de DNA, o pellet resultante ainda continha muitos restos celulares (membranas, lipdeos, etc.), o que poderia comprometer o resultado da PCR. Todos os principais protocolos atuais de extrao de cidos nuclicos seguem o mesmo esquema, otimizado: 1) Coleta, separao e lise do material vivo; 2) Separao da soluo em fases e 3) Precipitao e lavagem do produto. Todos os reagentes devem estar preferencialmente gelados, e a centrfuga usada a 4C. Coleta, separao e lise do material biolgico: A integridade do material extrado depende principalmente deste incio de processo. Para remover fases dispensveis, costuma-se usualmente centrifugar imediatamente aps a coleta o material. Assim, uma amostra de clulas sangneas no ter traos significativos de plasma; uma suspenso fecal estar livre de partculas slidas; uma amostra de urina ou de lquor se tornar livre de clulas. Cuidados especiais devem ser tomados com amostras com alta celularidade (sangue), grande quantidade de inibidores enzimticos (urina), lipdeos (tecido nervoso) e protenas (tecido heptico). Quanto ao sangue, durante a coleta no se pode usar heparina como anticoagulante, pois esta substncia forte inibidor das DNA polimerases, especialmente a Taq. A urina deve ser centrifugada e sofrer o mnimo de contato possvel com a atmosfera para inibir a oxidao de certos componentes.

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A lise consiste no tratamento das membranas celulares com detergentes (aninicos, catinicos ou zwitterinicos). Normalmente utiliza-se o N-LauroilSarcosino ou o SDS (Sodium Dodecyl-Sulphate). Assim, todo o contedo citoplasmtico torna-se livre na soluo. Para bactrias, que possuem parede celular, no se utiliza lise: solues de altas concentraes de glicose alteram a osmolaridade extracelular e foram a expulso do citoplasma para o meio. Tecidos vegetais so tratados inicialmente com nitrognio lquido, que petrifica a membrana celulsica ou formaes como esclernquima. Nesse estado, o material triturado por esmagamento, e depois a lise realizada. Aps a lise pode ocorrer a adio de sais caotrpicos em altas concentraes (4 a 8M), que inibem a formao de duplas-fitas e impedem que o DNA (ou RNA) fique preso em restos celulares. O Tiocianato de Guanidina ou a Guanidina-HCl so os compostos mais eficientes para este propsito. No caso de partculas virais, a etapa de lise no ocorre: os compostos de guanidina so suficientemente eficazes na quebra dos capsdeos. Compostos caotrpicos so, portanto, altamente denaturantes e permitem o fracionamento total do material. Separao da Soluo em fases: Aps fragmentar o material completamente, deve-se criar uma soluo heterognea, de modo que o cido nuclico de interesse seja solvel em apenas uma das fases. Utiliza-se ento uma soluo de fenol, dissolvido em TE e pH em torno de 8,0 para extrair DNA e 7,2 para RNA (o DNA mais solvel em meio alcalino; o RNA nem tanto). O fenol, solvente orgnico, no se mistura gua. Porm o DNA e o RNA so altamente solveis em fenol, assim como os lipdeos. Para separar os lipdeos, adiciona-se clorofrmio mistura.Em tecidos ricos em lipdeos adiciona-se aproximadamente 40% a mais de clorofrmio. A seleo entre DNA e RNA feita pelo pH da soluo, como dito acima. Adiciona-se sais, normalmente Acetato de Sdio e/ou de Potssio, para a precipitao do material. Aps centrifugamento, obtm-se pelo menos duas fases: uma aquosa e uma fenlica. A fase fenlica contm o DNA; a aquosa, aps centrifugamento, o RNA. Ento separa-se a frao de interesse.

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Precipitao e lavagem do produto: Adiciona-se isopropanol fase recuperada na etapa anterior. Para a recuperao de RNA, recomenda-se incubao overnight a 20C para otimizar a precipitao. Para DNA, centrifugamento a 13000xg por alguns minutos. Descarta-se o isopropanol e adiciona-se etanol, preferencialmente 70% e gelado, com a funo de precipitar totalmente as cadeias de cido nuclico em centrfuga. Etanol absoluto pode desidratar demais a amostra, dificultando a dissoluo do produto final, alm de no permitir a dessalinizao completa da amostra (os acetatos so mais solveis em gua do que em etanol). Aps centrifugamento, surge no fundo do tubo um pellet, variando do transparente ao branco. Pellets amarelados indicam impurezas, o que requer a repetio deste passo final. o caso do tecido heptico, rico em protenas e de difcil purificao. A purificao adequada das amostras de grande importncia: traos de fenol, protenas e sais so reconhecidamente complexantes das reaes de PCR. Aps secagem, o material ressuspenso como descrito acima e quantificado. Utiliza-se a espectrofotometria por UV de 260nm como padro. Relaes absorbncia/concentrao

dsDNA: 1 A260 - 50mg/mL (0,15mM) ssDNA : 1 A260 - 33mg/mL (0,1mM) ssRNA : 1 A260 - 40mg/mL (0,12mM)
A absorbncia a 280nm tambm medida. Sua relao com A260 usada para determinar o grau de pureza da amostra. Para DNA, a relao A260/A280 deve estar entre 1,7 e 1,9; para RNA entre 1,8 e 2,0.

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PCR Na verdade, cada reao possui suas prprias caractersticas quanto concentrao de reagentes e condies de temperatura. No entanto, durante a padronizao podemos adotar um ponto de partida, ou standard protocol. Partindo destes parmetros, ajusta-se as condies de reao para a otimizao dos resultados. Concentrao de Enzima: Recomenda-se concentraes de 0,4 a 1U para cada 25L de soluo final. Outras concentraes podem ser utilizadas em casos especiais (LD-PCR = Long Distance PCR = PCR que amplifica grandes fragmentos de DNA, como vetores inteiros). No entanto, deve-se observar as especificaes de cada fabricante e de cada produto (a enzima adequada para PCR ?; qual a concentrao (em U/L)?; existe alguma condio especial para operao?). Algumas opes podem ser consideradas, como Hot-Start, Taq Beads, leo mineral, anticorpos anti-Taq, etc. Assume-se que a Taq convencional permanea ativa mesmo depois de 40 ciclos na reao. Para reaes mais longas, recomenda-se o uso de outra enzima ou uma concentrao levemente maior. dNTPs: Utiliza-se uma soluo estoque de 10mM em gua e pH 7,0 de todos os dNTPs utilizados (ATP, TTP, CTP e GTP) em concentraes iguais (salvo em alguns casos). Adiciona-se reao uma quantidade suficiente para se obter uma concentrao final entre 20 e 200M, dependendo tambm do tamanho do segmento que se quer amplificar e da durao da reao. Normalmente a concentrao final de deoxinucleotdeos na reao ajustada para 25M. Altas concentraes de dNTPs podem afetar a especificidade dos primers, pareando-se a eles.

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MgCl2: Obrigatrio para o funcionamento da enzima, o MgCl2 encontrado na soluo de reao em concentraes em torno de 0,5 a 2,5 mM. Como todo on, pode afetar as temperaturas de denaturao das fitas de DNA e de anelamento de primers. Alm disso, altas concentraes so responsveis pelo aparecimento de produtos inespecficos, formados por aumento excessivo da atividade da polimerase e pela formao de primer-dimers. importante que a presena de quelantes de ons, como o EDTA, podem alterar a concentrao do magnsio livre na reao. Outros Componentes: Os tampes de reao, fornecidos juntamente com as polimerases, possuem uma grande diversidade de componentes, cujo efeito no pode ser desprezado. Normalmente, os tampes possuem um pH a 20C entre 8,3 e 8,8. Possuem Tris (Tris(hidroximetil)aminometano), importante para o tamponamento, NaCl, KCl, e outros reagentes descritos anteriormente. Deve-se observar as concentraes de ons: at 50mM de NaCl e/ou KCl pode facilitar o anelamento dos primers (sabe-se que concentraes de KCl maiores que isso inibem a atividade das polimerases). Quando se trabalha com seqncias ricas em G e C, torna-se mais difcil a denaturao das fitas, devido presena de ligaes de lata energia. O simples aumento de temperatura para mais de 95C no recomendvel (denaturao dos dNTPs, reduo da atividade enzimtica, alterao excessiva do pH da soluo). Portanto, podemos utilizar um agente denaturante, como o DMSO (Dimetilsulfxido), que ajuda na denaturao das fitas. Utiliza-se uma concentrao final de 0,1 a 10% deste reagente na soluo. Concentraes acima de 10% inibem drasticamente a atividade da enzima (DMSO um solvente orgnico que em altas concentraes destri as ligaes da molcula da enzima).

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Durao dos ciclos de temperatura: Descrio da programao do termociclador passo a passo I) II) III) IV) Denaturao inicial: 4 minutos a 95C suficiente para a grande maioria dos casos. Denaturao: 1 minuto a 95C Anelamento: 1 minuto operando na temperatura de anelamento especfica do primer, podendo ser aumentada at 90 segundos. Extenso: Temperatura tima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1 minuto a 72C, podendo ser aumentada at 2 minutos de acordo com a quantidade utilizada, o nmero de ciclos e o tamanho do produto desejado. V) Extenso Final: Aps o trmino dos ciclos, costuma-se acrescentar um passo de 4 minutos a 72C, como oportunidade adicional para a polimerase agir VI) Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4C, para manter as amostras conservadas at o momento de estocagem Informaes sobre desenho de primers e a padronizao das temperaturas de anelamento sero discutidas posteriormente.

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