UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUMICA GRUPO DE QUMICA DE LEOS ESSENCIAIS E ALIMENTOS-

GQOEA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE INICIAO CIENTIFICA PIBIT/CNPq

RELATRIO PARCIAL Perodo: Agosto/2010 a Fevereiro/2011

BOLSISTA: Rayone Wesly Santos de Oliveira

ORIENTADOR: Prof Dr. Victor Elias Mouchrek Filho

So Lus - MA 2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUMICA GRUPO DE QUMICA DE LEOS ESSENCIAIS E ALIMENTOS- GQOEA LABORATRIOS DE FISICO-QUIMICA E MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

Estudo a na ltic o e a va lia o da ativ idade larv ic ida do le o e sse nc ia l do

Syzygium aromaticum (cra v o-da-ndia ) fre nte ao mosquito Aede s ae gypti

(linna eus, 17 62)

Relatrio Parcial Apresentado ao Programa Institucional de Iniciao Cientifica PIBIT/CNPq.

BOLSISTA: Rayone Wesly Santos de Oliveira

ORIENTADOR: Prof Dr. Victor Elias Mouchrek Filho

So Lus - MA 2011

1. INTRODUO

O mosquito Aedes aegypti (Linnaeus 1792) (Figura 1) o principal responsvel pela transmisso da febre amarela urbana e do dengue em todo o mundo. domstico e antropoflico, com atividade hematofgica diurna e utiliza -se preferencialmente de depsitos artificiais de gua limpa para colocar seus ovos (CDC, 2009; TAUIL, 2001). Embora oriundo do Velho Mundo, esse mosquito acompanhou o homem em sua longa e ininterrupta migrao pelo g lobo, e permaneceu onde as alteraes antrpicas propiciaram a sua proliferao. Hoje, o Aedes aegypti considerado um mosquito cosmopolita, com ocorrncia em regies tropicais e subtropicais (CDC, 2009; CONSOLI e OLIVEIRA, 1994).

Fonte: INFO-E (2009)

Figura 1. Mosquito Aedes aegypti (Linnaeus, 1762).

Dados de novembro de 2008 indicavam as reas de maior risco (em amarelo no mapa da Figura 2): Amrica Central, Amrica do Sul (exceto Chile, Uruguai e sul da Argentina), Amrica do Norte (Mxico), frica, Austrlia (norte), Caribe (exceto Ilhas Caymam), China (sul), Ilhas do Pacfico, ndia, Sudeste Asitico

e Taiwan1 (CDC, 2009). Nos Estados Unidos a ocorrncia de dengue incomum, mas em 1995 foram registrados casos de transmisso no Texas. O mosquito Ae des aegypti esta distribudo na maior parte do Brasil e a regio Nordeste est mais suscetvel a ocorrncia de epidemias do dengue.

Fonte: WHO (2009).

Figura 2 . Distribuio do Aedes aegypti no mundo em 2008 (pases ou reas de

risco). O mosquito Aedes aegypti, encontrou no mundo moderno condies muito favorveis para uma rpida expanso, pela urbanizao acelerada que criou cidades com deficincias de abastecimento de gua e de limpeza urbana; pela intensa utilizao de materiais no -biodegradveis, como recipientes descartveis de plstico e vidro; e pelas mudanas climticas. Com essas condies, espalhou -se por uma rea onde vivem cerca de 3,5 bilhes de pessoas em todo o mundo (FUNASA, 2002).

O co n to r no das l i nh as d as i so t er m as d e jan ei r o e jul ho i n di cam o s l i mi tes geo gr f i co s po ten ci ai s do s H emi sf r i os No r t e e S u l do pl an et a p ar a so br evi v n ci a do A ed es aegyp ti ao l o n go do an o ( WHO , 2 0 0 9 ).

No Brasil o mosquito est restrito s vilas e cidades, sempre ligado ao peridomiclio e ao domiclio humano. Nas cidades brasileiras encontrado nos locais de maior concentrao humana e raramente em ambientes semi -silvestres ou onde a populao humana mais escassa (NEVES, 2000).
1.1.1 - O ciclo de vida do Aedes aegypti

O conhecimento do ciclo de vida do mosquito contribui para melhoria das formas de combate a esse vetor. O Aedes aegypti uma espcie domstica, que se reproduz, preferencialmente, em gua parada e limpa, acumulada em recipientes fabricados pelo homem, como latas, pneus, vasos etc., dentro ou perto das habitaes. Seu ciclo de vida compreende quatro estgios: Ovo Larva Pupa Adulto (SILVA 2006).

a) O ovo

O ovo do Aedes aegypti (Figura 3), mede aproximadamente 1mm de comprimento, com contorno alongado e fusiforme e depositado individualmente, nas paredes dos depsitos que servem como criadouros, prximos lmina da gua; no momento da postura os ovos so brancos, mas nas primeiras 24 horas adquirem a cor negra; a formao do embrio se completa em 48 horas; so capazes de resistir a longos perodos de dessecao (SILVA 2006).

Fonte: FIOCRUZ (2009)

Figura 3. Ovos do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762).

De acordo com dados da FUNASA (2002), ovos com at 450 dias, sofrem ecloso, quando colocados em contato com a gua. A capacidade de resistncia dos ovos um srio obstculo para sua erradicao. Esta condio permite que os ovos sejam transportados a grandes distncias, em recipientes secos, tornando -se assim, o principal meio de disperso do inseto.

b) A larva

Na fase de larva o Aedes aegypti (Figura 4) possui aspecto vermiforme, sifo curto, grosso e mais escuro que o corpo e possui quatro estdios evolutivos. A durao desta fase depende da temperatura e da alimentao, em m dia dura sete dias. As larvas so sensveis a movimentos bruscos na gua.

Fonte: WIKIMEDIA (2009)

Figura 4. Larvas do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762). c) A pupa

A pupa o ltimo estgio da fase aqutica (Figura 5) e possui o aspecto de vrgula, sendo bastante mvel quando perturbada; seu corpo escurece a medida que se aproxima o momento da emergncia do adulto. Esta fase dura de dois a trs dias e durante este perodo a pupa no se alimenta.

Fonte: ARBOVIRUS (2009).

Figura 5. Pupa do Aedes aegypti (Linnaeus, 1762).

d) O adulto

Os mosquitos adultos esto na fase de reproduo e disperso da espcie. Seu corpo escuro, com faixas brancas nas bases dos segmentos tarsais e possui um desenho em forma de lira no mesonoto (Figura 1). Eles podem acasalar 24h aps emergirem. O acasalamento pode se dar durante o vo ou pousados sobre uma superfcie. O repasto sanguneo das fmeas fornece protenas para o desenvolvimento dos ovos. Ocorre nas primeiras horas do dia e ao anoitecer. O macho alimenta-se de carboidratos extrados dos vegetais. A fmea faz uma postura aps cada repasto sanguneo. O intervalo entre a alimentao e a postura de trs dias. A postura se d geralmente no fim da tarde. A fmea atrada por recip ientes sombreados ou escuros, com superfcie spera. Prefere gua limpa e distribui cada postura em vrios recipientes (SILVA 2006). O dengue um dos principais problemas de sade pblica no mundo. A Organizao Mundial da Sade (OMS) estima que entre 50 a 100 milhes de pessoas se infectem anualmente, em mais de 100 pases, de todos os continentes, exceto a Europa. Cerca de 550 mil doentes necessitam de hospitalizao e 20 mil morrem em conseqncia dessa doena (BRASIL, 2009a). Trata-se de uma virose transmitida pela picada dos mosquitos Aedes aegypti ou Aedes albopictus, que aps terem picado uma pessoa doente, adquirem o flavivrus, causador da doena, passando a dissemin -lo. Seu perodo de incubao de oito a dez dias (FUNASA, 2002). uma doena transmitida por um arbovrus do gnero Flavivirus, pertencente famlia Flaviviridae. So conhecidos quatro sorotipos: 1, 2, 3 e 4. A presena do vrus no organismo provoca alteraes bioqumicas como a diminuio da albumina no sangue, albuminria e discre to aumento dos testes de funo

heptica:

aminotransferase,

aspartato

srica

(conhecida

anteriormente

por

transaminase glutmico oxalactica TGO) e aminotransferase alanina srica (conhecida anteriormente por transaminase glutmico pirvica TGP) (SILVA, 2006). A doena manifesta-se de duas formas. A forma benigna difundida e tem sintomas semelhantes aos de uma forte gripe. A forma maligna a hemorrgica e atinge principalmente as pessoas que j foram acometidas pela forma benigna da doena. Esta forma hemorrgica letal na maioria dos casos, pois provoca hemorragias internas. No existe tratamento especfico contra o dengue. Os mosquitos so responsveis por mais doenas que qualquer outro grupo de artrpodes. O mosquito Aedes aegypti atua como um vetor para um arbovrus responsvel pela febre amarela nas Amricas Central e do Sul e no oeste da frica. Este mosquito tambm o vetor do dengue hemorrgico, que se tornou endmica no Brasil. Ele atualmente um mosquito que apresenta a maior disperso em reas urbanas do mundo. Esta espcie de grande importncia para a medicina, pois se trata do vetor de quatro sorotipos do flavivrus causador do dengue clssico e da febre hemorrgica do dengue. O aumento na densidade desse mosquito est relacionado ao comportamento sinantrpico e ao habito antropoflico dessa espcie (SILVA et al., 2004). Os machos de todas as espcies de mosquitos no sugam o sangue humano ou de animais, eles se alimentam de frutos. Apenas as fmeas sugam o sangue que ela precisa de modo a amad urecer os seus ovos. Os ovos da maioria das espcies de insetos so postos juntos, mas o Aedes pe os ovos separadamente, conseqentemente permitindo a difuso dos ovos e aumentando a chance de sobrevivncia.

O primeiro relato de doena semelhante ao dengu e foi descrita numa enciclopdia chinesa da Dinastia Chin (265 a 420 A.C.). Foi denominada pelos chineses de veneno da gua, pois achavam que de alguma maneira estava associada a insetos (SILVA e SILVA, 1999). Epidemias foram tambm descritas nas ndias Ocidentais em 1635. Os primeiros relatos de uma sndrome febril aguda semelhante ao dengue foram detectados na ilha de Jakarta, na sia, e no Cairo e em Alexandria, no Egito, em 1779. Em 1903, Graham forneceu, pela primeira vez, evidncias da transmisso por mosquito, e, em 1906, Bancroft concluiu ser o Aedes aegypti o vetor do dengue. At os dias atuais, o dengue ainda um dos principais problemas de sade pblica no mundo. A Organizao Mundial de Sade (OMS) estima que 80 milhes de pessoas se infectem anualmente, em 100 pases, de todos os continentes, exceto a Europa. Cerca de 550 mil doentes necessitam de hospitalizao e 20 mil morrem em conseqncia do dengue (FUNASA, 2002). O dengue clssico e o dengue hemorrgico so problemas importantes de sade pblica em regies tropicais e subtropicais (GUZMN e KOURI, 2001). De acordo com SILVA (2006) h referncias de epidemias em 1916, em So Paulo, e em 1923, em Niteri, sem diagnstico laboratorial. A primeira epidemia documentada clnica e laboratorialment e ocorreu em 1981 -1982, em Boa Vista Roraima, causado plos sorotipos DEN-1 e DEN-4. A partir de 1986, foram registradas epidemias em diversos estados. A mais importante ocorreu no Rio de Janeiro onde, pelo inqurito sorolgico realizado, estima-se que pelo menos l milho de pessoas foram afetadas pelo sorotipo DEN -1 nos anos 1986/1987.

1.1.2. - O Dengue

Em nosso pas, as condies socioambientais favorveis expanso do Aedes aegypti possibilitaram a disperso do vetor desde sua reintroduo em 1976 e o avano da doena. Essa reintroduo no conseguiu ser controlada com os mtodos tradicionalmente empregados no combate s doenas transmitidas por vetores. Programas com baixssima ou mesmo nenhuma participao da comunidade, sem integrao intersetorial e com pequena utilizao do instrumental epidemiolgico mostraram-se incapazes de conter u m vetor com altssima capacidade de adaptao ao novo ambiente criado pela urbanizao acelerada e pelos novos hbitos (BRASIL, 2009a). Um levantamento de dados realizado em fevereiro de 2009 pelo Ministrio da Sade mostra o mapa da incidncia da doena n o Pas (Figura 6).

Fonte: BRASIL (2009b).

Figura 6. Taxa de Incidncia do dengue no Brasil e Regies entre os anos de 1990

e 2008.

 notvel que desde o ano de 1990 a incidncia da doena tem crescido em todas as regies do Pas. Contudo, at maro de 2009, os casos de dengue caram no Brasil. O balano parcial de casos, divulgado Ministrio da Sade, aponta que nas dez primeiras semanas deste ano foram notificados 114.355 casos da doena, representando uma queda de 28,6% em relao ao mesmo perodo de 2008, quando 160.137 pessoas foram vtimas do mosquito. Houve reduo no nmero de casos da doena em 19 estados e no Distrito Federal. Ocorreu aumento de notificaes na Bahia, Acre, Roraima, Amap, Minas Gerais, Esprito Santo e Mato Grosso do Sul (BRASIL, 2009c). Apesar dos esforos para o controle da doena, at o momento no existe uma vacina para preveno do dengue. Enquanto no se pode contar com esta medida de controle, o nico elo vulnervel da cadeia epidemiolgica o vetor. A luta contra os mosquitos consiste principalmente na eliminao dos seus criadouros potenciais, que se constituem em recipientes artificiais de gua, como pneus usados expostos ao ar, depsitos de ferro velho descobertos, latas, garrafas e plsticos abandonados. As medidas de controle consistem na limpeza de terrenos baldios; aplicao de larvicida em depsitos de gua de consumo; uso de inseticida para as formas adultas do mosquito, durante os perodos de transmisso. Claro que as aes de preveno do dengue necessitam de envolvimento de outros setores da sociedade, particularmente na questo da melhoria de condies de urbanizao e habitao, coleta regular de lixo, abastecimento permanente de gua encanada e educao escolar (TAUIL, 2001). Alm disso, a conscientizao d e cada cidado sobre as medidas de preveno e controle e a efetiva ao dos rgos pblicos de sade, no que diz respeito ao controle da doena, em parceria com a populao.

1.2 leos essenciais: definies e caractersticas

O termo leo essencial utiliza do para denominar lquidos oleosos volteis, dotados de aroma forte quase sempre agradvel extrados de plantas por alguns processos especficos, sendo o mais freqente a destilao por arraste de vapor dgua (MOUCHREK, 2000). De acordo com a International Standard Organization (ISO) leos essenciais definem-se como os produtos obtidos de partes de plantas atravs de destilao por arraste de vapor dgua, bem como os produtos obtidos por expresso dos pericarpos de frutos ctricos (Rutacea e). De forma geral, so misturas complexas de substncias volteis, lipoflicas, geralmente odorferas e lquidas. Tambm podem ser chamados de leos volteis, leos etreos ou essncias. Eles so assim chamados por serem: geralmente de aparncia oleosa e lquida, voltil; geralmente possuem aroma agradvel; solveis em solventes apolares, como o ter. Em gua, eles apresentam solubilidade limitada, mas o suficiente para aromatizar suas solues aquosas, que nesse caso so denominadas hidrolatos (MOUCHREK, 2000). Os leos essenciais, normalmente, so incolores e suas densidades inferiores da gua, com algumas poucas excees. Quase sempre so dotados de atividade ptica, com ndices de refrao elevados (WILLIANS, 1996) . So princpios imediatos de origem vegetal, prprios de vrios grupos de espc ies (CHAAR, 2000).

1.2.1 Processo de extrao

Os leos essenciais estocados em vrias partes da planta, como nas fores, folhas, na casca dos caules madeira, razes rizomas frutos e sementes. O mtodo empregado na extrao do leo essencial ir variar de acordo com o parte que ir ser extrado e para qual finalidade ser destinado, o processo mais comum so: enflorao (enfleurage), arraste por vapor dgua, extrao com solventes orgnicos, prensagem (ou espresso) e extrao por CO 2 supercrtico (CHAAR, 2000; MOUCHREK, 2000; SIMES 1999; CRAVEIRO, 1981) .

1.2.2 Finalidades dos leos essenciais

Os leos essenciais so largamente usados em muitas indstrias para conferir aromas especiais em inmeros produtos, tais como perfumes, cosmticos, sabonetes, condimentos, e recentemente na medicina alternativa, como aromoterpicos (COSTA, 1994; CRAVEIRO, 1981; RUBLES, 1998). So empregados tambm para mascarar odores desagradveis em ambientes de trabalho e instalaes sanitrias, alm de serem usados como insumos em diversos produtos das indstrias de plsticos, tintas, borrachas, inseticidas e outras (MOUCHREK, 2000; COSTA, 1994). Muitos oferecem compostos de partida para snteses de outras substncias teis nas indstrias qumicas e farmacuticas (DISTASI, 1996; MATOS 1989).

1.2.3 Mtodos de anlise dos leos essenciais 1.2.3.1 Tcnicas fsico -qumicas

Para avaliar a qualidade de um leo essencial, de uma matria -prima vegetal rica em leo essencial (ou, por exemplo, de um produto que o contenha), necessrio dispor de informaes analticas sobre a identidade e a pureza do material em questo. Informaes sobre a densidade do leo, seu ndice de refrao, sua solubilidade, seu ponto de ebulio e evaporao so de s uma importncia no controle de qualidade do leo analisad o (MOUCHREK, 2000).

1.2.3.2 Tcnicas analticas

A anlise de misturas complexas de multicomponentes, como so os leos essenciais, requer a aplicao de mtodos analticos modernos e instrumentao adequada. As tcnicas analticas permitem a avaliao da qualidade

do leo essencial, garantindo, assim, a constncia de seus constituintes qumicos e a segurana de sua utilizao. A avaliao quantitativa e qualitativa envolve a utilizao de diversas tcnicas bsicas, que passaram por algumas alteraes nos ltimos anos, devido essencialmente revoluo da informtica (programas de computadores, nveis de automao, forma de integrao dos dados obtidos) e da sofisticao dos experimentos que podem ser realizados, resultando na deduo de uma estrutura coerente (CHAAR, 2000). A anlise qumica de separao e identificao dos constituintes dos leos feita dentre outros mtodos conforme descritos a seguir.

1.2.3.3 Tcnicas Cromatogrficas Cromatografia Gasosa CG: utilizada na separao da mistura em

componentes individuais. Baseia -se na distribuio dos componentes da amostra entre a fase estacionria (slido ou lquido) e uma fase mvel (gs), sendo aplicada a gs e compostos volatilizveis. Como os leos so suficientemente volteis, a amostra somente solubilizada em solventes como clorofrmio, antes de ser injetada no cromatgrafo (CHAAR, 2000).
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas CGEM: a tcnica consiste na conexo direta de colunas capilares de cromatografia

gasosa ao espectrmetro de massa, sem a interface de enriquecimento, permitindo vrias varreduras de massas rpidas em pontos diferentes de um pico cromatogrfico, de modo a testar sua homogeneidade. Desse modo, poss vel resolver picos cromatogrficos parcialmente superpostos. Assim, a espectrometria de massa acoplada cromatografia gasosa fornece as fragmentaes dos componentes individuais separados (CHAAR, 2000).

1.2.3.4 Tcnicas espectromtricas Espectrometria de Massas EM:

tcnica

que

consiste

no

bombardeamento de um composto com um feixe de eltrons e no registro quantitativo do resultado na forma de um espectro de fragmentos inicos positivos. Um registro obtido desta forma um espectro de massas. A separao dos ons positivos feita em funo de suas massas (ou, mais corretamente, da razo massa/carga; a maior parte dos ons, entretanto, tem carga unitria) (SILVERSTEIN, 1994)
1.3. Consideraes sobre a espcie Syzygium aromaticum (Cravo da ndia)

O cravo-da-ndia (Syzygium aromaticum) da famlia Myrtaceae, uma rvore de grande porte, chegando atingir de 12 a 15m de altura (Figura 7) e o seu ciclo vegetativo alcana mais de cem anos. O seu nome cientfico antigo era Eugenia caryophyllata Thunb, derivada da palavra grega "karyophyllon" que significa "folha-noz". A copa bem verde, de formato piramidal. As folhas so semelhantes s do louro, ovais, opostas e de colorao verde brilhante, com numerosas glndulas de leo visveis contra a luz. As fl ores so pequenas, branco -amareladas, agrupadas em cachos terminais. O fruto do tipo baga e de formato alongado, suculentos, vermelhos e comestveis. Aroma forte e penetrante. Os cravos-da-ndia (Figura 7) que usamos na culinria e nas anlises so na re alidade, os botes florais (ainda no abertos) e secos.

Fonte: www.ceplac.gov.br/cravo Figura 7 rvore, Botes florais ainda no abertos, botes secos

Da China que veio a primeira indicao do uso do cravo -da-ndia como condimento, remdio e elemento bsico para elaborao de perfumes especiais e incensos aromticos. Na China, era ento conhecida por "ting hiang" e na dinastia Han (206 a.C. - 220 d.C.) seus frutos foram levados para a corte do imperador por enviados da Ilha de Java. Conta -se que os prprios javaneses mantinham um pequeno fruto na boca para melhorar o hlito, antes de ir falar pessoalmente com o imperador. A primeira pessoa a fazer uma descrio completa do cravo-da-ndia foi um botnico alemo chamado Everard Rumph que dizia: " a mais bela, a mais elegante e a mais preciosa de todas as rvores". Na culinria da Idade Mdia, o cravo-dandia era usado como aromatizante para cons ervas e como adorno para pratos selecionados. Na poca do reinado de Ricardo II, era ingrediente do Hippocras, um vinho quente tomado costumeiramente pelos nobres. No sculo XVI, quando chegaram s Ilhas Moluccas, os portugueses imediatamente dominaram as plantaes, destruindo aquelas que no podiam vigiar

de perto. Esse monoplio fez com que o preo do cravo -da-ndia no mercado ficasse muito alto. Os holandeses que sucederam aos portugueses agiram da mesma forma e ganharam o monoplio ao destruir todos os craveiros-da-ndia, exceto aqueles que cresciam em uma ilha de sua propriedade: Ambon. Finalmente, a Frana rompeu o monoplio e, no comeo do sculo XIX, a planta j era cultivada em grandes plantaes em muitas regies tropicais. No Brasil, o cravo-da-ndia cultivado em regies quentes. Praticamente apenas a Bahia produz esta especiaria de forma comercial na Regio do Baixo Sul, representada pelos municpios de Valena, Ituber, Tapero, Camamu e Nilo Peanha, sendo estes os principais produtor es e mais ao Sudeste o municpio de Una. De acordo com algumas literaturas, o cravo -da-ndia a gema floral seca, sendo usado principalmente como condimento na culinria, devido ao seu marcante aroma e sabor, conferido por um composto fenlico vol til, o eugenol. Nas folhas ele chega a representar aproximadamente 95% do leo extrado (RAINA et al. 2001) e no cravo tambm o principal componente do leo, variando de 70 a 85%. A proximidade entre os valores do ndice de refrao descrito para o eug enol com os valores encontrados para os leos essenciais dos talos e dos frutos do Cravo da ndia confirmam que esses leos so ricos em eugenol. Os leos essenciais apresentaram os seguintes rendimentos em massa e em volume: Talos (9,45 e 9,26)% e Frutos (15,45 e 15,07)%. Os botes florais do Cravo da ndia de boa qualidade chegam a produzir at 15% de leo essencial (TAINTER et al., 1993). As folhas verdes, folhas secas na estufa e folhas secas ao sol apresentaram bons rendimentos (em massa e volume) de leos essenciais: (2,26 e 1,99)%, (5,62 e 5,26)% e (6,57 e 6,29)% respectivamente (REIS, 2006). Outros componentes dessa frao do leo so acetato de eugenila (15%) e ORTIZ 1992). -cariofileno (5 a 12%), que juntos com eugenol somam 99%. (BROWN & MORRA 1995, BROWN et al. 1991,

1.3 Caractersticas do eugenol

O eugenol (Figura 8), com frmula molecular C10H12O2 e massa molar 164,2 g mol -1, apresenta-se como um lquido incolor a amarelo claro (que escurece

quando exposto luz), voltil, baixa solubilidade em gua, cheiro forte e aromtico de cravo, sabor ardente e picante. Sendo o eugenol o componente majoritrio do leo essencial do Syzygium aromaticum, recomenda-se guardar seco tal leo em frasco mbar e em geladeira por questo visual, possvel decomposio trmica e perda do seu componente majoritrio.

OH O CH3

Figura 8. Frmula estrutural do eugenol.

Ele muito usado na odontologia como componente de seladores e outros produtos antisspticos de higiene bucal, tendo comprovado efeito bactericida (CAI & WU 1996, CHONG et al. 1997, KAPLAN et al. 1999, SHAPIRO et al.1994). Essa aplicao comercial direta tem como conseqncia vrios estudos sobre a obteno do leo essencial do cravo -da-ndia (CLIFFORD et al. 1999, ROVIO et al . 1999). Alm disso, o eugenol tem sido emprega do para a produo de outros fenlicos, tal como a vanilina importante matria -prima na aromatizao de doces, chocolates e sorvetes (PRIEFERT et al. 2001).

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Extrair, caracterizar e avaliar a atividade larvicida de leos ess enciais frente ao mosquito Aedes aegypti Linnaeus.

2.2. Objetivos especficos

1. Coletar, preparar a exsicata e identificar botanicamente as espcies vegetais selecionadas; 2. Estabelecer essenciais; 3. Determinar as propriedades fsico-qumicas dos leos essenciais; 4. Caracterizar quimicamente e quantificar os componentes majoritrios dos leos essenciais por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas;
3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Equipamentos e acessrios 3.1.1 Deionizador

as

melhores

condies

de

extrao

dos

leos

Foi utilizada gua ultrapura no preparo de solues e lavagem de vidrarias e materiais em sistema de deionizao NANOPURE.
3.1.2 Refratmetro

Utilizou-se um refratmetro AABE de bancada, modelo 2 WAJ, para as medidas de ndice de refrao .

3.1.3 Cromatgrafo gs acoplado a espectrmetro de massas

Para a determinao qumica do leo, foi utilizada a anlise por meio da cromatografia gasosa contendo uma coluna capilar HP -5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (30 m x 0,25 mm; 0,25 m de espessura de filme) com fase estacionria. O cromatgrafo do modelo QP -500 fabricado pela Shimadzu tendo hlio como gs de arraste, com fluxo na coluna de 1 mL min -1.

3.2 Materiais

 Provetas;  Pipetas (graduadas e volumtricas);  Micropipeta;  Bales volumtricos;  Bqueres;  Funil de vidro;  Bastes de vidro;  Algodo;  Esptula de ao inoxidvel;  Pra;  Piceta;  Cubeta;  Frascos de Polipropileno;  Frascos de vidro;  Tubos capilares de vidro; As vidrarias foram lavadas com cido ntrico (P.A. MERCK) 10% e em seguida com gua ultrapura at completa remoo do cido.
3.3 Reagentes e Solues 3.3.1 Reagentes

 Sulfato de sdio anidro (Na 2SO4);  lcool etlico (C 2H5OH);  Brometo de Potssio (KBr);  Clorofrmio (CHCl 3);  gua ultrapura; Todos os reagentes utilizados foram de pureza analtica (P.A.).

4. PROCEDIMENTO 4.1 Coletas das amostras 4.1.1 Obteno do leo essencial

Obtiveram-se amostras autnticas do fruto do Syzygium aromaticum

(Cravo da ndia) no comercio de So Lus. Fez-se a extrao do leo essencial por

meio de destilao por arraste de vapor de gua em um sistema extrator de Clevenger (Figura 9) no Laboratrio de Fsico -Qumica e Microbiologia de Alimentos do Programa de Controle de Qualidade de Alimentos e gua PCQA do Prdio do Pavilho Tecnolgico, da Universidade Federal do Maranho, Campus do Bacanga .

Figura 9. Sistema extrator de Clevenger

4.2 Anlises fsico-qumicas 4.2.1 Caractersticas fsicas do leo essencial

Na caracterizao das propriedades fsicas do leo essencial foram realizadas as anlises de densidade, solubilidade em etanol a 7 0%, ndice de refrao, rendimento do leo, cor e aparncia.
4.2.2 Densidade

Determinou-se

densidade

utilizando-se

um

balo

volumtrico

especialmente confeccionado e aferido para 1mL, o qual foi escolhido devido o pequeno volume de amostra de leo essencial disponvel, previamente seco, tarado e aferido, onde se adicionaram as am ostras de leo a 25C, pesando -se em seguida.
4.2.3 Solubilidade em etanol 70%

Para esse teste, foi utilizado balo volumtrico de 10 mL contendo um volume constante do leo essencial, sobre o qual era adicionado proporcionalmente volume crescente da mistura de lcool/gua destilada a 70% (v/v) at a sua completa solubilizao.
4.2.4 ndice de refrao

Adicionaram-se as amostras de leo no prisma de Flint do refratmetro a 25C, com o auxlio de tubos capilares de vidro.
4.2.5 Cor

A tcnica usada foi visual, feita por comparao das cores das essncias com as cores conhecidas.

4.2.6 Aparncia

A tcnica usada, tambm neste caso foi visual, na qual se faz uma comparao das essncias no que diz respeito sua transparncia ou limpidez .
4.2.7 Anlises cromatogrficas 4.2.7.1 Anlise por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (CG-EM)

Analisou-se

leo

essencial

qualitativamente

por

CG-EM

no

cromatgrafo a gs contendo uma coluna capilar HP-5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (30 m x 0,25 mm; 0,25 m de espessura de filme) com fase estacionria. O cromatgrafo do modelo QP -500 fabricado pela Shimadzu tendo hlio como gs de arraste, com fluxo na coluna de 1 mL min -1. Para as anlises, foram injetadas alquotas de 0,3 QL da amostra diluda (1,0 mg do leo em 1000 L de diclorometano com pureza de 99,9%), fixando -se as seguintes condies: temperatura do injetor em 280 C; split de 1:10; programao de temperatura do forno de 40C (5,0min.) a 240C ( com taxa de aquecimento de 4C/min.) e de 240 a 300 C (com taxa de aquecimento de 8 C/ min., 7,5min.). No Espectrmetro de Massas do tipo quadrupolo linear o modo de varredura foi de 0,5seg/scan, a faixa de varredura variou de 40 a 500 daltons cada uma, a linha de transferncia fo i de 280C e o filamento desligado em 0,0 a 4,0 min.

5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1 Caractersticas fsicas do leo essencial

As essncias alteram-se com maior ou menor facilidade, dependendo da natureza qumica dos seus constituintes e consoante s circunstncias do meio. Entre os fatores principais que as modificam esto o ar, a luz, o calor, a gua e impurezas diversas de origem natural ou oriunda de falsificaes. As alteraes podem ser reconhecidas tanto por mudanas de suas caractersticas organolpticas (aroma, cor, sabor, transparncia, fluidez), como tambm dos valores dos seus parmetros qumicos e fsicos. Desta maneira, diminuindo as suas qualidades, reduz-se de igual modo o seu aproveitamento nas indstrias de perfumaria, cosmtica, alimentos, qumicas, etc. Prejuzos anlogos sofrem as indstrias farmacuticas, quando se utiliza como corretivo do cheiro; sabor e a teraputica, quer pela diminuio dos constituintes ativos, quer, por se tornarem agressivos quando usados externamente, causando irritaes na pele
[5,10,16]

Os parmetros fsico-qumicos do leo essencial dos botes florais do Syzygium aromaticum esto expostos na (Tabela 10).

Propriedades Fsico -Qumicas

leo essencial

(a)

leo essencial

(b)

Densidade (g mL -1) Solubilidade em lcool 7 0% (v/v) ndice de refrao (N D ) Rendimento (%) Cor Aparncia
25

0,85 1:6 1,46 2,5 Amarelo Lmpido

0,86 1:5 1:9 1,47 1,5 Amarelo Lmpido

Tabela 10. Propriedades fsicas do leo essencial extrado dos botes florais do Syzygium aromaticum.
(a) leo em estudo. (b) MOREO, Q. A. El Aceite Esencial de limn producido enEspaa. Contribucin a su evaluacin por Organismos Internacionales (1999).

Quanto densidade o leo essencial apresentou valores baixos variando de 0,84 g mL-1 a 0,86 g mL-1, com mdia de 0,85 g mL-1, esse fato se deve devido elevada quantidade de hidrocarbonetos terpnicos. (DI GIACOMO y MINCIONE 1994). Quanto solubilidade o leo essencial apresentou um valor mdio de 1:6 (1 volume de leo essencial para 6 volumes de lcool etlico a 90 GL). Para os leos essenciais de frutos ctricos se empregam solues de lcool etlico de elevada graduao alcolica, compreendidas entre 80 a 96 GL. A solubilidade do leo essencial ser tanto maior quanto maior sua composio em componentes oxigenados. Segundo Calvarano et al (1988) os valores encontrados foram entre 1:5 a 1:9 volumes de lcool etlico a 90 GL (v/v). Por esse mtodo pode se determinar a possibilidade de adio de certos adulterante, que no so solveis em lcool etlico. O ndice de refrao obtido para o leo essencial apresentou -se semelhante ao encontrado na literatura. Elevado ndice de refrao caracterstica inerente aos leos essenciais, podendo ser utilizado como indicativo de pureza destes produtos (SIMES & SPITZER, 1999).
5.2 Cromatografia gasosa acoplada espectroscopia de massas

O cromatograma do leo essencial extrado dos botes florais do Syzygium aromaticum, obtidos com o uso da coluna capilar HP-5MS, 5% difenil, 95% dimetil polisiloxano (30 m x 0,25 mm; 0,25 m de espessura de filme) com fase estacionria, com uma energia de 70 eV, mostrado na Figura 11.

Figura 11. Cromatograma do leo essencial do cravo da ndia.

A Figura 11 encerra o cromatograma do leo essencial Syzygium aromaticum. notvel neste cromatograma a eficincia do mtodo cromatogrfico empregado nas condies fixadas no item 4.2.7.1, pois a resoluo entre os picos foi satisfatria. Apresenta cinco picos cromatogrficos, sendo que o pico cromatogrfico 1 o Eugenol, cujo tempo de reteno foi 27,40 min; o pico cromatogrfico 2 o Copaeno, com tempo de reteno 27,99 min; o pico cromatogrfico 3 o Cariofileno, o qual apresentou o tempo de reteno 29,47; o pico cromatogrfico 4 o Humuleno, cujo tempo de reteno foi 30,57 min; o pico cromatogrfico 5 o Acetato de Eugenila, com tempo de reteno 32,94 min. A Tabela 12 mostra a identificao de cada pico apresentados na Figura 11, assim como o seu tempo de reteno (T r) na coluna e o respectivo teor na mistura de leos essenciais, sendo que a quantificao dos cinco picos cromatogrficos foi determinada pelo mtodo de normalizao (integrao da rea do pico correspondente). Nota -se que o eugenol apareceu com 52,53%, e o cariofileno com 37,25%, o que caracteriza serem estes os componentes majoritrios.

Pico 1 2 3 4 5

Tr (min)

Substncia identificada

Teor (%)

27,40 27,99 29,47 30,57 32,94

Eugenol Copaeno Cariofileno Humuleno Acetato de Eugenila

52,53 2,05 37,25 4,11 4,05

Tabela 12. Composio qumica do leo essencial.

6. CONCLUSO

 Os estudos das constantes fsicas do leo essencial essencial Syzygium aromaticum apresentaram valores semelhantes aos valores obtidos pela literatura e pelos padres usados para as suas comparaes ;  A identificao positiva do eugenol no leo essencial foi realizada utilizando-se as tcnicas de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas, baseado nos seus tempos de reteno comparados com seus padres e aos seus fragmentos de massas, nas mesmas condies de anlises;  A quantificao por normalizao dos componentes do leo essencial por cromatografia gasosa mostrou que o eugenol apresentou -se como componente majoritrio apresentando um teor de 52,53%.

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