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Srie : C

N' d'ordre: 861


N' de Srie : 340
THSE
prsente devant
1
!
L'UNIVERSIT DE RENNES l
V.E.R. Scence5 de la Vie et de l'Environnement
PO/II obtenir
Le Titre de Docteur en Troisi lne Cycle
.
Spcialit: cologie ET MALGACHE
fOUr- L'ENSE!GNEMENT SUPERIEUR
C tlI. f:. S. - OU/\GADOUGOI}
par A' ., ln 8 1A 1\' 1998
. , U'l\" .
\ 2 .
Joseph GOMA TCHIMBAKALA-------_
NITRIFICATION AUTOTROPHE DANS UN SOL ACIDE DE LANDE:
TUDE EN MILIEU RENOUVEL DE L'EFFET LITIRE SUR DES
POPULATIONS DE NITHOBACTER.
Soutenue le 6 Juillet 1984 devant la Co [Omission cl' Examen
MM.. J. TOUFFBT
G. BERTRU
J. GOASGUEN
L. LABROUE
J.C. LEFEUVRE
F. ROZE
Prsident
UNIVERSITE de RENNES J
U.E.R. Sciences et Philosophie
Doyens Honoraires
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M. LE MOAL H.
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M. LE MOAL H.
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M. LE BOT J.
Matres de Confrences Honoraires
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An ne 1983-1984
/...
2.
MATHEMATIQUES et II\IFORMATIQUE
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REMERCIEMENTS
J'exprime ma reconnaissance Monsieur le Professeur TOUFFET , pour
m'avoir accueilli dans le laboratoire d'Ecologie Vgtale de l'Universit
de Rennes l et pour avoir accept de prsider le jury de cette thse.
C'est Monsieur BERTRU, Matre-Assistant au laboratoire de Microbio-
logie de l'Universit de Rennes l, que je dois mon initiation la micro-
biologie. Il a suivi le travail tout au long de sa ralisation; ses cri-
tiques et ses suggestions judicieuses m'ont t d'un secours prcieux.
Qu'il veuille bien trouver ici l'expression d'une fidle reconnaissance.
Mademoiselle Matre-Assistante au laboratoire de Biologie
des sols l'Universit de Lyon l, nous a appris les techniques d'immuno-
fluorescence applique l'cologie microbienne des sols. Je suis heureux
de lui adresser le tmoignage de ma gratitude.
Ce travail doit beaucoup Mademoiselle ROZE, Assistante l'Univer-
sit de Rennes l, dont l'aide m'a t prcieuse dans la partie terrain.
Qu'elle sache que j'ai hautement apprci son concours et ses conseils.
Monsieur le Professeur LEFEUVRE, du Musum d'Histoire Naturelle de
Paris, malgr ses nombreuses occupations, a trouv le temps de s'intresser
notre travail en nous faisant l'honneur de participer notre jury de thse.
Qu'il trouve ici l'expression de ma respectueuse gratitude.
Monsieur LABROUE, Matre-Assistant l'Universit Paul Sabatter de
Toulouse, a tmoign un grand intrt pour ce travail en acceptant de le
juger. Je suis trs honor de le compter dans ce jury.
Monsieur GOASGUEN, CHEF DE TRAVAUX 'la Facult de Mdecine de Rennes l,
a accept de juger ce travail.Qu'il veuille trouver ici l'expression de ma
gratitude.
Je ne voudrais pas terminer sans remercier ma collgue R. SALAUN et
Monsieur GUBETTI et tous les autres membres des laboratoires de Microbio-
logie, d'Hmatologie et d'Ecologie Vgtale, qui ont aid d'une faon ou
d'une autre l'aboutissement de ce travail.
Je remercie galement Madame JOUANNEAU qui a assur la dactylographie
de cette thse. Qu'elle soit assure de toute ma sympathie.
SOMMAIRE
INTRODUCTION .
CHAPITRE l : MATERIEL ET r-THODES .
1) CADRE DE L'ETUDE ET MATERIEL BIOLOGIqUE .
A) CADRE DE L'ETUDE .
B) MATERIEL BIOLOGIQUE: SOUCHES BACTERIENNES .
1) Enrichissement et isolement de Nitrobacter .
2) Rsultats .
II) TECHNIQUES DE DENOMBREr-NT .
A) L' IMMUNOFLUORESCENCE .
1) Principe .
2) Protocole sui vi .
3) Application de la mthode d'immunofluorescence au comptage
de Ni trobacter .
4) Dis cus sion .
B) AUTRES METHODES DE DENOMBREMENT .
1) Numration directe: mthode de ZIMt-l'1AN et al.. (1978) ....
2) Mesure de la densit optique .
3) Numration indirecte: dosage de l'A.T.P. cellulaire .
C) AUTRES TECHNIQUES .
1) Mthode d'investigation de la ..
2) Dosage des nitrites et des nitrates
"'("} lJ "...
III:) ::::: :::::::::::::::i\' ::: :: :::
. :i ' " Il
c t ::1
r
B) SYSTEMES DE CULTURE ,?I'i
o
,;
1) S
- 1 liB h"
ys terne c os ou at c .................. '.';" .
_ ; .!J 118 61
2) Systeme ouvert : le chemostat -._ " .
C) MISE AU POINT D'UN DISPOSITIF EXPERIMENTAL .
1) Modifications apportes au chmostat .
2) Exprience prliminaire: vrification de l'tablissement
des tats d'quilibre .
CHAPITRE II : CARACTERISATION P1ITSIOLOGIQUE DES SOUCHES DE NITRO-
BACTER .
1) ETUDE DE LA CROISSANCE .
A) CROISSAl\lCE EN MILIEU FERl' .
B) CROISSANCE EN MILIEU OUVERT .
Pages
7
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30
30
30
31
31
31
32
32
32
37
37
33
41
4..
42
44
II) ETUDE DE LA DU NITRITE >....... 44
A) CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE EN MILIEU FERME.... 45
B) DISCUSSION..................................................... 45
C) CALCUL DE L'ACTIVITE SPECIFIqUE................................ 45
D) DISCUSSION..................................................... 50
III) INFLUENCE DU pH ET DE LA TEMPERATURE SUR L'ACTIVITE NITRIFlk1TE. 51
A) INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
B) PROTOCOLE EXPERIMENTAL......................................... 52
C) RESULTATS...................................................... 52
D) DISCUSSION..................................................... 54
IV) INFLUENCE DE LA MATIERE ORGk1IQUE.. .......... .......... 57
A) INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
B) PROTOCOLE EXPERINENTAL ................ 57
C) RESULTATS...................................................... 58
D) DISCUSSION..................................................... 63
CHAPITRE III : ETUDE DES EFFETS D'UN APPORT DE CaC0
3
ET DES EFFETS
LITIERES SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE.... 65
1) INTRODUCTION...................................................... 66
II) ETUDE DES EFFETS DES APPORTS DE CaC0
3
.. .. 67
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL......................................... 67
1) Sur le terrain............................................... 67
2) Au laboratoire.............................................. 67
B) RESULTATS ... ...... .... ................. 67
1) Rsultats des expriences ralises sur le terrain.......... 67
2) Rsultats des expriences ralises au laboratoire.... ..... 69
C) DISCUSSION..................................................... 70
III) ETUDE DES EFFETS LITIERES....................................... 71
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL......................................... 71
1) Modalits de la manipulation effectue sur le terrain. .... 71
2) Modalits de la manipulation effectue au laboratoire.. ..... 72
B) RESULTATS EXPERHNTAUX........................................ 75
1) Rsultats des expriences ralises sur le terrain.......... 75
2) Rsultats des expriences ralises en chmostat au
laboratoire................................................. 82
CONCLUS ION GENERALE ...............................................
BIBLIOGRAPHIE .
LISTE DES FIGURES ................................................
100
104
112
LISTE DES TABLEAUX................................................. 114
ANNEXES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
INTRODUCTION GENERALE
Les vgtaux chlorophylliens synthtisent leurs constituants cellulai-
res partir du carbone provenant du COZ atmosphrique de l'eau et des l-
ments minraux puiss dans le sol. Parmi ces derniers, l'azote apparat
primordial car il est l'un des constituants fondamentaux des tissus.
Aprs la mort des vgtaux ou des les lments minraliss
inclus dans la matire organique sont inutilisables directement par les
plantes. Leur minralisation est indispensable pour maintenir dans le sol
un taux suffisant d'lments assimilables; les microorganismes ont cet
gard un rle prpondrant.
L'azote atmosphrique fix par les vgtaux et les microbes revient
au sol par le processus de minralisation. La premire tape de celle-ci
consiste en une libration d'ammonium. Cet azote ammoniacal form par
ammonification est oxyd en nitrates c'est la nitrification. Ce processus
se prsente en deux tapes
la nitritation
la nitratation
+ 3/Z Oz
+ l/Z Oz
+
+ Z H + HZO + 63,8 kcal
+ 17,5 kcal
La nitrification est effectue par un groupe de bactries chimiolitho-
trophes : les Nitrobacteriaceae dont l'espce la plus cocmune est Hitrcsor'lonas
europea qui intervient dans la premire tape de ce processus et Nitrobac-
ter Winogradskyi dans la seconde tape. Les principales espces connues
sont rpertories dans le manuel de dtermination de BERGEY (1974).
Les bactries de ce groupe ont t pendant longtemps considres come
des chimiolithotrophes strictes. Mais les travaux mens par DELWICHE et
FINSTEIN (1965), CLARK et al. (1966), SNITH et HOARE (1968), WALKER (1975),
BOCK (1976), (1978) et rcemment (1983) et la discussion
de RITTENBERG (197Z) ont remis en question ce point de vue. Ces auteurs
- 8 -
ont montr que Nitrosomonas et Nitrobacter ont la capacit d'utiliser le
carbone organique. Ainsi donc l'autotrophie stricte au sens de WINOGRADSKYI
(1890) n'existe pas. Ces bactries sont donc des chimiolithotrophes faculta-
tifs. Cette capacit leur permet de se maintenir et de survivre en absence
momentane d'azote minral. Ces exemples dmontrent l'interpntration des
cycles du carbone et de l'azote dans la nature. Il est donc ncessaire de
tenir compte des effets de la matire organique dans l'essai de comprhension
du cycle de l'azote.
Des deux bactries intervenant dans la nitrification, Nitrobacter est
de loin la plus sensible aux facteurs de l'environnement. Cette sensibilit
fait de la dernire tape du processus un bon indicateur de l'activit glo-
bale du sol. C'est pourquoi de nombreux travaux ont t consacrs la con-
naissance de Nitrobacter.
C'est une bactrie gram-, de petite p. La prsence des
cytomembranes disposition polaire est le principal critre de reconnais-
sance retenu par et GIBBON dans la 8e dition de Bergey's Manuel
(1974) .
Nitrobacter tire son nergie principalement de l'oxydation du N0
2
en
N0
3
Au cours de cette transformation l'atome d'azote subit un changement
de valence de +3 +5.
Les lectrons sont transfrs grce un complexe multienzymatique qui
comprend la le cytochrome a et c (ALEEi'l et NASON, 1959).
Ce complexe est localis dans la membrane cellulaire/ENGEL (1941) cit par
RAUCK (1980), Yk'1ANAKA et al. (1979). Outre le systme du cytochrome l' oxy-
dation du N0
2
ncessiterait la prsence du fer (LEES et SIrSON, 1957,
ALEEH et ALEXANDER, 1958) et d'une Flavine VAN GOOL et (1966)
WALLACE et NICHOLAS (1969).
En utilisant de l' 2
1
(1970) a montr que l'eau et l'oxygne par-
ticipent directement la nitrification :
N0
2
+ H 0
18
NO ---H 0
18
2 2 2
H 0
18
2 Cyt
3+
N0
3
18
+ 2
2+ +
N0
2
+
a
l
Fe Cyt a
l
Fe + 2 H
2
2+ +
+ 1/2
3+
2 Cyt a
l
Fe + 2 H O
2
2 Cyt a
l
Fe + H
2
0 + Energie
La raction d'oxydation du N0
2
est exorgonique. L'nergie libre est
stocke sous forme d'ATP. Les valeurs de PlO (nombre de phosphates assimils
- 9 -
ou nombre de moles d'ATP produit par nombre d'atomes d'oxygne consomm)
est gale 1, c'est--dire que pour une mole de NO
Z
oxyde 1 ATP est
produit.
La formation de l'ATP a lieu au es structures membranaires.
L'ATP est utilis comme source d'nergie dans le cycle de CALVIN pour
la synthse de la matire organique par incorporation du COZ (KELLY, 1967).
ALEEM (1970) a montr que pour assimiler le COZ via le cycle de CALVIN,
3 ATP et Z NADH sont ncessaires. Ce processus implique l'oxydation d'au
13 moles de nitrite par Nitrobacter. Ila aussi montr que l'incorpo-
ration de l'azote provenant du NO
Z
dans les protines cellulaires demande
7 ATP. Selon ce mme auteur, la rduction du NADP+ par le NADH demande 1 ATP
En dfinitive, la fixation d'une molcule de COZ ncessite l'oxydation de
Z1 moles de nitrite.
La consquence d'un tel mtabolisme est un rendement de croissance trs
faible d'o la difficult rencontre lors des essais de cultures pour obtenir
de fortes densits de populations de Nitrobacter.
Malgr cette lente croissance de Nitrobacter, la nitrification autotro-
phique, visible par l'importance des teneurs en N0
3
, est trs rpandue dans
la nature. Son intensit varie selon les conditions du milieu. Elle est bien
reprsente dans les cosystmes bien ars par exemple: sols labours,
boues actives. L'vidence de son existence reste problmatique dans les
systmes climaciques, les eaux pollues et certains sols acides. Dans ces
cosystmes, la plus grande partie e l'azote est sous forme ammoniacale.
Ces constatations rendent ncessaire l'tude de la relation qui lie
Nitrobacter et la nitrification. Il est important pour aborder cet aspect
de connatre la physiologie et le comportement du microorganisme et de con-
natre sa niche cologique.
En fait, notre mconnaissance des lois rgissant le dveloppement et
la survie de ces microorganismes dans leur environnement est lie l'in-
suffisance des techniques. Les mthodes traditionnelles utilises en co-
logie ne sont pas applicables ces microorganisnes du fait de leur petite
taille.
A l'heure actuelle, les tudes sur le terrain sont remplaces par des
observations au laboratoire. Dans ce cas, pour rester le plus prs possible
des conditions naturelles, la matrise de l'chantillonnage et la dure
- 10 -
entre la collecte et l'observation est un impratif. Les techniques bac-
triologiques usuelles de comptage par talement sur gelose et de comptage
cause de leur dure, deviennent dans ce contexte inoprantes. L'inef-
ficience de ce dernier a mme fait voquer l'hypothse d'une nitrification
htrotrophique dans certains cosystmes. Selon BELSER (1979) par exemple
une incubatton de sol in situ a donn 30 ppm de nitrate; le comptage HPN
effectu a donn 10
4
bactries par gramme de sol alors que thoriquement
il eut fallu avoir 6 10
6
bactries pour donner les 30 ppm de nitrate ; ce
nombre est encore plus faible que celui en culture pure (2 10
8
ger-
mes). Cet exemple montre bien que l'hypothse de la nitrification htro-
trophe serait plutt imputable aux erreurs de comptage introduites par la
mthode
Toutefois, par des mthodes indirectes telle l'utilisation des inhibi-
teurs spcifiques de la nitratation (N-serve et chlorate); GHIORSE et
ALEXANDER (1978), MEVEL et (1981) ont pu mettre en vidence une
nitrification htrotrophe. Le rcapitulatif de FOCHT et VERSTRAETE (1977)
sur les tudes des souches htrotrophes en culture pure et en conditions
vitesse de fois plus faible
De tous ces fait, dcoule la ncess,{,i (,dB' avoir des plus efficaces
''::>( . P,
d d
. 1 . . d . L , . 3-1 Q.. .: \1
e comptage et e es sa.:tu.
\ "It ) - n Or J - W
., Cu . ,
\1'" ;"rI fi '
, . d . dl' \\ f'l'- . . l' .
L recente e a en uo,rescence et
".,,""
fluores cence (dj applique en mdecine cl'epu.i:s_L9.42 p'a,1 COONS in BOHLOOL

et al., 1980) dans les tudes d'cologie microbenne du sol, constitue une
avance mthodologique intressante. Cette technique permet une observation
et une quantification des germes moins d'une heure aprs la prise de l'-
chantillon.
jl Dans le cadre gnral de l'tude du cycle de l'azote dans les sols des
landes bretonnes, nos collgues se sont aperus que les teneurs en N0
3
sont trs faibles. Dans ces sols, l'ammonium reprsente la forme d'azote
la plus abondante (ROZE et FORGEARD, 1980, 1982). Ces cons tatations ont
entran plusieurs types de rflexions dont :
- Existe-t-il une nitrification autotrophe et des germes responsables
de cette activit dans ce type de sol ?
- Quel rle joue la matire organique apporte par les litires des
diffrentes espces vgtales prsentes dans la station tudie ?
- 11 -
Pour essayer d'apporter des rponses toutes ces interrogations, nous
avons envisag plusieurs types de manipulations in situ et au laboratoire.
Nous avons concentr nos efforts sur la nitratation et Nitrobacter parce ..
qu'ils sont de bons indicateurs du fonctionnement normal de la nitrification.
Etant donn que toute tude autocologique d'un germe suppose son
obtention en culture pure, nous avons cherch isoler une souche de Nitro-
bacter partir du sol de la station d'tude.
Aprs une prsentation sommaire du cadre de l'tude, nous avons expos
dans le chapitre l le matriel et les mthodes employs. Certaines d'entre
elles sont prsentes et discutes la lumire d'une exprimentation. La
technique de culture en milieu renouvel a fait l'objet d'une mise au point
particulire. Elle nous a dans une grande partie de notre travail de
laboratoire.
Le chapitre II est consacr l'tude comparative de la physiologie
de la souche isole par rapport une souche de Nitrobacter Winogradskyi
ATCC Leur sensibilit par rapport aux facteurs de l'environnement
pH, temprature et leur capacit utiliser la matire organique, ont t
explors.
Dans le chapitre III, nous exposons les rsultats de l'impact des
apports de CaCO] sur la nitrification in situ et in vitro des sols.
L'tude de l'effet litire ayant constitu l'essentiel de notre travail,
une large part lui est consacre dans ce chapitre. Le chmostat conu dans
le laboratoire nous a servi dans l'valuation de l'effet litire in vitro.
Cette souche nous a t fournie par Annie
Laooratoire de Biolof,ie des Sols de l'Universit de LYON 1.
Nous lui exprimons notre gratitude.
CHA PIT REl
MATERIEL ET METHODES
- 13 -
1) CADRE DE L'ETUDE ET MATERIEL BIOLOGIQUE
A) CADRE DE L'ETUDE
La station d'tude est situe dans le Hassif e Paimpont au lieu-dit
Trcesson 30 km de Rennes.
- Caractristiques cliatiques
Les tempratures moyennes estivales sont comprises entre 17 et 18C.
En hiver, elles sont situes entre 7 et 8C (fig. 1).
?;m!l 4
'" '"
'"

'" '" '" :c
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2D'n
J hr
X" 1
1 1 1
/0 .

Fig. VARIATIONS DE LA MOYENNE (COURBE, EN OC) ET DE LA
PLUVIOSITE (HISTOGRAHt'fE, EN mm) A PAUONT
(d'aprs ROZE et FORGEARD, 1982)
La pluviosit sur le Massif de Paimpont est de 800 1000 mm par an.
- Vgtation
Au dbut de cette tude la vgtation tait compose par: Agrostis
setacea 4, piliferum 3, Polytrichum formosunl 2,
juniperinum +, Erica cinerea l, Erica ciliaris l, Calluna vulgaris 1 ,
Ulex minor 1 , Ulex europaeus 1 , Molinia caerulea +, Carex caryophyllea +,
Betula verrucosa +.
- 14 -
- Sol
Le sol est de type brun acide. Il est dvelopp sur schiste rouge
cambrien. Sa profondeur varie entre 30 et 60 cm. La figure 2 montre une
description du profil.
- ~
- lb
-.t()
I
~ v """'"" .......... - -'
....... '- "- - "-" """"" ~
L _
B r
\
Litire de feuilles d'Agrostis et de Polytrics
Horizon structure cendreuse de couleur 10 YR 2,5/1.
Structure grumeleuse, texture limoneuse, fin chevelu
racinaire dense, pas de caillou, limite infrieure nette
et horizontale. pH (H20) 4,2
Horizon de couleur 5 YR 3/2. Structure polydrique, tex-
ture limoneuse, racines nombreuses et plus grosses, pas
de caillou, limite infrieure diffuse horizontale.
pH (H
2
0) 4,4
Horizon de couleur 5 YR 4/2. Structure polydrique,
texture limono-sableuse, racines rares, quelques
cailloux et bloes. pH (H
2
0) 4,2
Roche mre
Fig. 2
PROFIL SCHEHATIQUE DU SOL DE LA LANDE ETUDIEE
B) MATERIEL BIOLOGIQUE SOUCHES BACTERIENNES
Nous avons utilis au cours de nos expriences
- une souche de Nitrobacter Winogradskyi ATCC 25391,
- une souche de Nitrobacter que nous avons isole du sol de lande
employ pendant cette tude.
1) Enrichisseoent et isoleent de Jitrobacter
Les chantillons de sol (70 g) sont hOQogniss tamiss 2 mm,
mlangs avec 50 g de billes de verre de 4 mm.
Ils sont placs dans une colonne munie de dents intrieures pour
viter le tassement (schma 1).
Une percolation est effectue au n o ~ r dans une enceinte temprature
constante 28C.
Rservoir de
milieu de culture
Pompe

de verre
Pompe pristaltique
Coton de
verre
de percolation
- 15 -
d'air
Rservoir de rcupration
de l'effluent de percolation
Schma 1
SYSTHlE DE PERCOLATION lJTEISE POUR L' DES SOLS EN NITROBACTET<
- ,16-
L'enrichissement de la colonne en germes nitrifiants se fait l'laide
d'une solution de Schmidt (1973) contenant 100 ug/ml de N-N0
2
.
Aprs un mois de percolation, 5 g de sol sont prlevs et inoculs
dans 50 ml de milieu de culture 1 g/l de NaN0
Z
et contenus dans des erlens
de 150 ml. Les incubations ont lieu Z8C.
A intervalles de temps rguliers, 0,2 ml de la de sol sont
prlevs et la disparition du nitrite est au ractif de Griess.
Lorsque tout l'azote nitreux a disparu, ml d'inoculum est transfr dans
des tubes contenant 9 ml du mme milieu de culture. Dix transferts succes-
sifs sont ainsi raliss pour diminuer le maximum d'Htrotrophes.
Aprs l'puisement du nitrite au dixime repiquage, on ralise des
dilutions de 10-
1
10-10. Chaque dilution est ensuite ensemence sur une
bote de ptri contenant le milieu minral 0,5 g/l de NaN0
Z
et additionn
de 6 d'Agar noble. Les incubations se font 28C et durent environ
15 Jours. Aprs ce laps de temps, les colonies de Nitrobacter (petites et
blanches) sont repres, effleures avec un capillaire strile et trans-
fres aseptiquement dans des tubes contenant 5 ml de milieu de culture
0,5 g/l de NaN0
Z
'
Au bout d'une priode d'incubation variable quelques tubes ne con-
tiennent plus de nitrite. Ces cultures sont repiques dans des milieux frais
et tests pour dceler d'ventuels contaminants par ensemencement des mi-
lieux organiques complets (trypticase soja; bouillon nutritif, extrait
de levure ... ).
Si aucune contamination n'est dcele la souche est considre comme
pure.
Les souches isoles sont conserves sur milieu liquide 1 g/l NaN0
2
ZOC. Un repiquage sur milieu neuf est effectu tous les 15 jours.
Z) Rsultats
Une seule souche a t isole par cette technique. Elle correspond aux
2ritres d'autotrophie c'est--dire qu'elle ne se dveloppe sur les Bilieux
purement organiques. La coloration de la paroi montre qu'elle est gram ngatif.
Dans le milieu terrestre Nitrobacter est la seule bactrie reconnue
comme pouvant former le nitrate en grande quantit partir du nitrite
nous avons considr la souche isole comme tant un Nitrobacter. Nous
l'avons nomm Nitrobacter LB en rfrence sa station d'origine qui est
une lande de Bretagne.
L'obtention de la souche a t trs longue (9 mois) cause de sa
faible croissance et du nombre de bactries htrotrophes qui l'accompagnent
sur le milieu de SCHHIDT (1973) glose 6 %0' Ces dernires rendent trs
_ 17_
dlicate la manipulation de prlvement des colonies apparues dans les bo-
tes et par consquent leur transfert en milieu neuf pour l'obtention de
cultures pures.
La distinction en deux srotypes, Nitrobacter Winogradskyi et Nitro-
bacter agilis, effectue par FLIERMANS et al. (1974), sur les Nitrobacters
provenant de divers sols, la diversit signale par et al. (1979),
STANLEY et SCHMIDT (1981) grce aux techniques immunologiques en microsco-
pie fluorescence nous ont conduit caractriser srologiquement par
immunofluorescence la souche isole afin de mieux discuter sa physiologie
et son comportement face aux facteurs de l'environnement.
II) TECHNIQUES DE DENOMBREMENT
A) PAR L'IMMUNOFLUORESCENCE
L'approche analytique de la dynamique des populations nitrifiantes
a longtemps t bloque par l'absence de mthode rellement efficace et
rapide de numration. La technique des anticorps fluorescents introciuite
?ar BOHLOOL et al. (1974) a fait voluer cette
1) Principe
La technique est base sur le fait que les anticorps fabriqus chez
un animal (Lapin)) rendus fluorescents ragissent spcifiquement avec les
antignes (bactries) qui ont induit leur fabrication en formant un complexe
stable et visible au Ainsi donc cette mthode combine la fois
la sensibilit et la spcificit immunologique l'observation microscopique.
La figure 3 rsume les principales tapes de son application pour les
bactries nitrifiantes.
Nous nous sommes servi des ouvrages de synthse sur l'immunofluores-
cence de (1968), NAIRN (1976), FAURE (1977) pour faire le rappel
d'ordre thorique ci-aprs.
a) Proprits lies au fluorochrome
Dans la fluorescence l'mission de lumire se produit pendant un
tervalle de temps trs court et cesse en mme temps que l'excitation. Pour
qu'un fluorochrome soit utilisable pour le des protines, il doit
prsenter des groupements capables de ragir et un complexe
stable avec la protine. Il doit possder un pouvoir fluorescent lev.
(Xl
Anticorps onti-
bactries
(fluorescents)
Observation et comptage
au microscope
pifllloresccnce
[TI
Anticorps
.'Inti-bactries
----Il>
Anticorps anti-
globuline de lapin
(fluorescents)
1
\
u
)
LC ')
Bactries en
culture pure
10
9
bactries/ml
Cultures
des bactries

\I
r
/
-,'
Isolement _1 Echantlllon de sol
de, b'ctrie, 1'\i#. [ en suspension
........... dons 1120
___ '\:>
c --.. -'
Antignes concentration
<!"'f")

t--

t

Prlvement cIe
Lapin 20 Illl de sang l'urificotion du srum
,,.----------.1 ./ aprs 15 jours
r----
lIain-marie 100C
10 mn
'i"
Concentration sur
filtre millipore 0,454
[TI Raction directe
+ Raction indirecte
Fig. 3 APPLICATIONS DE LI H1NUNOFLU01SCENCE EN NICROIUOLOGIE DU SOL
- 19 -
Il ne doit ni s'altrer pendant la ni influencer les propri-
ts immunologiques du complexe. L'isothiocyanate de fluoresceine rryon
ces critres.
b) Proprits lies la raction srologique
Deux mthodes sont employes en ; elles sont
rsullies la fiGure 4.
- la mthode directe: les anticorps spcifiques de l'antigne, rendus
fluorescents, sont directement placs sur les bactries. Aprs l'incubation
l'excs d'anticorps est limin par lavage. Avantages: rapidit, risques
de ractions croises minimiss.
- la mthode indirecte : les anticorps spcifiques non marqus (Lapin)
sont appliqus l'antigne. L'excs est lav. On applique ensuite des
anticorps fluorescents antiglobulines de lapin. L'excs est limin par
lavage. Avantages : plus grande sensibilit ; inconvnients : dure plus
longue et augmentation risques de ractions croises.
2) Protocole suivi
a) Production des antignes
Afin d'induire une rponse immunitaire satisfaisante chez le Lapin,
la suspension bactrienne injecte doit tre dense (pas trop dense pour viter
les phnomnes de tolrance). Pour les bactries nitrifiantes, elle doit conte-
au moins 10
9
bactries/ml 1983 ; RENNIE, 1975). Ce sont les d-
terminants de la paroi de la bactrie entire qui agissent ici comme antigne.
Pour obtenir le nombre requis de bactries/ml il faut concentrer une grande
quantit de culture.
La culture des bactries a t ralise dans des fioles de Roux et
incube 28C. Elles contiennent 600 ml de milieu minral 1,5 g/l de
et ont l'avantage d'avoir une grande surface d'aration. Aprs
l'inoculation avec 50 ml de la solution antignique mre, les fioles sont
agites deux fois par Jour pendant l'incubation. La puret des cultures
est vrifie rgulirement sur du bouillon trypticase et sur gelose nutri-
tive. Au bout de 12 15 jours les cultures pures sont concentres l'aide
d'un appareil millipore sur membrane Sartorius SMN 0,45 p. Pour viter tout
dveloppement bactrien pendant la filtration longue et fastidieuse, du
merthiolate la concentration de 0,001 % est ajout la suspension bac-
trienne. Les bactries laves sont reprises dans un minimum d'eau physio-
logique. Elles sont transfres dans des tubes et places pendant une heure
la vapeur d'eau 100 pour inactivation des antignes flagellaires.
Ces derniers sont en gnral responsables de nombreuses ractions croises.
Avant emploi les antignes sont conservs -20C.
+
Ag
\

/
'\
1
1
+
/
Q=
"-
t
/

-
Ac _
Ag 1
)'

-
Ac .......
'\
=
/ "-
f
'\
+
t


l \

3:
Ac
2
II'
h.l
o
1
Fig. 4 MODALITE DE LA REACTION D'HIHUNOFLUORESCENCE (d'aprs GOLDMAN in FAURE et al. (1977)
A) Immunofluorescence directe
Ag) Antigne Ac) Anticorps
B) Immunofluorescence indirecte
Ag) Antigne Ac}) Premier anticorps non fluorescent
Ac
Z
) anticorps fluorescent
- 21 -
b) Prparation des antisrums
Les antisrums sont obtenus sur des lapins mles de 3-4 mois de race
No-Zlandaise. Deux animaux sont utiliss par souche bactrienne. La
rponse immunitaire est induite par une srie d'injections selon le pro-
tocole tabli par (1973) repris et corrig par FLIERMANS et aZ.
(1974), RENNIE (1975). Le tableau 1 rcapitule les diffrentes oprations.
Tab leau 1 : PROTOCOLE D' INJECT,ION DES SUSPENSIONS fu"ijTIGENIQUES
Jours Oprations
Quantit
d'antigne
injecte
Mode
d'injection
lf
1 Injection
3 Inj ection
4-6 Repos
2
7
8
9
Injection
Injection
Inj ection
Inj ection
0,5 ml
ml
1,5 ml
1,5 ml
2 ml
2 ml
LV
LV
LV
LV
LV
LV + 2 ml S. C
10-15 Repos
16 Prlvement du sang - Dtermination du titre
17 Jene
23 Inj ection
24-29 Repos
18
21
22
30
31
32
Ponction cardiaque
Inj ection
Inj ection
. \
Dtermination du
Jene
Ponction cardiaque
2
2
2
ml
ml
ml
LV
LV
LV
+ 2 ml S.C
Sous cutane
..
I.V :
!'f
S.C :
Intravineusedans la mar3inale de
l'oreille
c) Dtermination du titre par raction d'immunofluorescence
indirecte
Seize Jours aprs la premire injection un prlvement de sang est
effectu l'oreille de l'animal et le taux d'anticorps est dtermin par
raction d'immunofluorescence indirecte. Le titre donne une indication
sur la richesse en anticorps spcifiques contenus ans le srum.
Nous avons effectu une srie de dilutions (1/10 1/2560) du srum
de lapin. Des dpts de suspension bactrienne de 105 cellules/ml sont
_ 22 _
raliss sur les encoches de lames prvues cet usage et fixs la
chaleur. Quelques 80uttes des diffrentes dilutions du srum sont dposes
sur les encoches. Aprs incubation de 30 ron, d'antisrum est
limin par lavage l'eau physiologique tamponne. Une goutte de srum
de chvre anti-globuline de lapin dilue au 1/100
e
est ensuite applique
sur chaque dpt. Aprs l'incubation l'excs limin, les bords es laees
sont schs et ces ernires sont sontes ans la glycrine tamponne pH 7,6.
Les rsultats obtenus sont rassembls dans le tableau 2.
Tableau 2 DETERMINATION DU TITRE PAR REACTION D' IMl1UNOFLUORESCENCE INDIRECTE

1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560


Srum
Anti N.W ++ +++ +++ +++ +++ +++

-
Anti N B +++ +++ +++ +++ +++ +++ + - -
+++ Trs bonne fluorescence + Paroi visible faible
Bonne fluorescence
fluorescence
++
- Pas de fluorescence
1
Tous les ayant un titre en anticorps au gal 1/640
subissent 24 heures de jene avant la ponction cardiaque ayant pour but de
rduire la teneur du sang en lipides. Chaque prlvement permet de rcolter
20 ml de sang.
d) Purification du srum: prcipitation des globulines
Le sang rcolt est plac 1 heure 37C et douze heures au moins
4C afin d'obtenir une bonne coagulation. Aprs avoir t dcant, l'anti-
srum est centrifug 15 mn 5000 g. Les oprations suivantes sont alors
ralises pour prcipiter les globulines :
- 10 ml d'antisrum on ajoute 10 ml d'eau physiologique pH 7,2
20 ml de sulfate d'ammonium 3,9 M sont ajouts goutte goutte. Toute
l'opration est ralise froid;
- aprs une nuit 4C la solution est centrifuge 6000 g pendant
15 mn, le surnageant est rejet; le culot de protines est redissout dans
10 ml d'eau physiologique. Les oprations sont rptes deux fois, le culot
final est repris dans 5 ml d'eau physiologique
- afin d'liminer le sulfate d'ammonium, la solution de protine est
dialyse contre de l'eau physiologique 4C. La solution de dialyse est
frquemment renouvele jusqu' ce qu'elle soit exempte de NH
4
+ au ractif
de Nessler ;
- 23-
- les globulines sont alors congeles ou conjugues avec le fluorochrome.
e) Dosage des protines
Dans le but d'obtenir un conjugu correct la de la teneur
en protine de la solution de globuline est ncessaire. Elle dtermine la
quantit optimale de fluorochrome utiliser. La teneur en protines des
solutions de globulines a t dtermine par la mthode L.JRY et al. (1951).
f) Conjugaison des protines et du fluorochrome
Il faut une quantit d'I.T.C.F. de 1/50 du poids de globulines pour
obtenir un bon conjugu. L'opration conduite dans un tampon carbonate-
bicarbonate de sodium pH 9,3 s'effectue l'abri de la lumire tempra-
ture ambiante.
g) Purification du conjugu
L'excs de fluorochrome et le conjugu sont spars en chromatographie
d'exclusion sur gel de G50. L'eau physiologique sert d'luant
(DETEfu'1AN, 1967) .
h) Concentration du conjugu
Le conjugu a t concentr par dialyse 4C contre du carbowax
10% dans l'eau physiologique.
i) Contrles des conjugus
L'utilisation de l'immunofluorescence exige la la fois
du titre et de la spcificit des conjugus utiliss. Nous avons cherch
dterminer ces paramtres sur les conjugus avec lesquels nous travaillons.
j) Titration des anticorps
Deux modalits ont t retenues dans ce but : immunofluorescence
directe sur lames et sur membranes. Les rsultats apparaissent dans le
tableau 3.
NB : la prsence effective des germes dans les milieux utiliss pour le
dpt a t vrifie par la mthode de
Le tableau 3 montre qu'il y a une perte de fluorescence en passant
des lames aux filtres. Dans le cas du srum anti N.W la dernire dilution
donnant une fluorescence compatible avec les besoins de la dtection des
bactries est 1/40 tandis qu'elle n'est que de 1/20 pour le srum anti NLB.
Cependant tout au long de notre travail nous avons retenu la dilution 1/20
pour les deux srums.
- 24-
Tableau 3
TITRATION DES llirl'ICORPS PAR IHHUNOFLUORESCENCE DIRECTE
SUR LM-fES ET SUR

1/10 1/80 1/320 1/640


1
1/20 1/40 1/160
1/1
28
Oi
Srum
sur Anti N. \.[
++++ +++ +++ ++ ++ ++ -
-
lames Anti NLB
++++ +++ ++ ++ +
1
+ - -
1
1
1
sur Anti N.W ++++ +++
1
++ + - - - -
membranes\
Anti NLB ++++
1
+++ + +
1
- - - -
! 1 ! 1
k) Test de contrle de la spcificit des
Tous les tests de spcificit ont t effectus sur lames. Les antisrums
N.W et NLB sont tests sur des organismes isols ou maintenus en culture pure
au laboratoire. Les rsultats obtenus figurent dans le tableau 4.
Tab leau 4 SEROLOGIQUE DES SOUCHES
Souche teste Srum anti N.V Srum anti NLB
+
NW \ ++++ 1
.,-1 r: 1 1
g,o NLB + ++++
p. ,
;:; e t-r-o-s-o-m-o-n-a-s----rl------------i:-----------
I
I(\) 0 --
<il <il Europea
'"d
CIl E. coli
Klebsiella sp.
Actinomycte sp
++++
++++ N. \.J.
(lJ

0-
.-1 ::
g,o .3
1
NLB 1
.u
o p.
H H Nitrosomonas 1 1
0 -
<Il <Il Europea
'"d
CIl 1 E. coli
.-1 <Il
<:J /(lJ
1 1
Klebsiella sp. -
.-1 '"
<:J r------------t-------------------------i
I(lJ 1 [
Actinomycte sp l - -
-'---------------'-----_-------!..-__---.:
- 25 -
Nous obtenons une lgre fluorescence entre le srum anti N.W et la
souche isole ; sa spcificit est plus grande par rapport aux autres ger-
mes tests. La spcificit du srum anti NLB semble plus troite par rap-
port N.W. Une lgre fluorescence a t observe avec E. coli. Ce srum
a donc t pass sur un mlange de bactrie contenant E. coli, N.W,
Klebsiella (0,1 ml de chaque germe pour 7 ml d'eau physiologique) afin de
faire adsorber les anticorps non spcifiques. Les anticorps spcifiques
sont recueillis aprs 30 mn de contact par filtration (Protocole de
SCHMIDT (1974) adapt).
Les tests de spcificit montrent que la souche isole n'appartient
pas au srotype Nitrobacter Winogradskyi utilis comme souche de rfrence.
D'autres tests doivent tre envisags pour voir si elle ne s'identifie pas
avec le srotype Agilis ou un autre dfini par STANLEY et SCHMIDT (1981).
Nanmoins ce point de notre travail nous pouvons dire c ~ r n m e RENNIE et
al. (1977), STANLEY et SCHHIDT (1981), JOSSERAJ.\lD et al. (1982) qu'il existe
bien dans le genre Nitrobacter plus d'un srotype contrairement ce qui
a t retenu par GIBBONS et al. en 1974 dans le manuel de dtermination
bactriologique de BERGEY.
Conclusion: les ractions en immunofluorescence sont spcifiques. Nous
avons en effet pu diffrencier les souches de-Nitrobacter entre elles,
les ractions croises tant faibles avec d'autres microorganismes de la
mme famille ou de familles diffrentes.
3) Application de la mthode d'immunofluorescence au comptage
de Ni trobacter
a) Technique de marquage en immunofluorescence sur membrane
de fi ltration
Les membranes utilises (type millipore 0,45? gris) sont noircies
au nOLr Soudan. Les filtres sont laisss 24 h dans la solution (10 mg
de nOLr Soudan + 7,5 ml d'actone + 7,5 ml H
2
0 distille). Ils sont en-
suite rincs et conservs 4C.
Sur ces filtres, placs sur des appareils "Hillipore", on filtre une
quantit adquate de culture bactrienne ou de suspension de sol (2 20 ml).
Les filtres sont repris et placs sur des lames porte-objet o ils
sont recouverts de deux gouttes de Glatine-Rhodaoine (prpare selon
les indications de BOHLOOL et SCHMIDT, 1968).
Le srum fluorescent correspondant l'antigne est ensuite appliqu.
26
Aprs une incubation de 30 mn les filtres sont lavs par filtration avec
de l'eau physiologique pH 7,2 et monts entre lame et lamelle dans la gly-
crine tamponne pH 7,6.
La formule de calcul ci-aprs donne le nombre de bactries/ml comptes
au :
avec
Nombre de bactries par ml
X.S.D
s.V
X nombre de bactries par champ microscopique
S surface effective de filtration
s = surface du champ microscopique
D facteur de dilution
V volume de suspension utilis
b) Efficacit de la mthode d'immunofluorescence dans la
quantification de Nitrobacter : tude du taux de rcup-
ration des bactries inocules dans un sol ou dans du
charbon actif.
Le sol sch l'air est tamis avant emploi. la g de sol ou de char-
bon sont introduits dans des erlens de 100 ml et striliss l'autoclave
pendant 1 h 30 mu puis inoculs avec 2 ml de suspension bactrienne et
4 ml d'eau physiologique strile. Aprs 20 h d'incubation 4C les chan-
tillons sont traits de manire rcuprer le maximum de bactries.
Des comptages sont ensuite raliss par irnmunofluorescence sur filtre.
Les rsultats ports dans le tableau 5 montrent que le taux de rcu-
pration est meilleur pour la souche isole dans le cas du sol et qu'il
l'est moins pour le charbon. Pour la souche N.W la rcupration est bonne
pour le charbon. En comparant les deux souches nous remarquons qu'un bon
taux est obtenu pour NLB par rapport au taux de N.W.
La quantit de bactries rcupres se situe dans la zone de valeurs
cite dans la littrature. Ces valeurs sont gnralement comprises entre
20 et 100 % de rcupration (BOHLOOL et al., 1973 ; VIDOR et MILLER, 1980
1983).
Tableau 5
_ 27-
ETUDE DU TAUX DE RECUPERATION DES BACTERIES Dk1S
UN SOL OU DANS DU CHARBON ACTIF
(10
9
bactries/ml) en
Nombre de Subs trat Nombre de Nombre de
% de 1
filtres + bactries bactries
rcupration
utilis souche apportes rcupres
Sol de lande
105 105
4 + 5,63 1, 17 20,78
N. 'i.J
1
Sol de lande
105 105
4 + 4,62 1, 19 25,75
NLB
Charbon
105 105
4 + 5,63 1,43 25,39
N.W
Charbon
105 105
4 + 5,25 1,2
1
22,85
NLB
4) Discussion
La technique d'immunofluorescence rpond bien aux exigences imposes
par une tude autocologique. En effet en raison de la spcificit de mar-
quage et de sa sensibilit, elle permet la fois:
- la dtection et l'identification des microorganismes particuliers
au sein d'une population htrogne;
- la localisation de ces germes dans des environnements divers sol,
eau, racines de plantes ;
- l'valuation d'une manire satisfaisante du de la population
de l'organisme tudi;
- un de temps lorsque l'on possde les antisrums ncessaires.
En effet 1 h suffit pour avoir des rsultats contrairement aux mthodes
classiques o le dlai entre l'chantillonnage et l'obtention des rsultats
est d'au moins 15 jours.
Les inconvnients pour la en oeuvre de cette technique sont es-
sentiellement :
- la ncessit de possder en grande quantit
culture pure le germe tudier
- la longueur de la priode de prparation des antisrums correspondants
- 23-
aux microorganismes en tude.
La technique d'irnmunofluorescence est globale (elle prend en compte
mme les microorganismes morts).Elle est donc inadapte pour les manipu-
lations dans lesquelles le nombre de germes viables doit tre pris en
considration. Elle est avantageusement remplace par la mthode dvelop-
pe par ZIMMER}Uili et al. (1978). Cette dernire permet une distinction
entre les microorganismes viables (coloration rouge) et les germes non
viables (coloration verte).
B) AUTRES NETHODES DE DENOHBREt-IENT
Nous avons successivement employ au cours de cette tude la mthode
de dnombrement par microscopie pifluorescence et al., 1978)
et la mesure de la densit optique par spectrophotomtrie.
L'pifluorescence
En pifluorescence, le microscope est pourvu d'une source lumineuse
dont l'mission en tongueur d'onde courte (ultra violet principalement}
est importante et d'une srie de filtres d'arrt ne transmettant que le
rayonnement de la longueur d'onde mise par le fluorochrome employ.
C'est ici l'objectif qui joue le rle de condensateur (fig. 5).
FA
FE
IF
-- -
[F : Lumire incidente
pour la fluorescen-
ce.
FE: Filtre d'excitation.
FS : Miroir dichroique
partageant [es flux.
o : Objectif.
p : Prparation.
C : Condenseur.
M : l'vliroir.
1T : Lumire incidclllC
pOur ['observation
par transparence.
FA: Filtre d'arrt.
FS
p
c
<11--1 T
Fig. 5 : D'UN DISPOSITIF UTILISANT UN ILLUNINATEUR VERTICAL POUR
L'OBSERVATION PAR FLUORESCENCE EN LUMIERE INCIDENTE (d'aprs PLOEM, in
FAURE et al., 1977)
_ 29_
Ce mode d'observation est idal pour des travaux excuts sur des
membranes de filtration ou des prparations microscopiques paisses.
1 ) Numration directe : mthode de ZIMHERHAN et al. (1978)
Cette mthode couple l'action de l'INT celle de l'Acridine orange
ce qui permet la mise en vidence des systmes transporteurs d'lectrons
par l'observation au microscope pifluorescence. Sous l'action des
dshydrogenases l'INT est rduit en INT fcrmazan qui apparat sous forme
de petits points rouges l'intrieur des organismes physiologiquement
actifs tandis que les germes non viables apparaissent colors en vert.
Dans un erlen strile de 50 ml nous plaons 10 ml de l'chantillon
p u ~ s 1 ml d'une solution aqueuse 0,2 % d'INT.
Aprs homognisation, une incubation est effectue pendant 20 mn
dans le noir. La raction est arrte par addition de 0,1 ml d'une solu-
tion 37 % de formaldehyde. Une partie aliquote de 0,5 3 ml de l'chan-
tillon trait est filtre sur filtre nucleopore 0,1 u, pralablement n o ~ r c ~
au noir soudan. Aprs la filtration nous dposons sur le filtre 1 ml d'une
solution d'acridine orange. L'limination du surplus de fluorochrome s'ef-
fectue aprs 2 mn de contact.
- Prparation des filtres
Dissoudre 10 mg de n o ~ r soudan dans 7,5 ml d'ethanol pur p u ~ s ajouter
7,5 ml d'eau distille. Immerger le stock de filtres nucleopores dans la
solution obtenue (24 h). Avant l'emploi rincer abondamment l'eau distille.
- Prparation de l'acridine orange
Dissoudre 1 mg d'acridine orange dans 10 ml de tampon phosphate pH 6,7
(6,6 uM de phosphate).
2) Mesure de la densit optique
La densit optique (D.O.) a t mesure 580 nm l'aide d'un spec-
trophotomtre Jouan. Cet appareil rend compte des variations de la D.O. au
cours de la croissance de Nitrobacter.
- 30 -
3) Numration indirecte: dosage de l'ATP cellulaire
L'ATP a t mesur selon la mthode de bioluminescence dcrite par LEE
et al. (1971) et repnse par KARL et HOLM-Hfu\lSEN (1978), KARL (1980).
Ce dosage est bas sur la mesure de la lumire mise lors de l'in-
teraction de l'ATP avec la Luciferine-Luciferase et l'oxygne de l'air.
Selon la raction :
++
Mg
ATP + Luciferine-Luciferase Luciferase-Luciferine 'V AJ.'1P + P'V P
Luciferase-Luciferine At + O
2
pH 7 ) Luciferase + Luciferine oxyde + CO
2
+
AtlP + h Il
Les chantillons de sol sont prlevs dans deux horizons.
En surface dans le A
1
-
1
entre 0 et 5 cm ; dans le A
1
-
2
entre 5 et 15 Cffi.
Le sol de l'horizon est prlev dans une cuvette; les grosses racines et
les cailloux sont limins, puis il est homognis la main sans tamisage.
Une partie de ce sol est emporte pour tre analyse (cf hapitre III ..
tableaux 6, 7,11,12 13), l'autre partie est mise en incubation in situ.
Les mthodes d'incubation in situ utilises ont dj t employes par
de nombreux auteurs 1967 ; LABROUE et LACOMBES, 1971 ; CAJ.'1PBELL et
az.., 1974 ; ROZE et al., 1980-1982 ; HERBAUT, 1983).
Les incubations sont faites dans des botes de plastique de 500 ml
retournes. La partie infrieure est ferme par un tulle de nylon et les
parois latrales perfores. Nous vitons ainsi les phnomnes de lessivage
par les eaux de pluie et d'absorption par les racines des vgtaux sans
crer un confinement. Quatre botes sont prpares par horizon et replaces
- 31 -
au correspondant au prlvement. Elles sont enleves
aprs la mise en place et remplaces par d'autres.
2) Dosage des nitrites et des nitrates
Le dosage des nitrites est effectu par la mthode de GRIESS-ILOSVAY
(MORRIS et RILEY, 1963).
Le dosage des nitrates est aussi ralis par la mme technique aprs
passage de l'chantillon doser sur une colonne de cadmium.
III) TECHNIQUES DE CULTURE
A) MILIEUX DE CULTURE
- Milieu de culture autotrophe
Il est compos par la solution minrale utilise' par SOfr1IDT et al.
(1973) :
NaN
2
Na
2
HP
04
KH
2
P0
4
Solution de Fer-E.D.T.A.
Solution A
Solution B
HZO distille q.s.p.
Solution de Fer-E.D.T.A.
. Solution A
. Solution B
g
5 g
0,5 g
5 ml
ml
10 ml
1000 ml
77 mg de FeS0
4
, 7 H
2
0 + 103 mg E.b.T.A.
pour 50 ml d'eau distille
2 mg de ZnS0
4
, 7 H
2
0 + Z mg de CuS0
4
, 5 H
2
0 + 2 mg Na
Z
Mo0
4
,
2 H
2
0 pour 100 ml d'eau distille
0,2 g de MgS0
4
, 7 H
2
0 dans 100 ml d'eau distille.
Milieu mixte
Il est ralis en apportant au milieu autotrophe soit 1 g/l de pyruvate
de sodium, soit 1 g de pyruvate, du peptone et de l'extrait de levure rai-
- 32 -
son de 1,5 g/l chacun, soit en apportant seulement du peptone et l'extrait
de levure.
- Hilieu chimioorganotrophe
Il est compos par le milieu autotrophe sans nitrite additionn de
g/l de pyruvate de sodium, de peptone et d'extrait de levure 1,5 g/l
chacun.
B) SYSTErS DE CULTURE
1) Systme clos ou "Batch"
Les cultures sont effectues dans des erlens de 500 ml contenant 100 ml
de milieu minral ( 150 ug N-N02/ml) ou organique de trois erlens
par souche. L'incubation est effectue 28C l'obscurit. Des parties
aliquotes de 2 ml prleves aseptiquement permettent de suivre la crois-
sance bactrienne et la disparition des nitrites.
2) Systme ouvert : le Chmostat
a) Expression de la croissance
La variation de l'effectif (N) d'une population de microorganismes
est proportionnelle cet effectif d'o l'quation diffrentielle:
dN
dt
)l N o est le coefficient d'accroissement
La population crot donc d'une manire exponentielle:
N(t) = o N(t) est le nombre d'organismes au temps t
No est le nombre d'organismes au temps t = 0
Cette relation suppose que dans les conditions optimales toute cellule
donne naissance des cellules filles viables sans modifier la croissance
et les possibilits de survie de la population.
Cette hypothse a t utilise par MONOD (1950) pour dcrire la
sance bactrienne. Elle est actuellement universellement admise pour
vre l'volution des microorganismes. Cependant la plupart des chercheurs
prfrent utiliser la variante :
- 33-
N = N02
rt
qui dcoule du phnomne de division par bipartition.
r est ici gal au taux de croissance c'est--dire au nombre de divisions
. - d L N
par e temps: og N
i 0
N
N
r
La relation lie r et p
Log N - Log No
t Log
2
(taux nprien
.ut
Noe
N
?rt
0_
de croissance) est
N
Log No pt
N
Log No = rt Log
2
b) Le chmostat
Critres de choix du chmostat
Pendant l'enrichissement des sols (voir techniques d'enrichissement
et d'isolement de Nitrobacter) nous avons vu que le systme d'tude en
colonnes n'offre ni la possibilit d'un dnombrement immdiat des germes
ni la vrification de leur qualit ni encore celle de contrler l'homo-
gnit du milieu. Selon Mc LAREN (1971), SAUNDERS et BAZIN (1979), le
dveloppement des microorganismes en colonne est en relation avec leur vo-
lution en profondeur dans la colonne, le dbit et le mode de percolation
d'o une grande htrognit.
A cause de la possibilit qu'offre le chmostat de contrler le taux
de croissance (habituellement variable du temps), d'obtenir des cellules
dans un tat physiologique stable nous l'avons adapt pour tudier et mettre
en vidence l'influence relle de la concentration en nitrite du milieu et
des diffrentes litires sur le comportement physiologique de Nitrobacter.
!Ct Principe
Considrons une cuve contenant un volume fix de culture V, vigou-
reusement agite pour assurer l'homognit de la suspension cellulaire. Un
apport continu de milieu neuf contenant un seul substrat limitant S est
ralis vitesse fixe paralllement une vacuation au mme taux par un sys-
tme Qe trop plein 2). -Le milieu frais est mlang et une
partie est consomme pour produire une nouvelle biomasse qui a une concen-
tration X.
- 34 -
Pompe air
Cuve de
culture
Pompe
pristaltique
- --..,
---...._ l,
--_ ........
-
--'.
- ----
-.
-----
--
./
-
-
t
---
---
Systme d'agitation magntique
L, __I"
Rservoir de
rcupracion
de l'effluent
Rservoir de ;
milieu de
culture
- 35 -
Un tat d'quilibre s'instaure en fonction des conditions de l'envi-
ronnement. Dans un tel systme les microorganismes peuvent se multiplier
indfiniment aucun changement n'intervient dans les conditions
mentales.
Le maintien d'un tel quilibre
- une bonne agitation pour liminer les gradients de concentrations,
b 1
" . 1 dX ( ,
- un su strat te que dt = f S)
- un flux infrieur au taux de croissance des cellules)
- l'existence dans le milieu d'une majorit de germes physiologiquement
actifs.
Les quations d'quilibre des cultures en chmostat sont bases sur
la conservation des masses. Des relations peuvent tre tablies entre le
taux de croissance p, la biomasse X, la concentration en substrat S et
le taux de dilution D. Les premires thories sur le chmostat ont t
mises par MONOD (1950), NOVIGK et (1950 a et b). Ces dernires
ont t corriges et compltes par HERBERT et al. (1956), TEMPEST et
HERBERT (1965), (1970), PIRT (1975) .
. Biomasse, croissance et taux de dilution
Le taux de croissance spcifique des microorganismes dpend de la
concentration en substrat limitant, de la vitesse d'apport du milieu nu-
tritif et du facteur de dilution D tabli lors de sa dispersion dans la
cuve deculture.Elle est donc fonction du rapport
F Vitesse d'apport du milieu nutritif
qui est gal la vitesse d'vacuation
D
F
V
(h-1)
avec V Volume de la culture
. Influence sur la biomasse
Dans la cuve de culture simultanment les microorganismes se dvelop-
pent et sont entrans par le flux du milieu. L'quation ci-aprs reprsente
le transfert de la biomasse
Augmentation de biomasse = Croissance - Evacuation
Pendant un intervalle de temps trs court (dt) cette quation devient
pour l'ensemble de la culture V :
V dx = V.Y.X.dt - F.X. dt
F
En divisant tous les termes de l'quation par V et en remplaant V par sa
valeur D nous obtenons
dx
Y
x - DX
dt
- 36-
dx
dt (P - D) X
si
dx
P<D, dt <0 et X dcrot avec le temps
dx
? P>D, dt >0 X crot avec le temps. Cependant dans les conditions
fixes du chmostat, la population tend s'auto-
stabiliser en fonction du facteur limitant. A
l'quilibre la densit cellulaire dans la cuve de
culture est constante et p apparent s'ajuste au
taux de dilution. On peut alors crire
l
, - . l' b dx 0 \; D
re dt ? =
dx
D, dt
0, X reste constant au cours du temps
Substrat limitant, taux de croissance, taux de dilution
L'quation de conservation des masses pour le substrat limitant peut
s'crire:
Vitesse de changement Vitesse d'arrive - Vitesse de - Vitesse de con-
de S du mi lieu frais
-,.
sortie de S sommation par X
Pour un iutervalle de temps bref (dt) et pour l'ensemble de la culture
nous pouvons crire :
V ds F. SR.dt - F.S - V.p.X dt/y
avec SR concentration en substrat limitant dans le milieu d'alimentation
S = concentration rsiduelle en substrat limitant l'quilibre
y rendement de
F
En divisant par V tous les termes de l'quation et remplaant V par
sa valeur D :
ds
dt D (SR - S) - PX/y
si
'4<).1>
D,
0, S dcrot
dt
1ft )J <
D,
ds >
0, S crot
dt
lj! )J = D,
ds
0, S
dt
est constant
Lorsque p est gal D et ne pas avec le temps, la culture at-
teint un tat d'quilibre simultanment pour la concentration en
organismes et pour la concentration en substrat limitant, d'o:
- 37 -
ds dx
0 D (S -
S) PX/y
dt dt
==9
R
X = Y
(S - S)
R
Ainsi la biomasse est fonction du rendement de croissance et du substrat
limi tant utilis.
D'autre part D
S
P = y max: KS + S
Ln2
-r
Les difficults rencontres dans la m ~ s e en oeuvre de cette technique
rsident essentiellement dans la matrise :
- du taux de dilution de sorte que la culture ne soit pas lave,
- de l'agitation pour assurer la meilleure homognisation de la
culture.
Les avantages de la mthode sont multiples :
- la possibilit de travailler des taux de croissance,
- le maintien de conditions stables pendant la priode d'exprimentation,
- la prsence dans le milieu l'tat d'une majorit de germes viables,
- la possibilit de l'tude des rponses des microorganismes' aux
contraintes de l'environnement par la facilit d'introduction de
variations du substrat, du pH, de la temprature, la tension
d'oxygne,
- la possibilit de raliser des tudes de toxicit avec des mtaux
lourds, des extraits de litires ...
C) MISE AU POINT D'UN DISPOSITIF EXPERIMENTAL
1) Modifications apportes au chmostat
Pendant la prparation des antignes (mthode d'immunofluorescence)
nous nous sommes aperu que le nombre de bactries obtenu par millilitre
de milieu tait faible. Nous avons cherch pallier cet inconvnient
en augmentant la surface de contact offerte aux bactries pour leur
multiplication.
Pour ce faire, nous avons m ~ s dans le chmostat un support solide.
Nous avons cherch nous replacer de cette manire dans les conditions
aussi naturelles que possible pour voir si le support avait un rle dans
les phnomnes de toxicit des litires.
Mais compte tenu de la thorie du chmostat et de son fonctionnement,
- 38-
pour empcher le lavage du support, il a fallu apporter une modification
en plaant dans la cuve de culture un verre fritt. Le but de cette op-
ration est d'obtenir deux chambres communicantes dont l'une puisse contenir
un support solide. Le verre fritt a t choisi de sorte que seules les
bactries puissent le traverser (fig. 6).
2) Exprience prliminaire
tats d'quilibre
vrification de l'tablissement des
Nous avons voulu vrifier si les quations du chmostat son compatibles
avec la modification introduite. Pour ce faire, la cintique d'apparition
du nitrate a t suivie pour diffrentes concentrations de nitrite dans la
rserve et ce, jusqu' l'chtention de l'quilibre. L'exprimentation a t
mene pour un mme p.
F h-1
En considrant D = V=Y = 0,010 , nous constatons que pour un mme
y, le taux de nitrification est fonction de la concentration en N-N0
2
apport dans le milieu.
L'quilibre se dplace en faisant passer la concentration de 18 65)1g
N-N0
2
!ml (fig. 7).
L'obtention de ces quilibres montre que l'introduction du verre fritt
n'entrane aucune modification dans le fonctionnement du chmostat.
Le maintien d'une proportion constante de cellules viables tant une

condition essentielle l'tablissement des quations du chmostat, ce point


a t contrl dans les deux parties de la cuve par la mthode de
(1978). Nous avons pu observer une majorit de germes viables dans les deux
cas.
La strilit de la culture obtenue avec ce chmostat se maintient assez
longtemps (16 25 jours) pour permettre des tudes plus pousses de
Nitrobacter.
Ce chmostat conu dans le laboratoire ayant donn des rsultats satis-
faisants, nous l'avons urilisi la suite du travail.
Le volume de la cuve de culture est de 1,6 1. L'4gitation e3t ra-
lise grce un systme d'agitation magntique. L'aration est obtenue
partir d'une pompe (RENA 301) relie un systme de filtre strile.
L'alimentation en milieu frais est effectue l'aide d'une pompe pris-
taltique dbit variable.
Le chmostat est plac l'obscurit dans une enceinte dont la temp-
rature est maintenue 28C.
Le nitrite par sa concentration dans le milieu de rserve constitue le
substrat limitant.
'"
_ 39_
servant introduire
1 l'inoculum
Sortie d'air
combine la
sortie de la
culture par
trop plein
Verre fritt _.
Tube servant introduire
le milieu neuf
Entre d'air
Systme de prlvement
des chantillons
maentique
o
Agitateur magntique
Fig. 6
SCHEHA DU DISPOSITIF UTILISE POUR LES ETUDES EN CHHI0STAT
H-N0
3
ug/ml
0 28C
70
(2)
60
50
40
!

o
1
120 14'4 168 192 2'16 240 264 288 J 1'2 336 360 38'4 LI 08 432 45'6 LI 80 564 528 55'2 576
l (1) :
72 96 LI 8 2
n
. al
C
.. 'tl
-
3 t
1 \
;, 0
-
"
" ..'-..-;
'"

30
20
Fig. 7
h-I
CHANGE!'iENT DU TAUX DE NITRIFICATION DANS UN CHEHOSTAT CONTENANT NITROBACTER HAINTENU A UN TAUX DE DILUTION DE 0,01
1) l.a culture est d'abord alimente avec lme solution de 20 ug N-N0
2
/ml jusqu' d'quilibre.
Au moment iqdiqu par la fche (1) la concentration de rserve est porte 65 ug,N-N0
2
/ml
2) La deuxime flche (2) indique le moment oa la concentration de rserve est ramene 18 ug N-N0
2
/ml
CHA PIT REl l
CARACTERISATION PHYSIOLOGIQUE DES SOUCHES DE NITROBACTER
1) ETUDE DE LA CROISSANCE
Elle a t effectue en milieu clos et en milieu ouvert.
A) CROISSANCE EN MILIEU FEFJ.1E
Nous avons suivi la densit optique du milieu de culture en fonction
du temps. Elle traduit l'augmentation de la biomasse bactrienne. Elle nous
a permis de calculer la valeur du taux de croissance usuel de chaque sou-
che, selon la formule :
r
Log,N - Log No
t Log 2
Nous avons pour ce faire utilis les paramtres de la figure 8 et
l'quation ci-dessus.
Nous avons considr :
No gal la D.O. minimale prise pendant la phase exponentielle de
croissance correspondant au temps t
1
N gal la D.O. maximale prise pendant la phase exponentielle de
croissance correspondant au temps t
2
t gal t
2
- t
l
en heure
Les valeurs de r sont calcules ci-essous
Pour la souche N.W
No 0,015
N 0,032
t 72
soit i
Log 0,032 - Log 0,015
72 Log
2
Pour la souche H.LB
No 0,013
N 0,030
t 120
soit r
Log 0,030- Log 0,013
120 Log
2
r 0,0151
r 0,0101
- 43-
X10
-
3
a
D.
30
25
20
15
la
5
1

0-- -0 souche N. W
e - --@ souche NLB
/
a
@
2 3 5 6 7 8 9 la jours
Fig.
Cl
U CINETIQUE DE CROISSAJ."lCE DE NITROBACTER EN HILIEU LIQUIDE
Temprature d'incubation 20C
Milieu minral 200 pg N-N0
2
/ml contenu dans erlen de 500 ml
100 ml de milieu
Les points de la courbe reprsentent la moyenne des 3 valeurs
- 44-
B) CROrSSAi'iCE EN HILIEU OUVERT
Nous nous sommes s e r v ~ de la =elation
)J r Log
Z
et de la valeur de r calcul ci-dessus pour valuer le taux nprien de
croissance p. Ce dernier nous a permis de fixer le taux de dilution utilise
pour les tudes en chmostat. En effet
)J
D
F
V
avec F Flux
Nous obtenons a ~ n s ~
Pour la souche N.W
)J
r Log
Z
r = 0,0151
JJ
0,0151 Log
Z
)J
0,0105
V Volume de la culture
Dans les cultures en chrnostat le taux de dilution utiliser sera
donc
lfr Pour la souche NLB
)J
r Log
Z
r = 0,0101
)J= 0,0101 Log
Z
)J=
0,0059
D
a OlOsh-l
,
Nous utiliserons donc pour les cultures en chmostat un taux de
dilution :
D 0669
h
-
1
,
II) ETUDE DE LA TRANSFORMATION DU NITRITE
La cintique d'utilisation du nitrite par les souches de Nitrobacter
a t suivie en milieu clos et ferm. Elle nous a permis de calculer l'ac-
tivit spcifique des souches dans ces deux systmes de culture.
- 45 -
A) CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE EN HUlEU FERME
Elle est diffrente selon la souche. Elle est relativement rapide pour
la souche N.W. Tout le nitrite est transform en 156 heures.
La souche NLB oxyde plus lentement le nitrite. Ce dernier est totalement
utilis au bout de 216 heures.
Tous les rsultats sont ports sur la figure 9.
B) DISCUSSION
Nous avons obtenu un taux de diffrent pour les souches de
Nitrobacter. Dans les conditions exprimentales utilises, la vitesse de
croissance de la souche N.W est plus grande que celle de la souche isole.
Cette diffrence est confirme au niveau du mtabolisme du nitrite. En effet
les cintiques d'utilisation du substrat sont nettement diffrencies; la
souche N.W utilise tout le nitrite en six jours tandis qu'il en faut neuf
la souche NiB.
Par transformation semi-logarithmique de la fonction S
nous avons :
ft) ,
ds
dt
ds
s
ds
qs
qdt
qdt
s
Log S qt + Log Sa
S
Log Sa = qt
S
Sa
qt
e
q est assimilable au taux de pendant la phase exponentielle.
Nous remarquons que la consommation du nitrite par Nitrobacter est lie
la croissance. De l'quation ci-dessus nous pouvons calculer le taux de
croissance q (quivalent r) de la bactrie en milieu clos. La valeur
trouve par cette mthode est trs proche de celle obtenue par le calcul
partir de la DO. Il est donc possible par ce biais de calculer le taux de
crois&ance de deux manires.
C) CALCUL DE L'ACTIVITE SPECIFIQUE
Nous nous des rsultats de la figure 10 pour calculer
l'activit spcifique.
- 46-
N-N0
2
mg/l
200
100
50
20
souche isole
souche N.H
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Jours
Fig. 9 CINETIQUE D'UTILISATION DES NITRITES EN MILIEU LIQUIDE PAR NllROBACTER
Temprature d'incubation 28C
Milieu minral ZOO pg N-NOZ/ml contenu dans erlen de 500 ml
100 ml de milieu par erlen (3 erlens/souche)
Les points de la courbe sont des valeurs moyennes de 3 valeurs de
chaque prlvement
250
230
210
190
170
150
130
110
90
70
50
30
10
N-N0
2
en pg/mt
- 47-
A Nombre de
bactries/ml
5
6
10
5
5
2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il Jours
Fig. 10 CINETIQUE D'UTILISATION DU NITRITE ET EVOLUTION DU
NmmRE DE NITROBACTER IHNOGRi... DSKYI EN CULTURE PURE
EJ)--@ courbe d'oxydation du ni tri te
*-----* courbe d'volution du nombre de bactries
La culture est effectue dans une fiole de Roux avec
GOa ml de milieu liquide contenant 250 pg de N-NO?/ml
La teQprature d'incubation est de 28C
Les points de la courbe reprsentent la moyenne de 2 valeurs
- 48-
Cette dernire est gale la quantit de produit form par cellule
et par unit de temps. Le produit form doit tre obligatoirement li
la croissance microbienne.
Dans le cas prsent, il est gnralement admis que l'utilisation du
nitrite et la production du nitrate sont couples la croissance bact-
rienne Hc LAREN (1969, 1971, 1973).
En considrant qu'une molcule de N0
2
donne par transformation m ~ c r o
bienne une molcule de N0
3
-, il est possible de calculer l'activit de
Nitrobacter en utilisant l'une ou l'autre quantit de compos mesure dans
un intervalle de temps trs court (avec un nombre de cellules connu).
+ En milieu ferm
Nous avons utilis la formule
dP
dt
q N
P
dP
N dt
avec activit spcifique
changement de la concentration en
produit form en fonction du temps
N nombre de cellules pendant l'intervalle
de temps considr
dP 1.4
2
7 ug N
dt == 1 H
N == 4,768 10
6
-6
qp 0,2993 10 pg N/cellule/heure
Nous divisons le tout par 14 (Poids molculaire de l'azote) afin
d'obtenir le rsultat en pH/cellule/heure. Nous obtenons:
qp == 0,021 pM.N/cellule/heure
+ En milieu ouvert
La formule employe est la suivante
dP
dt
dP
dt
q N - DP
p
avec variation en fonction du temps de la
concentration du produit form
qp quantit de produit form par cellule
et par unit de temps
N nombre de cellules pendant l'intervalle
de temps. Dans ce cas c'est le nombre
de cellules lorsque le systme est
l'tat d'quilibre
DP quantit de produit form vacue du
systme
- 49-
en remplaant s par sa valeur y
A l'tat d'quilibre
dP

dt
q N - DP
P
soit
DP
qp
N
Nous obtenons :
D taux de dilution
P
u
N
qp
192,5 ).lg N/ml
0,0105
h
-
1
6 10-
6
bactries/ml
192,5 x 0,0105
6 10
6
-6
0,144375 10 ~ g N/cellule/heure
qp
qp
Nous divisons ce chiffre 14 (Poids molculaire de l'azote) pour ob-
tenir le rsultat pM.N/cellule/heure
qp = 0,024 pM.N/cellule/heure
Nous avons voulu, en nous servant des donnes de la littrature, cal-
culer l'activit spcifique thorique de Nitrobacter.
D'aprs le Bergey's Manuel (1974) le volume d'un Nitrobacter est sen-
siblement gal 1 p3, si nous considrons que sa densit est de l, le
-9
poids humide de cette bactrie sera de 1 10 mg. Ce dernier est compos
de 15 % de matire sche. La moiti de celle-ci est constitue de carbone.
Toutes ces considrations nous permettent d'avoir le poids en carbone d'une
cellule de Nitrobacter selon l'quation:
Poids en carbone
d'une cellule
Poids humide x Pourcentage de matire sche x Pourcentage
en carbone
P
ma
o
15 50
x 100 x 100
P 7,5 1o-II mg de carbone
Selon ALEEN (1970) la production de 12 mg de carbone demande l'oxyda-
tion de II 13 moles de N0
2
' 3 ATP et 2 NADH. La figure II donne le d-
tail du mtabolisme du nitrite chez Nitrobacter.
Poids en carbone d'une bactrie
12
7 5 10-
1
1
,
1,6 10
11
bactries
N
Nombre de bactries
N
Nous pouvons, connaissant le poids en carbone d'une bactrie, calculer
le nombre de Nitrobacter ncessaire l'obtention des 12 mg de carbone.
Poids total en carbone
! 1 NO
Z
- 7+
+ 17.5 Kcal
A. Production d'nergie au cours de l'oxydation de NO
Z
- en
par Nitrobacter. 1 mole d'oxygne est consomm pour produire
1 ATP (PlO = 1)
ATP
c)( Cyt B flavo)( 1NADH
Z
+ 34 Kcal
1co<", oh ;;: 1;NAD' , 2H'
ATP ATP
B. Formation Gu pouvoir rducteur chez Nitrobacter
Fig. Il DE PRODUCTION D'ENERGIE ET DE DU POUVOIR
REDUCTEUR AU COURS DE L'OXYDATION DE N0
2
en N0
3
PAR NITROBACTER
(d'aprs ALEE1'f, 1968)
de 12 moles de N0
2
par Nitrobacter exige au rn1n1mum 20 heures.
En nous basant sur tous les facteurs: nombre de bactries, quantit de subs-
trat oxyd et temps d'oxydation du compos, nous pouvons valuer l'activit
spcifique thorique de Nitrobacter. Pour ce faire nous utilisons l'quation
P
qp Nt
12 10
9
prIN
1,6 1011 x 20
0,0038 pM.N/cellule/heure
D) DISCUSSION
Les activits spcifiques en milieu ferm sont relativement
proches de celles enregistres en chmostat. Elles sont de l'ordre de
0,021 pM.N/cellule/heure pour les cultures en milieu ferm et de 0,024 pM.N/
cellule/heure en milieu renouvel. Dans ce dernier, la majorit des cellules
est viable et physiologiquement active. Ce fait peut expliquer l'amlioration
de la valeur de l'activit spcifique dans ce mode de culture. Les valeurs
trouves ne s'loignent pas trop de celles contenues dans la littrature
(YOSHIOKA et t'Xl., 1982; BELSER, 1979).
51 _
En comparant les valeurs des activits spcifiques cites ci-dessus
avec celle du calcul thorique que nous avons effectu, nous remarquons
qu'il existe une diffrence de 0,020 pM.N oxyd en surplus par cellule.
AinsilQ.SO % de l'azote oxyd servirait non pas la croissance mais
produire l'nergie ncessaire la biosynthse des composs et la main-
tenance de la bactrie. Ces faits sont une explication possible de la
difficult d'obtenir en culture des biomasses importantes. Ils explique-
raient aussi les faibles densits de populations nitrifiantes observes
dans les sols (10
3
10
4
bactries/gramwe de sol dans les sols agricoles
non fertiliss, PROSSER et aZ., 1982).
Dans le milieu ferm, l'oxydation du N-N0
2
est utilise la fois pour
produire une nouvelle biomasse carbone et pour produire l'nergie nces-
saire la maintenance de l'intgrit de la bactrie. Mais dans ce milieu
les cellules n'ont pas toutes le mme taux de croissance, par consquent
la mme activit mtabolique. L'activit spcifique trouve dans ces
conditions est donc une valeur moyenne. Il est donc difficile d'valuer
correctement l'nergie de maintenance dans ce milieu.
En milieu ouvert, toutes les cellules ont un mme taux de croissance.
Par consquent, chacune d'elles est capable d'une activit dcelable. C'est
donc avec cet appareil qu'il faudrait rechercher l'nergie de maintenance.
III) INFLUENCE DU pH ET DE LA SUR L'ACTIVITE
A) INTRODUCTION
Les interrelations des facteurs de l'environnement affectent d'une
manire trs sensible les processus microbiologiques d'oxydation du,nitrite
dans le sol. D'une manire gnrale, le pH et la temprature sont souvent
prlS en considration pour l'apprciation de l'activit nitrifiante.
Le pH, de l'avis de la plupart des auteurs, est l'un des facteurs
limitant la nitrification. Certains auteurs (BOON et aZ., 1962 ;
DER, 1958) ont dfini la lumire de leurs travaux, une limite de tol-
rance et un optimum compris entre 7,5 et 8,5 compatibles avec la crois-
sance des nitrificateurs.
La temprature a une grande influence sur le mtabolisme des mlcro-
organismes. BOON et (1962) en ont montr l'importance sur la
en-dessous
- 52-
consommation d'oxygne par une culture pure de Nitrobacter \vinogradskyi.
Les auteurs ne sont pas unanimes propos de ce facteur de l'environnement
Nanmoins dans le sol l'optimum serait situ entre 28 et 35C. La nitrifi-
cation serait nulle en de de 4C et au-del de 45C. Les tempratures
choisies pour notre travail tiennent compte la fois de la temprature
moyenne du sol pris comme modle et des donnes de la littrature.
Nous avons cherch mettre en vidence des optimums physiologiques
diffrents en fonction du pH et de la temprature pouvant traduire une
adaptation des bactries en notre possession ces facteurs.
B) PROTOCOLE EXPERIHENTAL
Il s'agit pour nous de si les facteurs pH et temprature sont sus-
ceptibles d'expliquer l'activit physiologique et l'volution quantitative
des populations bactriennes introduites dans un milieu. Pour cela, il coa-
vient de se placer dans des conditions aussi proches que possible de celles
rencontres dans le sol. Nous avons, dans ce but, utilis le milieu minral
prconis par scaMIDT (1973). L'ajustement des pH s'effectue par l'quilibre
de la solution tampon phosphate (NaHP0
4
-KHP0
4
) pour les pH entre 7 et 8,
avec de la soude NilO pour les pH suprieurs 8 ou avec de l'acide chlorhy-
drique NilO pour les pH infrieurs 7. Aprs strilisation l'autoclave,
les milieux inoculs soit par la souche N.U, soit par la souche N Sp sont
incubs trois tempratures diffrentes : 15C, 23C et 28C.
Au temps zro un comptage des bactries viables dans le milieu est
effectu par la mthode de Le mme type de dnombrement est
nouveau ralis aprs 144 heures d'incubation.
C) RESULTATS
Les rsultats nots sur la figure 12 montrent une rapide utilisation
des nitrites en passant des pH acides aux pH lgrement basiques avec un
optimum pH 7,6.
L'activit de la souche N.W est inexistante aux pH extrmes
de 6,3 et au-dessus de 9,5.
Les performances des activits enregistres 15C sont toujours inf-
rieures quel que soit le pH celles observes 23C et 28C. La meilleu-
re activit est observe pour les tempratures les plus leves.
70 de N-N02 utilis aprs
144 h d'incubation par
50 rapport au N-N02 de dpart
25
f:-:-o
1 ,
- 53-
o NLB
D N. H.
100
75
50
r:=
r-- :.
r- ::
..
..
."
-
25
n r: ...
...
100
75
50
25
n
5 ,5 6,3 6,6 7
r--;
7,6
-:
8,5
.....
5
pH
9,
Fig. 12
IFFET DE LA TEMPERATURE 1T DU pH SUR L'ACTIVITE DE NITROBACTER
Les cultures sont ralises dans des erlens de 500 ml contenant 100 ml
de milieu 200 ug de N-N02/ml
Les histogrammes reprsentent la moyenne de quatre valeurs
- 54-
La souche NLB montre la mme tendance en ce qui concerne le pH. L'ac-
tivit maximale se situe aussi autour du pH lgrement basique de 7,6. La
souche s'avre sensible aux pH en-dessous de 6,3 et au-dessus de 8,5.
L'activit de la souche N LB qui n'est que de 50 % 15C pour l'optimum
de pH, augmente d'une manire significative aux fortes tempratures. La
performance la plus leve (92,5 % d'activit) est enregistre 23C.
Pour les tempratures de 23C et 28C une trs faible activit de la souche
N LB est perceptible pH 5,5.
Les comptages des bactries ont t raliss uniquement pour la tem-
prature de 28C. Les rsultats prsents dans la figure 13 montrent que
le nombre de bactries viables en fin d'exprience est faible ou nul pour
les valeurs de pH comprises entre 5,5 et 7. A pH 7,6 nous retrouvons la
totalit des bactries mais cette proportion dcrot rapidement pour n'tre
que de 23 % pour N.W et 1,35 % pour N Sp pH 9,5.
D) DISCUSSION
La souche NLB isole apparat dans les tudes au laboratoire trs
au pH du milieu. Plusieurs auteurs l'avaient dj constat avec
la souche N.W notamment MEYEROF (1916), Mc LAREN et SKIUJINS(1963).
Le taux d'oxydation du nitrite devenait ngligeable pH 5-6,5 ; EOON et
LAUDELOUT (1962) n'ont pu mettre en vidence une consommation d'oxygne
des pH infrieurs 6,4 ou suprieurs 8,5. Les mmes effets sont rap-
ports par BAZIN et al. (1982), JOSSERA"{D (1983) et GAY (1983). Tous notent
que l'activit nitrifiante a lieu principalement aux pH alcalins ou neutres.
Nous avons m1S en vidence ce phnomne au cours de notre travail. Cependant
et al. (1975) ont trouv une nitrification dans un sol pH 5,4 ;
LOSSAINT et ROUBERT (1964) observent une bonne nitrification pH 4,9.
D'autres auteurs tels VAN PRAAG et (1965), BRAAR et GIDDENS (1968),
LEMEE (1967), (1974), RENNIE et (1977) ; SARATCHfu"{DRA (1978),
WALKER et WICKRM1ASINGHE (1979), JOSSERfu"{D et BARDIN (1981), ROZE et
FORGEARD (1980-1982) ont parfois constat une production relativement
importante de nitrate en sol acide. Il est noter que nous avons obtenu
une activit nitrifiante certes m1n1me pH 5,5 traduisant une adaptation
de la souche ce facteur. Ceci va dans le sens de Mc HARNESS et Hc CARTY
(1973) qui ont not que les bactries nitrifiantes pouvaient oprer avec
un maX1mum d'efficience d'une manire rgulire pH bas si elles ont t
100
75
50
~ ~ Quantit de bactries
retrouves en fin d'exprience
par rapport au nombre de dpart
- ,55 -
~ T l
o. ~
o NLB
ON. IV.
25
n
5,5
~
.. ~ ~
6,3
6,6 7 7,6 8,5
1'"
1 ...
9,5
Fig. 13 INFLUENCE DU pH SUR LE NOUERE DE NITROBACTER
INCUBE A LA TEMPERATURE DE 28C

- ::JO-
maintenues longtemps un pH acide.
Les diffrences observes dans les taux d'utilisation du nitrite peuvent
s'expliquer aussi par la diffrence dans les populations nitrifiantes ces
diffrents pH. L'augmentation de la nitrification obsrve pH 7,6 reflte
l'accroissement du nombre de bactries. La baisse du nombre de bactries
observes lorsque l'on passe de pH 7,6 pH 5,5 ou pH 9,5 est essentiellement
due une diminution graduelle de la proportion du nombre de bactries via-
bles dans la population globale.
L'amplitude de la nitrification est gouverne par la temprature d'in-
cubation. Les tests ont montr que la temprature idale de la nitrifica-
tion est de 23C par la souche NLB. KJ.'WHLES et al.. (1965), JOSSERAJ."lD (1983),
ADDISCOTT (1983) ont des rsultats similaires au cours de leurs travaux.
Vues les tempratures moyennes qui rgnent dans le sol utilis, il ne serait
pas hasardeux d'affirmer que cette souche est mieux adapte aux basses
tempratures. D'ailleurs selon et al. (1966), ANDERSON et al.
(1971), MONIB et al. (1979) les conditions climatiques de l'aire d'origine
du sol dterminent l'intervalle et la temprature optimale de croissance
des bactries nitrifiantes. Ils affirment en outre "Les bactries sont
acclimates au rgime de tempratures de leur aire".
Les tempratures de 23C et 28C semblent la fois la
souche N.W. Elles se situent dans l'intervalle de 28 35C gnralement
admis comme zone optimale d'activit nitrifiante (SABEY et al. 1959, NELSON
1931 in 1970, DEPPE et EHGEL 1960, MONIB et al. 1979). Il faut
souligner qu'un optimum d'activit 42C a t rapport par LAUDELOUT et
VAN TICHELEN (1960).
Dans les deux cas l'activit nitrifiante est fortement rduite 15C
c'est--dire 50 % seulement de l'activit totale enregistre dans les
meilleurs cas pour les tempratures de 23 et 28C. ALHER et al. (1977)
observent une diminution de 30 % du taux de nitrification pour une baisse
de temprature de 1C.
En comparant l'action combine de ces deux facteurs nous nous aperce-
vons que :
- aux basses tempratures les deux souches sont totalement inhibes
aux pH <. 6,3,
seule la souche NLB n'est pas reprime au pH < 6,3 aux tempra-
tures leves,
'- seule la souche N.W est capable de crotre pH 9,5 basse temprature.
- 57 -
Tous ces faits ne permettent pas de mettre en lumire une corrlation
entre l'activit nitrifiante et le pH dans les conditions extrmes. D'au-
tres facteurs entrent en ligne de compte.
On est amen penser que le pH du sol prls globalement ne reflte pas
le pH effectif au niveau des microsites o se dveloppent les microorganis-
mes. Dans ces endroits peuvent rgner des conditions de pH et de temprature
compatibles avec l'activit physiologique des germes, ce qui expliquerait
la bonne nitrification rencontre dans certains sols acides.
IV) INFLUENCE DE LA MATIERE ORGANIQUE
A) INTRODUCTION
La relation entre la nitrification et la prsence de matire organlque
est complexe saisir. Une action nocive lui est souvent attribue dans la
littrature. KACZMARCK (1972 a) mentionne l'effet inhibiteur du glucose sur
la nitrification. En 1977, HOKENBURY attribue plusieurs acides amins
ce mme effet. Les travaux deIVA et ALEXANDER (1965), BOCl( (1976) montrent
que les bactries nitrifiantes sont capables de crotre en condition de
mixotrophie. L'utilisation concomittante des sources d'nergie autotrophe
et organique devient possible ; le bnfice cologique pour le micro-
organisme est alors une question pertinente. C'est pourquoi il nous a paru
intressant d'envisager le cas de la mixotrophie dans le cadre de cette
tude sur Nitrobacter.
B) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
Nous avons pour ce faire utilis le protocole dcrit par BOCK (1976).
La composition des milieux de culture est porte dans le chapitre 1.
Les dnombrements bactries ont t effectus par irnmunofluorescence
pour ne pas prendre en compte d'ventuels contarninants. La viabilit des
bactries en fin d'exprience est vrifie par la mthode de Z I ~ ~ R M A N .
Toutes les cultures sont ralises dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml du milieu adquat et incubes 28C. Nous avons trois rptitions
par exprience. Les inoculums proviennent de prcultures maintenues 23C.
C) RESULTATS
Les figures 14 et 15 indiquent que la vitesse d'oxydation du nitrite
n'est pas affecte par la prsence des composs organiques dans le milieu.
L'oxydation du N-NO
Z
en milieu autotrophe et rnixotrophe est effectue
en 9 jours par la souche NLB . La densit optique atteint cet instant
0,03Z pour le milieu autotrophe et 0,065 en milieu mixotrophe. Elle con-
tinue d'augmenter aprs la disparition totale du N-NO
Z
alors que les bac-
tries ne disposent plus que de l'azote organique comme source d'nergie.
Dans ces conditions la D.O. atteint une valeur maximale de 0,117 aprs
30 jours d'incubation.
Dans les conditions chimioorganotrophes (fig. 16) nous observons
une nette augmentation de la turbidit du milieu.
Dans les deux cas : mixotrophie et chimioorganotrophie, la croissance
la plus leve est obtenue lorsque sont prsents dans le milieu le pyruvate,
l'extrait de levure et le peptone. La croissance obtenue sur pyruvate seul
est infrieure celle du cas prcdent.
En milieu mixotrophe avec Extrait de levure et peptone aprs la dis-
parition du nitrite, la croissance est moins rgulire que dans les autres
milieux.
Aucune n'est enregistre sur le milieu Extrait de levure-
peptone en condition purement chimioorganotrophe.
Les dnombrements effectus au 3e, ge, ZOe et 30e jours d'expriences
montrent un accroissement rgulier du nombre de bactries (fig. 17).
Comme pour la souche NLB- .) la prsence des composs n'a pas
d'influence sur l'utilisation par la souche N. H du N-NO
Z
: Contrairement au
cas prcdent, tout le nitrite est oxyd en 6 jours au lieu de 9. La dif-
frence de D.O. 0,03 en milieu autotrophe contre 0,055 en milieu mixotrophe
s'explique par un nombre de bactries par ml de milieu plus lev la fin
de l'utilisation du N-NO
Z
.
La meilleure croissance est observe sur le milieu pyruvate-Extrait
de levure-peptone-N-NO
Z
avec une valeur maximale de densit optique de 0,103.
Le milieu chimioorganotrophe ne permet pas d'observer une croissance
sans passage pralable de la souche par les conditions mixotrophes.
ra--
1llI
""
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o
/
/
,/
..... 0
- 59-
N-NOZ + pyruvate + extrait de
levure + peptone 9---G
0,-,0 N-N02 + pyruvate
X 10-
3
D.O. 580 nm
/'
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.10.--.06. N-NOZ + extrait de levure 1!iI""
.-. N-N02 + peptone Il
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1
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40
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80
90
100
110
120
1 i 1 j j t 1
~
4 8 12 16 20 24 28 jours
Fig. 14 CINETIQUE DE CROISSi\NCE DE NITROBACTER EN CONDITION
D' AUTOTROPHlE
}
Souche NLB
DE HIXOTROPHIE
Les cultures sont ralises dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml de l'un ou l'autre milieu
-+----+
----+--+
- O -
0-_-0-.-0
_.{J--- --.-
__ 00--- .
-'
_a-'
1IiI---1lll
0'-'0
4--,6.
+-+
-
-
X 10-
3
D.O. 580 nm
N-N0
2
+ pyruvate + extrait de levure + peptone
N-NO.., + pyruvate
"-
N-N0
2
+ extrait de levure + peptone
N-N0
2
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11
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10
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90
110
100
28 24 20 1Ci 12 8 4

jours
Fig. 15 CINETIQUE DE CROISSANCE DE NITROBACTER EN CONDITION
D'AUTOTROPHIE l S h
ouc eN. l'i
DE MIXOTROPHIE J
Les cultures sont ralises dans des erlens de 500 ml contenant
100 ml de milieu
61-
X 10-
3
0.0. 580 nm
m---m pyruvate - extrait de levure - peptone
0'-'0 pyruvate
70
60
50
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30
20
10
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./
4 8 12 16 20 24 28 jours
Fig. 16 CROISSA1\lCE DE NITROBACTER SOUCHE NLB EN CONDITION CHHlIOORGANOTROPHE
9
7
5
3
- 62-
5 10 15 20 25 30 Jours
Fig. 17 EVOLUTION DU NOUERE DE BACTERIES EN FONCTION DU TE!1PS
DANS LES CONDEIONS DE tlIXOTROPHIE ET D'AU'lOTROPHIE
.
Ml Milieu N-NOl + pyruvate + Extrait de levure + peptone
Ml Milieu N-NO? + pyruvate
M
3
Milieu + extrait de levure + peptone
A Milieu N-NO
1
Souche NLB
63 -
D) DISCUSSION
Nous avons remarqu au cours de nos manipulations une constance dans
le temps d'utilisation du N-NO
Z
en condition mixotrophe et
aussi bien par la souche N Sp que par N.W. Nos rsultats s'accordent ainsi
avec les observations de SMITH et HOARE (1968) et ceux de JOSSERAND (1983).
En conformit avec ce dernier et en contradiction avec SMITH et HOARE (1968)
nous constatons une nette influence de la prsence des composs
sur la turbidit du milieu. En effet, nos rsultats montrent une cintique
de croissance nettement plus leve en prsence des composs organiques dans
le milieu. Cet effet stimulant est d'ailleurs corrobor par les expriences
menes par KRULWICH et (1965) et STEINMULER et BOCK (1976) sur des
souches de Nitrobacter en prsence de composs organiques.
Les comptages effectus de l'immunofluorescence nous ont per-
de constater une lgre diffrence du nombre de bactries dans le milieu
mixotrophe par rapport au milieu autotrophe, ce qui expliquerait la plus
forte turbidit observe dans ce milieu.
LONDON et RITTENBERG (1966), RITTENBERG (1969) travaillant sur Thio-
bacillus intermedius constatent une stimulation du taux de croissance et du
rendement cellulaire aprs avoir ajout dans le milieu autotrophe de l'ex-
trait de levure.
Les souches de N.W et de N LB en notre ont la capacit d'u-
tiliser les composs organiques comme source d'nergie pour crotre en
absence de nitrite. Les auteurs tels SMITH et al. (1968), BOCK (1976),
(1978), KALTHUFF (1979), GAY (1983) ont aussi dmontr cette proprit
avec certaines souches de Nitrobacter.
Notons que comme IDA et (1965), (1971) et contrairement
la plupart des auteurs cits ci-dessus, nous n'avons pu obtenir une crois-
sance mme faible de la souche N.W en condition chimioorganotrophe sans
passage par la phase de mixotrophie.
Nous trouvons, comme BOCK (1976) et (1983), une croissance
toujours moins leve par rapport celle observe en mixotrophie.
Les implications cologiques de cette capacit utiliser les compo-
ss organiques peuvent tre nombreuses. Elle peut intervenir dans la s-
lection naturelle des souches lorsque les conditions de pH et de tempra-
ture deviennent mauvaises. Elle aiderait ainsi le maintien de la souche
en condition limitant la source d'nergie autotrophe ce qui est probable-
ment le cas dans la plupart des environnements naturels o crot la bactrie.
L'aptitude de la souche NLB rsister la prsence de matire
organique et aussi l'utiliser; nous a incit tudier les diffrentes
litires prsentes dans sa station d'origine. Cette question sera aborde
dans le chapitre suivant.
CHA PIT REl l l
ETUDE DES EFFETS cr'UN APPORT DE CaC0
3
ET DES EFFETS LITIERES
SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE
- 66-
1) INTRODUCTION
La nitrification dans le sol est conditionne par la qualit des apports
en azote assimilable issus de diffrentes sortes de composs organiques : tissus
vgtaux ou animaux morts, exudats ou produits de percolation d'organes ariens
ou souterrains, cadavres bactriens. Il en rsulte que les microorganismes
du sol prsentent une activit maximale dans les zones o s'accumulent
spontanment ou non ces matriaux, la litire et les horizons sous-jacents
sont ce point de vue des zones privilgies. Il est par consquent nces-
saire de tenir compte de l'influence exerce par la litire sur la micro-
flore nitrifiante.
Dans quelques sols des systmes climaciques de forts et dans certains
sols acides comme les sols de lande, l'absence de nitrification a pour
consquence d'arrter les ractions de la minralisation de l'azote au
stade ammoniacal (RICE et al., 1972, 1973, 1974 ; BELSER, 1979).
Ces observations ont incit certains auteurs rechercher les o r ~ g ~
nes de l'inhibition et notamment dterminer le rle jou par les compo-
ss provenant des litires. C'est ainsi que BASARABA (1964) a montr l'as-
pect inhibiteur des tanins sur la nitrification. Les tudes menes par
NEAL (1969), BOCQUEL et al. (1970), RICE (1964, 1969), LODHI (1976, 1978)
attribuent le faible taux de nitrification et celui des populations n ~
trifiantes au pouvoir antimicrobien des composs provenant des vgtaux
prsents sur le site.
La biodgradation des substances antimicrobiennes trs lente dans
certains sols peut tre acclre par une lvation du pH et une amlio-
ration de l'aration. L'acclration de la dtoxication sous l'influence
de ces facteurs expliquerait en partie tout au moins l'effet favorable
du chaulage sur la nitrification dans l'horizon de surface d'un mor sous
sapinire (BERNIER et ROBERGE, 1962).
Nous avons cherch valuer l'influence du relvement du pH par
apport de CaC0
3
sur la nitrification des sols de lande.
Nous avons aussi tudi in situ et au laboratoire l'intensit des
processus d'inhibition sur l'activit nitrifiante. Pour ce faire, nous
avons employ des litires d'Ajonc (Ulex europaeus) , de Bruyre (Erica
ciliaris) et de Pin (Pinus maritimus). Les investigations de laboratoire
ont t menes en chmostat sur des populations constantes de nitrifiants
de mme tat physiologique. Dans ce cas ce sont les extraits aqueux des
- 67 -
litires prcites q u ~ ont t utiliss.
II) ETUDE DES EFFETS DES APPORTS DE CaC0
3
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1) Sur le terrain
La manipulation consiste rpandre sur la surface du sol du CaC0
3
;
la dimension des parcelles utilises est de 1 m2. Cinq taux de CaC0
3
(100, 150, 250, 300 et 350 g/m2) ont t choisis.
Le but de la manipulation tait de favoriser les bactries nitrifiantes
du sol et de voir les consquences sur la nitrification. Les variations de
cette dernire ont t suivies au cours de l'anne, dans l'horizon sup-
rieur entre a et 5 cm et dans l'horizon infrieur entre 5 et 15 cm. Les
modes de prlvement et d'incubation sont prsents dans la chapitre I.
2) Au laboratoire
L'effet sur l'activit nitrifiante est abord en ajoutant 100 g de
solS g ou la g de CaC0
3
. L'chantillon est ensuite plac dans des erlens
de 500 ml avec une arrive d'air humide et strile mis incuber.
Dans les deux expriences nous avons dos les nitrites et les nitra-
tes aprs une priode de six semaines d'incubation.
B) RESULTATS EXPERIMENTAUX
1) Rsultats des expriences ralises sur le terrain
Les valeurs portes dans les tableaux 6 et 7 reprsentent respective-
ment les teneurs en
d
"" ++
a J o n c t ~ o n de Ca .
d'azote dans le sol
azote nitrique et azote ammoniacal dans les sols aprs
Elles constituent la diffrence entre les quantits
au moment du prlvement et les quantits aprs une
incubation de six semaines.
Nous remarquons (tableau 6), entre la fin de l't 1982 et l'automne
1982, qu'un apport de 1 1,5 quivalent de Ca++ occasionne une diminution
de la quantit d'azote minralis dans le sol. Quel que soit l'horizon,
++
avec un apport de 2,5 quivalent de Ca ,cette diminution n'a lieu qu'en
Tab leau 6
68 -
++
INFLUENCE DES APPORTS DE Ca SUR LA NITRIFICATION DA.L\lS LE SOL
DE LANDE.N-N0
3
+ N-N0
2
MINERALISE EN SIX SEMAINES D'INCUBATION
(exprim en 10-
3
%du poids de sol sec)

[
Priode
. 'quivalent
1 1,5 2,5 3 3,5
- Ca++
Horizon
de
suprieur
-0,005 -0,034 -0,049 +0,027 +0,001
Nov. 1982
0-5 cm

infrieur
Dc. 1982 -0,025 -0,14 +0,027 +0,006

5-15 cm
de
suprieur
+0,002

+1,204 +0,294
Mars 1983
0-5 cm

infrieur
Mai-1983
5-15 cm

+0,003 +0,316 +0, 121 +0,021


Tableau 7
++
INFLUENCE DES APPORTS DE Ca SUR LA DE NH
4
MINERALISE
EN SIX SEMAINES D'INCUBATION (exprim en 10-
3
du poids de sol sec)

1
Priode
'quivalent 1
1,5 2,5 3 3,5
Ca++
Horizon
de
suprieur
-0,30 -0,10
1
+0,06 +0,22
-0,55
Nov. 1982
0-5 cm

infrieur
Dc. 1982
5-15 cm
-0,45 +0, 1 +0,07 +0,04 +0,07
de
suprieur

+0,001
0-5 cm

traces
Hars 1983

infrieur
Mai 1983
5-15 cm


traces
- 69-
surface. Au-del de ces valeurs nous observons un en azote minralis
dans presque tous les horizons.
Au printemps 1983, nous avons une stimulation de la nitrification dans
toutes les parcelles tous horizons confondus, sauf dans l'horizon infrieur
avec un apport de 1 quivalent de Ca++ et dans l'horizon suprieur avec 1,5
; . 1 ++
ent de Ca .
Les valeurs moyennes en nitrates diminuent de l'horizon de surface
l'horizon infrieur. Les meilleurs rsultats (1,302 10-
3
%et 1,204 10-
3
%)
sont obtenus en surface avec un apport de 2,5 et 3 quivalents de Ca++
ce qui a amen le sol un pH d'environ 6. L'apport de 2,5 quivalent de
++ .
Ca toujours le plus favorable pour la
Le tableau 7 montre une diminution en azote ammoniacal dans l'horizon
de surface avec des apports de l, 1,5 et 3,5 quivalents de Ca++ pendant
l'automne 1982. Les les plus leves (0,22 %et 0,07 sont
++
enregistres pour des adjonctions de 3 et 2,5 quivalents de Ca . En mars-
1983 les teneurs deviennent nulles.
Les taux de nitrification sont importants avec un apport de 2,5 qui-
valent de Ca++. Les valeurs calcules la fin de l'automne 1982 et du
dbut du printemps 1983 sont respectivement de 27,83 et 99,92.
2) Rsultats des expriences ralises au laboratoire
Les valeurs portes dans le tableau 8 montrent une amlioration trs
sensible de la nitrification dans le sol aprs un apport de 1/10 quivalent
++ . ; ++
de Ca sous forme de CaC0
3
. Avec une plus forte de Ca nous
n'avons pas obtenu de meilleurs rsultats.
Tableau 8
TENEURS EN N-N0
3
DES SOLS DE LANDE INCUBE IN VITRO
INFLUENCE D'UN APPORT DE Ca++
Quantit Teneur en
pH du sol
de Ca++
N-
N
03
5/100Equivalent
0,049
6,)
de Ca++
1
1110 Equivalent
0,093
6,7
de Ca++
1/5 Equivalent
0,023
6,8
de Ca++
----J
- 70-
C) DISCUSSION
Nous remarquons que l'apport de Ca++ est bnfique la nitrification
du sol acide de lande. Cet apport au sol montre en effet que la production
de N-N0
2
+ tout en restant relativement faible, augmente avec la
quantit de Ca+ ajout. Nous remarquons au dbut de l'exprience une di-
minution des teneurs en azote aprs un ajout de 1 et 1,5 quivalent de
Ca++. Nous attribuons ce phnomne une rorganisation de l'azote dclen-
che par la reprise de l'activit de l'ensemble de la microflore. Mais le
rythme d'accroissement de l'activit des minralisateurs est trop lent par
rapport celui de l'ensemble. Ds que cette activit atteint son
le dficit est combl et nous observons mme que le stock d'azote augmente.
La faible nitrification enregistre dans ces sols n'est pas due un
manque de substrat assimilable car la quantit d'ammonium prsent est sou-
vent leve (RaZE et al., 1980-1982).
Ces faits rvlent que les nitrifiants autotrophes sont prsents dans
ce sol acide et qu'ils rsistent mais leur mtabolisme est ralenti par le
pH. Ces constatations renforcent les rsultats que nous avons obtenus cha-
pitres l et II. En effet nous avons isol une souche de Nitrobacter. L'tude
de ses caractres physiologiques nous a rvl que son mtabolisme fonc-
tionne pH 7,6 donc lgrement alcalin. Nous avons observ une baisse
du nombre de bactries comptabilises aux pH <6.
,
TAJ.\lDON et HISHRA (1969), BONNEAU (1967-1971), .:IONES ET HOOD (1980) ont
constat au cours de leurs travaux que l'apport de CaC0
3
favorisait la
nitrification des sols acides.
P,AJ.\lG et al. (1975) pensent que le nombre restreint des nitrifiants
rencontrs dans ce type de sol est l'origine de leur faible nitrification.
L'apparente absence .de nitrification dans ces sols peut aussi s'expli-
quer par le fait que les nitrates produits en faible quantit sont rapide-
ment assimils par les plantes ou lessivs. En effet lorsque l'on supprime
le lessivage et l'absorption par les racines nous nous apercevons qu'il y
a une faible nitrification dans ces sols.
Toutes ces observations ne nous permettent pas d'tablir une relation
directe entre la quantit de CaC0
3
apporte dans le sol et son taux de
nitrification.
Nous sommes alors amen nous poser la question sur le rle exact du
CaC0
3
dans le processus de l'amlioration de la nitrification. Il est pos-
sible qu'il agisse au niveau du pouvoir tampon du sol amliorant le pH.
- 71 -
Nous avons vu que malgr son origine acide la souche de Nitrobacter isol
avait sa meilleure croissance pH 7,6. Le CaC0
3
pourrait agir sur la ni-
trification en favorisant la chelation des substances inhibitrices (si
elles existent) du mtabolisme bactrien ou encore en constituant une
source de carbone. Nous n'avons pas personnellement vrifi ces hypothses.
Elles peuvent constituer une base de travail pour la comprhension de la
nitrification dans les sols acides.
III) ETUDE DES EFFETS LITIERES
Nous dsignerons sous l'expression "Effet litire" l'ensemble des
interrelations se manifestant entre les vgtaux suprieurs et les micro-
par l'intermdiaire des litires sous forme de rsidus divers
dposs la surface du sol,; au laboratoire les litires sont remplaces
par des solutions aqueuses de ces mmes rsidus.
A) PROTOCOLE EXPERIMENTAL
1) Modalits de la manipulation effectue sur le terrain
Elles' consistent simuler une litire en disposant du matriel vg-
tal sec la surface du sol sur des parcelles de 1 m2 et non en l'enfouis-
sant artificiellement. Ce matriel est ainsi la fois la dcom-
position et l'incorporation au sol par des agents biotiques et abioti-
ques. Il a t rcolt la fin de la priode de vgtation en novembre 1981.
Nous avons test les litires d'Agrostis de Molinia
d'Erica d'Ulex Betula de Quercus peduncu-
lata et de Pinus maritimus. Ces espces sont caractristiques des diff-
rents tats d'volution de la lande vers la fort. La quantit de litire
utilise est de 2 kg/m2. Elle a t dpose sur le terrain au mois de
dcembre 1981.
Nous avons ensuite suivi les variations saisonnires de la teneur en
N-N0
3
+ N-N0
2
dans les horizons sous-jacents : horizon suprieur entre
et 5 cm - horizon infrieur entre 5 et 15 cm. Les mthodes de prlvements
et d'incubations sont dcrites dans le chapitre 1.
- 72-
2) Modalits de la manipulation effectue au laboratoire
Le matriel vgtal employ est compos de feuilles et de petits rameaux
d'Ulex d'Erica ciliaris et des aiguilles de Pinus maritimus,
rcolt en mme temps que celui dpos sur le terrain en novembre 1981.
Le matriel vgtal sch l'air est rduit en poudre par broyage
en vue de l'extraction des substances hydrosolubles. Cette dernire se
fait en prsence d'eau distille 4C avec un rapport Poids de matire
vgtale sur Volume d'eau gal 5 g pour 100 ml (BEeK et al., 1969
BOCQUEL et al., 1970, LODHI et al., 1980). La dure de l'extraction est
de 12 heures.
Les extraits obtenus aprs centrifugation sont striliss sur filtre
millipore 0,45 u et congels jusqu'au moment de l'emploi.
La strilit de chaque extrait est vrifie par incubation de 1 ml
sur trypticase 28C pendant 72 heures. Le tableau 9 rsume toutes les
manipulations effectues sur le matriel vgtal.
Nous avons valu l'effet des extraits sur des populations constantes
de nitrifiants et dans un mme tat physiologique, en chmostat. Pour ce
faire nous avons inject directement dans la chambre de culture l'tat
d'quilibre 10 ml d'extrait de litire. Le chmostat est ensuite aliment
par le mme extrait contenant la source d'azote sous forme de N-N0
2
(200 ug/ml) et dont le pH a t ramen 7,6. Cette manire de procder
nous vite d'avoir, dans la cuve de un gradient de concentration
en extrait de litire qui rendrait difficile l'interprtation d'ven-
tuels phnomnes d'inhibition. En ramenant le pH 7,6 nous avons cherch
liminer ce facteur dont l'importance n'est plus dmontrer, comme va-
riable de l'exprience. Nous avons vu chapitre II que ce pH tait idal
pour la croissance de Nitrobacter.
Dans l'effluent, la concentration en N-N0
2
rsiduel et celle de l'ATP
sont SUlVles en fonction du temps. Paralllement des comptages de bactries
sont raliss.
Le tableau 10 donne le dtail des manipulations effectues sur les
parties aliquotes prleves dans l'effluent.
Tableau 9
- 73-
Matriel vgtal sec :
Ulex Erica Pinus maritimus
Broyage au Dangourneau
l
Extraction par eau froide
rapport Poids M.V./eau = 5/10
'Ii II'
Centrifugation 5000 g 15 mn
des extraits obtenus
'11'
Strilisation par filtration
sur Millipore 0,45 des extraits obtenus
Conglation -20C
jusqu'au moment de l'emploi
Vrification de la strilit sur
trypticase avant et pendant l'emploi
SCHEMA DESCRIPTIF DES EFFECTUEES POUR L'OBTENTION DES EXTRAITS
- 74-
j 20 ml Effluent 1
Filtration sur filtre millipore 0,45 p
Dosage du N-N0
2
rsiduel
par la mthode de GRIESS
sur le filtrat
Reprise du filtre dans
2 ml d'eau strile
tt.
Dilution de la suspension
bactrienne dans Extraction de l'ATP
eau strile
l
l
Coloration l'INT
ou Conglation -20C
avec anticorps fluorescent
l l
Comptage au microscope Dosage de l'ATP
pifluorescence par bioluminescence
Tableau 10: RECAPITULATIF DES EFFECTUEES SUR LES PARTIES
ALIQUOTES PRELEVEES L'EFFLUENT
- 75-
B) RESULTATS EXPERIMENTAUX
1) Rsultats des expriences ralises sur le terrain
Nous avons respectivement port dans les tableaux Il, 12 et 13 les
valeurs des teneurs en azote nitrique et nitreux, l'azote ammoniacal et
les taux de nitrification, dans les sols sous-jacents des diffrentes li-
tires.Ces valeurs reprsentent la diffrence entre les teneurs des sols
au moment du prlvement et aprs six semaines d'incubation.
Nous remarquons dans le tableau Il une absence d'azote nitrique et
nitreux dans l'horizon 0-5 cm des sols sous toutes les litires sauf pour
Pinus maritimus et Quercus pedunculata. La situation est identique dans
l'horizon infrieur mais les gains sous les litires d'Ulex europaeus et de
-3
Betula pubescens sont respectivement de 0,036 et 0,002 la % en automne 1982.
Pendant le printemps 1983 quel que soit le niveau considr 0-5 cm ou 5-15 cm,
les teneurs en azote deviennent importantes. Ceci n'est pas vrai pour le sol
sous Erica ciliaris et l'horizon 5-15 cm de Pinus maritimus. C'est sous la
litire de cette dernire espce que nous observons la plus importante accu-
mulation (0,057 10-
3
%). A l'automne 1983 la quantit d'azote devient nulle
sous toutes les litires et dans tous les horizons except sous les sols
sous-jacents des litires de Quercus pedunculata. Notons que toutes les
teneurs enregistres, sauf pour pinus maritinn{s pendant cette priode,
concident avec la disparition sur le terrain du matriel vgtal apport.
En analysant par espce vgtale les rsultats ports dans le tableau
Il nous nous apercevons que:
- sous la litire d'Agrostis setacea,la quantit d'azote nitrique et
nitreux minralis est nulle dans les deux niveaux 0-5 cm et 5-15 cm pour
les deux automnes. Par contre il y a une accumulation de N-N0
3
durant le
printemps 1983
- sous la litire de Molinia caer1llea, la nitrification est nulle
dans les deux horizons 0-5 cm et 5-15 cm pendant l'automne 1982 et 1983.
Comme pour l'espce prcdente une augmentation du stock d'azote nitrique
et nitreux est visible pendant le printemps 1983 ;
- sous la litire d'Erica ciliaris, la nitrification est reste
inexistante pendant toute la manipulation
- :1 'horizon immdiatement en contact avec les litires d' Ulex euro-
paeus ne prsente pas de nitrification l'automne 1982. Nous retrouvons
Tableau Il INFLUENCE DES APPORTS DE LITIERES SUR LES TENEURS EN
(exprim en 10-
3
% du poids de sol sec)
N0
3
+ N0
2
EN SIX SEMAINES
Litires
apportes Agrostis Molinia Erica Ulex Betula Pinus Quercus
Tmoin
Priode ur le sol setacea caerulea ciliaris eUl'opaeus pubescens maritimus pednculata
Horizon
du
suprieur

traces traces traces
28 sep. 1982
0-5 cm
au
infrieur
7 nov. 1982
5-15 cm

+0,036 +0,002 traces traces traces


du
suprieur
+0,035 +0,016

+0,016 +0,032 +0,057 +0,004

24 mars 1983
0-5 cm
au
infrieur
4 mai 1983
5-15 cm
+0,040 +0,008

+O,OO!I +0,015

+0,010

du
suprieur

+0,075
0-5 cm
traces
23 sep. 1983
au
infrieur
8 nov. 1983
5-15 cm

+0,007

"-J
()\
- 77-
ce phnomne dans les deux horizons 0-5 cm et S-lS cm l'automne 1983.
C'est au dbut de novembre 1982 que le maximum en azote N-N0
3
+ N-N0
2
est
enregistr. La nitrification diminue ensuite graduellement;
- au niveau des litires de Bet-ula pubescens,la nitrification est nulle
dans l'horizon o-S cm et dans les deux niveaux l'automne 1982 et 1983.
Les meilleurs rsultats (0,032 et O,OlS 10-
3
%) sont obtenus pour des in-
cubations ayant eu lieu au printemps 1983 ;
- au niveau de pinus maritimus,l'azote nitrique et nitreux existe sous
forme de traces dans les deux horizons tudis entre la fin de l't 1982
et l'automne 1982. La nitrification est relativement importante dans le
niveau O-S cm au printemps 1983. Elle devient nulle l'autoITille de cette
mme anne
- sous les litires de Quercus pedunculata, il y a une progression
dans les gains en azote nitrique et nitreux, tous horizons confondus, de
la fin de l't 1982 l'automne 1983. Les sont atteints cette
priode. Les valeurs sont approximativement gales dans les deux
sauf pour l'horizon O-S cm au printemps 1983.
A l'automne 1982 la teneur en azote ammoniacal (tableau 12) est nulle
dans les horizons sous-jacents des diffrentes litires (sauf sous l'Ulex
europaeus : 0,17 et 0,12 %).
Au printemps 1983 les quantits d'azote ammoniacal augmentent dans
tous les horizons et sous toutes les litires. Les valeurs obtenues en
surface O-S cm sont toujours suprieures celles de l'horizon infrieur
avec des maximum sous l'Ulex 0,S3 10-
3
% et sous Agrostis
-3
setacea 0,21 10 %.
C'est seulement sous l'Agrostis setacea et Molinia caerulea que
nous observons une prsence d'azote ammoniacal en automne 1983. Les te-
neurs en cet lment dans les sols situs sous les litires de ces deux
espces vgtales, n'augmentent qu' partir du printemps 1983 ; elles
atteignent leurs maxima entre l't et l'automne 1983.
Sous les litires d'Ulex europaeus les teneurs en azote ammoniacal
sont leves dans les deux horizons O-S cm et S-lS cm de l'automne 1982
au printemps 1983. Nous observons une disparition de cet lment dans les
sols sous-jacents, entre la fin de l't 1983 et l'automne de cette mme
anne.
Tableau 12 INFLUENCE DES APPORTS DE LITIERES SUR LES QUANTITES DE N1I
4
MINERALISE EN SIX SEMAINES D'INCUBATION
(exprim en 10-
3
%du poids de sol sec)
Litires
apportes Agrostis Molinia Erica Ulex Betula Pinus Quercus
Tmoin
Priode sur le sol setacea caerulea ciliaris ew'opaeus pubescens mari t inrus pedunculata
Horizon
du
suprieur

+0,17

traces
28 sep. 1982
0-5 cm
-
au
infrieur
7 nov. 1982
5-15 cm

+0,12

traces
du
suprieur
+0,21 +0,05 +0,15 +0,53 +0,19 +0,13 +0,12
24 mars 1983
0-5 cm
au
infrieur
4 mai 1983
5-15 cm
+0,04 +0,04 +0,15 +0,09 +0,04 +0,005 +0,02 0,01
du
suprieur
+0,65 +0,29

traces
23 sep-. 1983
0-5 cm
au
infrieur
8 nov. 1983
5-15 cm
+0,09 +0,027

traces
-...J
co
1
79 -
Sous les litires d'Erica ciliaris en priode automnale l'ammonifica-
tion est nulle. L'azote assimilable n'est prsent 198};
Sous les ,litires de Be-tula Pinus maritirrrus et de
Quercus pedunculata, l'azote d'ammonium n:est prsent dans les horizons
que!:.pendant les mois de mars mai 1983.
Les valeurs du tableau 13 indiquent que le taux de nitrification est
nul pendant les deux automnes 1982-1983. Ces taux augmentent au printemps
1983 avec des maximum dans l'horizon 5-15 cm sous Agrostis setacea 50 %
et Quercus pedunculata 33,33 %.
Les sols sous-jacents des litires des Gramines, c'est--dire Agros-
tis setacea et Molinia caerulea ragissent de la mme manire. Nous pou-
vons attribuer l'absence de nitrification pendant l'automne 1983 soit
une inhibition due la prsence de composs antimicrobiens soit au fait
que la quantit de N-N0
3
+ N-N0
2
produite est insuffisante pour couvrir
la fois les besoins des microorganismes telluriques des plantes du site
et la constitution de rserve quantifiable. Nous observons une anne aprs
une stimulation peut-tre due au lessivage complet des substances inhibi-
trices et la mise la disposition des bactries nitrifiantes de composs
rapidement assimilables. L'volution de ce phnomne rappelle les rsultats
obtenus sur un sol auquel on a incorpor soit des litires (LOSSAINT, 1961),
soit de la paille 1962). Ces auteurs attribuent l'apparente ab-
sence de nitrification au dbut de leurs expriences, un processus de
rorganisation se droulant en deux parties: une phase d'immobilisation
nette, qui dans notre cas dure prs de six mois, suivie d'une phase de
minralisation nette. Cette seule explication n'est pas satisfaisante car,
malgr des teneurs relativement importantes en azote ammoniacal pendant
la phase de stimulation, les quantits de N-N0
3
et restent faibles.
Il y a donc lieu de rechercher une autre explication. Nous cartons l'ab-
sence de nitrifiants autotrophes puisque nous avons isol une souche de
Nitrobacter. Par contre, le nombre de ces derniers dans le sol pourrait
donner une indication. Il est en effet admis que la quantit des bactries
conditionne les teneurs en N-N0
3
+ N-N0
2
observables dans un sol.
Nous pensons donc que c'est ce niveau qu'il faudra rechercher les causes
de l'absence de nitrification.
Tableau 13 TAUX DE NITRIFICATION
N0
3
+ N0
2
NH
4
+ N0
3
+ N0
2
x 100 SOUS DIFFERENTES LITIERES IN SITU

Agrostis MoZinia Erica UZex BetuZa Pinus Quercus apportees
Priode

setacea caeruZea ci Ziaris europaeus pubescens maritimus peduncuZata
Hon.zon
du
suprieur
0 0 0 0 0 0 0
28 sep. 1982
0-5 cm
au
infrieur
7 nov. 1982
5-15 cm
0 0 0 23,07 - 0 0
du
suprieur
14,2 26,66 0 2,93 14,41 30,48 3,22
24 mars 1983
0-5 cm
au
infrieur
4 mai 1983
5-15 m
50 16,66 0 4,25 27,27 0 33,33
du
suprieur
0 0 0 0 0 0 -
23 sept. 1983
0-5 cm
au
infdeuy
8 nov. 1983 0 0 0 0 0 0 -
5-15 cm
--
C).)
o
1
31-
Le phnomne d'inhibition de la nitrification est plus visible dans
le cas d'Erica ciliaris avec un taux de nitrification nul. Ces litires
contiendraient des substances antimicrobiennes trs actives vis--vis du
mtabolisme des nitrifiants. Ces composs agissent en complexant la source
d'nergie mtabolisable par ces bactries. Les rsultats obtenus avec une
autre Bruyre, Calluna vulgaris 1971) corroborent ces
explications.
Sous les litires d'Ulex les phnomnes de nitrification
sont stimuls dans les sols sous-jacents. La disparition de N-N0
3
+ N-N0
2
en automne 1983 est essentiellement provoque par la dcomposition complte
du matriel vgtal apport et la rorganisation de l'azote. Les observa-
tions de LEMEE (1967, 1975, 1982) sur l'volution annuelle de la minrali-
sation apportent une caution cette hypothse. Cet auteur a en vi-
dence un maximum de minralisation au printemps suivi d'une brusque ror-
ganisation de l'azote en automne.
Les rsultats obtenus avec pinus maritimus concordent avec la plupart
des donnes de la littrature. Dans cette dernire l'activit nitrifiante
est rduite inexistante sous les forts de Conifres.
Nous nous sommes plac dans des conditions telles qu'il n'y a pas
apport continuel de matire vgtale frache et donc de substances anti-
microbiennes. Nos rsultats ne peuvent surprendre l'on sait que
l'activit antimicrobienne n'est pas constante et qu'elle baisse progres-
sivement aprs la chute au sol des rsidus vgtaux. Il a t dmontr que
la teneur en polyphnols hydrosolubles (ayant une grande activit inhibi-
trice) de la litire de Pinus sylvestris atteint sa valeur minimale ds le
troisime aprs la chute des aiguilles (HAYES, 1965). Le fait que nous
ayons commenc nos manipulations huit mois aprs le dpt sur le terrain
des litires, ne nous permet pas de dire si ces dernires ont une action
inhibitrice sur la nitrification. Du moins les rsultats suggrent qu'il y
a nitrification dans l'horizon suprieur du sol sous-jacent, la disparition
prcoce en automne pouvant tre impute la fois au phnomne de rorga-
nisation (LEMEE, 1982) et aux facteurs internes de la litire. Une expri-
mentation de BEeK et al. (1969) a en effet mis en vidence une action
hibitrice globale des processus de la nitrification par les litires.
Nous pouvons faire l'hypothse que les substances hydrosolubles in-
hibitrices de la minralisation libres par la litire jeune migrent en
conditions naturelles dans la litire ancienne dont elles freinent la
_ 82-
minralisation de l'azote.
Au du Quermls pedunmllata, nous assistons un phnomne de lib-
ration progressif d'azote, directement assimilable par les nitrifiants.
Ceci expliquerait l'augmentation continuelle de la nitrification dans les
horizons sous-jacents.
Nous pensons qu'il y a d'une manire concommittante un lessivage des
substances antimicrobiennes contenues dans ces litires. BECK et al. (1969)
ont montr que les litires de Quermls petraea rcoltes au de novem-
bre sont plus toxiques que celles de dcembre. De plus celles prleves
au mois de janvier ont un effet stimulateur. Il y a donc bien une dtoxi-
cation des litires par processus de lessivage ou de biodgradation.
C'est au moment o les litires tendent disparatre sur le terrain que
nous observons le maximum de N-N0
3
+ N-N0
2
dans l'horizon directement en
contact avec la litire de Quermls pedunculata.
2) Rsultats des expriences ralises en choostat au laboratoire
a) Effet des litires d'Ulex europaeus
Aprs adjonction d'un extrait aqueux de litire d'Ulex europaeus au
milieu de la cuve de culture, nous ne remarquons aucune variation ni au
du mtabolisme des nitrites dans la concentration en ATP de
l'effluent. Dans ce dernier le nombre de bactries comptabilises par
immunofluorescence reste sensiblement le mme. Les figures 18 21
rsument les rsultats obtenus.
Les observations ci-dessus sont valables pour les deux souches de
Nitrobacter en exprimentation et ceci quel que soit le support (charbon
actif ou sol) contenu dans la cuve de culture.
Les expriences menes par NEAL (1969) corroborent ces rsultats.
Les souches de Nitrobacter peuvent rester insensibles l'incorporation
dans leur milieu de culture, des extraits aqueux de certaines plantes.
Au cours de leurs travaux RENNIE et (1977), SMITH et WOLDENDORP
(1981) ont signal la prsence de substances organiques favorables
l'activit des bactries nitrifiantes.
Nous pouvons dire que dans les conditions exprimentales choisies,
les substances contenues dans l'extrait aqueux d'Ulex europaeus n'ont
aucun effet sur l'activit nitrifiante.
b) Effet des litires d'Erica ciliaris
L'injection d'un extrait aqueux de litire d'Erica ciliaris dans la
cuve de culture du chmostat, entrane des perturbations dans le compor-
ATP
Pg/ml
x
2,5
N-NO
flg/mt
O.J'\. - 0.. -0-0 -- -0- - -- 0- -- -- --0--- - II n-,,-O
. v -'(J"- -. - - - __ -0
>/.'-. .
- *-\ / ... - ... ----*-- * 1>-*-:+:

6
Nombre de
bactries/ml
;c 10
6
1/5
0---0
* * \li--- --19
Bactries
ATP
N-NO
2
5
4
3
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2

W
1
o

36

1
1 t---t-.----.
48 IL 120 Heures
Fig. 18 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NHllRE DE NITRDHACTER Ln CULTIVE EN CHEMOSTAT
La temprature d'incubation est de 28C; le pH du milieu a t ramen 7,6 ; la
concentration en N-N0
2
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens
ont t effectus par iuullunofluorescence
La flche indique le moment du changement de milieu.
ATP
Pg/ml
x 10
3
i 1'1-1'102
).lg/ml
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
O
- 0- _
0-0-0-_0_0...--0 -- --0-- -- 0-------0--------
2,5
--------*


- --- - -0-11-0-.0 -0
* -* 11_,(*"-*
6
15
1
0---0
;./4 tk
1IlI--- - --ft
Bactries
ATP
N-NO
2
5
4
3


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_________ - -- - --., a-. _._ ..
2
10
r
o
,-----r:----,-------I---' .------.... 0-_--------------.; _
6 1218 24 30 36' 1!2 48 72 120 lleures
(Xl
.po.
Fig. 19
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIEllliS D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NOH13RE DE NlTROBACTER LB CULTIVE EN CIIEMOSTAT
La d'incubation est de 28C; le pli du milieu a t ramen 7,6 ; la
concentration en 1'1-1'102 dans le milieu de est 200 ug/ml. Les cOlnptages bactriens
ont t effectus par iWTIunofluorescence
La flche indique le moment du changement de milieu.
ATP
Pg/ml
x 10
3
N- N02
Jlg/ml
)'0,0-0 o'o--o-o----Q... .D--__ __ __------0
_ '0-0' if 0
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
2,5
'lA-\ /-M___ __*--------;j<
/-M- ----M-)l--I------.-
M-
_____________>i'
6
72'0. 0 Ile
- - ures
1,5
0
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5
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1 t- - --
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0---0
:.Ii *
D--- --1l2
Bactries
ATP
N-NO
2
-,
5
4
3
2
CP
Ln
Fig. 20
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ULEX EUROPAEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE,
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NmmRE DE NITROI3ACTER HINOGRADSKYI CULTIVE EN CHEMOSTAT
Les conditions de cultures sont les mmes que celles de la figure 18.
ATP
Pg/ml
x IOJ
2,5
1,5
N- N02
).Ig/ml
0- --- -0_ _ -0
- -0.-0- - -_-0---- _
(}----o
*
11I-----1:1
6
5
4
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
g5
t,
l
' _ l ' .. __ .__ . ._
' 1 1
........
- - - ..._- -- - - --- - ----
- -'-'
3
2
-0
30
, --------t t------.---.---
36' 4 2 413 72120 Heures
C'">
0-'
fig. 21 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D
1
ULEX EUROPIlEUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE.
LA CONCENTRATION EN ATP ET LE NONlll DE NITR0131\CTER HINOGRADSKYI CULTIVE EN CHEHOSTAT
Les conditions de cultures sont les que celles de la figure 18.
- 87-
tement bactrien (diminution de la concentration en ATP et du taux d'uti-
lisation des nitrites).
Comme dans le cas ci-dessus, nous n'avons pas enregistr de grandes
diffrences de raction des souches entre les supports. Les rsultats ob-
tenus sont ports dans les figures 22 25.
Dans l'effluent le nombre de bactries dnombres par la mthode
d'immunofluorescence ne varie pas. Les comptages effectus l'aide de la
mthode de et al. (1978) ne montrent pas de variations dans le
nombre de bactries viable.
Par contre nous observons une chute brutale de la concentration en
ATP alors que le nombre de bactries est rest constant. La concentration
en ATP n'est plus proportionnelle la biomasse bactrienne. L'ATP est
dans ce contexte l'expression de l'activit cellulaire. Tout se passe
comme si la charge en adenylate du milieu diminue. Cette dernire est
la mesure linaire du taux d'nergie mtabolique momentanment stock
dans les adenylates. Elle est gale :
(ATP) + 1/2 (ADP)'
(ATP) + (ADP) + (AMP)
(ATKINSON, 1969 ; et al., 1971 ; KARL et al., 1978).
La chute de la concentration en ATP peut s'expliquer par sa dissociation
en ADP et librant l'nergie ncessaire une meilleure rgulation
interne de la cellule. Une analyse en chromatographie en phase liquide par
HPLC nous aurait permis de monter que la diminution de la charge en
adenylate est due l'augmentation des formes de nuclotide ci-dessus
cites. La rgulation a pour but de permettre la cellule de s'adapter
aux nouvelles conditions du milieu. Elle se fait par une mise hors circuit
de toutes les enzymes rgulatrices des systmes biosynthtiques et d'au-
tres consommatrices de l'ATP. Ce phnomne favorise en mme temps le taux
de rgnration de l'ATP faisant revenir la charge en adenylate son ni-
veau antrieur. En effet, le taux initial en ATP est rcupr aprs quel-
ques heures d'exprimentation.
Le mtabolisme du nitrite est aussi perturb; nous remarquons une
lgre inhibition du taux d'utilisation de cet lment par les souches de
Nitrobacter. Cet effet se traduit par une augmentation de la concentration
en N-N0
2
rsiduel dans l'effluent. L'activit antimtabolique de l'extrait
n'est pas permanente. Elle devient reversible aprs quelques heures dans
les nouvelles conditions de culture. Les rsultats ci-dessus suggrent la
prsence de substances faiblement inhibitrices dans les tissus d'Erica
ciZiaris.
ATP
Pg/ml
x 103
N-NO
)ug/mt
Nombre de
bact6ries/ml
x 10
6
2>5
1,5
- ---l!';---
?-(KJoo-o-o-o-o 0 _ -;f')- _
. 0'\. ......... <4>::-
.........0-0 _/..
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0- - -0 Bactries
* *ATP
1Ill- -----s N-NO
2
6
5
4
3
0>5 2
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1
GO
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48 72 120 Heures
- - .-. - . _.
42 36 30 2Ll 18 12 6
"
o
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Fig. 22
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D' ERICA CILlARIS SUR LI ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER LB CULTIVE EN CllEMOSTAT
La temprature d'incubation est de 28C; le pH du milieu a t ramen il 7>6 ; la concentration en N-N0
2
dalls le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par immunofluorescence
La flche indique le moment du changement de milieu.
- =-lt'=ii!
ATP
Pg/ml
x 10
3
2,5
1,5
N-NO
}lg/mt
ct'
*\ - - ---
\
/
0---0
\ :-------:
""
*
"a
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Bactries
AT1'
N-NO
2
Nombre de
bact
6
ies/ml
x 10
6
5
4
3
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- - - - - - - - - - - - .. -- .. - -
2
'6 1'1. 18 24 JU 36
4'2

48 72 120 Heures
(,.)
\D
Fig. 23 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ERICA CILIARIS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN AT1' ET LE NOMBRE DE NITIWBACTER LB CULTIVE EN CHEHOSTAT
La temprature d'incuGation est de 28C; le pH du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
dans le milieu de rserve est 200 ug/nll. Les comptages bactriens ont t effectus par imnmnofluorescence
La flche indique le moment du changement de milieu.
ATP
Pg/ml
x 103
N-N02
j1g/ml
Nombre de
bact ries /ml
x lOb
4
5
6

2
13acteries
ATP l,
0---0
* *
1ll-----1ll

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0 '\. 0
0 0 /*-----=--- *-
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15-
1
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3
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1
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- ........ - ....... pi
1-'-'-"-'+
I.D
o
1
o
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6 1'2
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4'2
""0
48 7 I:L Heures
Fig. 2!. INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIEHES DI ERICA CILTARIS SUR LI ACTIVITE NITIUFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOHI3I DE NI'l'ROnACTER \] CULTIVE EN CHEHOS1'AT
La temprature d'incubation est de 28C; le pH du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les conlptages bactriens ont t effectus par
La indique le moment du changement de milieu.
0-' - -0 Bactries
* *ATP
fII- --1- - -11:1 N-NO
2
ATP
Pg/ml
x 103
2,5
1,5
0,5
N- N02
)Jg/ml
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-',.0--0--0-0'0_ 1
-0........ 0--- 0-0- .0 __A'L --- t;- .
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-*
Nombre de
bactries/ml
x 10
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5
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2
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l '-'-"-"',
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J
J
\//'-.. ,_.-.._-....j
'. -- - -- -- - -- - -- -- -- --.- - -- -- -- -- -- - --t __
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.
18
- 1 r----"f
24 30 36
-- --" -- -- "1 r,,- ..- -+
-1 I--r--......- .
42 48 72 120 Heures

Fig. 25 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES D'ERICA CILIARI8 SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NmmRE DE NITROBACTER CULTIVE EN CHEHOSTAT
La temprature J'incubation est de 28C; le plI du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par immunofluorescence
La flche indique le moment Ju changement cie milieu.
92-
c) Effet des litires de pinus maritimus
Les extraits de Pinus maritimus entranent une chute du nombre de
bactries viables dans l'effluent tandis que la population globale de ni-
trifiants comptabilits par irnmunofluorescence reste peu prs identique.
Ce phnomne traduit la mortalit des cellules dans la cuve de culture
(figures 26 30). Les deux souches de Nitrobacter ragissent de manire
quivalente l'influence des extraits aussi bien avec le sol qu'avec le
charbon actif comme support. L'effet litire n'est pas permanent. En effet
progressivement nous retrouvons le nombre initial de bactries contenu
dans l'effluent. Ainsi donc la mortalit mentionne ci-dessus n'est pas
due une croissance.
RENNIE (1978) remarque les mmes effets avec diffrentes souches de
Nitrobacter. Cet auteur note aprs l'incorporation au sol d'exudats ra-
cinaires ou de polyphenols tels les tanins, une baisse de 20 38 % du
nombre de bactries dans les soixante douze premires heures de l'exp-
rience. Une remonte de la quantit des bactries comptabilises inter-
vient aprs la 100e heure ; il a mme observ une stimulation de la crois-
sance aprs cette heure. RICE ET PANCHOLY (1972), LODHI, 1978 b) ont mon-
tr dans leurs que la prsence de composs antimicrobiens
(tels les acides chlorogniques, les polyphenols) entranent une rduction
de 68 93 % des germes nitrifiants par rapport au tmoin de la manipulation.
Aprs toutes ces constatations nous pouvons dire que Nitrobacter rsiste
bien la prsence de matire organique dans son milieu de culture.
La chute brutale de la concentration en ATP peut s'expliquer:
- par sa dissociation en ADP et AMP, afin de mettre la disposition de
la cellule le maximum d'nergie sa rgulation interne pour une meilleure
adaptation aux conditions du milieu. Ce phnomne entrane une diminution
de la charge en adenylate qui a pour consquence de stopper tous les sys-
tmes utilisateurs d'ATP et de favoriser sa rgnration;
- par la mortalit des cellules qui a entran un changement dans
la composition de la biomasse bactrienne. GUSTAFSON et al. (1983) ont
remarqu en prsence de toxiques une baisse allant jusqu' 50 % de la
concentration en ATP. Elle est le reflet d'une rduction du nombre total
des bactries viables
- par le changement dans l'activit de la biomasse prsente dans la
cuve de culture. Cette activit rduite au maximum permet la bactrie
de retirer juste l'nergie qu'il faut pour garder son intgrit.
ATP ...
Pg/ml
x 10
1
25
1
N- N02
fig/ml
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
6
2
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5
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Bacteries /'
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0.5
1,5
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6 12
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36 4'2 48721'<'0Heures
Fig. 26 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINUS MARI2'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER LB CULTIVE EN CHEHOSTAT
La temprature'd'incubation est de 28C; le pH du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par
La flche indique le moment du changement de milieu.
I.Q
.p-
I
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
3
6
4
:2
5
Bacteries
ATl'
N-NO
2
0----0
1lI------111 * *
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_________ - -0
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-0 6 l' 2 18 Ji 30 36 4' 2 41' '1'20 Heures
N- N02
yg/ml
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C>-- -0

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1
1
1
1
1
1 J
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.......'"
Q::,
t5
ATP
Pg/ml
x 10
3
2.5
Fig. 27 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINUS MARIl'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMBRE DE NITROBACTER CULTIVE EN CHEMOSTAT
La temprature d'incubation est de 28C; le plI du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par
La flche indique le momellt du changement de milieu.
ATP
Pg/ml
x 10
3

N- N02
f
g
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ml
Nombre de
bactries/ml
x 10
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Q5
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1 1 1 -, 1 1
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4' 2 4A 1'20 s
Fig. 28
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LI'rIERES DE PINUS MARI'PTMUS SUR LI ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NOMl3llli DE NlTROBACTER Ln CULTIVE EN CIIEMOSTAT
La temprature d'incubation est de 28C; le pH du milieu a ramen 7,6 ; la concentration en N-N0
2
dans le milieu tle rserve est 200 ug/ml. Les cOl!lptages bac.trie,ns ont t effectus par la mthode de ZU!HElUIAN
et az.. (1978)
La flche indique le moment du changement de milieu.
N- N02
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4
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1
Nombre de
bactries/ml
x 10
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3
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2
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48 72 120
Fig. 29 INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIERES DE PINlfS MARI2'IMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN ATP ET LE NmmRE DE NIT1WBACTER CULTIVE EN CHEHOSTAT
La temprature d'incubation est de 28C; le pH du milieu a t ramen 7,6 ; la concentration en N-N02
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par la mthode de
ZUlJvlERMAN et al. (1978)
La flche indique le moment du changement de milieu.
ATP
Pg/ml
x 10
3
N- N02
pg/ml
Nombre de
bactries/ml
x 10
6
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1 .....
36 42 48 7 2 ~ 0 Heures
Fig. 30
INFLUENCE DES EXTRAITS AQUEUX DES LITIElillS DE PINUS.MARITIMUS SUR L'ACTIVITE NITRIFIANTE, LA CONCENTRATION
EN A'l'P ET LE NOMBRE DE NITROI3ACTER I-J CULTIVE EN CIJEMOSTAT
La temp6rature d'incubation est de 28C; le pH du milieu ft t ramen 7,6 ; la concentration en N-NO
Z
dans le milieu de rserve est 200 ug/ml. Les comptages bactriens ont t effectus par la mthode de
ZUlHEflilAN et al. (J 978)
La flche indique le moment du changement de milieu.
- 98-
Aprs quelques heures d'accoutumance au nouveau milieu, la source d'-
nergie qui est toujours disponible dans le milieu est mieux utilise. Ce
phnomne entrane un surplus d'nergie dans la cellule qui est alors
stocke. A cet instant, la quantit en ADP et AMP diminue augmentant ainsi
la charge en adenylates et par consquent la concentration en ATP. Ceci
explique la remonte de cette dernire que nous observons dans l'effluent.
Les faits ci-dessus rejoignent l'affirmation de KARL (1980) "Lorsque les
cellules bactriennes sont maintenues sous des conditions environnementa-
les de stress (toxicit induite par des mtaux lourds, des matires orga-
niques, l'absence du nitriment essentiel ou des antibiotiques) et que la
source d'nergie est disponible dans le milieu pour la rgnration de
l'ATP, l'tat originel de sa concentration est restaur mme si les taux
d'utilisation et de biosynthse sont significativement altrs
ll

L'effet litire se traduit par une nette augmentation du N-NO


Z
rsi-
duel dans l'effluent. Elle est le reflet de la baisse du taux de nitrifi-
cation dans la cuve. Nous remarquons que cet effet est plus prononc sur
le sol. Nous pouvons relier ces faits :
- la baisse du nombre de bactries dans la cuve de culture. Nous
avons dmontr chapitre II que l'utilisation du nitrite est lie la
croissance bactrienne, par consquent au nombre de cellules prsentes
dans le milieu ;
- la diminution de l'activit des germes restants. Nous savons que
l'oxydation des nitrites pour la formation de la biomasse carbone demande
beaucoup d'nergie: 3 ATP pour 13 Moles de NO
Z
oxyds. Etant donn le
dficit en ATP cette fonction est momentanment bloque laissant ainsi
dans l'effluent un peu plus de N-NO
Z
;
- la prsence dans l'extrait de substances inhibitrices tels les
acides phnoliques, les tanins (polyphenols). LODHI et al. (1980) a donn
la composition des substances contenues dans les extraits aqueux des ai-
guilles de Pin et ayant un pouvoir inhibiteur (tableau 14).
Selon RICE et Pk1CHOLY (1974), LODHI (1977), l'acide chlorognique
a une forte action inhibitrice sur Nitrobacter. La prsence de cet acide
dans les extraits aqueux des aiguilles de Pin est considrer dans l'-
valuation du phnomne dTinhibition partielle que nous observons. Ainsi
malgr le fait que nous ayons ramen le pH du milieu 7,6 (valeur idale
pour la croissance, chapitre II), cet acide a une action. Il existe peut-
tre un phnomne de synergie avec les autres composs phnoliques tels
Tableau 14
- 99-
DES EXTRAITS AQUEUX DES AIGUILLES DE PIN EN
INHIBITRICES DE LA NITRIFICATION
(d'aprs LODHI et al., 1980)
Compos
Dtermination par chromatographie
liquide sur Wathman N 1
acide calcique
et caractrisation fluorescence par
acide ch1orognique
dans le bleu
quercitine
tanins (po1yphno1)
les tanins. RICE et al. (1973) ont dmontr que 8 ppm de ces derniers
inhibent totalement Nitrobacter. L'action inhibitrice de ces composs
rsulterait de leur capacit prcipiter les enzymes mibrobiens mais
aussi former des complexes avec le substrat mtabo1isab1e, le rendant
momentanment inaccessible la bactrie. Il faut cependant croire que
Nitrobacter a une grande rsistance face tous ces composs. En effet,
l'activit nitrifiante est restaure quelques heures aprs le temps d'ac-
coutumance au milieu. Ce phnomne a lieu ou concide avec le retour de
l'ATP son niveau compatible avec la reprise des fonctions biosynthti-
ques. THIBAULT et aZ. (1982) remarquent aussi que les processus de forma-
tion du N-N0
3
n'est jamais totalement affect par la prsence de substan-
ces antimicrobiennes provenant des feuilles de sapin.
Nous venons de que l'activit antimicrobienne des extraits aqueux
des litires varie en fonction de l'espce vgtale considre. Mais cette
activit inhibitrice n'est ni totale, ni permanente. Ceci laisse supposer
que dans la nature l'inhibition de la nitrification ne semble pas provenir
d'une perturbation du mtabolisme de Nitrobacter mais plutt de celle de
Nitrosomonas. Dans ce cas nous obtenons une limitation du processus d'oxy-
+ -
dation de NH
4
en N0
2
. Si cette premire tape dans la nitrification est
inhibe, la totalit du processus l'est effectivement.
CONCLUSION GENERALE
Au cours de ce travail, nous avons procd l'isolement d'une souche
de Nitrobacter partir d'un sol pH acide.
Les anticorps fluorescents correspondant cette souche ont t pr-
pars. La mthode de l'immunofluorescence sur lame nous a permis de la ca-
ractriser srologiquement par rapport une souche Nitrobacter Winogradskyi
ATCC 25391 comme rfrence. Aprs adsorption rciproque des srums
pour viter les ractions croises, les deux souches se sont rvles
diffrentes.
Cette diffrence srologique recouvre-t-elle des particularits physio-
logiques ? Pour rpondre cette question, la physiologie des deux souhes
a t compare. Elles se sont montres distinctes. En effet:
- dans les conditions de culture pure en milieu autotrophe, la souche
Nitrobacter Winogradskyi a une capacit de croissance plus leve
que la souche isole ;
la cintique d'utilisation du nitrite par Nitrobacter Winogradskyi
est plus rapide que celle de Nitrobacter LB ;
la souche LB dans des conditions de pH bas rsiste ce est
en accord avec son origine. Cependant les deux souches ont leur ma-
ximum de croissance et d'activit un pH lgrement alcalin. Ceci
pose le problme de ce dernier au niveau du micro site. En effet
si le pH du sol pris globalement est acide}dans les microsits il
peut tre plus lev et favoriser la survie du microorganisme ;
- leur capacit utiliser l'azote organique comme source d'nergie
est distincte. La souche LB s'est montre plus apte dans cette
fonction. Cette dernire est peut-tre l'une des plus importantes
dans la distribution des sites en condition de substrat limitant.
- 101-
Il semble bien que les diffrences srologiques recoupent des diff-
rences physiologiques. Ces deux souches occupent donc des niches cologiques
diffrentes.
si Nitrobacter Winogradskyi est le seul genre bactrien reconnu oxydant
le nitrite dans le sol, force est de constater qu'il existe en son sein une
grande diversit srologique. Cette dernire est corrobore par les travaux
de (1983), STMiLEY et (1981) qui ont reconnu sept sro-
groupes dans le genre Nitrobacter.
Pour complter ces rsultats, il serait intressant d'tudier la sta-
bilit de cette diversit :
- par une recherche des plasmides
- par la mthode d'lectrophorse bidimentionnelle. Cette mthode per-
met de rechercher les protines spcifiques chaque souche afin de
diminuer la ractivit immunologique de proche en proche induite par
l'emploi de bactries entires comme antigne dans l'obtention des
anticorps.
Nous avons employ la mthode d'immunofluorescence pour les comptages
bactriens de ce travail ; les anticorps sont longs obtenir, cependant
cette technique permet un de temps par rapport aux mthodes classiques
de et d'talement sur plaque. Les rsultats sont obtenus en 2 heures
au maximum au lieu de 15 jours au moins dans le cas du comptage
Haler cet avantage au niveau du temps et compte tenu de la diversit
que nous avons souligne ci-dessus, cette mthode n'est applicable que pour
l'tude autocologique. Pour qu'elle ait une porte gnrale, il faudrait
possder les anticorps de tous les srotypes rpertoris. De plus, elle a
le dsavantage d'tre globale.Elle est donc inutilisable dans les tudes
dans lesquelles il est ncessaire de connatre le nombre de bactries viables.
Sachant qu'il existe bien des bactries responsables de la nitrifica-
tion dans les sols tudis, il reste expliquer quels sont les facteurs
qui ralentissent ce phnomne, c'est dans ce sens que nous avons recherch
l'influence que peuvent exercer les produits de la dcomposition des li-
tires sur la nitrification. En consquence de quoi nous avons ralis
deux types d'expriences
- sur le terrain en disposant du matriel vgtal sur des parcelles
de 1m2. Nous avons montr que la nitrification dans les sols sous-
jacents des litires variait selon l'espce vgtale;
- 102 -
- la nitrification est nulle en priode automnale sous les litires
des deux Gramines : Agrostis setacea et MoZinia caeruZea. La
constitution de stock mesurable n'a lieu qu'au printemps;
- l'azote minralis sous les litires d'Erica ciZiaris compense
exactement l'assimilation par les microorganismes telluriques;
- la minralisation est stimule par les apports en azote assimilable
des produits de dcomposition des litires d'UZex europaeus ;
- le phnomne ci-dessus est identique sous les litires de BetuZa
pubescens. Elle cesse avec la disparition des litires donc de la
source en azote assimilable par les nitrifiants. Ceci montre la
dpendance de ces microorganismes vis--vis des appotts externes
- la nitrification sous les litires de pinus maritimus est faible
et n'a lieu que pendant la premire anne de dpt sur le terrain
- la libration de matire favorable la nitrification est visible
sous les litires de Quercus peduncuZata.
A la lumire de toutes ces expriences d'incubation, l'information la
plus importante qui se dgage est l'absence d'une volution brutale de la
nitrification aprs les apports de litires, l.es litires d'Erica ciZiaris
entranent un arrt dans la constitution de stock d'azote nitrique et ni-
treux mesurables. Toutes ces manipulations ne nous ayant pas donn d'in-
,
formation sur les bactries responsables de cette activit, nous avons
envisag une exprimentation au laboratoire avec les extraits aqueux de
trois espces vgtales.
Pour aborder le problme nous avons utilis un chmostat conu dans
le laboratoire. Aprs avoir surmont toutes les difficults de m ~ s e au
point, il nous a donn satisfaction. Nous avons pu/obtenir des cultures
avec une majorit de germes viables et un bon maintien des conditions de
strilit.
Ce dernier nous a perrns de r:J.ontrer sur des populations constantes de
nitrifiants dans le mme tat physiologique :
- que l'activit nitrifiante des germes n'est pas perturbe par la
prsence des extraits de litire d'UZex europaeus. Qu'elle baisse
si le milieu contient soit des extraits aqueux d'Erica ciZiaris,
soit de Pinus maritimus. L'action des composs contenus dans ces
- 103.-
extrai ts est de courte dure, les bactries devenant indiffrentes
leur prsence au bout de quelques heures d'adaptation;
- que le nombre de germes dans le milieu n'est pas influenc par des
extraits d'Ulex europaeus. Par contre une petite mortalit est
duite par les extraits aqueux des litires d'Erica ciliaris , ceux
de Pinus maritimus ayant une action plus prononce. Comme pour le
mtabolisme une priode d'accoutumance au niveau milieu annihile
tous ces effets
- que l'ATP cellulaire est trs sensible l'introduction des extraits
aqueux dans le milieu de culture. Elle indique le stress subi par
les nitrifiants en diminuant en proportion dans les cellules bactriennes.
Pour que ce travail avoir une porte plus gnrale il eut fallu
pouvoir disposer d'un plus grand nombre de souches. Mais les difficults
rencontres pour leur obtention et leur culture interdisaient cela dans le
cadre d'une thse de troisime cycle.
De mme il aurait t souhaitable de disposer d'analyses plus fines
quant aux composs des extraits des litires afin de raliser des expriences
globales.
Ce chmostat s'est avr tre un systme facilitant les observations
et les analyses tout en nous permettant de nous situer le plus prs possi-
ble des conditions naturelles. Son utilisation apparat ici comme une
1
technique originale dans ce genre d'approche colQgique.
Toutefois, nos rsultats montrent que Nitrobacter est indiffrente
aux composs contenus dans certaines plantes tel Ulex europaeus, ce qui
expliquerait la bonne nitrification enregistre sur le terrain, mais que
d'autres tels ceux d'Erica ciliaris et Pinus maritimus pourraient induire
une diminution du nombre de nitrifiants et par consquent les produits
mesurables de leur mtabolisme (NO
Z
N0
3
).
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Figure
Figure 5
Figure 2
Figure 3
Figure 4
LISTE DES FIGURES
Variations de la temprature moyenne (courbe, en OC) et de la
pluviosit (histogramme en mm) Paimpont (d'aprs ROZE et
FORGEARD, 1982)
Profil schmatique du sol de la lande tudie
Applications de l'immunofluorescence en microbiologie du sol
Modalit de la raction d'immunofluorescence (d'aprs GOLDMAN
~ n FAURE et al., 1977)
A) Immunofluorescence directe
Ag) antigne Ac) anticorps
B) Immunofluorescence indirecte
Ag) antigne ACl) premier anticorps non fluorescent
AC2) deuxime anticorps fluorescent
Schma d'un dispositif utilisant un illurninateur vertical pour
l'observation par fluorescence en lumire incidente
(d'aprs PLOEM, in FAURE et al., 1979)
Figure 6 :Schma du dispositif utilis pour les tudes en chmostat
Figure 7
Figure 8
Figure 9
Figure 10
Figure Il
Figure 12
Figure 13
Figure 14
Figure 15
Figure 16
Figure 17
Figure 18
Figure 19
Changement du taux de nitrification dans un chmostat contenant
Nitrobacter maintenu un taux de dilution de O,Ol
h
-l
Cintique de croissance de Nitrobacter en milieu liquide
Cintique d'utilisation des nitrites en milieu liquide par
Nitrobacter
Cintique d'utilisation du nitrite et volution du nombre de
Nitrobacter Winogradskyi en culture pure
Mcanisme de production d'nergie et de formation du pouvoir
rducteur au cours de l'oxydation de N0
2
en N0
3
par Nitro-
bacter (d'aprs ALEEN, 1968)
Effet de la temprature et du pH sur l'activit nitrifiante
de Nitrobacter
Influence du pH sur le nombre de Nitrobacter incub la
temprature de 28C
Cintique de croissance de Nitrobacter en condition
d'autotrophie et de mixotrophie sur souche NLB
Cintique de croissance de Nitrobacter en condition
d'autotrophie et de mixotrophie sur souche N.W
Croissance de Nitrobacter souche NLB en condition chimioorganotrophe
Evolution du nombre de bactries en fonction du temps dans les
conditions de mixotrophie et d'autotrophie
Influence des extraits aqueux des litires d'Ulex e u ~ o p a e u s sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Ulex e u ~ o p a e u s sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Figure 20
Figure 21
Figure 22
Figure 23
Figure 24
Figure 25
Figure 26
Figure 27
Figure 28
Figure 29
Figure 30
113 -
Influence des extraits aqueux des litires d'Ulex europaeus sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter Winogradskyi cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Ulex europaeus sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter Winogradskyi cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Erica ciliaris sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Erica ciliaris sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Erica ciliaris sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter :7 cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires d'Erica ciliaris sur
l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre de
Nitrobacter H cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires de Pinus maritimus
sur l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires de Pinus maritimus
sur l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter W cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires de Pinus maritimus
sur l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter LB cultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires de Pinus maritimus
sur l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter Wcultiv en chmostat
Influence des extraits aqueux des litires de Pinus maritimus
sur l'activit nitrifiante, la concentration en ATP et le nombre
de Nitrobacter Wcultiv en chmostat
influence
Tableau 1
Tableau Z
Tableau 3
Tableau 4
Tableau 5
Tableau 6
Tableau 7
Tableau 8
Tableau 9
Tableau 10
Tableau Il
Tableau 1Z
Tab leau 13
Tableau 14
....
LISTE DES TABLEAUX
Protocole d'injection des antigniques
Dtermination du titre par raction d'immunofluorescence indirecte
Titration des conjugus par irnmunofluorescence directe sur lames
et sur membranes
Caractrisation srologique des souches
Etude du taux de rcupration des bactries inocules dans un
sol ou dans du charbon actif
++
Influence des apports de Ca sur la nitrification dans le sol
de N-N0
3
+ N-NO
Z
en six semaines d'incubation
en 10-
3
% du de sol sec)
Influence des apports de Ca++ sur la quantit de NH4 minralis
en six semaines d'incubation (exprim en 10-3 % du poids de
sol sec)
Teneurs en N-N03 des sols de lande incub vitro
d'un apport de Ca++
Schma descriptif des manipulations effectues pour l'obtention
des extraits
Rcapitulatif des manipulations effectues sur les parties
aliquotes prleves dans l'effluent
Influence des apports de litires sur les teneurs en N-N03+
N-NOZ minralis en six semaines d'incubation (exprim en
10-3 % du poids de sol sec)
Influence des apports de litires sur les quantits de NH4
minralis en six semaines d'incubation (exprim en 10-
3
%
du poids de sol sec)
N03 + .NOZ
Taux de nitrification x 100
NH4 + N03 + NOZ
sous diffrentes litires in situ
Composition des extraits aqueux des aiguilles de Pin en subs-
tances inhibitrices de la nitrification (d'aprs LODHI et
al., 1980)
ANNEXES
DOSAGE DE L'ADENOSINE TRIPHOSPHATE PAR BIOLUMINESCENCE
Le dosage de l'ATP par bioluminescence est bas sur la mesure de la lumire mise
lors de l'interaction ATP avec la Luciferine-Luciferase et l'oxygne de l'air.
La quantit de photons mis est proportionnelle la concentration en ATP. Un seul
photon est mis par molcule d'ATP hydrolyse.
Le mcanisme de la raction de bioluminescence peut se rsumer par les ractions
chimiques de KARL et 1976 :
++
ATP + Luciferine + Luciferase __ Luciferase - Luciferine - + PrP
'f 'f . pH 7 L 'f L 'f' co
erase - - A} + O
2
) erase + oxy ee + 2 + +
hv
Le dosage de l'ATP par cette mthode ncessite une extraction pralable du
nucleotide intracellulaire.
De nombreuses mthodes d'extraction de l'ATP ont t proposes dans la littrature.
Pour tre valable, chacune d'elle doit rpondre aux critres suivants
- comporter un traitement nergique pour dtruire la paroi bactrienne. Ce traitement
doit permettre la mise en solution de l'ATP et le blocage des ATlases qui transforment
ATP en ADP.
- ne pas permettre la en solution de substances pouvant gner ou inhiber la
raction d'mission des photons pendant la mesure de l'ATP.
- permettre une grande stabilit long terme de l'ATP extrait.
Le temps et la temprature d'extraction ont une grande importance sur la quantit
d'ATP. Afin d'viter les pertes, il est ncessaire de contrler rigoureusement ces
facteurs.
Les principales mthodes d'extraction sont rsumes dans le tableau suivant.
L'extraction de l'ATP dans les sols et les sdiments pose des problmes. Vue la
structure physique de ces milieux, l'extraction est difficilement complte et s'ac-
compagne souvent d'une libration de cations et d'anions. Ces derniers inhibent
l'mission des photons pendant la lecture de l'ATP. C'est ainsi que pour valuer le
taux de rcupration LEE et al. (1971), JONES et SIMON (1977) ont-ils propos l'emploi
d'talons internes 8/7 de t bactriennes vivantes et de concentration en ATP connue.
Le pourcentage d'efficacit en ATP est obtenu par:
(ATP chantillon + ATP talon interne) - ATP chantillon
% de rcupration de l' ATP = '---------.------------:-=,.....-::;----=-------,------------'---------------------
ATP talon interne
PROCEDES D'EXTRACTION DE L'ATP
Mthode
d'extraction
DMSO
ATCA
APC
H
2
S0
4
Ethanol
Volume de
l' chanti Hon
(ml)
0, 1
2
Composition
du milieu
d'extraction
0,9 ml DMSO
13,9 mol/l
1 ml CCl
3
COOH
0,5 mol/l
1 ml HC10
4
1,2 mol/l
1 ml H
2
S04
0,6 mol/l
5 ml Ethanol
96 %
Temprature
(OC)
20
o
o

78
Traitement aprs introduction de l'chantillon
Vortex (15 s), repos 2 mn, addition de 5 ml de Mops
Repos dans un bain de glace (15 mu). Extraction de l'ATCA l'ther
diethylique 5 x 10 ml ; vaporation sous vide de l'ther; addition de
8 ml de Tris-EDTA
Vortex 10 s, extraction avec 8 ml de n-octanol, vortex 10 s, centrifuga-
tion 0,72 mol/I-KC03 0,16 mol/l. Elimination du KCI0
4
par centrifugation
10 mn 2000 g + 4C. Dilution 10-
1
avec Tris EDTA
Repos dans un bain de glace (15 mn), neutralisation avec KOH 0,6 mol/l,
amener pH 7,8, complter 10 ml avec de l'eau distille. Diluer
10-
1
avec Tris-EDTA l'emploi
Bain marie bouillant (5 mn), vaporation sous courant d'azote, reprise
du rsidu sec par 5 ml de Mops
Tris
Tris-MgS0
4
9 m Tris
20 m mol/l
+ EDTA 2 m mol/l
pH 7,75
4 ml Tris
35 m mol/l
+ MgS0
4
16 m
mol/1 pH 7,6
100
110
Bain marie bouillant (5 mn)
Bain marie bouillant (5 mn)
Luciferase - Luciferine - A}W - PrP
METHODE DE LECTURE DE L'ATP
La lecture de l'ATP est base sur la raction de bioluminescence.
++
ATP + Luciferine + Luciferase ~ / M ~ g ~ __~
" )
Luciferase - Luciferine - A}W + O
2
pH 7, Luciferase + Luciferine oxyde + CO
2
+ AJ.'1P
hv
Prparation de la Luciferine
Dissoudre 10 mg de D-Luciferine (sigma LTd)
dans 6 ml de tampon tris 0,02 M/l pH 7,8 ajust avec H
2
S0
4
dilu
Rpartir sous atmosphre d'azote dans 6 ampoules raison d'r ml/ampoule
soit une concentration de 1,66 mg de Luciferine dans chaque ampoule
Stocker -20C jusqu' utilisation.
Prparation de la Luciferase
Dissoudre 50 mg de Luciferase (sigma Ltd)
3 ml de srum albumine bovine 0,3 %
dans 9 ml de mlange
6 ml (EDTA 1,5 ~ ~ , MgS0
4
15mM)
Ajuster le pH 7,5 avec du KOH dilu
Prparation du ractif Luciferine - Luciferase
Mlanger ml de Luciferine
9 ml de Luciferase
Conserver le mlange 4C pendant une nuit
Centrifuger ensuite 18 000 g pendant 10 mn
Equilibrer le mlange pendant 1 h dans le noir, avant emploi, temprature ambiante.
Prparation des solutions Etalons d'ATP
Dissoudre mg d'ATP (sigma)
dans 10 ml d'eau distille dionise et strile
c;OURBE ETALON DE
L'ATP
Prparer les
solutions
suivantes
Solution Mo
Dissoudre
Img d'ATP
dans
10 ml
d'Fi
2
0 strile
soit
Une
solution

100 ug/ml
Solution
Ml
Diluer
0, 1
ml
de
la solution
Mo dans
3
ml
de
tampon tris
0,02 H
soit
une solution

3,2258 ug/ml
Solution
M
2
Diluer
0, 1
ml
de
la solution
Hl
dans
3
ml
de
tampon
tris
0,02
M
soit
une sOlution

0,104058 ug/ml
Solution
M
3
Diluer
3
ml
de
la solution
M
2
dans
9
ml
de
tampon tris
0,02
M
soit
Une
solution

0,0260145 Ug/ml
Solution
M
4
Diluer
ml
de
la solution
M
3
dans
7,
ml
de
tampon tris
0,02
M
soit
une
solution

0,00325
ug/ml
Pour raliser
la Courbe prendre
Sol M
4
dans
soit
soit
Vml
Tml
V
t
ml
(
)266
ul
0,092
1,5
1,592
49,95 0,197
1,5
1,697
100,35
0,453
1,5
1,953
200,52
0,800
1,5
2,300
300,69
Sol
M
3
dans
soit
soit
Vml
Tml
V
t
ml
(
)266
ul
0,100
1,5
1,600
432,49
0,200
1,5
1,700
814,10
0,275
1,5
1,775
10
72,09
0,450
1,5
1> 950
1596,89
0,650
1> 5
2> 150
2092,05
0,850
1>5 2,350
2502,93
,
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
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j
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j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
J
..
/
Joseph Gama Tchimbakala : Nitrification autotrophe dans un sol acide de
lande. Etude en milieu renouvel de l'effet litire sur des populations
de Nitrob.;:tcter.
Thse 3e ycle. IIBp. Universit de Rennes I.
RESUME
Cette thse est une tude du phnomne de nitrification
autotrophe dans un sol acide de lande. De ce der'nier. nous avons isol
l
i
.1
f;..,
une souche de Nitrobacter. Nous avons montr. par la mthode d'irnrnunofluo-
rescence. qu'elle est diffrente du srotype Nitrobacter Winogradskyi.
Cette diversit srotypique. au. sein de la seule espce reconnue dans le
genre Nitrobacter. pose le problme de l'existence de populations diff-
,
rentes et de leur cologie dans l'habitat naturel.
Pour tenter de comprendre le comportement cologique. nous avons
dfini la physiologie de chaque souche. En l'acti- ,
vit nitrifiante et la croissance de Nitrobacter Winogradskyi sont sup-
rieures. alors que la rsistance aux bas pH et la en tonditions
chimioorganotrophes sont meilleures pour la souche Nitrobacter isole.
Nous avons au point un systme de milieu renouvel afiri
l'effet litire au laboratoire car dans la nature les conditions d'auto-
trophie sont rarement ralises.
Les rsultats obtenu? montrent que la faible nitrific,ation s'ous les
Ericaces et les Conifres est due une baisse d'activit et la faible
densit, des nitrifiants.
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Mots-cls Nitrification - Isolement - Nitrobacter - Irnrnunoflorescen
Sy'stme milieu renouvel (chmostat) - Effet litire.
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