TÉCNICA DE ELISA PARA ANAPLASMA MARGINALE

MATERIAL:

Placa de fondo plano de 96 pozos (Costar No. de Cat. 3590).

Viales de 1.5 ml
Micropipetas de una punta para 20, 200, y 1000 microlitros
Micropipetas de ocho o doce puntas para 200 microlitros

Reactivos:

Antígeno.- El actual es: Am 040595 (Mex 3109601) c 20

Sueros problema y sueros testigo (positivos y negativos)
Conjugado anti IgG bovina Chemicon Ap 102 A Gt X Bov IgG Alk phos en dilución
1:10000 (normalmente marca SIGMA)
Substrato para fosfatasa alcalina. No de Cat. 10440T, Sigma 104® phosphatase
substrate. (buscar en congelador y dejar que tome la temperatura ambiente antes de
manipular)

PROCEDIMIENTO

1. SENSIBILIZACIÓN DE PLACA

El antígeno se usa a una dilución final de 1:200

11.1 Mezclar volúmenes iguales de antígeno y SDS o LLS1 al 0.1%. Para una
placa se mezclan 110μl de Ag + 110 μl SDS (0.1%) = 220μl.
1.2 Incubar la mezcla por 30 minutos a temperatura ambiente (TA).
1.3 Diluir la mezcla Ag-SDS 1:200 en solución amortiguadora de carbonatos
pH 9.6 30 mM. Para una placa se agregan a los 220 μl de la mezcla Ag-
SDS, 21.78 ml del regulador de carbonatos, esto da una dilución final de
1:200
1.4 Homogenizar
1.5 Depositar 200 μl de esta mezcla a cada pozo de la placa.
1.6 Incubar toda la noche en refrigeración (a 4ºC)
1.7 Lavar 3 veces la placa (200μl por pozo) con solución salina reguladora de
fosfatos pH 7.2 (SSAF)-Tween 20 al 0.05%. Cada lavado consiste en
eliminar el contenido de la placa mediante una fuerte sacudida arrojando
el contenido hacia la tarja, secado de los residuos que quedan sobre la
placa con toalla de papel y llenando los posos con la solución de lavado
dejando la placa con dicha solución por el tiempo requerido, en este caso
5 min.

1
Para la preparación de las soluciones usadas en esta técnica, ver el apéndice anexo.
2. BLOQUEO

2.1 Depositar en cada pozo 200μl de leche descremada en polvo (“Svelty”,

Nestle) al 5% en SSAF/Tween 20.
2.2 Incubar por 30 min. a 37º
2.3 Lavar (Repetir el paso 1.7) Lavar 3 veces la placa con solución salina
reguladora de fosfatos pH 7.2 (SSAF)-Tween 20 al 0.05%. (200μl por pozo)

3 REACCION Ag-Ac

3.1 Sueros:
3.1.1 Diluir 1:100 en SSAF/Tween 20 todas las muestras de suero,
incluyendo controles positivos, negativos y problema. En viales de
1500 µl se depositan 990 µl de SSAF/Tween 20 y 10 µl de suero.
3.1.2 Depositar por triplicado 200 μl de cada dilución por pozo. Tomando en
cuenta los controles positivo y negativo y el Blanco. Este es uno o
varios pozos que se utilizan para calibrar el lector de ELISA. Para este
propósito, se depositan en el/los pozos que serán usados como
blanco, 200μl de SSAF/Tween 20 en lugar del suero diluido. 2
3.1.3 Incubar la placa a 37ºC por 60 min.
3.1.4 Realizar 3 lavados como se describió en el punto 1.7.

3.2 Conjugado:
3.2.1 Diluir apropiadamente el conjugado (anti IgG bovina, en SSAF/Tween
20 Para este propósito el conjugado deberá ser titulado previamente y
en cada lote se debe definir la dilución de uso.(1:5000 - 1:10000)
3.2.2 Agregar 200 µl del conjugado diluido por pozo.
3.2.3 Incubar la placa a 37ºC por 60 min.
3.2.4 Realizar 2 lavados con SSAF/Tween 20 y un lavado final con Solución
Tris 100mM, pH 9.5.

3.3 Substrato:
3.3.1 Depositar 200μl por pozo del Substrato (una solución previamente
elaborada de p-nitrofenilfosfato al 0.075% en solución reguladora de
Tris 100mM, pH 9.5) (15 mg en 20 ml)

2
Ver diagrama anexo
• Para dos repeticiones la placa se divide en cuadrantes repitiendo las
muestras en cada uno de las mitades, ej: la muestra que se deposita en el
pozo A1 se repite en el pozo A7, la muestra del pozo A2, se repite en A8 y
así sucesivamente.
• Para tres repeticiones marcar la placa de tal manera que las replicas
queden en las columnas 1, 5 y 9, (2, 6 y 10) etc. Y con cuatro repeticiones
serían 1, 4, 7 y 10 (2, 5, 8 y 11 -- 3,6,8 y 12).
 3.3.2 Incubar Las placas por 30 min a 37ºC.

4 REGISTRO DE VALORES:

La reacción se registra mediante un Espectrofotómetro específico para leer placas

de ELISA, programado para la lectura de absorbancia a 405 nm.

5 ANÁLISIS DE RESULTADOS:

Para el análisis de los resultados se deberán tomar en cuenta los siguientes

parámetros.

5.1.1 El valor del/los pozos blanco. Este valor debe ser substraído de los
valores de todas las demás lecturas si es que no es substraído
automáticamente por el lector de ELISA.
5.1.2 El promedio de los valores negativos con sus respectivas
desviaciones estándar.
5.1.3 La línea de corte se establece tomando el valor del negativo +3 veces
la desviación estándar del negativo, esto representa probabilidad de
que cualquier valor que esté por arriba de este valor determinado sea
superior al 99.9%.
5.1.4 El promedio de los valores positivos con sus respectivas desviaciones
estándar.
5.1.5 Para efecto de valoración de la consistencia del operador de la
prueba, se debe también estimar el error “E” que se calcula
determinando el porcentaje que representa la desviación estándar de
cualquier suero problema contra su media.
 SOLUCIONES

1. Solución de lauril sulfato de sodio (LSS) 0.1%.

SDS 0.1g
Agua destilada 100 ml

Diluir el g de lauril sulfato de sodio en los 100 ml de agua destilada ( Almacenar a

temperatura ambiente

2. Solución amortiguadora de carbonatos (SAC) pH 9.6

Carbonato de Sodio, Na2CO3, P.M. 106 (30mMoles) 3.18 g

Bicarbonato de Sodio, NaHCO3, P.M. 84.01 (70 mMoles) 5.88 g
Agua destilada 1000. ml

Disolver las sales en 800 ml de agua destilada, se titula el pH A 9.6 con Hidróxido
de Sodio o ácido clorhídrico según sea el caso y se afora a 1000 ml. Hay que tomar en
cuenta que dada la naturaleza de los carbonatos, esta solución se debe mantener
herméticamente sellada o su fuerza iónica se pierde con el tiempo. Distribuir en volúmenes
de 25 ml y almacenar 4ºC. Los residuos de cada vial abierto se deben descartar.

3. Solución concentrada de fosfatos 0.1 m (SAF 10X).

Fosfato de Sodio monobásico monohidratado, H2NaO4P.H2O, PM. 137.99 (19 mM) 2.62
g
Fosfato de Sodio Dibásico, Anhidro Na2HPO4, PM. 142 (81mMoles) 11.50 g
Agua destilada 1000 ml

Disolver las sales en 800 ml de agua destilada, si es necesario se calienta para

disolver los cristales. Aforar a 1000 ml con agua destilada. Almacenar a 4ºC.
4. Solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) 1X/tween 20 0.05%, pH 7.2
NaCl 0.875%; H2NaO4P.H2O/Na2HPO4 10 mM, Tween 20 0.05%

NaCl PM. 58.44 8.75 g (0.875 %)

SAF 10 X 100 ml (solución 3)
Agua destilada 1000 ml

1.- Disolver (la sal) NaCl PM. 58.44 en 700 ml de agua destilada
2.- Agregar 100 ml de solucion SAF 10X
3.- Ajustar el ph a 7.2,
4.- Agregar 500μl de Tween 20
5.- Aforar a 1000 ml, homogeneizar y almacenar a 4ºC.

5. Solución de Bloqueo, leche descremada 5%

Leche descremada (Svelty, Nestle) 1g

SSAF 1X Tween 20. 20 ml

Disolver la leche en la SSAF 1X Tween 20. Esta cantidad es suficiente para una
placa. La solución se prepara el día en que se usa y se desecha el sobrante.

6. Solución amortiguadora Tris pH 9.5.

Trizma Base (hydroxymethyl)aminomethane), C4H11NO3 PM. 121.1(0.1 moles) 12.110 g

Cloruro de Magnesio Anhidro MgCl2, PM 95.21 (0.107 moles) 10.165 g
NaCl P.M. 58.44 2.920 g
Agua destilada 1000 ml

Disolver en 800 ml de agua destilada el cloruro de magnesio, antes que los demás
componentes, ya que si se trata de disolver en un pH alcalino el magnesio precipita, una
vez que este reactivo este disuelto se agrega el NaCl y finalmente el Trizma, ajustar a pH
9.5, aforar a 1000 ml con agua destilada, almacenar a 4ºC.

Nota: En el caso de que los reactivos que se describen en esta técnica no se encuentren
disponibles y se encuentren reactivos con mayor o menor número de moléculas de agua,
se convierte el peso especificado para el reactivo en cuestión y se convierte a moles, una
vez tomado ese dato se toma su equivalencia en moles del reactivo con mayor o menor
número de moléculas de H2O.