La transmisin de la hepatitis C por inoculacin intraheptica con ARN transcrito

1. 2. 3. 4. 5. 6. Alexander Kolykhalov A. , Eugene V. Agapov , Keril J. Tizn , Kathleen Mihalik , Stephen M. Feinstone y Charles M. arroz * +Afiliaciones de los autores 1. Kolykhalov AA, Agapov EV, Tizn KJ, arroz CM, Departamento de Microbiologa Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, 660 South Euclid Avenue, St. Louis, MO 63110-1093, EE.UU. 2. Mihalik K. y Feinstone SM de la Divisin de Virologa del Centro de Evaluacin e Investigacin de Productos Biolgicos, Administracin de Alimentos y Medicamentos, Bethesda, MD 20892, EE.UU. RESUMEN Ms del 1% de la poblacin mundial est crnicamente infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC).infeccin por el VHC puede dar lugar a hepatitis aguda, hepatitis crnica y cirrosis, que est fuertemente asociado con el desarrollo del carcinoma hepatocelular. Los estudios genticos de replicacin del VHC se han visto obstaculizados por la falta de un autntico clon molecular infecciosas. clones completas funcionales de ADN complementarias se construyeron VHC. transcripciones de ARN de los clones resultaron ser infecciosas y de enfermedades en los chimpancs despus de la inoculacin intraheptica directa. Este trabajo define la estructura funcional de un genoma de ARN del VHC y demuestra que el VHC es suficiente para causar la enfermedad. En 1989, el VHC, el agente viral que se cree responsable de la mayora postransfusional no-A, hepatitis B, no, fue clonado molecularmente ( 1 ). El VHC es un virus ARN envuelto positivos clasificados en la familia Flaviviridae ( 2 ). Caracterizacin del genoma del VHC organizacin y de expresin ha progresado rpidamente desde su descubrimiento ( 3 ). El genoma del ARN del VHC es de ~ 9,6 kb y consta de una regin 5 'no traducida (NTR) que funciona como una entrada del sitio del ribosoma interno, un marco abierto de lectura de largo (ORF) que codifica una poliprotena de> 3000 aminocidos, y un 3' NTR . El genoma de ARN fue pensado originalmente para terminar con poliadenilato [poli (A)] o polyuridylate [poli (U)] extensiones, pero estudios recientes han revelado la presencia de un interno de poli (U) / polipirimidina [poli (U / UC)] las vas seguidas por un 98 conserva a base de secuencia altamente ( 4 , 5 ). La poliprotena del VHC es procesado por la peptidasa seal de acogida y dos proteasas virales para producir por lo menos 10 diferentes estructurales y no estructurales (NS) (Fig. 1 ). Propiedades de muchas de las enzimas de replicacin codificados-VHC, tales como la serina proteasa, helicasa de ARN, la polimerasa y han comenzado a surgir en el marco de los intensos esfuerzos para desarrollar tratamientos ms eficaces para el VHC nuevos portadores infectados crnicamente.Estos esfuerzos se han visto obstaculizados, sin embargo, por la replicacin pobres en el cultivo

celular, el rango de hospedadores limitada del virus (el chimpanc, Pan troglodytes , es el nico husped conocido no humanos), y la falta de un clon infeccioso moleculares para el anlisis gentico del VHC funciones.

Ver una versin ms grande: y En esta pgina

y

En una nueva ventana Descargar diapositiva de PowerPoint para la enseanza

Figura 1 Caractersticas de la longitud consenso clon derivados total de 10 pruebas en los chimpancs. ( Arriba ) Esquema del VHC H77 consenso ADNc del ARN. El 5 'y 3' ZRSEs (lneas continuas) y el consenso ORF (caja abierta) se indican con la ubicacin aproximada de la divisin productos poliprotena se muestra a continuacin. ( Abajo ) El 10 transcripciones de ARN utiliza para la inoculacin de chimpancs son diagrama.Adicional 5 'y 75 nucletidos base de comparacin 133-base de poli (U / UC) tractos se indican. Todos los clones y las transcripciones incluye dos sustituciones de nucletidos en silencio: la posicin 899 (C en lugar de U, asteriscos), la posicin 5936 (C en lugar de A, crculos abiertos) (posiciones de nucletidos que se refieren a la secuencia de H VHC). La sustitucin en la posicin 5936 inactivada un Bsm internos que el sitio en la secuencia del cDNA H77 para que un sitio Bsm de ingeniera que podra ser utilizado para la produccin de la escorrenta de las transcripciones de ARN con la exacta 3 'del genoma de ARN del VHC ( 15 ). Los clones con otros 5 'bases contena una mutacin que inactive el marcador en silencio me Xho sitio en la posicin 514 (tringulos slidos). Los clones con 75 bases versus 133-base de poli (U / UC) tractos se distinguan por A (crculos slidos) en comparacin con G en la posicin 8054, respectivamente. Los 10 derivados fueron creados por los mtodos de ADN recombinante y sus estructuras fueron verificados por la digestin de restriccin y anlisis de la secuencia. Problemas con la construccin de un clon de ADNc VHC funcionales incluyen los altamente variable "cuasi-especies" la naturaleza de este virus de ARN, las pequeas cantidades de ARN viral presente en muestras clnicas, que requieren en la amplificacin in vitro antes de la clonacin, y la falta de un simple y verificado transfeccin ensayo de infectividad. Como material de partida, se utiliz el suero obtenido de un paciente en la fase temprana de la infeccin (designado H77) ( 6 ). Esta especfica de infecciosidad sricos elevados contiene ~ 10 8 molculas de ARN y ~ 10 6.5 dosis infecciosa chimpanc por mililitro. Una biblioteca combinatoria con una complejidad de> 10 5 longitud ADNc del

VHC-completo fue construido por la fidelidad de montaje de alta inversa-reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin (RT-PCR) seguida de subclonacin en un recipiente que contiene el plsmido vector 5 'y 3' terminal de VHC secuencias consenso ( 7 ). Un acompaamiento T7 promotor y un sitio de restriccin especfica de ingeniera permiti la produccin de la escorrenta de las transcripciones de ARN; 233 de los clones fueron preseleccionadas mediante anlisis de restriccin, el procesamiento poliprotena, y la produccin de la terminal NS5B protena-COOH (el dependiente de la ARN polimerasa de ARN del VHC). En un experimento fallido, ARN transcrito a partir de 34 clones que pasaron estos anlisis fueron analizadas para la infectividad por inyeccin intraheptica directa en dos ingenuo chimpancs-VHC ( 8 ). Como control negativo, un tercer animal recibieron inyecciones de este tipo con las transcripciones de un clon que contiene un amino cido 20-marco que abarca la eliminacin de la polimerasa NS5B sitio activo. Las muestras de suero fueron recolectadas durante 2 meses despus de la inoculacin y se analiz la evidencia de la replicacin del VHC. Ni el animal de experimentacin ni la de los animales control negativo exhibido signos de infeccin productiva (que circula el ARN del VHC, el aumento de las enzimas hepticas, histopatologa, o seroconversin) ( 9 ). Destaca la ausencia de ARN del VHC detectable circulan dos das despus de la inoculacin. Falta secuencias terminales, baja eficiencia de transfeccin de ARN in vivo, y los errores introducidos durante la sntesis de DNA o amplificacin por PCR podra explicar estos resultados negativos. Debido a la preocupacin de este ltimo se dirigi rpidamente, secuenciado seis clones de la biblioteca combinatoria, as como uncloned RT-PCR los productos, para determinar una secuencia consenso para el aislamiento H77 ( 10 ). A partir de este anlisis, se hizo evidente que cada uno de los seis clones secuenciados figuran numerosos consenso secuencia de cambios-no esparcidos por todo el genoma, lo que podra ser perjudicial y podra explicar los resultados negativos. Se utiliz esta informacin para dirigir el montaje de un clon de longitud completa que refleja la secuencia de consenso H77 ( 11 ). Aparte de los cambios espordicos corregido en este clon de consenso, una mayor heterogeneidad de la secuencia, incluso se observ en tres regiones del genoma del VHC. Durante el anlisis del extremo 5 ', encontramos un gran nmero de clones que contenan una o ms bases, adems de los 5'-terminal de la secuencia reportada (5'-GCCAG ... -3') ( 12 ). En la regin de codificacin de protenas estructurales, el NH 2 -terminal de la glicoprotena E2 sobre virin fue muy variable, pero una secuencia predominante fue identificado ( 13 ). Cerca de 3 ', el poli (U / CU) del tracto fue variable en longitud y la composicin ( 14 ). Debido a que estas diferencias podran ser funcionalmente importantes, las variantes del clon consenso con bases adicionales en el extremo 5 'y dos) tramos de poli (U / UC se construyeron diferentes (Fig. 1 ). sustituciones de nucletidos Silencio fueron diseados como marcadores para que el virus de recuperacin de animales transfectadas podra ser secuenciado para identificar los clones infecciosos. De cada uno de los 10 clones, de longitud sin tope salarial total ARN se transcribe a partir de ADN plantilla lineal ( 15 ) y se utiliza para la inoculacin de dos chimpancs que fueron seronegativos para todos los virus de la hepatitis conocidos, fueron negativos para el ARN del VHC por RT-PCR, y haba de referencia cantidades normales de enzimas hepticas. Los animales fueron inoculados por intraheptica inyeccin directa en mltiples sitios ( 16 ). Las muestras de suero y biopsias de hgado fueron tomadas antes de la inoculacin y en intervalos de una semana despus. Durante 3 meses despus de la inoculacin, las muestras de suero fueron analizadas para las enzimas del hgado, los anticuerpos de VHC y viremia, segn la evaluacin de la cuantificacin del ARN del VHC

que circulan por ADN ramificado (bDNA) y cuantitativos a la competencia (CC) RT-PCR ( 5 ). Chimpanc 1535 haban aumentado las concentraciones de alanina aminotransferasa (ALT), que es un marcador de dao heptico, en la semana 2 despus de la inoculacin; ALT disminuy gradualmente a la cantidad de referencia preinoculacion y luego volvi a aumentar en las semanas 10 a 12 (Fig. 2 A) . Los ttulos de VHC ARN indetectable antes de la inoculacin, el aumento a 0,45 Meq / ml en la semana 1, disminuy ligeramente en la semana 2 (0,28 Meq / ml), y luego sigui subiendo de manera constante, alcanzando 8,3 Meq / ml en la semana 13. Este animal se convirti claramente seropositivos VHC en la semana 13 (Fig. 2 C) ( 17 ).Chimpanc 1536 no mostr evidencia de dao heptico precoz (Fig. 2 B). En la semana 10, las concentraciones de ALT aument considerablemente y alcanz su punto mximo en la semana 12, disminuyendo rpidamente a partir de entonces. En la semana 1, el ARN del VHC era indetectable ttulo por bDNA (lmite de deteccin, 0,2 meq / ml o ~ 2 10 5 molculas de ARN por mililitro), pero 10 4 molculas de ARN por mililitro de control de calidad se mide por RT-PCR. El ARN circulante del VHC ttulo alcanz su punto mximo en la semana 10 (5,8 Meq / ml) y luego se neg a cantidades indetectables por bDNA en la semana 13. Chimpanc 1536 haba sufrido una seroconversin en la semana 10 (Fig. 2 C). cambios histolgicos en las biopsias de hgado fueron tpicos de la hepatitis C en los chimpancs ( 18 ) y se caracteriza principalmente por la inflamacin portal y necrosis focal. alteraciones del hepatocito incluidos los hepatocitos multinucleados, la agrupacin citoplasmtica y vacuolizacin probablemente representan gotas de grasa ( 9 ). La gravedad de las lesiones histolgicas aparecieron generalmente en paralelo a la elevacin de la ALT. Estos perfiles son sorprendentemente patogenia recuerda a los obtenidos en los chimpancs inoculados con el material H77 infecciosas o de otro tipo que contienen las muestras-VHC ( 19 ).

Ver una versin ms grande: y En esta pgina En una nueva ventana Descargar diapositiva de PowerPoint para la enseanza
y

Figura 2 , La hepatitis, y la respuesta serolgica viremia en los chimpancs inoculados con ARN transcrito. Antes y despus de la inoculacin, los animales fueron controlados semanalmente por la cantidad de circulante del VHC ARN, las transaminasas hepticas, y anticuerpos especficos contra el VHC. ARN y la enzima del hgado de datos se muestran para los chimpancs 1535 ( A ) y 1536 ( B ). RNA fue cuantificada por el ensayo bDNA (Chiron Corp.) y se reporta como equivalentes mega de ARN por mililitro (mEq / ml) (lmite de deteccin es 0,2 meq / ml). Enzimas hepticas medida suero de alanina

aminotransferasa incluido (ALT) (indicado en UI / litro) y -glutamil transferasa (GGT) (UI / litro). Normales de ALT y la concentracin de GGT rango de 18 a 45 y de 0 a 60 UI /, respectivamente litro. ( C ) VHC-especfica respuestas serolgicas (+) fueron detectados por inmunoensayo enzimtico comercial (EIA) y el ensayo de inmunoblot recombinante (RIBA) ( 17 ), as como por la precipitacin inmune de metablicamente etiquetados antgenos del VHC ( 23 ). EIA-Slo las muestras positivas fueron analizadas por RIBA (ND, no determinado). Para los anlisis de la inmunoprecipitacin, marcado radiactivamente antgenos del VHC se produce por la infeccin de clulas BHK-21 con una vacuna recombinante que expresa toda la poliprotena del VHC H77 consenso (vvHCV 13011con) [( 9 ), vase tambin ( 23 )]. Las clulas fueron lisadas en TNA [0,5% Triton X100, 200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mg de albmina srica bovina por mililitro, y 20 mg de fluoruro fenilmetilsulfonilo por mililitro] , aclar, y se incubaron con 2,5 l de suero de chimpanc seguido de 3 l de anticuerpos de conejo a la inmunoglobulina humana. Immunoprecipitates se recoge, se lava, y separados por electroforesis en un 12% en gel de poliacrilamida-SDS. VHC NS3 estuvo presente en el 70kD especies immunoprecipitated por los sueros de chimpancs (flecha) como se muestra en la solubilizacin de la immunoprecipitates (en 2% SDS, 1% de 2-mercaptoetanol, y 20 mM DTT, y la calefaccin a 80 C durante 20 min ), dilucin de las protenas eluye con 20 volmenes de TNA, y reprecipitacin con un especfico de antisuero policlonal de conejo NS3 del VHC ( 9 , 23 ). Para demostrar que las seales detectadas en el bDNA y RT-PCR ensayos de control de calidad no se deben a la plantilla de ADN residual de las reacciones de transcripcin, se analizaron todas las muestras por PCR sin transcripcin inversa. Ningn producto se obtuvieron, lo que demuestra que las seales se detectaron por VHC ARN (Fig. 3 A). Si el ARN del VHC en el suero se detect el virus de replicarse, ARN debe ser envasada en viriones envueltos y resistente a la degradacin por la ribonucleasa (RNasa), mientras que la transcripcin de RNA residual debe ser sensible a la RNasa. De hecho, el ARN del VHC en muestras de suero de chimpanc era resistente a la digestin RNasa en condiciones completamente degradados exceso de desnudos competidor ARN (Fig. 3 B). Por otra parte, no hubo correlacin entre el nivel de viremia aparente y la cantidad de ARN inoculados. El importe total de la transcripcin de ARN utiliza para la inoculacin de chimpancs fue 1535 ~ 3000 g pero no fue hasta ~ 22 mg de chimpanc 1536. A pesar de esta diferencia de 150 veces ~, los mismos niveles de viremia se observaron (Fig. 2 ). Por ltimo, en dos experimentos con animales anterior (un total de seis animales), que circula especfica de cido nucleico-VHC no se ha detectado, incluso a los 2 das despus de la inoculacin ( 9 ). Estos experimentos sugieren que circulan ARN fue el resultado de la replicacin del virus en lugar de autntica liberacin de cido nucleico inoculados.

Ver una versin ms grande: y En esta pgina

y En una nueva ventana Descargar diapositiva de PowerPoint para la enseanza

Figura 3 Circulantes de cido nucleico es ARN del VHC y es resistente a la RNasa.( A ) Las muestras de suero de los animales inoculados no contienen ADN molde prrroga. El anlisis que se muestra es para los chimpancs 1535, que recibi la mayor cantidad de inoculados ARN del VHC y donde el DNA de la plantilla no ha sido degradado por la digestin con DNasa I ( 16 ). Duplicar las muestras de ARN (de 10 l de suero) de la semana indicada despus de la inoculacin sin (carril 1) o con la competencia de ARN (CRNA) (10 2 molculas en las calles 2 y 7, 10 3 molculas en los carriles de 8 a 14) fueron amplificados por RT-PCR con (+) o sin (-) enzima en la etapa de RT ( 5 ). El cRNA, que contiene una base de supresin de 29 internos, se ha aadido a 1 / 10 a 1 / 30, el determinado previamente las concentraciones de cido nucleico del VHC para servir como RT-PCR de control interno. Una porcin igual de cada mezcla de reaccin se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida 6% y las bandas se visualizaron por tincin con bromuro de etidio. En la exposicin se muestra, una banda dbil correspondiente al producto cRNA se puede ver en algunas calles (como la calle 8). N especfica banda de PCR se detect en la ausencia de la sntesis de DNA, lo que indica que el cido nucleico de la seal especfica de VHC se deba al ARN. ( B ) circulante del VHC ARN de animales inoculados est protegida contra los RNasa. La muestra analizada fue de 6 semanas de suero de chimpanc 1536, que tena un ttulo de ARN del VHC, de 6 10 6 molculas por mililitro de control de calidad de RT-PCR. Extrae muestras de ARN fueron sometidos a RT-PCR ( 5 ) y una porcin igual de cada mezcla de reaccin se separan por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6%.Carril 1, 10 l de suero (que contiene ~ 6 10 4 molculas de ARN del VHC) se mezcl con el exceso de cRNA (3 10 5 molculas), digerido con 0.5 g de RNasa A por 15 min a temperatura ambiente, y se extrae con RNAzol. Carril 2, 10 l de suero se extrajo por primera vez con RNAzol y luego se mezcla con 3 10 5 molculas de cRNA. Carril 3, 10 l de suero sin adicin de cRNA se predigeridas con RNasa A y se extrae con RNAzol. Carril 4, el control negativo de RT-PCR. Los productos de RT-PCR correspondiente al VHC genmico y cRNA se indican. En la calle 2, la intensidad relativa de los productos y cRNA genmica refleja los cerca de cinco veces la diferencia en las cantidades molares de estos RNAs de esta reaccin de RT-PCR competitivo. La banda

adicional de mayor masa molecular aparente representa un heterodplex de la cRNA PCR productos y genmica, ver ( 5 ). enzima de restriccin de la digestin y anlisis de secuencias de ARN viral recuperado revel la presencia de marcadores de ingeniera, demostrando que estas infecciones se deriv de la transcripcin de ARN inoculados.Dos mutaciones silenciosas en la posicin 899 (C en lugar de T) y en la posicin 5936 (C en lugar de A, que la ablacin Bsm internos que el sitio en la posicin 5934), marcados todos los ARNs transfectadas (Fig. 1 ). Para los nucletidos (nt) 899 marcador, la regin entre 466 y nt nt 950 fue amplificado por RT-PCR, secuenciados directamente, y se encontr que la espera H77 secuencia consenso, excepto para el marcador C ingeniera en NT 899 ( 9 ). La regin de nt 5801 a 6257 tambin fue amplificado por RT-PCR y se encontr que era resistente a la digestin con Bsm I, pero no con otros cuatro enzimas sabe que unir en esa regin ( 9 ). Estos anlisis se llevaron a cabo tanto para los chimpancs 1535 (semana 5) y el chimpanc 1536 (semana 6). Adicional marcadores silencio fueron analizadas para identificar la secuencia 5'-terminal (s) y la longitud (s) de poli (U / UC) las vas necesarias o preferido para iniciar la infeccin ( 20 , 21 ). Aunque no es posible sacar conclusiones firmes acerca de las diferencias cuantitativas en la infectividad especficos, los resultados demostraron claramente que las transcripciones de ARN sin ningn tipo de adicional de 5 'nucletidos fueron infecciosas ( 20 ). Transcripciones con otros 5 'nucletidos tambin podra iniciar la infeccin, aunque nuestro anlisis no permiten distinguir entre los diversos derivados prueba (fig. 1 ). Las transcripciones que contienen las 75 de la base o el 133-base (U / UC) fueron tratados poli infecciosas, pero los 133 de la base de poli (U / UC) las vas se prefiere ( 21 ). La demostracin de que el ARN transcrito a partir de DNA clonado del VHC puede iniciar la infeccin y causar la hepatitis en chimpancs transfectadas proporciona una prueba formal ( 22 ) que el VHC es el agente causal de esta enfermedad. Con este modelo, la infeccin por el VHC puede ahora ponerse en marcha a partir de derivados de clones para facilitar los estudios sobre la evolucin del virus, patogenia y respuesta inmune de acogida pertinentes a la comprensin de los factores que determinan la eliminacin del virus en comparacin con infeccin crnica. Nuestros experimentos tambin definir los elementos funcionales del genoma de ARN del VHC. Aparte de un genoma secuencia consenso, no hay otros 5 'secuencias fueron requeridos para la infectividad y 3' poli (U / UC) tramos de longitud variable se toleraban. Infecciosa del VHC ARN ahora se pueden producir en cantidades ilimitadas y se utiliza para identificar y optimizar los sistemas de cultivo de replicacin de las clulas y para comenzar los anlisis genticos de replicacin del VHC in vivo e in vitro. * A quin debe dirigirse la correspondencia. Recibido para su publicacin el 16 de abril 1997. Aceptado para su publicacin el 19 de junio 1997. REFERENCIAS Y NOTAS 1. 1. Q.-L. Choo 2. et al. , Ciencia 244 , 359 ( 1989 ). Resumen / GRATIS Texto completo 2.

y y y

Arroz CM, en Virologa Campos , Campos BN, Knipe DM, PM Howley, Eds. (Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 1996), vol. 1, pp 931-960. 3. M. Houghton, ibid. , pp 1035-1058; ME Mayor y Feinstone SM, Hepatologa 25 , 527 (1997), Reed KE y arroz CM, en la hepatitis C virus , HW Reesink, Ed. (Karger, Basilea, Suiza, 1997), vol. 61, en prensa. 4. Tanaka, T., N. Kato, M.-J. Cho, K. Shimotohno, Biochem. Biophys. Res. Com. 215 , 744 (1995); T.Tanaka , N. Kato , M.J. Cho , K. Sugiyama , K. Shimotohno , J. Virol. 70 , 3307 ( 1996 ); N. Yamada et al Virologa., 223 , 255 (1996). Resumen / GRATIS Texto completo 5. 1. AA Kolykhalov , 2. SM Feinstone , 3. CM Arroz , J. Virol. 70 , 3363 ( 1996 ). Resumen / GRATIS Texto completo 6. HJ Alter, Purcell, RH, Holanda PV, H. Popper, The Lancet i , 459 (1978); Feinstone S. et al Infect., J..Dis. 144 , 588 (1981); YK Shimizu , RH Purcell , H. Yoshikura , Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 90 ,6037 ( 1.993 ). Resumen / GRATIS Texto completo 7. Se seleccionaron 41 pares de primers VHC y que se encuentran 11 sistemas tiles para amplificar la superposicin 1 - a 4 kb porciones del genoma de ARN H77 [AA Kolykhalov, Reed KE, CM Rice, en la hepatitis C Protocolos , Jyn Lau, Ed. (Humana Press, Totowa, New Jersey), en prensa]. Una mezcla de enzimas termoestables se utiliz para reducir la frecuencia de errores y aumentar la sntesis de productos de longitud completa [WM Barnes, Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 91 , 2216 (1994); KS Lundberg et al. , Gene 108 , 1 ( 1991 )]. Con rondas de PCR secuencial de montaje, y un nmero limitado de ciclos de amplificacin, los productos intermedios de PCR se combinaron para producir casi de cuerpo entero ADNc del VHC (nt 39-9352), que fue clonado como Kpn I (580)-No yo (9219 ) fragmento en un recipiente plsmido. Este plsmido contiene el promotor T7, el consenso VHC-H-5'-terminal y secuencias 3 '5' a la que Kpn sitio y 3 'del sitio que no, y un sitio de restriccin especfica para la linearizacin de plantilla y produccin de escorrenta ARN transcripciones. CrossRefMedlineWeb of Science 8. Diecisiete clones fueron inyectados por animal esencialmente por los mismos procedimientos, los cuales fueron finalmente con xito ( 16 ). inoculacin

intraheptica con ARN ha sido utilizado con xito para iniciar la infeccin por dos virus ARN de cadena positiva: virus de hepatitis A [SU Emerson . et al, J. Virol. 66 , 6649 (1992)] y la enfermedad hemorrgica del conejo virus [ VF Ohlinger , B . Haas , G. Meyer, F. Weiland , H.-J. Thiel , ibid 64 , 3331 ( 1990 )]. 9. AA Kolykhalov et al. , datos no publicados. 10. Como se inform en otro lugar (AA Kolykhalov y arroz CM, en preparacin), el VHC H77 secuencia de consenso (nmero de acceso GenBank AF009606 ) fue determinada por la secuencia de seis clones de la coleccin combinatoria H77 (clones 12, 209, 211, 213, 227 , y 248) ( 7 ), y determinadas regiones amplificadas por RTPCR. 11. Fragmentos producidos por la digestin de la restriccin de los clones secuenciados ( 10 ) se utilizaron para montar una longitud consenso clon completo de los mtodos estndar. Que se derivan de las siguientes regiones y los clones (entre parntesis): nt 580-1.045 (213); 1,046 hasta 1173 (248); 1174 a 1356 (12); 1357 hasta 1481 (209); 1,482 a 1,747 (227); 1748-1907 (209); 1.908 a 2.107 (227); 2,108 hasta 2,321 (12); 2322-2439 [VHC-H prototipo, como se describe en ( 23 )], desde 2440 hasta 2525 (213) 2526-2827 (VHC prototipo-H), 2828-2977 (211); 2.978-3235 (209); 3.236 a 3477 (227); 3478 a 3732 (209); 3.733-3.941 (12); 3.942 hasta 4.068 (211) 4069-4544 (227); 4545 a 4,645 (248) 4646-4975 (211); 4,976 a 5,609 (227) 5610-5749 (209); 5750 hasta 6208 (H-prototipo VHC); 6209 hasta 6301 (213), 6302 -7528 (227); 7,529 a 7,860 (213); 7861 hasta 8.204 (209); 8205 a 9219 (213). 12. Tanto la ciclacin de cDNA y PCR inversa y cDNA ligadura de oligonucletidos (5 'amplificacin rpida de extremos de cDNA) mtodos se utilizaron para determinar la secuencia 5'-terminal de VHC ARN de ttulo-H77 de alta del plasma ( 10 ). La secuencia predominante, 5'-GCCAGCC ... -3 ', era idntica a la fijada para la mayora de cepas del VHC. Con menos frecuencia, los clones con otros 5 'bases (incluyendo G, U, A, AA, GC, GG, GGG, y AAAGTCC) fueron recuperados. 13. El NH 2 terminal de parte de E2 (HVR1) es muy variable y se cree que el objetivo de la seleccin inmune ( 3 ). En la muestra H77, existe una considerable variabilidad en HVR1 N. [ Nakajima, M. Hijikata, H. Yoshikura, Shimizu YK, J. Virol. 70 , 3325 (1996); N. Ogata , HJ Alterar , HR Miller , RH Purcell ,Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE .UU. 88 , 3392 ( 1.991 ); G. Inchauspe al. et al , ibid. , p. 10292]. Hemos secuenciado varios clones independientes de esta regin ( 10 ) y la predominante HVR1 secuencia en cada posicin se utiliz en el consenso clones nuestra. Resumen / GRATIS Texto completo 14. La longitud y la composicin de 3 de NTR 'poli del VHC (U / UC) las vas no se han determinado de forma inequvoca. cantidades suficientes de DNA de doble cadena no se pudo obtener de H77 suero para la clonacin directa de esta regin sin recurrir a la amplificacin por PCR, que puede alterar la longitud de la poli (U / UC) las vas ( 9 ). Los clones resultantes de este procedimiento por lo que no puede reflejar la

estructura nativa genoma de ARN del VHC. En mltiples clones independientes obtenidos por amplificacin por PCR, la longitud de este tramo variado desde 41 hasta 133 nt ( 5 ). Por lo tanto, dos diferentes longitudes de poli (U / UC), las vas fueron probados: 75 y 133 bases. La longitud de la base de las vas 75 (del clon H77 # 8) ( 5 ) es en realidad acerca de la longitud media para todas las secuencias (de diferentes genotipos) inform por nosotros o por otros ( 4 , 5 ). La base del tracto 133 se recuper en slo un clon de VHC-H (H77 # 10) ( 5 ), un tramo de longitud similar se recuper en un clon de un genotipo 4 aislar ( 5 ). Tan larga poli (U / UC) tratados an no han sido reportados por otros ( 4 ). 15. Plsmido ADN purificado se digiri a la terminacin con Bsm I, una vez extrados con fenol-cloroformo, y se precipit con etanol. pellets de ADN se lavaron con etanol para eliminar las sales y se resuspendi en H 2 O. mezclas de reaccin de transcripcin (120 l) que figuran los siguientes componentes: 12 ug de DNA del modelo lineal, 40 mM Tris-HCl (pH 7.8), 16 mM MgCl 2 , 5 mM ditiotreitol (TDT), 10 mM de NaCl, 3 mM de cada PNT, 100 unidades de T7 RNA polimerasa, y 0,02 la unidad de pirofosfatasa inorgnica.Despus de 1 hora de incubacin a 37 C, los rendimientos tpicos eran alrededor de 350 mg con ms del 80% de longitud completa de ARN, segn lo estimado por electroforesis en gel ( 9 ). 16. Dos inoculacin diferentes y protocolos de la transfeccin se utilizaron. Para los chimpancs 1535, 100 l de cada mezcla de reaccin se diluy la transcripcin con 400 l de solucin salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacena congelado a -80 C hasta su uso para la inoculacin. Estas condiciones de almacenamiento se han probado y demostrado que no tienen ningn efecto observable sobre la integridad de las transcripciones de ARN del VHC. Antes de la inoculacin, las muestras fueron descongeladas y cada muestra se inyect intrahepatically en dos sitios (~ 0,25 ml por sitio). Los puntos de inyeccin para los 10 clones fueron distribuidos en tres lbulos del hgado. Chimpanc 1536 se inocul con cantidades ms pequeas de ARN que se haban mezclado con lipofectina (Bethesda Research Labs). En este caso, 20 l de la mezcla misma reaccin de transcripcin de los 10 de longitud completa VHC H77 plantillas fue tratado con desoxirribonucleasa (DNasa I) para extraer DNA de la plantilla, de 0,15 mg, 0,5 mg, y las porciones de 1,5 mg se diluyeron a 50 l con PBS y se almacenan a -80 C hasta su uso para la inoculacin. Despus de las mezclas se descongelaron, 100 l de PBS que contiene 9 g de lipofectina se aadi a cada muestra, mixtos, y se inyecta en un solo sitio. Por lo tanto, cada preparacin de la transcripcin, con distintas proporciones de ARN lipofectina /, se inyecta en tres sitios distintos. Los chimpancs fueron enjaulados y mantenerse en condiciones que cumplen todos los requisitos pertinentes para el uso de primates en una instalacin aprobada. protocolos de los animales fueron revisados y aprobados por el cuidado de los animales y los comits de uso de cada institucin involucrada con los estudios de los chimpancs. Los experimentos chimpanc tambin fueron revisadas y aprobadas por el Servicio de Salud Pblica Inter-Modelo Animal Comit. 17. Los anticuerpos contra el VHC se midieron por inmunoensayo enzimtico comercial. El VHC EIA Abbott 2,0 ensayo (Abbott Laboratories, abad Park, IL) contiene tres antgenos recombinantes del VHC: HC34, residuos de aminocidos de

la poliprotena 1-150 (protena del core del VHC), HC-31, los residuos de 1192 a 1457 (una porcin interna de NS3 ) y residuos de 1676 a 1931 (COOH-terminal de NS4A y la mayora de NS4B), y c100-3, los residuos de 1569 hasta 1931 (la porcin COOH-terminal de NS3, NS4A, y la mayora de NS4B). Antgeno especfico de la reactividad de los sueros positivos EIA se defini an ms con la tira de ensayo de inmunoblot RIBA VHC 2,0 SIA (Chiron Corporation, Emeryville, CA), que contiene cuatro antgenos recombinantes: c22-3, los residuos 2-120 (protena del core del VHC); c33c, residuos de 1192 a 1457 (regin interna de NS3), c100-3, y 5-1-1, residuos de 1694 a 1735 (COOH-terminal de la porcin de NS4A y NH 2 terminal de parte de NS4B). Las pruebas se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 18. 1. H. Popper , 2. JL Dienstag , 3. SM Feinstone , 4. HJ Alterar , 5. RH Purcell , Virchows Arco. Un Pathol. Anat.Histolgico. 387 , 91 ( 1.980 ). CrossRefMedline 19. Farci P., et al. , J. Infect. Dis. 165 , 1006 (1992); M. Shindo , AM DiBisceglie , R. Biswas , K. Mihalik, SM Feinstone , ibid 1 66 , 424 ( 1992 ). 20. Las pequeas cantidades de circulacin de ARN del VHC se oponen a la determinacin directa de la terminal de secuencias de ARN-5 '. Por lo tanto, el virus derivados de las transcripciones que contienen las ms prevalentes extremo 5 '(5'AMCC ... -3') se distingue de los procedentes de las transcripciones con otros 5 'nucletidos por la presencia o ausencia de la I Xho sitio en la posicin 514 (Fig. . 1 ). La regin que contiene este marcador fue amplificado por RT-PCR en condiciones que asegur que un nmero representativo de cDNAs independientes [AA Kolykhalov, Reed KE, CM Rice, en la hepatitis C Protocolos, Jyn Lau, Ed. (Humana Press, Totowa, New Jersey), en prensa] fueron analizados (> 50 en este caso).Los productos resultantes se analizaron para la digestin, ya sea con Xho I o, como control, Acc I, una enzima que debe digerir este fragmento de todos los clones de entrada. Para los chimpancs 1535 (semana 3 de la muestra), la fraccin de los productos digeridos por el exceso de XhoI paralelo al inculo de entrada: 20% fue digerido por XhoI, el 80% fue resistente a la digestin (los valores se determinaron mediante el escaneo de etidio digestin patrones manchados-bromuro de con un SI1000 Digital Imaging System, Alfa Innotech Corp.). la digestin completa se observ que el CAC I. En la semana 4 muestra analizada por los chimpancs 1536, 45% fue digerido por XhoI; 55% fue resistente a la digestin. Una vez ms, la digestin completa se observ que el CAC I. Por lo tanto, los chimpancs en 1536 se observ una ventaja de transcripciones sin necesidad de 5 'bases (5'-AMCC ... -3'). 21.

Las transcripciones que contienen la base de 75 o 133 de la base de poli (U / UC) tractos se distinguan por el marcador de silencio en NT 8054 en el NS5B regin codificante (Fig. 1 ). La regin entre nt 7955 y 8088 fue amplificado por RT-PCR, con suficiente material de partida para garantizar la ampliacin de ms de 100 independientes molculas de DNA [AA Kolykhalov, Reed KE, CM Rice, en la hepatitis C Protocolos , Jyn Lau, Ed. (Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, en prensa)], y molecularmente clonado.Las secuencias de 10 y 9 clones independientes fueron determinados para los chimpancs 1535 (semana 3) y el chimpanc 1536 (semana 4), respectivamente. Se encontr que el 90% (chimpanc 1535) y el 67% (chimpanc 1536) de los clones contena el G en NT 8054, indicativas de los 133 a base de poli (U / UC) las vas. Por lo tanto, la base de las vas 133 parece ser preferida, aunque no podemos descartar la posibilidad de que esta preferencia se debi a un efecto deletreo de la mutacin del marcador en las transcripciones con la base de las vas 75. 22. Falkow S., Rev. Infect. Dis. 10 (Supl. 2), S274 (1988). 23. 1. A. Grakoui , 2. C. Wychowski , 3. C. Lin , 4. SM Feinstone , 5. CM Arroz , J. Virol. 67 , 1385 ( 1 993 ). Resumen / GRATIS Texto completo 24. Agradecemos a C. Lea para la asistencia de expertos tcnicos, S. Emerson para la hepatitis control positivo un cDNA virus, R. Purcell por su generosidad al poner a disposicin sus instalaciones de primates, M. Shapiro para la recoleccin y anlisis de muestras de los chimpancs, y A. DiBisceglie de bDNA anlisis. Agradecemos tambin a A. Grakoui, Heise M., y JA Lemm por su participacin en las primeras fases de este trabajo y S. Amberg, D. Goldberg, Hultgren S., Lindenbach B., M. Macdonald, J. Grandes Ligas, y Reed K. til para el debate y los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Servicio Pblico de Salud a CMR (CA57973 y AI40034).
y

o o o y o o o

Este artculo ha sido citado por otros artculos: MicroARN-122 antagonismo contra el virus de la hepatitis C genotipo 1-6 y reduccin de la eficacia de la insercin de acogida o de ARN del VHC mutaciones en el 5 'UTRProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 22 de marzo 2011 : 4991 - 4996 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La deteccin de la hepatitis C virus y anticuerpos en la sangre y manchas de sangre post mortemJ. Clin. Microbiol. 01 de marzo 2011 : 1122 - 1123 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o y

o o

El virus GB: revisin y propuesta de clasificacin de la violencia de gnero-A, el GBVC (camiones), y la violencia de gnero D-en Pegivirus gnero dentro de la familia FlaviviridaeJ. Virol general. 01 de febrero 2011 : 233 - 246 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Anfipticas {alpha}-Helix AH2 es un factor determinante para la oligomerizacin de la hepatitis C virus protenas no estructurales 4BJ. Virol. 15 de diciembre 2010 : 12.529 - 12.537 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Novela Infecciosas clones de cDNA de la hepatitis C virus genotipo 3 bis (cepa S52) y 4 bis (Cepa ED43): Los anlisis genticos y los estudios in vivo PatognesisJ. Virol. 15 de mayo 2010 : 5277 - 5293 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Piscinas desafo de virus de la hepatitis C genotipos 06/01 cepas prototipo: Gimnasio de replicacin y patogenicidad en chimpancs y humanos modelos de ratn quimrico-HgadoEl Diario de Enfermedades Infecciosas 01 de mayo 2010 : 1,381 mil 1389 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C virus ligados a la disfuncin mitocondrial promueve la hipoxiainducible factor 1 {alpha}-mediada glucoltica AdaptacinJ. Virol. 01 de enero 2010 : 647 - 660 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Patognesis de la infeccin por el virus hepatitis C en Tupaia belangeriJ. Virol. 01 de enero 2010 : 303 - 311 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Determinantes del virus de la hepatitis C la protena no estructural 2 de dominio necesarios para la produccin de la proteasa del virus infecciosoJ. Virol. 15 de diciembre 2009 : 12.702 - 12.713 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Identificacin y Caracterizacin de los ampliamente neutralizantes Humanos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la glicoprotena E2 del sobre de la hepatitis C virusJ. Virol. 01 de diciembre 2009 : 12.473 - 12.482 . Resumen Texto completo

o y

o o o y

o o o y

o o o y o o y

o o o y

o o o y

o o o y

o o o

Texto completo (PDF) Un anfipticas {alpha}-hlice en el extremo C de la hepatitis C, Virus de protenas no estructurales 4B media la membrana AsociacinJ. Virol. 01 de noviembre 2009 : 11.378 - 11.384 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Identificacin de un determinante Novela de la Asociacin de la membrana en la hepatitis no estructurales del virus 4B Protena CJ. Virol. 15 de junio 2009 : 6257 6268 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Papel de la hepatitis C virus un marco de lectura abierto y cis Ncleo Bsico-interino Elementos del RNA en la traduccin del ARN viral y la replicacinJ. Virol. 01 de diciembre 2008 : 11.503 - 11.515 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C de entrada de virus: los posibles objetivos para la terapia dela tripa 01 de diciembre 2008 : 1,728 - 1,737 . Texto completo Texto completo (PDF) Represin de los virus ARN de silenciamiento gnico mediado-interferencia por las protenas estructurales del virus de la hepatitis CJ. Virol general. 01 de noviembre 2008 : 2.761 - 2.766 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Determinantes estructurales de la asociacin de membrana y organizacin dinmica de la hepatitis C-4A complejo NS3Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 23 de septiembre 2008 : 14.545 - 14.550 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La forma principal de la hepatitis alternativa virus marco de lectura de protena C se suprime por el ncleo de expresin de protenascidos nucleicos Res. 01 de mayo 2008 : 3054 - 3064 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La activacin de la protena 1c esterol elemento vinculante de reglamentacin y el cido graso sintasa de la transcripcin de C no-estructural de la protena del virus la hepatitis 2J. Virol general. 01 de mayo 2008 : 1225 - 1230 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

y o o o y

o o o y o o y

o o o y

o o o y

o o o y o o o y o o o y o

Caracterizacin de la hepatitis C Supresin mutantes del virus circulante en pacientes infectados crnicamenteJ. Virol. 15 de noviembre 2007 : 12.496 - 12.503 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Robusta produccin de partculas virales infecciosas en las clulas Huh-7 con la introduccin de mutaciones en las protenas del virus C estructurales hepatitisJ. Virol general. 01 de septiembre 2007 : 2495 - 2503 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) El estudio de virus de la hepatitis C: Hacer el mejor de un virus malJ. Virol. 01 de septiembre 2007 : 8853 - 8867 . Texto completo Texto completo (PDF) La helicasa NS3 y a 3'X Regiones NS5B son importantes para la hepatitis C virus eficiente tensin JFH-1 de replicacin en las clulas Huh7J. Virol. 01 de agosto 2007 : 8030 - 8040 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) En Vivo Estudio de la IL-tensin de HC de la hepatitis C virus recuperado de un paciente con hepatitis fulminante: transcripciones de ARN de un clon molecular (APS-TN) son fuentes de infeccin en los chimpancs, pero no en clulas Huh7.5J. Virol. 01 de julio 2007 : 7208 - 7219 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un ARN estructura conservada Filogenticamente en el marco de lectura abierta de poliomyelits Inhibe la RNasa L Endoribonuclease antiviralesJ. Virol. 01 de junio 2007 : 5.561 - 5.572 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La variacin allica en el virus de la protena C NS4B hepatitis influye dramticamente en la replicacin del ARNJ. Virol. 01 de junio 2007 : 5724 - 5736 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La produccin de la hepatitis C virus infecciosos de genotipos diferentes en cultivos celularesJ. Virol. 01 de mayo 2007 : 4405 - 4411 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un GB virus quimrico que codifica la B virus de la hepatitis C es una regin hipervariable infecciosas en vivoJ. Virol general. 01 de marzo 2007 : 895 - 902 . Resumen

o o y o o o y o o o y o o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o y o o o

Texto completo Texto completo (PDF) La evidencia de un elemento funcional de ARN en el ncleo de genes hepatitis C virusProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 20 de febrero 2007 : 2879 - 2884 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C en la replicacin del virus y Transfectados infectados por suero cultivadas hepatocitos fetales humanosAm. J. Pathol. 01 de febrero 2007 : 478 - 489 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) ARN de interferencia pequeos dirigidos a la Hepatitis C Virus 5 'regin no ejerce un efecto antiviral potenteJ. Virol. 15 de enero 2007 : 669 - 676 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un virus de la hepatitis C (VHC) proteasa dependiente de la estrategia de NS3/4A para la identificacin y purificacin de las clulas infectadas por el VHCJ. Virol general. 01 de diciembre 2006 : 3587 - 3598 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La entrada de virus de la hepatitis C pseudotipos en primaria de hepatocitos humanos por endocitosis dependiente de clatrinaJ. Virol general. 01 de septiembre 2006 : 2583 2593 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Foxp3 + CD4 + CD25 + clulas T especficas del virus de control-clulas T de memoria en los chimpancs que se recuper de la hepatitis CSangre 1 jun 2006 : 4424 - 4432 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Construccin y caracterizacin de las enfermedades infecciosas y intragenotypic intergenotypic virus de la hepatitis C quimerasProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 09 de mayo 2006 : 7408 - 7413 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Generacin de la hepatitis infecciosa del virus C en hepatocitos humanos InmortalizadoJ. Virol. 01 de mayo 2006 : 4633 - 4639 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

o o o y

o o y

o o o y

o o o y o o o y o o o y

o o o y

o o o y

De la contraportada: la clula de cosecha cultivo de virus de hepatitis C es infecciosa en vivo y se puede resembraron in vitroProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 07 de marzo 2006 : 3805 - 3809 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un hito para la investigacin de virus de la hepatitis C: Un virus generado en cultivos celulares es totalmente viable en vivoProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 07 de marzo 2006 : 3.500 - 3.501 . Texto completo Texto completo (PDF) Regulacin al alza de la protena fosfatasa 2AC por virus de hepatitis C helicasa NS3 modula la actividad a travs de la inhibicin de la protena arginina metil 1J. Virol. 15 de diciembre 2005 : 15.342 - 15.350 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La produccin de robusta Infecciosas virus de hepatitis C (VHC) de establemente ADNc del VHC-Transfectados Humanos clulas de hepatomaJ. Virol. 15 de noviembre 2005 : 13.963 - 13.973 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Dirigida por interfern gamma hgado Gene entrega de la hepatitis crnica CJ. Virol. 01 de noviembre 2005 : 13.412 - 13.420 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Virus de la Hepatitis C no estructural 5A protena (NS5A) es una protena de unin al ARNJ. Biol. Chem. 28 de octubre 2005 : 36.417 - 36.428 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) El resurgimiento de la hepatitis C virus despus de 8.5 aos en un paciente con hipogammaglobulinemia: Evidencia de un viral depsito ocultoel diario de la enfermedad infecciosa 15 de septiembre 2005 : 1088 - 1092 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La deteccin de la hepatitis C (VHC) en suero y de sangre perifrica de clulas mononucleares de monoinfectados por VHC y el VIH / HCV coinfectados PersonasThe Journal of Infectious Disease 15 de julio 2005 : 258 - 265 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Robusto la hepatitis C virus in vitroProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 28 de junio 2005 : 9294 - 9299 .

o o o y

o o o y o o o y

o o o y o o o y o o o y

o o o y

o o o y

Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Caracterizacin de la protena de la membrana no estructurales de anclaje mutantes de delecin Expresado en el contexto de la hepatitis C virus poliprotenaJ. Virol. 15 de junio 2005 : 7911 - 7917 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Estable linfoblastoides lneas celulares humanas que expresan constitutivamente el virus de la hepatitis C protenasJ. Virol general. 01 de junio 2005 : 1737 - 1746 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Suero humano Facilita la hepatitis C infectados con el virus, y las respuestas neutralizantes correlacionan inversamente con la cintica de replicacin viral en la fase aguda de la hepatitis C, infeccin por el virusJ. Virol. 15 de mayo 2005 : 6023 6034 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un modelo in vitro de la hepatitis C virin produccinProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 15 de febrero 2005 : 2579 - 2583 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C (VHC) constitutivamente activa STAT-3 a travs de estrs oxidativo: papel de STAT-3 en la replicacin del VHCJ. Virol. 01 de febrero 2005 : 1569 - 1580 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Asociacin de la membrana de la ARN polimerasa dependiente de ARN-es esencial para la replicacin del ARN del virus hepatitis CJ. Virol. 01 de diciembre 2004 : 13.278 - 13.284 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Reglamento de la hepatitis C, Virus de procesamiento poliprotena por peptidasa seal Implica Determinantes estructurales de la p7 uniones secuencia deJ. Biol. Chem. 01 de octubre 2004 : 41 384 - 41 392 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) L-SIGN (CD209L) y DC-SIGN (CD209) mediar transinfection de las clulas del hgado por el virus de la hepatitis CProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 28 de septiembre 2004 : 14.067 - 14.072 . Resumen

o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o y o o

Texto completo Texto completo (PDF) y funcin de la estructura de la membrana de anclaje de dominio no estructurales del virus de la hepatitis 5A Protena CJ. Biol. Chem. 24 de septiembre 2004 : 40.835 40.843 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) A largo plazo la persistencia de la infeccin en chimpancs inoculados con un virus de hepatitis C Infecciosas Clon est asociada con una disminucin en el viral Sustitucin de Aminocidos Tarifa y bajos niveles de heterogeneidadJ. Virol. 15 de septiembre 2004 : 9782 - 9789 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Representacin exacta del virus de la hepatitis C Quasiespecies en kilobases Amplicones 5.2J. Clin. Microbiol. 01 de septiembre 2004 : 4223 - 4229 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Adyuvante Actividades de citoquinas novela, la interleucina-23 (IL-23) e IL-27, para la induccin de la hepatitis C linfocitos T citotxicos especficos-Virus en HLA-A * 0201 Los ratones transgnicosJ. Virol. 01 de septiembre 2004 : 9093 - 9104 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La fosforilacin de la hepatitis no estructurales del virus 5A protena C modula sus interacciones de protenas y la replicacin del ARN viralProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 31 de agosto 2004 : 13.038 - 13.043 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Diversos hepatitis C virus Glicoprotenas Mediar infeccin viral en un dependiente de Forma CD81J. Virol. 15 de agosto 2004 : 8496 - 8505 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Respuesta de anticuerpos neutralizantes durante la fase aguda y la hepatitis crnica por virus C infeccinProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 06 de julio 2004 : 10,149 10,154 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Purificar las mscaras de seleccin de la flexibilidad mutacional de la transcriptasa inversa del VIH-1J. Biol. Chem. 18 de junio 2004 : 26.726 - 26.734 . Resumen Texto completo

o y o o o y

o o o y o o o y o o o y

o o o y

o o o y o o o y o o o

Texto completo (PDF) CD81 es un correceptor de entrada para virus de la hepatitis CProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 11 de mayo 2004 : 7270 - 7274 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Virus de la Hepatitis C (VHC) Diversidad en los sujetos coinfectados por VHC-VIH Iniciar la terapia antirretroviral altamente activo,el diario de enfermedades infecciosas 15 de abril 2004 : 1472 - 1481 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Uncleaved NS2-3 se requiere para la produccin de virus de la diarrea infecciosa viral bovinaJ. Virol. 01 de marzo 2004 : 2414 - 2425 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C genotipo por desnaturalizacin de alto rendimiento de la cromatografa de lquidosJ. Clin. Microbiol. 01 de enero 2004 : 158 - 163 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Expresin de la hepatitis C no se modifican los sobres Virus glicoprotena-secuencias de codificacin conduce a la escisin de Cryptic Intron A y de la superficie de la clula de expresin E1/E2 heterodmeros Consta de longitud completa y parcialmente eliminados E1J. Virol. 15 de diciembre 2003 : 13.418 - 13.424 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) En el ensayo in vitro para anticuerpos neutralizantes al virus de la hepatitis C: Evidencia para la conservacin general de neutralizacin eptoposProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 25 de noviembre 2003 : 14.199 - 14.204 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Importancia en la replicacin de la Terminal de nucletidos del genoma FlavivirusJ. Virol. 01 de octubre 2003 : 10.623 - 10.629 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C, igual que las partculas de virus en ciernes: Papel de la protena del ncleo y la importancia de su Asp111J. Virol. 15 de septiembre 2003 : 10.131 - 10.138 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o y o o o y

o o o

La hepatitis crnica asociada con B GB persistencia del virus en un tit despus de la inoculacin intraheptica del sintticas ARN viralProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 19 de agosto 2003 : 9962 - 9967 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Virus de la hepatitis C IRES la eficiencia no se ve afectado por el ARN genmico 3'NTR incluso en la presencia de virus o protenas no estructurales estructuralesJ. Virol general. 01 de junio 2003 : 1549 - 1557 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) El virus de hepatitis C ncleo proteico de la clula T modula las respuestas de los Inducir espontnea y alteraciones de las clulas T del receptor activado por oscilaciones de Ca2 +J. Biol. Chem. 23 de mayo 2003 : 18.877 - 18.883 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Identificacin de un determinante clave de la clula del virus hepatitis C en la adaptacin Cultura II dominio de helicasa NS3J. Biol. Chem. 02 de mayo 2003 : 16,741 - 16,746 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Interacciones protena-protena entre los virus de hepatitis C no estructurales ProtenasJ. Virol. 01 de mayo 2003 : 5.401 - 5.414 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Cintica de las clulas CD4 + y CD8 + de memoria celular T-respuestas durante la hepatitis C virus de la reintroduccin del frmaco previamente recuperados chimpancsJ. Virol. 15 de abril 2003 : 4781 - 4793 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La hepatitis C virus Glicoprotenas Interactuar con DC-SIGN y DCSIGNRJ. Virol. 01 de abril 2003 : 4070 - 4080 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La interferencia de ARN bloques de la expresin gnica y la sntesis de ARN de la hepatitis C replicones propagado en clulas de hgado humanoProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 04 de marzo 2003 : 2783 - 2788 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

o o o y o o o y

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y o o o

Anlisis de la localizacin subcelular de la hepatitis C virus de la glicoprotena E2 en clulas vivas utilizando protenas de fusin EGFPJ. Virol general. 01 de marzo 2003 : 561 - 566 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Eficiente de replicacin del virus de hepatitis C genotipo 1a ARN en cultivo celularJ. Virol. 01 de marzo 2003 : 3181 - 3190 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Un promotor de la actividad est presente en la secuencia de ADN correspondientes a los virus de la hepatitis C 5 'UTRcidos nuclicos Res 15 de febrero 2003 : 1,275 1,281 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La liquidacin de la hepatitis C infeccin por el virus en chimpancs de mayo se correlaciona necesariamente con la aparicin de inmunidad adquiridaJ. Virol. 15 de enero 2003 : 862 - 870 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Funcin del receptor y la entrada en Asialoglycoprotein La unin de las protenas del virus C estructurales hepatitis en hepatocitos humanos cultivadosJ. Virol. 01 de enero 2003 : 546 - 559 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) El virus de la hepatitis C dependiente de ARN polimerasa de ARN membrana de secuencias de insercin es un segmento transmembranaJ. Virol. 15 de diciembre 2002 : 13.088 - 13.093 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Las mutaciones que permiten la replicacin eficiente del virus de la hepatitis C de ARN en las clulas Huh-7 impedir la replicacin productiva en los chimpancsProc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU. 29 de octubre 2002 : 14416 - 14421 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La estructura secundaria y accesibilidad hibridacin de virus de hepatitis C-Terminal de secuencias 3 'J. Virol. 01 de octubre 2002 : 9563 - 9574 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

y o o o y o o o y

o o o y

o o o y

o o o y

o o o y o o o y

o o o

Interaccin de la hepatitis C como partculas, virus y clulas: un sistema modelo para estudiar virales de unin y de entradaJ. Virol. 15 de septiembre 2002 : 9335 - 9344 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La estructura secundaria de la 3 'de C Menos de virus ARN de cadena hepatitisJ. Virol. 15 de agosto 2002 : 8058 - 8068 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Caracterizacin de la estomatitis vesicular virus recombinantes que expresan y Incorporar altos niveles de virus de la hepatitis C GlicoprotenasJ. Virol. 15 de julio 2002 : 6865 - 6872 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Anteriormente infectados y recuperados chimpancs muestran respuestas rpidas que controlan la replicacin del virus de la hepatitis C a una reexposicinJ. Virol. 01 de julio 2002 : 6586 - 6595 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Molecular y significacin inmunolgica de los chimpancs Complejo de Histocompatibilidad Mayor de haplotipos C Respuesta Inmune Virus Hepatitis y Estudios vacunacinJ. Virol. 15 de junio 2002 : 6093 - 6103 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Expresin de protenas virus de la hepatitis C induce la membrana diferentes alteraciones Incluye un complejo de replicacin viral candidatosJ. Virol. 15 de junio 2002 : 5974 - 5984 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Localizacin subcelular y Topologa de la Polipptido p7 del virus de la hepatitis CJ. Virol. 15 de abril 2002 : 3720 - 3730 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Seleccionable subgenmico y Genoma de longitud Dicistronic ARN derivados de una enfermedad infecciosa clon molecular de la N-Colar el VHC de la hepatitis C virus de replicar de forma eficaz en las clulas cultivadas Huh7J. Virol. 15 de marzo 2002 : 2997 - 3006 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)

o o o y

o o o y

o o y o o o y

o o o y o o o y o o o

Un amino-terminal de la alfa-hlice anfipticas media la membrana de la Asociacin de la hepatitis C virus protena no estructural 5AJ. Biol. Chem. 01 de marzo 2002 : 8130 - 8139 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La unin de la hepatitis C virus-como partculas infecciosas derivadas de la clonacin humana definida H77C a las variedades de clulasJ. Virol. 01 de febrero 2002 : 1181 1193 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Propiedades funcionales de un anticuerpo monoclonal inhibicin de la hepatitis C virus de ARN dependiente de ARN polimerasaJ. Biol. Chem. 04 de enero 2002 : 593 601 . Resumen Texto completo Determinantes de la membrana de la Asociacin de la hepatitis C virus de ARN dependiente de ARN polimerasaJ. Biol. Chem. 16 de noviembre 2001 : 44.052 - 44.063 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) La identificacin de un factor heptica Capaz de Apoyo a la hepatitis C de replicacin del virus en una lnea celular nonpermissiveJ. Virol. 15 de noviembre 2001 : 11.017 11.024 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Generacin de viriones infecciosos transmisibles y de un B GB de cuerpo entero consenso clon-virus en tamarinosJ. Virol general. 01 de octubre 2001 : 2437 - 2448 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF) Efecto del interfern alfa en el virus de la hepatitis C ReplicnJ. Virol. 15 de septiembre 2001 : 8516 - 8523 . Resumen Texto completo Texto completo (PDF)