EXTRACCIN DE DNA MICRO ESCALADO POR SALTING OUT

Autor Departamento Lic. Ral P. Ferreira Capote Biologa Molecular y Gentica

OBJETIVO Mtodo para la extraccin y purificacin de DNA a partir de sangre perifrica con una calidad suficiente para anlisis por PCR Se utilizar cuando las cantidades de DNA requeridos para el estudio sean menores de 1 microgramo. Esta situacin se presenta en anlisis en que slo se necesita realizar uno o dos procesos de amplificacin a partir del DNA del paciente. Mtodo propuesto por Bunce M. (ver protocolo con cdigo salting out macro) microescalado en nuestro Laboratorio. Se basa en la lisis inicial de los glbulos rojos mediante solucin hipotnica y la lisis total de las clulas y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminacin de la protenas mediante precipitacin salina (saltingout) y extraccin con solventes orgnicos. Un tcnico medio Centrfuga refrigerada para microtubos Freezer -200C

Indicaciones

Breve descripcin

Personal requerido Equipos requeridos

Vortex para tubos

Juego de micropipetas de volumen variable Relacionados en el protocolo reactivos comunes requeridos para el trabajo en Gentica Molecular

Reactivos

Preparacin de soluciones

Buffer de lisis de glbulos rojos (RCLB)

NH4CL Na HCO3 7.70 gramos 0.84 gramos

H2O destilada c.s.p. Conservar a 40C

1 000 mL

Disolver mediante agitacin y esterilizar en autoclave.

Buffer de lisis nuclear (NLB)

NaCL 1M tris HCL pH8.2 0.5M EDTA pH 8.0 H2O destilada c.s.p. 4 mL 900 mL 23.37 gramos 10 mL

Salting out micro

Disolver mediante agitacin y esterilizar en autoclave Aadir 50 mL de solucin 10 % SDS y 50 mL agua destilada estril Conservar a temperatura ambiente.

Solucin de cloruro de sodio 6M

Na Cl H2O destilada Esterilizar en autoclave Conservar a temperatura ambiente 35,1 gramos 100 mL

CIA
Cloroformo Alcohol isoamlico Conservar a 4 C
0

96 mL 4 mL

Toma de muestra Colectar 0,5 mL de sangre perifrica en un tubo de 1,5 mL estril conteniendo 20 l de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversin fuerte para garantizar homogenizacin. Conservar en refrigeracin hasta su procesamiento, el cual deber realizarse en un plazo no mayor de 48 horas despus de haberse realizado la toma de muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las

clulas nucleadas.

Extraccin y purificacin del DNA Centrifugar 2 minutos a 10 000 rpm a 4o C Eliminar cuidadosamente parte del plasma, cuidando de no remover el buffy

coat.

no presente mohos.

Aadir el buffer de lisis de los glbulos rojos (RCLB) bien fra hasta completar 1 mL, homogeneizar por inversin repetida del tubo y colocar por 5 minutos en el congelador. Verificar antes de usar que esta solucin

Agitar por inversin suave y centrifugar 2 minutos a 10 000 rpm a 40C. Eliminar el sobrenadante por inversin del tubo teniendo cuidado de no remover el pellet. Repetir los pasos 3 y 4 (hasta que el pellet de leucocitos quede blanco) Aadir 100 L de buffer de lisis nuclear (NLB) a temperatura ambiente y agitar con vortex suave hasta resuspender bien el pellet. Aadir otros 200 L de NLB y homogeneizar con toque de vortex. Aadir 100 L de solucin de cloruro de sodio 6M y agitar fuertemente invirtiendo el tubo. Si la solucin de cloruro de sodio 6M presenta

precipitado, antes de utilizar calentar a 37-560C hasta que se disuelva el precipitado.

Aadir 200 L de la mezcla de cloroformo-alcohol isoamlico (CIA) y agitar por vortex. La suspensin debe presentar un aspecto lechoso. Centrifugar 5 minutos a 10 000 rpm a temperatura ambiente. Pasar cuidadosamente el sobrenadante a un tubo de 1,5 mL con pipeta de con punta amarilla cortada, cuidando de no remover la interfase. Si se

remueve la interfase es necesario reintegrar al tubo la solucin extrada y repetir los pasos 9 y 10.
Precipitacin y resuspensin del DNA Aadir 2 volmenes de etanol absoluto fro (aproximadamente 800 L) y agitar por inversin fuerte. Si no observa la medusa de DNA, dejar

toda la noche a -200C. Salting out micro

Centrifugar 10 minutos a 10 000 rpm a 40C. Eliminar el sobrenadante por inversin del tubo, vigilando que el pellet de DNA no se desprenda de la pared del tubo. Aadir 500 L de etanol 70 % fro y dar vortex hasta la resuspensin del pellet de DNA. Centrifugar 10 minutos a 10 000 g a 40C. Eliminar el sobrenandante por inversin, vigilando que no se desprenda el pellet de DNA. Repetir los pasos 14 y 15 (segundo lavado con etanol 70 %) Dar toque de centrfuga y extraer todo el exceso de etanol con una pipeta con punta amarilla, cuidando de no arrastrar el pellet de DNA

secado excesivo del DNA dificulta su posterior resuspensin.

Secar el DNA a vaco por el tiempo mnimo requerido (unos 15 minutos). El

Aadir un volumen de 50 L de agua destilada estril. Dar vortex ligero para resuspender el pellet e incubar a 560C por al menos 30 minutos con vortex ocasional. Conservar en refrigeracin.