Procedimientos básicos en microbiología

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PROCEDIMIENTOS BASICOS EN
Vigencia: 28.08.09
MICROBIOLOGIA. PARTE I.
Rev.: 01 (marzo 2010)
Ramo: Microbiología de Alimentos TEA.
Facultad Tecnológica
Carrera: Tecnólogo en Alimentos
Depto. de Ciencias y Tecnología de los Alimentos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Elaborado. por: Osvaldo Torres -Norma Castillo – Liliana Godoy – Ma. Angélica Ganga
PRACTICO 1
PROCEDIMIENTOS BASICOS EN MICROBIOLOGIA PARTE I
I. INTRODUCCION
MATERIALES Y EQUIPOS EMPLEADOS EN LA PRACTICA

MICROBIOLOGICA
Los principales que se usan son:
Material fungible:
Tubos, placas de Petri, campanas de Durham, matraces, probetas, vasos

de precipitado, cubreobjetos, portaobjetos, pipetas graduadas y de Pasteur, asa
de Drigalsky (rastrillo de vidrio), asa de siembra, mecheros, gradillas, trípodes,
termómetro, filtros de membrana, etc.
Equipos:
Autoclave, horno Pasteur, estufa de cultivo, microscopio, agitador de

tubos, baño termorregulado, contador de colonias, espectrofotómetro, etc.
DESCRIPCIÓN DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS Y MATERIALES

DIVERSOS
a) Autoclave
Es un aparato de laboratorio que se utiliza para esterilizar distintos tipos

de materiales. Consta de una cámara metálica de doble pared con cierre
hermético, diseñada para operar con vapor de agua saturado a presión superior
a la atmosférica y mantenerlo a una temperatura y presión determinada por un
tiempo establecido. Puede disponer de los siguientes accesorios indispensables:
- termómetro
- registradores de temperatura
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- manómetros
- control de entrada de vapor
- trampa de vapor y filtro
- válvula de seguridad y escape
- purga de agua
El autoclave es imprescindible en un laboratorio de Microbiología. La

mayoría de los medios de cultivo, soluciones de dilución, materiales con alta
humedad, ropas contaminadas, cultivos de desecho y en general, materiales
termorresistentes son esterilizados rutinariamente en este aparato.
Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una atmósfera

por encima de la presión atmosférica, lo cual corresponde a una temperatura de
120 °C. Habitualmente, las condiciones de esterilización corresponden a 15
libras/pulgada cuadrada a 121 °C por 15 minutos, pero los materiales altamente
contaminados pueden necesitar 134 °C durante 15 minutos, en autoclaves de
alta presión.
La temperatura de 121 °C dentro del autoclave se conseguirá, a la presión

indicada, solamente si la atmósfera consta únicamente de vapor. Por lo tanto, al
iniciar la operación se debe expulsar todo el aire que estaba dentro de la cámara
y reemplazarlo por vapor; esto se logra mediante el uso de una válvula de vapor
que permanece abierta mientras sale el aire a través de ella, pero que se cierra
cuando la atmósfera interior está saturada de vapor de agua. Si queda algo de
aire dentro de la cámara de esterilización, la presión parcial del vapor será más
baja que la indicada en el manómetro y la temperatura será, por consiguiente,
inferior.
La temperatura del interior de la cámara de esterilización puede vigilarse

incluyendo entre los objetos que se van a esterilizar papeles indicadores
especiales, que cambian de color si el tratamiento térmico ha sido adecuado.
b) Horno de esterilización
Es un horno que consta de una cámara termoaislada, de atmósfera

de aire, con circulación de aire forzado, impulsado por un ventilador eléctrico y
termorregulado por un termostato.
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La calefacción de este tipo de horno se consigue con resistencias eléctricas que

están ubicadas en la parte inferior de la cámara de esterilización.
Debido a que el aire caliente es un mal conductor del calor y penetra

lentamente a los objetos, la distribución uniforme del calor en la cámara del
horno se consigue por circulación de aire a través de un ventilador durante todo
el proceso, solamente interrumpiéndose o conectándose la circulación, cuando
se alcanza el nivel térmico prefijado por el termostato.
Toda la esterilización en horno significa previamente cargar la cámara con

el material a esterilizar. Luego, calentar el tiempo necesario, hasta que toda la
masa calefaccionada alcance la temperatura deseada; controlar el tiempo que se
va a esterilizar, desconectar el horno hasta que se enfríe a unos 50°C a lo menos
y finalmente descargar el material, utilizando para esto guantes de asbesto.
El calor seco se usa principalmente para esterilizar material de vidrio y

otros materiales sólidos estables al calor, vidriería de laboratorio tal como placas
de Petri, pipetas, tubos de ensayo, frascos y metales. Los objetos se envuelven
en papel o se les protege de otra forma de la contaminación posterior.
Cuando se seleccionan objetos para la esterilización en seco se debe tener

en cuenta que se logran temperaturas de 160 a 180 ºC, que carbonizará telas y
destruirá muchos plásticos. Sin embargo, plásticos como el polimetilpenteno,
PTFE y poliamida pueden resistir estas temperaturas.
Para vidrios y porcelanas de laboratorio se emplea un tiempo de

esterilización de 1 hora a 180 ºC, pero no se recomienda para objetos
taponados con algodón, ya que éste se puede tostar, liberando sustancias
bactericidas.
c) Campana de flujo laminar
Es una cámara que permite disponer de un ambiente aséptico para

realizar las siembras y otras operaciones de laboratorio con bajo riesgo de
contaminación microbiana
Consta de una cámara cúbica o rectangular con una ventana en su frente,

de altura regulable y una superficie de material inerte y liso para las
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operaciones. En su parte superior y en los bordes inferiores a la salida de la

ventana posee ductos que forman una cortina de aire estéril, evitando así la
entrada de contaminantes. El aire externo es filtrado por un sistema de filtros
HEPA (Fit High Efficiency Particulate Air). Estos son filtros de papel de fibra de
vidrio capaces de reducir en varios millones los niveles de partículas en
suspensión en el aire, proporcionando así, aire estéril en todo momento.
Antes de proceder a trabajar en el ambiente aséptico de la cámara, debe

procederse a su desinfección con irradiación con lámpara ultravioleta germicida
(incorporada en la campana) por varias horas, así como a una limpieza prolija
de toda la superficie interna con alcohol al 70%.
Durante el funcionamiento se debe comprobar la esterilidad del aire que

está siendo proporcionado, mediante control microbiológico. Esto se efectúa
colocando en su interior placas de agar nutritivo abiertas, dejándolas durante
algunas horas y luego incubándolas a temperatura y tiempos establecidos.
Si no se observa desarrollo de colonias en las placas existe seguridad de

un ambiente de trabajo estéril. Sin embargo, el manipulador debe aplicar en
su trabajo todas las medidas de asepsia del trabajo microbiológico, más aún
debido a que frecuentemente este tipo de campana es mal mantenida y puede
que no sea más segura que lo que es una campana de laboratorio común y
corriente, que dicho sea de paso, nunca debe usarse en prácticas
microbiológicas.
d) Estufa de cultivo o incubadora
Es una cámara metálica termoaislada con mecanismo regulador

automático de temperatura prefijada, que permite mantener constante la
temperatura para el desarrollo adecuado de los microorganismos.
El tamaño de la estufa debe ser adecuada a las necesidades del

laboratorio. En algunos casos se hace indispensable el uso de cuartos
mantenidos a temperatura constante, que se denominan cámaras-estufas.
El uso y cuidado de las estufas es importante. Las placas de Petri se

colocan invertidas y los tubos en gradillas. Los materiales deben colocarse en
forma ordenada, debidamente rotulados. Debe tenerse cuidado de no
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sobrecargar la estufa para permitir la libre circulación de aire calefaccionado

entre cada objeto. Se debe evitar abrir una y otra vez sus puertas, a fin de
mantener una temperatura constante. Para el cultivo de hongos se ajusta la
temperatura a 25 C habitualmente y para cultivar bacterias se ajusta a 37 ºC.
Periódicamente es muy conveniente limpiar los estantes y las paredes

interiores de las incubadoras con alcohol al 70%, así como verificar
temperatura.
e) Contador de colonias
Es un aparato que facilita el recuento de las colonias crecidas en una

placa de agar nutritivo. Consta de una lupa con transiluminación artificial
controlada y un campo cuadriculado en centímetros, sobre el cual se coloca la
placa sometida a análisis. El aparato clásico es el cuentacolonias Quebec, pero
actualmente existen contadores electrónicos automáticos, en los cuales la placa
se coloca en un transiluminador y el recuento de colonias es mostrado
numéricamente en un visor digital.
El contador de colonias se usa habitualmente para el análisis

morfológico de las colonias crecidas en una placa de agar, lo que constituye un
criterio morfológico para el diagnóstico de un aislado microbiano, así como para
el recuento de colonias en la técnica de recuento en placa para determinar el
número de gérmenes viables en una muestra.
Cuando se utiliza el contador de colonias se debe considerar las siguientes

precauciones:
- colocar adecuadamente la placa de Petri sobre la superficie del

contador
- no contar placas que tengan la superficie irregular
- evitar contar placas con partículas extrañas o con burbujas
- no contar placas que tengan colonias difusas o de superficie muy
grande
- evitar las placas con rayaduras
- limpiar cualquier marca o suciedad del fondo de la placa antes de
observar.
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Jarra de anaerobiosis
Cuando es necesario cultivar microorganismos en condición anaeróbica,

se suele recurrir a jarra de anaerobiosis. Consiste en una cámara
herméticamente cerrada en la cual se colocan las placas de cultivo o tubos de
cultivo.
Autoclave Estufa de cultivo

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Campana de flujo laminar Cuenta colonias
f) Microscopio óptico
El microscopio puede definirse como un instrumento diseñado para

amplificar las imágenes de objetos pequeños, invisibles al ojo humano (menos
de 0,1 mm). Es esencial para observar la forma y estructura de los
microorganismos.
Un microscopio moderno contiene tres sistemas separados de lentes. El

condensador, interpuesto entre la fuente de luz y la muestra, rectifica los rayos
de luz que iluminan el campo del microscopio. El objetivo produce una imagen
amplificada del campo microscópico, y el ocular amplifica más esta imagen y
permite que sea percibida por el ojo. Proporciona aumentos de entre 1000 a
1500 veces. Además de este factor de amplificación son de gran importancia
otros dos factores: el contraste y la resolución. Con el fin de producir una
imagen amplificada clara, el microscopio debe poseer un poder de resolución
suficiente para permitir la percepción, como objetos separador, de dos puntos
muy cercanos entre sí. La resolución habitual es de no menos de 0,2 micrones
(0,0002 milímetros).
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MATERIALES DIVERSOS
• Tubos de cultivo
Son tubos de paredes gruesas, de unos 13 cm de longitud, con un cierre

hermético que impide la entrada de contaminantes microbianos. Las tapas
pueden ser de plástico tipo rosca, metálicas o cierre de tapón de algodón. Estos
tubos se utilizan para medios de cultivo que han de mantenerse por un cierto
tiempo o durante la incubación de cultivos.
• Matraces
Los matraces Erlenmeyer se utilizan en diversas formas de cultivo y

también para conservar medios nutritivos líquidos, soluciones tampón, extractos
líquidos e incluso sólidos. Se cierran con tapones de algodón hidrófobo o tapa
rosca.
• Placas de Petri
Se componen de una tapa y base de vidrio encajadas una en otra. Con

frecuencia el diámetro de la tapa es de unos 10 cm y la altura es de unos 2 cm.
Se utilizan para cultivar microorganismos en una capa de medio sólido, el que se
agrega en un volumen de 15 a 20 mL.
• Pipetas
Se utilizan pipetas Pasteur y diversas pipetas graduadas, taponadas con

algodón en la boquilla para la transferencia de medios líquidos y siembras.
• Campanas Durham
Son pequeños tubos que se emplean en las pruebas de formación de gas

en las fermentaciones microbianas.
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• Asas de siembra
El asa de siembra es el instrumento para efectuar habitualmente la

extracción de inóculos y las siembras en la práctica microbiológica. Está
compuesta de un mango metálico con un alambre en su extremo terminado en
argolla o punta, con la cual se extrae directamente una porción de cultivo para
inocularla en un medio sólido o líquido.
PROCEDIMIENTOS BÁSICOS PARA MANEJAR MATERIALES.
a) Esterilización de asas y pipetas.
Cuando se utilizan asas de siembra, pipetas capilares o agujas de

inoculación, éstas deben ser esterilizadas a la llama del mechero antes de
extraer inóculos de microorganismos y luego de usarlas, como medida de
seguridad.
Para esterilizar el asa de siembra, se coloca el alambre con la argolla en

forma oblicua sobre la llama hasta que se ponga incandescente e
inmediatamente se flamea la parte metálica del mango en extensión mayor a la
que va a penetrar al recipiente. No se debe calentar en extremo el mango; con
dos o tres pasadas es suficiente.
Para extraer microorganismos, luego de esterilizada el asa, se debe tener

cuidado que esté totalmente fría. Para enfriar se toca con la argolla las paredes
internas del tubo, el interior de la placa Petri o bien, la zona del cultivo donde no
hay crecimiento microbiano. Enseguida se toma la muestra cuidando de no
romper el medio si es sólido.
Si se utiliza pipeta capilar, se debe romper el extremo con una pinza

flameada a la llama y luego pasarla por la llama dándole vueltas y en extensión
mayor a la que se introducirá al recipiente. Luego se enfría con movimientos
rápidos y se procede a tomar la muestra.
Las pipetas aforadas pueden estar contenidas en cilindros de bronce,

aluminio o vidrio, aunque también pueden estar envueltas en papel Kraft. En
cualquier caso se taponan con algodón hidrófobo en la boquilla y se esterilizan
en horno Pasteur. Si están en un contenedor cilíndrico, éste se coloca en una
superficie desinfectada, se destapa y se saca una pipeta sin tocar las demás. Si
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está envuelta, se le saca el envoltorio sin tocar su punta. Luego se puede pasar
por la llama al igual que la pipeta capilar.
b) Manipulación de tubos o matraces de siembra.
Cada vez que se destapa un tubo estéril, matraz, botella u otro recipiente
estéril, se debe flamear su boca con movimiento rotatorio y repetir la operación
antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento evita la entrada de
microorganismos contaminantes de la parte externa del tubo y del aire. No se
debe flamear en exceso pues se quemará el algodón o se trizará el vidrio.
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas apropiadas

para el crecimiento de los microorganismos. Pueden ser líquidos o sólidos y
normalmente poseen varios ingredientes del sustrato natural en el cual el
microorganismo se desarrolla.
CONTROL DEL DESARROLLO MICROBIANO
El control del crecimiento microbiano es necesario en la práctica

microbiológica para evitar la contaminación de superficies, recipientes, medios
de cultivos, en la industria de alimentos para evitar el deterioro de los
productos, así como para prevenir la transmisión de enfermedades la generación
de toxinas, la pérdida de la calidad y la pérdida económica para los productores
de alimentos. Por tanto, el control de los microorganismos es un aspecto
esencial en la producción segura de alimentos.
El control del crecimiento significa evitar o limitar el desarrollo de los

microorganismos. Este control se efectúa de dos formas: (1) matando a los
microorganismos o (2) inhibiendo el crecimiento de los microorganismos. El
control del crecimiento generalmente involucra el uso de agentes químicos o
físicos que eliminan o evitan el desarrollo de los microorganismos. Los agentes
que matan células se refieren como agentes cidas. Los agentes que inhiben el
crecimiento de las células (sin matarlas) se denominan como agentes
estáticos. De esta manera, el término bactericida se refiere a los que matan
bacterias y el bacteriostático se refiere al que inhibe el crecimiento de las
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células bacterianas. Un bactericida mata bacterias, un fungicida mata hongos

y así.
La esterilización es la destrucción o eliminación completa de todos los

organismos viables (en o sobre un objeto). En términos estrictamente
microbiológicos no existen grados de esterilización: un objeto es estéril o no lo
es. Los procedimientos de esterilización implican el uso de calor, radiación o
agentes químicos, o la separación física de las células.
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
Calor: es el más importante y el más usado. Para la esterilización siempre se

considera el tipo de calor, el tiempo de aplicación y la temperatura para
asegurar la destrucción de todos los microorganismos, incluidos sus estados de
resistencia (endoesporas). Las endosporas de bacterias se consideran las más
termodúricas (termorresistentes, termoestables) de todas las células, de modo
que su destrucción garantiza la esterilidad.
1. Incineración: Quema a los microorganismos y físicamente los destruye.

Se usa para agujas, alambres de inoculación, vidriería, etc. y objetos que
no se destruyan en el proceso de incineración.
2. Ebullición: 100ºC por 30 minutos. Mata todas las células excepto
algunas endoesporas. Para matar las endoesporas, y por lo tanto
esterilizar la solución, se necesita de un proceso de ebullición
prolongada o intermitente.
3. Autoclavado (vapor de agua a presión en autoclave u olla a
presión): 121ºC por 15 minutos a 15 libras de presión. Adecuado para
esterilizar casi cualquier elemento contaminado, pero las sustancias
termosensibles se desnaturalizan o se destruyen.
4. Calor seco (horno de aire caliente: 170 ºC/2horas o 180 ºC/1hora.
Usado para material de vidrio, metales y objetos que no se
descompongan por calor.
El protocolo y recomendaciones para el uso del calor para controlar el

crecimiento microbiano se muestran en la tabla Tabla 1.
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Tabla 1. Uso recomendado del calor para controlar el crecimiento

bacteriano
Temperatura Efectivid Comentario

de ad
tratamiento
Incineración >500ºC Vaporiza el material orgánico o superficies no
inflamables pero puede destruir varias
sustancias en el proceso
Ebullición 100ºC 30 minutos de ebullición mata a los
patógenos microbianos y formas vegetativas
de bacterias pero puede que no mate
endoesporas bacterianas
Ebullición 100ºC Tres intervalos de 30 minutos de ebullición,
intermitente seguidos de períodos de enfriamiento matan a
las endoesporas bacterianas
Autoclave y 121o/15 Mata a todas las formas de vida incluyendo a
olla a presión minutos a las endoesporas bacterianas. La sustancia que
(vapor a 15 psi de está siendo esterilizada se debe mantener a la
presión) presión T efectiva por el tiempo completo especificado
Calor seco 170ºC/2 Para materiales que deben permanecer secos
(horno de aire horas y que no son destruidos a T entre 121ºC y
caliente) 170ºC. Bueno para vidriería, metales. No para
elementos de plástico o goma
Calor seco 180ºC/1 Lo mismo que arriba. Nótese que al aumentar
(horno de aire hora la T° en 10 grados se acorta el tiempo de
caliente) esterilización en un 50 por ciento
Pasteurización 63ºC/30 Mata a la mayoría de las células bacterianas
(método batch ) minutos vegetativas, incluyendo a patógenos, tales
como estreptococos, estafilococos coliformes,
salmonelas y Mycobacterium tuberculosis
Pasteurización 72ºC/15 Efecto sobre células bacterianas similar al
(método flash ) segundos método batch; para la leche, este método es
más aplicable a la industria de alimentos y
tiene pocos efectos indeseables sobre la
calidad o sabor
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Irradiación: generalmente destruye o altera los ácidos nucleicos. La luz

ultravioleta se usa habitualmente (comúnmente utilizada para esterilizar las
superficies de objetos), aunque los rayos X y las microondas son posiblemente
útiles en la actualidad.
Filtración: implica la separación física (exclusión) de todas las células en un

líquido o gas, especialmente importante para esterilizar soluciones que se
destruyen por calor (Ej. antibióticos, fármacos inyectables, aminoácidos,
vitaminas, etc.)
Químicos y gas: (formaldehído, glutaraldehído, óxido de etileno) los químicos

tóxicos matan todas las formas de vida en una cámara de gas especial.
1. CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO MEDIANTE AGENTES

FÍSICOS
Aplicaciones del calor. La temperatura letal varía en los microorganismos. El

tiempo requerido para matar depende del número de organismos, especies,
naturaleza del producto que es calentado, pH y temperatura. Cada vez que se
use el calor para controlar el crecimiento microbiano, inevitablemente se debe
considerar el tiempo y la temperatura.
1. Esterilización: (ebullición, autoclavado, horno de aire caliente) mata a

todos los microorganismos con calor; empleado comúnmente en
conservería, embotellado y otros procedimientos de envasado estéril.
2. Pasteurización: es el uso de calor intermedio para disminuir el número
de microorganismos en un producto o alimento. En el caso de la
pasteurización de la leche el tiempo y temperatura dependen de la
muerte de los patógenos potenciales que son transmitidos por la leche,
Ej. Estafilococos, estreptococos, Brucella abortus y Mycobacterium
tuberculosis. Para la pasteurización de la leche: método batch:
63ºC/30minutos; método flash: 71ºC/15 segundos.
Baja temperatura (refrigeración y congelado): La mayoría de los

organismos crece muy poco o nada a 0ºC. El almacenado de alimentos
perecibles a bajas temperaturas disminuye la tasa de crecimiento y el deterioro
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consecuente (Ej. leche). Las bajas temperaturas no son bactericidas. Los

psicrotrofos, más que los verdaderos psicrófilos, son la causa habitual del
deterioro de los alimentos refrigerados (ej. carnes, aves, cecinas).
Secado (eliminación de agua): La mayoría de los microorganismos no

pueden crecer a una actividad de agua reducida (Aw < 0.90). A menudo se usa
para preservar alimentos (ej. Frutas, cereales, leguminosas, etc.). Los métodos
involucran la eliminación del agua del producto por calor, evaporación,
liofilizado, agregado de sal o azúcar.
Irradiación (microondas, UV, rayos x, rayos gamma): destruye a los

microorganismos tal como lo que se describió como "esterilización". Varios
organismos de deterioro mueren fácilmente por irradiación. En algunos lugares
de Europa, las frutas y vegetales son irradiados para prolongar su vida útil hasta
en un 500 por ciento. La práctica no ha sido aceptada en USA.
3. CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO MEDIANTE AGENTES

QUÍMICOS
Agentes antimicrobianos: son sustancias químicas que matan o inhiben el

crecimiento de los microorganismos. Los agentes antimicrobianos incluyen los
preservantes químicos (aditivos antimicrobianos) y los antisépticos, como
también a los fármacos usados para el tratamiento de infecciones en plantas y
animales. Los agentes antimicrobianos pueden ser de origen natural o sintético,
y pueden tener un efecto estático o cida sobre los microorganismos.
Tipos de agentes antimicrobianos
Antisépticos: agentes microbicidas inofensivos lo bastante como para ser

aplicados a la piel o membranas mucosas; no deben ser ingeridos. Ejemplos:
químicos mercuriales, nitrato de plata, solución de yodo, alcoholes, detergentes.
Desinfectantes: agentes que matan microorganismos, pero no necesariamente

sus esporas, no seguro para su aplicación en tejidos vivos; son usados sobre
objetos inanimados tales como mesones, pisos, utensilios, etc. Ejemplos: cloro,
hipocloritos, compuestos de cloros, soda cáustica, sulfato de cobre, compuestos
de amonio cuaternario
.
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Nota: los desinfectantes y antisépticos se distinguen sobre la base de que sin

son seguros para su aplicación sobre membranas mucosas. A menudo, la
seguridad depende de la concentración del compuesto. Por ejemplo, el
hipoclorito de sodio, se agrega al agua para que sea segura de beber, pero el
"clorox”, un excelente desinfectante, no es seguro como para tomárselo.
Varios antisépticos y desinfectantes comunes, con sus usos están resumidos en

la Tabla 2.
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Tabla 2. Antisépticos y desinfectantes comunes
Químico Acción Usos
Etanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas Antiséptico usado sobre la piel

y
solubiliza lípidos
Isopropanol (50- Desnaturaliza proteínas Antiséptico usado sobre la piel
70%) y solubiliza lípidos
Formaldehído (8%) Reacciona con grupos Desinfectante, mata
NH2, SH y COOH de las endoesporas
proteínas
Tintura de Iodo (2% Inactiva proteínas Antiséptico usado sobre la piel
I 2 en alcohol al 70%
)
Cloro (Cl 2 ) gas Forma ácido Desinfectante para agua de
hipocloroso (HClO), un bebida; desinfectante general
fuerte agente oxidante
Nitrato de plata Precipita proteínas Antiséptico general y usado
(AgNO3) antiguamente
Cloruro mercúrico Inactiva proteínas por Desinfectante, aunque

reacción con grupos ocasionalmente usado como
sulfhidrilo antiséptico sobre la piel
Detergentes (Ej. Rompe membranas Antisépticos y desinfectantes
Compuestos de celulares para la piel
amonio cuaternario)
Compuestos Desnaturaliza proteínas Antisépticos a bajas
fenólicos (Ej. Fenol, y rompe membranas concentraciones;
lisol, hexilresorcinol, celulares desinfectantes a altas
hexaclorofeno) concentraciones
Gas óxido de etileno Agente alquilante Desinfectante usado para
esterilizar objetos sensibles al
calor como goma y plásticos
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Preservantes (aditivos antimicrobianos): agentes estáticos usados para

inhibir el crecimiento de los microorganismos, con frecuencia en alimentos. Si
son ingeridos ellos no deben ser tóxicos. Ejemplos: propionato de calcio,
benzoato de sodio, nitrito, sulfito, sorbato de potasio. La tabla 3 muestra una
lista de preservantes comunes y sus usos.
Tabla 3 Preservantes comunes de alimentos y sus usos
Preservante Concentración Usos
Acido propiónico y 0,32% Agente antifúngico en pan,

propionatos bizcochuelos, queso Suizo
Ácido sórbico y 0,2% Agente antifúngico en quesos,

sorbatos mermeladas, jarabes, masas dulces
Ácido benzoico y 0,1% Agente antifúngico en margarina,
benzoatos cidra, salsas, bebidas
Diacetato de sodio 0,32 Agente antifúngico en pan
Ácido láctico ? Agente antimicrobiano en quesos,

mayonesas, yogurt y pickles
Dióxido de azufre, 200-300 ppm Agente antimicrobiano en frutas
sulfitos secas, uvas, vinos, melazas
Nitrito de sodio 200 ppm Agente antibacteriano en cecina,

pescados
Cloruro de sodio ? Evita el deterioro microbiano de
carnes, pescados, etc.
Azúcar ? Evita el deterioro microbiano de
conservas, mermeladas, jarabes,
jaleas, etc.
Humo líquido ND Evita el deterioro microbiano de
carnes, pescados,etc.
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Agentes quimioterapéuticos: agentes antimicrobianos de origen sintético

útiles en el tratamiento de enfermedades microbianas y virales. Ejemplos:
sulfanilamidas, isoniazida, etambutol, AZT, cloramfenicol. Nótese que la
definición de los microbiólogos de un agente quimioterapéutico, requiere que el
agente sea usado para propósitos antimicrobianos y de esta forma, excluye a los
agentes sintéticos usados para la terapia contra enfermedades que no son de
origen microbiano.
Antibióticos: agentes antimicrobianos producidos por microorganismos que

matan o inhiben a otros microorganismos. Esta es la definición de los
microbiólogos. Una definición más amplia incluye a cualquier sustancia de origen
natural (de cualquier tipo de célula), la que tiene el efecto de matar o inhibir el
crecimiento de otros tipos de células. Puesto que la mayoría de los antibióticos
de uso clínico son producidos por microorganismos y son usados para matar o
inhibir infecciones bacterianas, nos quedaremos con la definición clásica
II. OBJETIVOS.
• Identificar materiales, equipos e instrumentos empleados en la práctica

microbiológica.
• Manejar en forma apropiada materiales, equipos e instrumentos usados
en microbiología.
• Esterilizar materiales de uso microbiológico.
• Preparar medios de cultivos estériles
III. ACTIVIDADES.
III.1 Preparación de materiales de cultivo estériles
a) Envolver placas de Petri en papel Kraft, según indicaciones.

b) Taponar pipetas de 1, 5 y 10 mL con algodón hidrófobo y envolverlas en
papel Kraft según indicaciones, señalando el volumen de cada pipeta.
c) Preparar tapones de algodón hidrófobo para tubos según indicaciones.
Taponar los tubos y disponerlos en una gradilla metálica limpia.
d) Disponer todo el material ordenado en el horno y esterilizar a 180ºC
durante 1 hora.
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e) Una vez frío, retirar el material y disponerlo sobre una superficie seca,
desinfectada y protegida de polvos ambientales. El material de vidrio
esterilizado debe ser utilizado antes de un mes.
III.2 Preparación de medios de cultivo
Preparar los siguientes medios de cultivo de acuerdo al procedimiento.
1. Caldo peptonado al 0,1%: dos tubos con 9 mL cada uno

2. Caldo peptonado al 0,1%: un frasco con 90 mL.
3. Caldo nutritivo: 2 tubos con 5 mL cada uno
4. Agar nutritivo: 1 tubo con 7 mL, tendido
5. Agar nutritivo: 1 tubo con 7 mL, vertical
6. Agar nutritivo: para 4 placas
7. Agar para recuento en placa: 1 frasco con 120 mL
Procedimiento para la preparación de los medios de cultivo.
a) Disolver los ingredientes o el medio en polvo en un cierto volumen de

agua temperada, agitando con varilla de vidrio. Ajustar al volumen de
agua de la formulación. Habitualmente el volumen de agua es el volumen
de medio a preparar.
b) Determinar el pH con indicador de cinta o pHmetro, según sea necesario.
Ajustar al valor de pH adecuado agregando ácido (HCl) o base (NaOH).
En varios casos no es necesario ajustar puesto que los medios
comerciales vienen estandarizados.
c) Si el medio es de agar, se debe disolver a baño maría en agua hirviendo
hasta que se torne transparente.
d) Distribuir el medio en tubos, matraces, botellas, frascos, etc., los cuáles
se taponan con algodón, capuchón de aluminio o tapón de rosca poco
apretado. Conviene cubrir la boca de matraces y frascos con papel Kraft,
el que se sujeta con pitilla o cinta tipo Masking. Los frascos no deben
llenarse más de las 3/4 partes. Los tubos deben colocarse en gradillas
termorresistentes y no apretados. Todos los recipientes deben ser
rotulados con lápiz resistente al agua o con etiquetas indicando: nombre
del medio, preparador y fecha.
e) Esterilizar los medios en autoclave según indicaciones. Generalmente los
medios de cultivo se esterilizan a 121°C, 15 psi durante 15 minutos.
f) Cumplido el período de esterilización, esperar que la temperatura del
Código: MITEAL01
Vigencia: 28.08.09
Rev.: 01 (marzo 2010)
autoclave descienda bajo 90°C y entonces proceder a abrir la cámara y

retirar los materiales. Si se abre el autoclave a temperaturas muy altas,
el medio comenzará a ebullir en los recipientes y saltarán los tapones.
Todos los materiales deben ser colocados en una bandeja limpia y
protegidos del polvo.
Si no se van a usar de inmediato los medios de cultivo se pueden guardar

una semana en refrigeración.
BIBLIOGRAFÍA:
1. Breach, B,R. “Sterilization: Methods and Control” Butterworth & Co., Ltd. England 1976.
2. Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. “Biología de los Microorganismos”. 10ª Edición. Prentice Hall
Hispanoamericana. Mexico. 2004.
3. FDA “Bacteriological Analytical Manual”. Edition 8, Revision A. USA.1998
Goldman, E. & Green, L. (Editores). “Practical Handbook of Microbiology”. 2ª Ed. CRC Press. Boca Ratón, USA.
2009.
4. ICMSF “Microorganismos de los alimentos. 1: Técnicas de análisis microbiológicos" Ed. Acribia. 1983. Existen
ediciones más recientes.
5. Instituto de Salud Pública (ISP) "Manual de técnicas microbiológicas para alimentos y aguas" Santiago, Chile.
1998.
6. Jay, J., Loessner, M. & Golden, D. “Modern Food Microbiology” Seventh Edition. Springer Science+Business
Media, Inc. NY. USA. 2005.
7. Ministerio de salud “Manual normas de esterilización y desinfección” 1995.
8. Pascual, Mª del Rosario "Microbiología alimentaria: metodología analítica para alimentos y bebidas". Ed. Díaz
de Santos S.A., España, 1992.
9. Pelczar, Reid y Chan “Microbiología”, varias ediciones. Ed. Mc. Graw Hill, Mexico.
10. Prescott, L.M. “Microbiology”. 5th Edition. The McGraw-Hill Companies, USA. 2002
11. Refay, MK."Análisis para el control de calidad de los alimentos. Parte IV: Análisis microbiológicos, FAO.
Roma. 1994.
12. USDA/FSIS “Microbiological Laboratory Guidebook: Media and Reagents”, 3rd Edition. USA.2008

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Código: MITEAL01

PROCEDIMIENTOS BASICOS EN MICROBIOLOGIA PARTE I

MATERIALES Y EQUIPOS EMPLEADOS EN LA PRACTICA

Los principales que se usan son:

Tubos, placas de Petri, campanas de Durham, matraces, probetas, vasos

Autoclave, horno Pasteur, estufa de cultivo, microscopio, agitador de

DESCRIPCIÓN DE LOS PRINCIPALES EQUIPOS Y MATERIALES

Es un aparato de laboratorio que se utiliza para esterilizar distintos tipos

El autoclave es imprescindible en un laboratorio de Microbiología. La

Los autoclaves de laboratorio se emplean generalmente a una atmósfera

La temperatura de 121 °C dentro del autoclave se conseguirá, a la presión

La temperatura del interior de la cámara de esterilización puede vigilarse

Es un horno que consta de una cámara termoaislada, de atmósfera

La calefacción de este tipo de horno se consigue con resistencias eléctricas que

Debido a que el aire caliente es un mal conductor del calor y penetra

Toda la esterilización en horno significa previamente cargar la cámara con

El calor seco se usa principalmente para esterilizar material de vidrio y

Cuando se seleccionan objetos para la esterilización en seco se debe tener

Para vidrios y porcelanas de laboratorio se emplea un tiempo de

c) Campana de flujo laminar

Es una cámara que permite disponer de un ambiente aséptico para

Consta de una cámara cúbica o rectangular con una ventana en su frente,

operaciones. En su parte superior y en los bordes inferiores a la salida de la

Antes de proceder a trabajar en el ambiente aséptico de la cámara, debe

Durante el funcionamiento se debe comprobar la esterilidad del aire que

Si no se observa desarrollo de colonias en las placas existe seguridad de

d) Estufa de cultivo o incubadora

Es una cámara metálica termoaislada con mecanismo regulador

El tamaño de la estufa debe ser adecuada a las necesidades del

El uso y cuidado de las estufas es importante. Las placas de Petri se

sobrecargar la estufa para permitir la libre circulación de aire calefaccionado

Periódicamente es muy conveniente limpiar los estantes y las paredes

Es un aparato que facilita el recuento de las colonias crecidas en una

El contador de colonias se usa habitualmente para el análisis

Cuando se utiliza el contador de colonias se debe considerar las siguientes

- colocar adecuadamente la placa de Petri sobre la superficie del

Cuando es necesario cultivar microorganismos en condición anaeróbica,

Autoclave Estufa de cultivo

Campana de flujo laminar Cuenta colonias

El microscopio puede definirse como un instrumento diseñado para

Un microscopio moderno contiene tres sistemas separados de lentes. El

Son tubos de paredes gruesas, de unos 13 cm de longitud, con un cierre

Los matraces Erlenmeyer se utilizan en diversas formas de cultivo y

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Se utilizan pipetas Pasteur y diversas pipetas graduadas, taponadas con

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PROCEDIMIENTOS BÁSICOS PARA MANEJAR MATERIALES.

a) Esterilización de asas y pipetas.

Cuando se utilizan asas de siembra, pipetas capilares o agujas de

Para esterilizar el asa de siembra, se coloca el alambre con la argolla en

Para extraer microorganismos, luego de esterilizada el asa, se debe tener

Si se utiliza pipeta capilar, se debe romper el extremo con una pinza

Las pipetas aforadas pueden estar contenidas en cilindros de bronce,

b) Manipulación de tubos o matraces de siembra.

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias nutritivas apropiadas

CONTROL DEL DESARROLLO MICROBIANO

El control del crecimiento microbiano es necesario en la práctica

El control del crecimiento significa evitar o limitar el desarrollo de los

células bacterianas. Un bactericida mata bacterias, un fungicida mata hongos

La esterilización es la destrucción o eliminación completa de todos los

Calor: es el más importante y el más usado. Para la esterilización siempre se

1. Incineración: Quema a los microorganismos y físicamente los destruye.