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Introduo

O mtodo de espectrofotometria o mtodo de anlises mais utilizado nas investigaes biolgicas e fsico-qumicas [1]. Esse mtodo analtico se baseia na interao (absoro e /ou emisso) da matria com a energia radiante, ou seja, a radiao eletromagntica emitida ou absorvida medida quando os eltrons se movimentam entre nveis energticos [2]. A absoro da radiao eletromagntica acontece nos comprimentos de onda entre o violeta e o infravermelho no espectro da radiao eletromagntica [2]. Os mtodos de espectrometria abrangem um grupo de mtodos analticos baseados na espectroscopia atmica e molecular. A espectrofotometria de absoro molecular UV/vis constitui um dos mais amplos mtodos utilizados em anlises qumicas para a determinao de espcies moleculares em soluo [3]. Esse mtodo utiliza radiao eletromagntica cujos comprimentos de ondas variam entre 200 e 780 nm. A molcula do composto quando excitada com esse tipo de radiao pode sofrer transies eletrnicas por conseqncia da absoro de energia quantizada [3]. A maior parte dos elementos da tabela peridica pode ser determinada usando uma tcnica apropriada de absoro molecular. A espectrofotometria permite identificar substncias com base no espectro da substncia, pois as substncias possuem diferentes padres de absoro [3]. Alm disso, possvel quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a concentrao do soluto em determinada soluo [1]. O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto (analito) e uma quantidade conhecida da mesma substncia (soluo-padro) [3]. Este instrumento faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo e mede a quantidade de luz que foi absorvida e a luz transmitida por essa soluo [1]. Usando um prisma, o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (), a frao de radiao absorvida pela soluo, ignorando perdas por reflexo, ser funo da concentrao da soluo e da espessura da soluo [1]. Portanto, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com o aumento da espessura atravessada lei de Lambert e o aumento da concentrao ou da intensidade de cor da soluo Lei de Beer [3]. A diferena entre a energia emergente (I) e a energia incidente (I0) indica a transmitncia (T) da soluo [1]. Em espectrofotometria, utiliza-se absorbncia (A) como a intensidade de radiao absorvida pela soluo,

seguindo as leis de Lambert-Beer. A lei de Beer estabelece uma relao entre a absorbncia ou transmitncia com a concentrao de uma espcie absorvente quando um feixe de radiao monocromtica atravessa um recipiente contendo a espcie absorvente, dada por [1]: A = - log (T) Onde, A representa a absorbncia; T representa a transmitncia. O mtodo de espectrofotometria pode ser aplicado a compostos absorventes e no absorventes. Geralmente, para uma amostra no absorvente adiciona-se reagentes que atravs de reaes qumicas proporcionam colorao soluo [1]. O Fe (II) em soluo no apresenta cor suficiente para produzir uma absoro diferenciada a concentraes diversas, portanto, sua determinao exige o uso de um reagente seletivo, a 1,10-fenantrolina. A 1,10-fenantrolina forma complexos estveis com o on Fe(II). O composto original tem um par de tomos de nitrognio localizado em posies tais que cada um pode formar uma ligao covalente com o on Fe (II). Trs molculas de 1,10fenantrolina combinam-se com cada on Fe (II) formando um complexo de acordo com a reao [1]: (phen)3Fe3 + e- (phen)3Fe2 Ao utilizar o espectrofotmetro alguns cuidados devem ser tomados, como: limpar imediatamente lquidos derramados; no deixar cubetas no equipamento quando ele no est em uso; aps deslig-lo, tap-lo; no limpar as superfcies pticas do aparelho; trabalhar com o equipamento em locais ventilados, livre de vapores corrosivos; evitar lugares com trocas bruscas de temperatura; no utilizar o aparelho em mesas submetidas a vibraes intensas. As cubetas devem ser protegidas, no permitindo que elas raspem-se entre si ou com outra superfcie spera; devem ser lavadas com gua deionizada; suas faces pticas devem ser secas com papel absorvente macio antes de cada leitura; nunca devem ser pegas com os dedos nas faces pticas; no devem existir bolhas de ar dentro das cubetas antes de efetuar as medies[1]. necessrio extremo cuidado ao manusear os cidos sulfdrico e ntrico. O acido sulfdrico concentrado tem ao corrosiva sobre os tecidos dos organismos vivos tambm devido sua ao desidratante e, produz srias queimaduras na pele. O acido ntrico concentrado um lquido muito voltil e seus vapores so muito txicos. Assim

como o cido sulfdrico um cido muito corrosivo e necessita-se de capela. O acetato de sdio no considerado um produto perigoso. Em caso de contato com a pele ou com olhos deve-se lavar com gua em abundncia. O composto cloridato de hidroxilamina concentrado considerado nocivo por ingesto e irritante a pele e aos olhos, podendo causar efeitos graves para a sade e caso de exposio prolongada por inalao. A fenantrolina toxica ao meio ambiente e, por isso, no pode ser descartada na pia, necessrio um descarte correto. Em caso de contato com olhos ou pele deve-se lavar com gua abundantemente.

Materiais e mtodos
- Preparao das solues: Para a preparao da soluo padro de Fe2+ pesou-se exatamente 0,7g de sulfato ferroso amoniacal padro primrio [Fe(NH4)2(SO4)2].5H2O, e transferiu-se quantitativamente para um balo volumtrico de 500mL. Adicionou-se quatro gotas de acido sulfrico concentrado para acidificar, dissolveu-se e completou-se o volume com gua deionizada (0,2 mg/mL de Fe(II)). Diluiu-se a soluo padro de Fe2+ transferindo 10 mL desta soluo para um balo volumtrico e completando o volume com gua deionizada (0,02 mg/mL de Fe (II)). Preparou-se uma soluo de cloridrato de hidroxilamina dissolvendo 5g de NH2OH.HCl em 100 mL de gua deionizada. Preparou-se uma soluo de acetato de sdio com uma concentrao de 2 mol/L, pesando 41 g de acetato de sdio anidrido e transferindo para um balo volumtrico de 250 mL. Completou-se o volume com gua deionizada. Pesou-se 0,25 g de 1,10-fenantrolina, transferiu-se para um balo volumtrico de 100 mL, adicionou-se cerca de 50 mL de gua deionizada, cinco gotas de acido ntrico concentrado, agitou-se e completou-se o volume com gua deionizada, resultando em uma soluo de 0,25% (m/ v) de 1,10-fenantrolina. - Construo da curva analtica: Numerou-se 6 bales volumtricos de 50 mL. Adicionou-se aos bales de nmeros 2, 3, 4, 5 e 6 os seguintes volumes de soluo de ferro diluda (0,02 mg/mL de Fe (II)), originando solues com diferentes concentraes de Fe(II) de acordo com a Tabela 1.

Fez-se as seguintes adies a todos os bales, inclusive ao branco, ordem indicada: 2 mL de soluo aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5%(m/v); 2 mL de soluo aquosa de acetato de sdio 2 mol/L; 4 mL de soluo de 1,10-fenantrolina a 0,25%(m/v). Completou-se os volumes dos 6 bales com gua destilada e, em seguida, homogeneizou-se as solues. Mediu-se as absorbncias a 512 nm de todas as solues usando a soluo do balo n 1 como o branco. Com os valores de absorbncia medidos traou-se a curva analtica (Absorbncia x concentrao) no Excel. Tabela 1 Volume de soluo diluda de Fe (II) adicionado em cada balo e suas respectivas concentraes. N do balo 1 2 3 4 5 6 Vol. sol. 0,02 mg/mL (sol. diluda de Fe (II)) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 Concentrao de Fe (II) (mg/mL) 0,0 0,0008 0,0016 0,0024 0,0032 0,0040

- Determinao da concentrao de Ferro no medicamento: Diliu-se 1 mL de amostra de medicamento (antianemicos a base de sulfato ferroso na forma liquida) em 50 mL de gua. Transferiu-se 1 mL da amostra diluda para um balo volumtrico de 50 mL e adicionou-se na seguinte ordem: 2 mL de soluo aquosa de cloridrato de hidroxilamina a 5% (m/v); 2 mL de soluo aquosa de acetato de sdio 2 mol/L; 4 mL de soluo de 1,10-fenantrolina. Completou-se o volume com gua destilada e deixou-se em repouso por 10 minutos. Fez- se a leitura no espectrofotmetro em absorbncia, no comprimento de onda de 512 nm. Obteve-se a concentrao atravs da curva analtica e calculou-se o resultado em mg de ferro mL de medicamento.

Resultados e discusso
importante ressaltar que a ordem da adio dos reagentes na preparao das solues-padro e da amostra fundamental para o sucesso do experimento. Primeiramente, adicionou-se o cloridrato de hidroxilamina, um agente redutor, para reduzir o Fe (III) em soluo a Fe (II), eliminando este interferente. Posteriormente, adicionou-se o acetato de sdio, que em soluo aquosa origina um tampo, sendo

importante na estabilizao do pH. Finalmente, adicionou-se a 1,10-Fenantrolina para a complexao com o Fe (II). O Fe (III) considerado um interferente, pois forma Fe(OH)3 em soluo, um colide, interferindo na leitura do espectrofotmetro. Trata-se de um fenmeno fsico, no qual os colides refletem a luz e, a soluo absorve e/ou transmite menos radiao. O experimento foi realizado em triplicatas. A absorbncia das solues foi medida no comprimento de onda no qual o complexo formado entre o Fe (II) e a 1,10Fenantrolina absorve o mximo de radiao eletromagntica, que igual a 512 nm. Os valores de absorbncia obtidos das solues padro de Fe (II) de cada alquota so mostrados na Tabela 2. A partir destas respostas construiu-se a curva analtica mostrada na Figura 1. Tabela 2 Valores de absorbncia obtidos das solues padro de Fe (II) nas trs alquotas. N do balo 1 2 3 4 5 6 Concentrao (mg/mL) 0 0,0008 0,0016 0,0024 0,0032 0,0040 Absorbncia da alquota 1 0 0,156 0,309 0,463 0,625 0,766 Absorbncia da alquota 2 0 0,164 0,336 0,465 0,620 0,770 Absorbncia da alquota 3 0 0,166 0,312 0,459 0,624 0,784

Figura 1 - Curva analtica dos dados experimentais com equao da reta e valor de R2. . Para verificar se a funo da regresso foi adequada aos dados foi feito o grfico dos resduos versus concentrao das solues-padro, mostrado na Figura 2. O grfico de resduos importante para detectar valores discrepantes no experimento. O resduo definido como: Onde, representa a absorbncia experimental; Yi

ei = Yi Yi

representa a absorbncia terica.

Yi

A absorbncia terica foi determinada substituindo os valores de concentrao das solues-padro na equao da reta da curva analtica (Figura 1). Os valores das absorbncias tericas, absorbncias experimentais e dos resduos so mostrados na Tabela 3. Tabela 3 - Valores de concentrao, absorbncia terica, absorbncia experimental e resduo de cada soluo-padro. Concentrao 0,0008 0,0008 0,0008 0,0016 0,0016 0,0016 0,0024 0,0024 0,0024 0,0032 0,0032 0,0032 0,0040 0,0040 0,0040 Absorbncia terica 0,161 0,161 0,161 0,314 0,314 0,314 0,467 0,467 0,467 0,621 0,621 0,621 0,774 0,774 0,774 Absorbncia experimental 0,156 0,164 0,166 0,309 0,336 0,312 0,463 0,465 0,459 0,625 0,620 0,624 0,766 0,770 0,784 Resduo -0,005 0,003 0,005 -0,005 0,022 -0,002 -0,004 -0,002 -0,008 0,004 -0,001 0,003 -0,008 -0,004 0,010

O critrio de controle estabelecido para a anlise dos resduos foi o 3s, onde s o desvio padro. Sendo assim, o limite de controle superior 3s e o limite de controle inferior -3s. Para que o ajuste de regresso seja adequado aos dados, os resduos devem possuir uma distribuio aleatria e devem estar entre os dois limites de controle. Com os valores dos resduos encontrados calculou-se o desvio padro com o auxlio do Excel, utilizando a seguinte equao:

O valor encontrado foi s = 0,007827. Dessa forma, o limite de controle superior, LCS, igual a 0,02348 e o limite de controle inferior, LCI, igual a -0,02348.

Figura 2 - Grfico dos resduos com intervalo de confiana 3s.

LC S

Como pode-se observar na Figura 2, no h nenhum resduo fora dos limites de controle e, alm disso, eles esto distribudos aleatoriamente. Portanto, conclui-se que o ajuste linear foi adequado aos dados experimentais, no h nenhum dado discrepante e o modelo no precisa de correo. A resposta da amostra foi de 0,493. A partir deste valor estimou-se a concentrao do analito usando a equao da reta da curva analtica. y = 191,74x + 0,0073 Can = 2,5331 x 10-3 mg/mL
LCI

[1]skoog [2] http://www.anaseca.uac.pt/pdf_bioquimica/introd_espectrof.pdf, acessado em 20/04/2011. [3] Harris

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