Universidad de Valparaíso

Laboratorio de Virología
Departamento de Química y Bioquímica
Facultad de Ciencias

Profesora coordinadora: Yoanna Eissler Parada

Profesores colaboradores: Juan Carlos Espinoza y Marcela Ruiz
Bioquímica Aplicada, Tecnología Médica, TMD - 323

LABORATORIO Nº2

Laboratorio de Centrifugación y Separación de Proteínas

Purificación y caracterización de Proteínas:

Cada tipo de célula puede contener millares de proteínas diferentes. Cada especie de
organismo contiene un conjunto característico de proteínas químicamente diferentes de
las de otros organismos. Las proteínas son moléculas relativamente frágiles, que
conservan su actividad biológica solamente en un intervalo relativamente limitado de pH y
de temperatura. El aislamiento en forma pura de una proteína determinada procedente de
una célula o tejido, puede por tanto parecer una tarea difícil, especialmente porque
cualquier proteína determinada puede existir sólo en una concentración muy baja en el
interior de la célula, acompañada de millares de otras proteínas. A pesar de todas estas
dificultades, se ha conseguido aislar muchas de ellas en forma pura. Por otra parte, los
métodos corrientes para la separación de proteínas poseen un poder de resolución
excepcionalmente elevado.

Es necesario por lo tanto describir los principios físicos en que se basan las técnicas
empleadas para la separación de proteínas, el sistema empleado en su purificación y
algunos de los métodos para la determinación de sus pesos moleculares. Esto es
importante porque, mucho de lo que se sabe en la actualidad acerca de la biología de las
proteínas, depende de la posibilidad de disponer de preparaciones de proteínas de
elevado grado de pureza, cuyo aislamiento ha precisado de una gran cantidad de
perseverante y cuidadoso esfuerzo.

Comportamiento de las proteínas en disolución: Aunque las proteínas han sido

conocidas desde hace más de un siglo, el conocimiento presente de su comportamiento
como solutos en los sistemas acuosos se ha conseguido en los últimos años, basándose
en estudios físico-químicos muy intensos. Durante muchos años, y hasta que su
estructura llegase a conocerse, las proteínas fueron consideradas como sustancias de
propiedades misteriosas, completamente diferentes en su comportamiento como solutos,
a las moléculas de otras clases. Se creía que las proteínas en disolución estaban cons-
tituidas por micelas coloidales de peso molecular variable e indefinido.

Aún en 1916, Emil Fischer, que hizo más que cualquier otro químico para transformar el
estudio de las biomoléculas en una ciencia exacta y rigurosa, negaba enérgicamente que
las proteínas tuviesen pesos moleculares superiores a 5000; creía que se asociaban para
constituir unos complejos de tipo micelar. Por otra parte, se descubrió que las proteínas
en disolución experimentaban cambios extraordinarios de solubilidad en presencia de
sales neutras, de ácidos o de bases, cambios que parecían completamente diferentes a
los efectos producidos por estos agentes en las moléculas orgánicas pequeñas y
sencillas.

Fueron necesarias dos o tres generaciones de investigación fisicoquímica para poder

afirmar la teoría de que las proteínas son macromoléculas de peso molecular bien
definido, que forman verdaderas disoluciones moleculares y que son electrolitos cuyo
comportamiento se rige por los mismos principios físicos que los de los electrolitos
pequeños. Merced a los esfuerzos de muchos investigadores, el estudio del
comportamiento de las proteínas en disolución y la separación de proteínas se ha
transformado en una ciencia casi exacta.
Las diversas propiedades características de las proteínas globulares en disolución se
aprovechan para separar mezclas de proteínas basándose en su: 1) tamaño molecular, 2)
solubilidad, 3) carga eléctrica, 4) diferencias en sus características de adsorción y 5)
afinidad biológica por otras moléculas.

Procedimientos de separación basados en el tamaño molecular: La característica

más notable de las proteínas es su gran tamaño, el cual permite el uso de métodos
sencillos para separar las proteínas de otras moléculas de pequeño tamaño, así como la
resolución de mezclas de proteínas.

Cromatografía de exclusión molecular: Uno de los medios más poderosos y útiles para
la separación de proteínas entre sí, basándose en el tamaño, es la cromatografía de
exclusión molecular, conocida también como filtración sobre gel o cromatografía de
tamiz molecular. Es diferente a la cromatografía de intercambio iónico, que separa los
solutos basándose en la carga eléctrica y en sus propiedades ácido-base.

En la cromatografía de exclusión molecular, la mezcla de proteínas disueltas en un

tampón apropiado, se deja fluir por gravedad, a lo largo de una columna empaquetada
con gránulos, o perlas de un polímero inerte, de elevado grado de hidratación, que ha sido
previamente lavado y equilibrado con el tampón.

Los materiales corrientes para el llenado de las columnas son el Sephadex, nombre
comercial de un derivado de polisacárido (dextrano); el Bio-Gel, un derivado comercial de
poliacrilamida y la agarosa, otro polisacárido, todos los cuales pueden estar preparados
con diferentes grados de porosidad interna. Los Sephadex se proveen en rangos de
fraccionamiento que se establecen en base al entrecruzamiento de las moléculas de
dextrano que lo constituyen, lo cual determina a su vez, los tamaños moleculares que
permiten pasar entre sus poros (tamaño de poro).
 Sephadex® G-10 – rango peso molecular entre 0.05-0.7 kD
Sephadex® G-25 – rango peso molecular entre 1-5 kD
Sephadex® G-50 – rango peso molecular entre 1-30 kD
Sephadex® G-75 – rango peso molecular entre 3-70 kD
Sephadex® G-100 – rango peso molecular entre 4-150 kD
Sephadex® G-200 – rango peso molecular entre 5-600 kD

Cada tipo de Sephadex tiene indicada una capacidad de hidratación y un volumen de

lecho que genera. Por ejemplo, para un dextrano con rango de fraccionamiento de 4-150
kD con partículas de 10-40 µm se especifica:

Sephadex® G-100-40
Agua retenida = 10,0 ± 1,0 g H2O; Volumen de lecho = 15,20 mL/g seco

En las columnas, las proteínas de diferente tamaño molecular van penetrando en los
poros internos de los gránulos en grados diferentes de intensidad y descendiendo a lo
largo de la columna a velocidades distintas.

Las moléculas de proteína muy grandes no pueden penetrar en los poros de las
partículas; se dice que son excluidas y permanecen por ello en el volumen de exclusión
de la columna, definido como el volumen de la fase acuosa en el exterior de los gránulos.
Por otra parte, las proteínas muy pequeñas pueden penetrar libremente en el poro de las
perlas. Las proteínas pequeñas ven obstaculizado su paso a través de la columna,
mientras que las proteínas de gran tamaño la atraviesan con rapidez, ya que no pueden
penetrar en las partículas poliméricas hidratadas. Las proteínas de tamaño intermedio
resultarán excluidas de las partículas en un grado que dependerá de sus dimensiones; de
aquí que se halla introducido el término de cromatografía de exclusión. A partir de las
medidas de concentración de proteínas en pequeñas fracciones del eluato se puede
construir una curva de elusión.
La cromatografía de exclusión molecular puede utilizarse también para separar
mezclas de otras clases de macromoléculas, así como bioestructuras muy grandes, por
ejemplo, los virus, los ribosomas, núcleos celulares o incluso bacterias, simplemente
utilizando resinas o geles con diferentes grados de porosidad interna. La capacidad de
resolución de la cromatografía de exclusión molecular es tan grande, que este sencillo
método se utiliza de manera muy generalizada como método de determinación del peso
molecular de las proteínas.

Parte Experimental:
1.- Preparación de la columna de Sephadex G-75 (rango de fraccionamiento: 3.000-
80.000)
a) manguera de salida y llave de regulación
b) lana de vidrio y filtro para soportar el gel hidratado
c) medición del volumen de la columna π x r2 x h
d) formar la columna; fijarse que no halla burbujas en el fondo de la columna, que no halla
fuga de aire y establecer goteo controlado a la salida de la columna. Preocuparse de
alimentar continuamente la columna a la entrada.
e) hacer pasar aproximadamente 20 ml de tampón (Tris HCl 0,1M pH 7,0) antes de
colocar la muestra recogiendo el eluido en un matraz
f) la muestra debe tener un volumen que no supere el 10% del volumen de la columna.
La muestra obtenida de un lizado de células CHSE-214 y/o de suero bovino fetal contiene
una mezcla de proteínas.
g) luego de colocada la muestra, eluir con tampón y recoger fracciones de
aproximadamente 2,0 ml. Numerar los tubos. Medir DO a 280 nm en los
espectrofotómetros usando cubetas de cuarzo. Hacer dilución 1:10 si la muestra
colectada está muy concentrada. Construir un gráfico de volumen de elusión en función
de la actividad enzimática y de la DO a 280 nm.

Bibliografía

Lehninger, Albert. Principles of Biochemistry. Fifth Edition. CHAPTER 3: Amino Acids,

Peptides, and Proteins. 2008 W. H. Freeman and Company.