DIAGNSTICO MOLECULAR

Diagnstico molecular

l CNIO incluye en sus actividades un servicio de diagnstico molecular, cuyo principal objetivo es la rpida identificacin del espectro patognico de mutaciones y otras alteraciones implicadas en el desarrollo y la progresin tumoral. Se persigue mejorar el diagnstico de los tumores, proporcionando asimismo informacin con valor pronstico o que contribuya a la aplicacin de la terapia ms adecuada y eficaz, sirviendo de referencia y apoyo a los servicios clnicos de los hospitales.
Identificacin de genes asociados con ciclo celular

Nuevas tecnologas al servicio de la investigacin y la clnica

La secuenciacin completa del genoma humano ha supuesto un cambio trascendental en la manera de entender, investigar y abordar el diagnstico y el tratamiento del cncer. En este contexto el desarrollo de la genmica, la protemica, la bioinformtica y las tcnicas moleculares han supuesto un impulso tecnolgico determinante en la investigacin del cncer, que ya est teniendo importantes consecuencias clnicas en cuanto al diagnstico, pronstico y tratamiento de los pacientes. La disponibilidad y el buen uso de estas tecnologas deben ser un incentivo fundamental para la investigacin de transferencia, gracias al esfuerzo comn y continuo intercambio de informacin y resultados entre laboratorio y la clnica.

La aplicacin de estas tecnologas en proyectos de excelencia ha permitido que Espaa forme parte del grupo de lite en investigacin oncolgica europea

1. Genmica y cncer
En este contexto tecnolgico, una de las concreciones ms esperanzadoras es la de los denominados microarrays de expresin gnica. Estos microarrays permiten determinar variaciones en los niveles de expresin de miles de genes de forma simultnea y reproducible. Los anlisis de expresin mediante microarrays de expresin constituyen actualmente una herramienta estndar para la identificacin de la huella gentica de las diversas formas de cncer, permitiendo un diagnstico preciso y una estimacin del riesgo de fallo con las diversas terapias existentes. Adicionalmente, permiten identificar dianas teraputicas potenciales y conducir a estudios experimentales basados en la firma molecular de los tumores.

1.1. Anlisis de expresin gnica

El CNIO ha sido pionero en Espaa en el empleo de microarrays de expresin para la subclasificacin de pacientes de diversos tipos de cncer. Desde el ao 2001 se han venido analizando ms de 1.000 muestras anuales pertenecientes a una variedad de proyectos de investigacin en que participaban sus investigadores.

Patologa Molecular en el diagnstico t(2; 5) en linfoma Anaplsico T CD30+

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Investigacin de transferencia en cncer: del laboratorio a la clnica 2005-2006 Con la garanta de la amplia experiencia de su Unidad de Genmica, el CNIO ofrece servicios de Anlisis de Expresin Gnica mediante microarrays de tecnologa Agilent, a investigadores espaoles pertenecientes a entidades sin nimo de lucro. Se pueden encontrar detalles sobre este servicio en el enlace Servicios a la Comunidad de la pgina web principal del CNIO, o en el enlace especfico siguiente: http://www.cnio.es/es/programas/expresion genica/index.asp Este tipo de microarray esta siendo usado en diversos proyectos cooperativos, permitiendo avanzar en la determinacin del perfil de expresin o huella gentica de distintos tipos de cncer, as como de huellas de sensibilidad o resistencia a tratamientos determinados. Los estudios relativos al perfil de expresin de los diferentes tumores incluyen el carcinoma de mama, endometrio, colon, pncreas, pulmn, melanoma, GIST, linfomas B y T, leucemia mieloide crnica y linfoctica crnica B. Respecto a huellas moleculares relacionadas con resistencia o sensibilidad al tratamiento, los estudios que se han realizado o estn en marcha son:

Imatinib en leucemia mieloide crnica Taxol + gemcitabina en carcinoma de mama Letrozol en carcinoma de mama Taxol + adriamicina + gemcitabina en carcinoma de mama

1.2. Polimorfismos (SNPs)

El ADN de los seres humanos presenta variaciones (polimorfismos) que constituyen la base gentica de nuestra individualidad. La forma ms comn de polimorfismo es la variacin de una nica base en la secuencia de ADN, llamada SNP (Single Nucleotide Polymorphism), cuya frecuencia y distribucin en el genoma (1 SNP cada 1.000 bases) y su fcil manejo los han convertido en potentes herramientas para localizar genes o regiones genmicas que pudieran ser responsables de algn tipo de enfermedad o del incremento de la susceptibilidad de ciertos individuos a padecerla. Desde hace tiempo, la tecnologa disponible permite analizar cientos o miles de SNPs a la vez, identificar genes y alelos de baja penetrancia e ir configurando poco a poco lo que sera el perfil gentico de riesgo de algunas enfermedades multifactoriales. El CNIO es uno de los tres nodos que configuran el Centro Nacional de Genotipado (CEGEN) financiado por la Fundacin Genoma Espaa, cuyo objetivo es desarrollar una plataforma de genotipado para abordar la investigacin del cncer desde esta perspectiva.: (http://cegen.bioinfo.cnio.es)

Yondelis en sarcomas -IFN en linfoma T cutneo -IFN en leucemia mieloide crnica Aplidina en leucemias agudas

Perfil de expresin de genes diferencialmente expresados en diferentes subtipos de linfomas T

Gracias a la plataforma de alto rendimiento disponible en el CNIO (Illumina) que permite el genotipado masivo de miles de SNPs, se han desarrollado varios proyectos entre los que destaca el anlisis de SNPs de genes relacionados con diferentes procesos tumorales, tales como apoptosis, ciclo celular, reparacin y metabolizacin entre otros. Con estos datos se han llevado a cabo amplios estudios de susceptibilidad y de interaccin entre genes que han permiten la identificacin de SNPs involucrados en cncer. Por otro lado, la identificacin de variantes farmacogenticas involucradas en el metabolismo de frmacos antitumorales, est siendo investigada para su aplicacin en la prctica clnica. El anlisis de SNPs que puedan predecir una respuesta adversa de los pacientes a un tratamiento su-

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Diagnstico molecular

Genotipaje masivo de SNPs utilizando la plataforma de Illumina

pondr una mejora incalculable en el tratamiento del cncer. En la actualidad, este tipo de pruebas farmacogenticas se estn realizando para el tratamiento de las leucemias infantiles.

Microarrays de Tejido. Muestra de 245 pacientes

1.3. Microarrays de Tejidos (TMAs)

Constituyen un mtodo sencillo de anlisis de expresin que se fundamenta en la realizacin de biopsias cilndricas de tejidos tumorales embebidos en parafina, preservando el resto del tejido para estudios futuros. Con los TMA se pueden analizar grandes series de tumores y validar los resultados obtenidos con otras tcnicas como los cDNA, oligonucleotido microarrays, as como de la hibridacin genmica comparada (CGH). El xito de esta tecnologa, por otra parte ya consolidada, viene dado por ser una herramienta robusta que permite monitorizar la expresin de mltiples muestras tumorales en un nico experimento, garantizando la homogeneidad de las tcnicas entre las muestras y un considerable ahorro de tiempo y reactivos, siendo aplicable en los Microarrays de tejidos (TMAs) cualquier tcnica, tanto histolgica, inmunohistoqumica as como de hibridacin in situ.

Por otra parte esta tecnologa se beneficia del elevado n anticuerpos disponibles y que pueden ser analizados en cada uno de los TMAs. En la actualidad contamos con un banco de mas de 400 anticuerpos que se actualizan e incrementan mensualmente, poniendo a punto, nuevos marcadores de inters pronstico y predictivo de inters para la comunidad cientfica. Fruto de la colaboracin con distintos centros y grupos de investigacin en proyectos de clasificacin molecular ha permitido, hasta el momento, el anlisis de ms de 26.000 muestras incluidas en los ms de 190 TMA que se han producido en el CNIO hasta el 2006. Entre los estudios cooperativos se incluyen procesos linfoproliferativos, fases de progresin del melanoma cutneo, y diversos estudios de carcinoma de mama, endometrio, colon, prstata y pulmn entre otros.

Preparacin de una matriz tisular

Microarrays de Tejido (TMAs) inmunoteido con un anticuerpo monoclonal

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Investigacin de transferencia en cncer: del laboratorio a la clnica 2005-2006

1.4. Microarrays de Hibridacin Genmica Comparada: (CGH arrays)

Desde un punto de vista genmico-cromosmico el formato del microarray se ha adaptado para la deteccin de polimorfismos puntuales (SNPs) y para la deteccin de variaciones en la dosificacin o nmero de copias del genoma mediante arrays de Hibridacin Genmica Comparada (CGH array). Los CGH arrays son herramientas de anlisis genmico de escaneado global que responden a preguntas esenciales. Bsicamente se emplean para detectar la presencia de ganancias (duplicacin o amplificacin) o prdidas (delecin o nulisoma) de segmentos del genoma. El material de partida es ADN genmico, por lo que es una tcnica que permite emplear material incluido en parafina. La aplicacin en el campo de la oncologa incluye la deteccin de nuevas amplificaciones genmicas asociadas a tumores humanos y murinos, la definicin en detalle de regiones comnmente amplificadas (amplicones), la deteccin de deleciones asociadas a tumores. Actualmente hay en el mercado diferentes plataformas de CGH array disponibles con diferentes grados de resolucin y cobertura de los genomas murino y humano. El CNIO se ha especializado en la produccin de plataformas genmicas especficas as como en el asesoramiento del uso y aplicaciones de las herramientas producidas por otras empresas de Biotecnologa.

diferencial de protenas en cncer colorectal y de identificacin de protenas diferencialmente expresadas en lneas celulares tratadas o resistentes a diversos frmacos.

3. Bioinformtica
Cualquier progreso en genmica, protemica y otros campos biomdicos requiere un slido apoyo de la bioinformtica, ya que es necesario procesar y manejar de un modo eficiente la abundante informacin que estas tcnicas masivas generan. Durante los ltimos aos se han realizado grandes avances en el desarrollo de las herramientas web para el anlisis masivo de datos de expresin gnica. El paquete integrado GEPAS, constituye a da de hoy el ms completo disponible en la red. Tambin se han creado otras herramientas para minera de datos (FatiGo), estudio de polimorfismos in silico (SNPGO), diseo de siRNA (pequeo RNA de interferencia que permite inhibir y diseccionar la funcin de cada gen y estudiar su influencia en la clula viva) y CGH in silico. Con el fin de facilitar a la comunidad cientfica espaola e internacional el acceso a estas herramientas de bioinformtica, se ha creado una pgina web (http://bioin-fo.cnio.es/) en la que se han integrado todas ellas.

Unidad de Diagnstico Molecular

Las tradicionales tcnicas de diagnstico histopatolgico, basadas en la evaluacin microscpica de las lesiones con la ayuda de tcnicas de inmunohistoqumica, estn siendo complementadas por nuevas herramientas de diagnstico molecular, imprescindibles para la correcta evaluacin y diagnstico en numerosos tipos de cncer (linfomas y leucemias, sarcomas infantiles, cncer familiar, cncer pulmonar, etc.).

2. Protemica y cncer
La Unidad de Protemica del CNIO dispone de un equipamiento completo para el anlisis protemico en distintos tipos de muestras biolgicas. Permite, por tanto, el anlisis de expresin proteica diferencial en muestras tumorales frente a muestras normales. El equipamiento incluye sistemas de electroforesis bidimensional, as como el necesario para realizar la tcnica conocida como DIGE (Differential In Gel Electrophoresis), que permite cuantificar de manera muy precisa pequeas diferencias en la expresin de protenas entre muestras pareadas. Esta tcnica es equivalente, aunque se realiza sobre protenas y con ciertas limitaciones que le son propias, al anlisis de expresin gnica diferencial realizado con los microarrays de ADNc. El CNIO cuenta tambin con el equipamiento necesario para la determinacin de modificaciones post-transduccionales en las protenas asociadas a determinados estados patolgicos. Los proyectos en curso en el CNIO incluyen estudios de expresin

Aplicacin de la inmunohistoqumica (BCL2) al diagnstico

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Diagnstico molecular

1. Diagnstico molecular
La funcin del diagnstico molecular es la determinacin de cambios en la secuencia o en la expresin de genes crticos en cncer, mediante tcnicas de biologa molecular como son PCR, PCR cuantitativa y secuenciacin. Estas tcnicas de biologa molecular se caracterizan por una alta sensibilidad lo que permite realizar un diagnstico preciso incluso antes de que el cncer se manifieste clnicamente o determinar la presencia de enfermedad mnima residual en pacientes en remisin clnica. La seccin tiene por objeto tambin el anlisis mutacional de receptores de superficie y oncogenes, til para ayudar en el diagnstico y, en algunos casos, para predecir la respuesta de los tumores a drogas usadas actualmente en los protocolos de quimioterapia. Tambin se incorporan en la rutina diagnstica otras determinaciones moleculares que constituyen factores predictivos de respuesta teraputica y condicionan el pronstico en muchos casos (cncer de mama, de pulmn, linfomas y leucemias,...). En el CNIO se han puesto a punto y optimizado numerosas herramientas de diagnstico molecular, consideradas imprescindibles en el estudio de diferentes neoplasias:

Identificacin de alteraciones citogenticas. Imgenes de la tcnica SKY

Determinacin de clonalidad linfoide e identificacin de reordenamientos gnicos en los genes de las inmunoglobulinas y del receptor de clulas T mediante PCR en leucemias y linfomas. Determinacin mediante RT-PCR cuantitativa de varias translocaciones encontradas en diferentes tipos de leucemias y linfomas (BCRABL, AML1-ETO, PML-RARA, INV(16), BCL2IGH,). El carcter cuantitativo de estas tcnicas permite monitorizar la respuesta al tratamiento

Imgenes de la tcnica FISH aplicada al diagnstico de sarcomas infantiles

mediante el anlisis de la expresin de genes precisos a lo largo del tratamiento.

Identificacin de mutaciones desconocidas me-

diante secuenciacin directa de los genes KIT, EGFR, PDGFRA, y BCR-ABL. La identificacin de mutaciones es til para ayudar en el diagnstico y, en algunos casos, para predecir la respuesta de los tumores a drogas usadas actualmente en los protocolos de quimioterapia.

PCR a tiempo real para detectar abl (imagen izquierda) y bcr-abl (imagen derecha)

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Investigacin de transferencia en cncer: del laboratorio a la clnica 2005-2006

Identificacin de mutaciones previamente caracterizadas mediante PCR, anlisis de restriccin o PCR especfica de alelo en los genes FLT3, JAK2, y BCR-ABL en cnceres hematolgicos. Identificacin de inestabilidad de microsatlites, fenmeno muy frecuente en cncer colorrectal.

tareas organizativas y de coordinacin de los tres mdulos iniciales, Patologa Quirrgica, Patologa Mamaria y evaluacin de HER2. Finalmente, hay que destacar que los laboratorios y unidades tecnolgicas implicados en procesos diagnsticos del CNIO disponen, desde 2001, del Certificado de Calidad segn la Norma UNE-ENISO 9001:2000. En la actualidad estas actividades estn tambin en fase de implantacin de la Norma UNE-EN-ISO15189:2003 Laboratorios clnicos: Requisitos particulares para la calidad y la competencia, que es especfica para los laboratorios clnicos. La acreditacin por la norma UNE-EN ISO 15189:2003, adems de cumplir los requisitos de gestin de la calidad (certificacin), quiere asegurar la competencia tcnica del laboratorio clnico, haciendo hincapi en la competencia tcnica del personal y la disponibilidad de todos los recursos tcnicos necesarios para producir datos y resultados fidedignos.

Citogentica
La funcin de la seccin de citogentica es el anlisis de cromosomas en metafase e interfase como apoyo en el diagnstico, pronstico y seguimiento de tumores. Para ello se cuenta con personal altamente formado y con gran experiencia en el estudio de cariotipos tanto convencionales como espectrales, y tcnicas de hibridacin in situ con fluorescencia (FISH). En el Grupo de Citogentica Molecular, adems de las sondas empleadas en los estudios diagnsticos, se desarrollan constantemente nuevas sondas que detectan posibles genes candidatos implicados en el desarrollo y progresin tumoral.

Segundas opiniones
La disponibilidad de toda esta tecnologa de diagnstico molecular ha permitido que el CNIO realice una importante actividad diagnstica como centro de referencia, orientada fundamentalmente a la obtencin de segundas opiniones en casos clnicos y estudios genticos de cncer familiar, mediante los acuerdos de colaboracin con numerosos centros clnicos de todo el territorio nacional. Esta actividad beneficia tanto a los pacientes, que de este modo pueden acceder a una segunda opinin sobre el diagnstico recibido, como al patlogo u onclogo remitente, quien dispone de un eficiente sistema de control sobre su propia actividad y acceso a tcnicas diagnsticas no disponibles en muchos centros hospitalarios. Cabe sealar que la revisin de diagnsticos y segundas opiniones en patologa es una actividad actualmente incluida en la Cartera de Servicios de Sistema Nacional de Salud. La demanda de segundas opiniones diagnsticas o la realizacin de tcnicas moleculares concretas se ha incrementado sustancialmente desde 2001. En el primer ao que se ofreci este servicio, el nmero de consultas fue de 623. Cinco aos despus, este tipo de estudios se han triplicado, alcanzando un total de 1935 en 2005 y una estimacin similar para 2006.

Identificacin de amplificacin gnica de Her2/NEU mediante FISH. Identificacin mediante FISH de translocaciones cromosmicas en linfomas y leucemias (Bcl2, Bcl1, NPM/ALK, API2/MALT1, Bcl6,...). Identificacin mediante FISH de translocaciones cromosmicas en sarcomas (EWS, PAX3, PAX7, t(X;18),..).

Certificado de calidad
Por otra parte, el uso diagnstico de tcnicas moleculares precisa la implantacin de programas que aseguren la calidad de los procesos de diagnstico molecular en todas sus fases: preanaltica, analtica y post-analtica (informe). Los programas, especficos para cada procedimiento, garantizan la calidad en la identificacin del paciente, obtencin, preservacin y transporte de la muestra, procesamiento molecular de la misma e informe diagnstico. El CNIO participa en el programa patrocinado por la Sociedad Espaola de Anatoma Patolgica de Garanta de Calidad en Inmunohistoqumica. La participacin incluye distintas actividades tales como la coordinacin, actuacin como laboratorio central y evaluacin de resultados. El CNIO participa en las

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