Moleküler Biyolog Eva Shyqyriu

YÜKSEK LİSANS TEZİ

2006
"B. SC. EVA SHYQYRIU" İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞ. BİL. ENST. YÜKSEK LİSANS TEZİ İSTANBUL-2006
 T.C.
İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

( YÜKSEK LİSANS )

KRONİK MYELOJENİK LÖSEMİLİ HASTALARDA WT1

GEN EKSPRESYONU VE GENETİK DEĞİŞİKLİKLERİN
ARAŞTIRILMASI

"MOL. BİYO. EVA SHYQYRIU"

DANIŞMAN
"PROF.DR. SENİHA HACIHANEFİOĞLU"

"TEMEL ONKOLOJİ / KANSER GENETİĞİ"

İSTANBUL-2006
 2

TEZ ONAYI
 3

BEYAN
 4

İTHAF

Sevgili annem Olimbjadha Shyqyriu ve babam Nefail Shyqyriu’ye

 5

TEŞEKKÜR

Onkoloji Enstitüsü müdürü Prof. Dr. Erkan Topuz’a,

Çalışmam boyunca bilgileri ve sağladıkları olanaklarla beni yönlendiren tez

danışmanım Prof. Dr. Seniha Hacıhanefioğlu ve Anabilimdalı başkanımız Prof. Dr.
Nejat Dalay’a,

Yardım ve desteklerini esirgemeyen Prof. Dr. Vildan Yasasever’e,

İstatistiksel hesaplamalar konusunda bana yardımcı olan Sn. Prof. Dr. Riyan
Dişçi’ye,

Çalışma örneklerinin ve klinik bilgilerinin toplanmasındaki yardımlarından

dolayı Doç. Dr. Selim Yavuz, Dr. Mesut Ayer ve Dr. Naciye Yıldırım Demirel’e,

Çalışmam ve tez yazımı sırasında destek ve yardımlarından dolayı Dr. Aslı

Rehber Beşer’e,

Destek ve yardımlarından dolayı çalışma arkadaşlarım Dr. Uğur Deligezer, Dr.

Semra Demokan, Özlem Özgüven, Elif Akışık, Ebru Akışık, Zübeyde Yalnız ve Türkan
Şen’e,

Bana yüksek lisans öğrenimim sırasında maddi ve manevi destekte bulunan

ablam Dr. Liliana Ramasaço, ağabeyim Julian Shyqyriu ve nişanlım Dr. Arjet Gega’ya,

Beni her zaman destekleyen arkadaşlarıma ve tüm sevdiklerime,

Teşekkürlerimi sunarım.

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından

T-780/27122005 no’lu proje olarak desteklemiştir.
 6

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI ................................................................................................................ 2

BEYAN ....................................................................................................................... 3
İTHAF ......................................................................................................................... 4
TEŞEKKÜR................................................................................................................. 5
İÇİNDEKİLER ............................................................................................................ 6
TABLOLAR LİSTESİ ................................................................................................. 9
ŞEKİLLER LİSTESİ.................................................................................................. 10
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ .............................................................. 11
ÖZET ......................................................................................................................... 13
ABSTRACT............................................................................................................... 14
1. GİRİŞ VE AMAÇ....................................................................................... 15
2. GENEL BİLGİLER .................................................................................... 17
2.1.Kronik Myelojenik Lösemi ................................................................................. 18
2.1.1.Sınıflandırma ................................................................................................. 18
2.1.2.Epidemiyoloji ve Etiyolojisi........................................................................... 18
2.1.3. Evreleme....................................................................................................... 20
2.1.4. Sitokinetiği ................................................................................................... 20
2.1.5. Sitogenetiği................................................................................................... 22
2.1.6. Moleküler Biyolojisi ..................................................................................... 25
2.1.6.1. ABL ve BCR genleri ................................................................................ 25
2.1.6.2. BCR/ABL füzyon proteini ve Sinyal İletim Yolları .................................. 28
2.1.7. Çoklu ilaç direnci.......................................................................................... 30
2.1.8.Klinik Özellikleri ........................................................................................... 31
2.1.8.1.Kronik Faz ................................................................................................ 31
2.1.8.2. İleri Faz.................................................................................................... 31
2.1.8.3.Biyokimyasal Değişiklikler ....................................................................... 32
2.1.9. Tedaviler....................................................................................................... 32
2.1.9.1. Imatinib Mesylate..................................................................................... 32
2.1.9.2. Hidroksiüre .............................................................................................. 35
2.1.9.3. Interferon-α .............................................................................................. 35
 7

2.1.9.4. Busulfan................................................................................................... 35
2.1.9.5. Homoharringtonin .................................................................................... 36
2.1.9.6. Kemik iliği transplantasyonu .................................................................... 36
2.1.10. Kronik Myeloid Lösemi Varyantları............................................................ 37
2.1.10.1. Ph-negatif kronik myeloid lösemi ........................................................... 37
2.1.10.2. Kronik myelomonositik lösemi............................................................... 37
2.1.10.3. Eozinofilik lösemi .................................................................................. 38
2.2. WT1 geni........................................................................................................... 39
2.2.1. Genin yapısı.................................................................................................. 39
2.2.2. Lösemide WT1 Geninin Rolü........................................................................ 43
2.2.3. Lösemide WT1 mutasyonları ........................................................................ 45
2.2.4. WT1 sinyal iletim mekanizması .................................................................... 47
2.2.5. WT1 geninin onkogenik aktivitesi................................................................. 49
3. GEREÇ VE YÖNTEM ............................................................................... 51
3.1. Gereç ................................................................................................................. 51
3.1.1. Materyal........................................................................................................ 51
3.1.2. Kimyasal maddeler ve malzemeler ................................................................ 52
3.1.3. Kullanılan Cihazlar ....................................................................................... 53
3.1.4. Tampon ve Çözeltiler.................................................................................... 53
3.1.4.1. Lenfosit İzolasyonu ve Jel Elektroforezi Tampon ve Çözeltiler................. 53
3.1.4.2. FISH’te kullanılan tampon ve çözeltiler.................................................... 54
3.2. YÖNTEMLER .................................................................................................. 56
3.2.1. Moleküler Biyoloji........................................................................................ 56
3.2.1.1. Kandan Lenfosit İzolasyonu ..................................................................... 56
3.2.1.2. Lenfositlerden RNA İzolasyonu ............................................................... 57
3.2.1.3. cDNA Sentezi .......................................................................................... 58
3.2.1.4. NESTED PCR.......................................................................................... 59
3.2.1.5. Elektroforez İşlemleri............................................................................... 62
3.2.2. Flüoresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) ........................................................ 63
3.2.2.1. Periferik kandan direkt yayma tekniği ...................................................... 64
3.2.2.2. Lenfositlerden yayma tekniği ................................................................... 64
3.2.2.3. Ön İşlem ve Prob uygulanması ................................................................. 64
3.2.2.4. Probun hazırlanması ................................................................................. 65
 8

3.2.2.5. Hibridizasyon sonrası yıkamalar............................................................... 66

4. BULGULAR .............................................................................................. 67
4.1.Hasta ve kontrol grubunun özellikleri ................................................................. 67
4.2. WT1 Ekspresyonunun Sonuçları ........................................................................ 68
4.3. FISH incelenmesinin değerlendirmesi................................................................ 72
4.3.1. Sinyallerin değerlendirilmesi......................................................................... 75
4.3.2. D-FISH yönteminin normal hücre aralığı ...................................................... 75
4.4. İstatistikler......................................................................................................... 81
5. TARTIŞMA................................................................................................ 84
KAYNAKLAR .......................................................................................................... 87
FORMLAR .............................................................................................................. 105
ETİK KURUL KARARI .......................................................................................... 108
ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................. 110
 9

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 2-1: Kronik myeloproliferatif hastalıklarda görülen sitogenetik anomaliler........23

Tablo 2-2: WT1 geninin hedef genleri .........................................................................47
Tablo 3-1: Yaş ortalaması ve cinsiyete göre hastaların dağılımı...................................51
Tablo 3-2: Yaş ortalaması ve cinsiyete göre kontrollerin dağılımı................................51
Tablo 3-3: Kandan Lenfosit İzolasyonu .......................................................................56
Tablo 3-4: Hücrelerden RNA izolasyonu .....................................................................57
Tablo 3-5: cDNA sentez yöntemi ................................................................................58
Tablo 3-6: GAPDH Geninin Primer Dizileri................................................................60
Tablo 3-7: Birinci PCR için Reaksiyon Karışımı .........................................................60
Tablo 3-8: Birinci PCR için Reaksiyon Şartları ...........................................................60
Tablo 3-9: İkinci PCR için Reaksiyon Karışımı ...........................................................61
Tablo 3-10: İkinci PCR için Reaksiyon Şartları ...........................................................61
Tablo 3-11: Ön İşlem aşamaları...................................................................................65
Tablo 3-12: Prob uygulama aşamaları..........................................................................66
Tablo 3-13: Hibridizasyon sonrası aşamalar. ...............................................................66
Tablo 4-1: Hastaların klinik bulgularına göre dağılımı.................................................67
Tablo 4-2: Hastaların PCR sonuçları............................................................................70
Tablo 4-3: Kontrol Grubunda PCR sonuçları ...............................................................71
Tablo 4-4: Sinyal dağılım şekillerinin sınıflandırılması................................................75
Tablo 4-5: Hastaların FISH sonuçları ..........................................................................76
Tablo 4-6: Hastalar ve kontroller arasında WT1 gen ekspresyonunun karşılaştırılması 81
Tablo 4-7: Hastalarda fazlara göre WT1 ekspresyonu..................................................81
Tablo 4-8: Hastalarda klinik fazlara göre Philadelphia kromozom pozitifliği ...............82
Tablo 4-9: Hastalarda FISH sonucu ve WT1 ekspresyonunun karşılaştırılması ............82
Tablo 4-10: Normal granulositlerin faz ile ilişkisi........................................................83
Tablo 4-11: Normal granulositlerin Philadelphia yüzdesi ile ilişkisi.............................83
 10

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 2-1: KML hücrelerinin oluşumu .........................................................................21

Şekil 2-2: Translokasyonların gen ekspresyonunu etkileme yolları ..............................22
Şekil 2-3:BCR/ABL Füzyon proteininin aktivitesi.......................................................26
Şekil 2-4: BCR ve ABL genleri ve füzyon sonucu oluşan transkriptler ........................27
Şekil 2-5: Sinyal iletim yolları.....................................................................................29
Şekil 2-6: Lösemi hücrelerinde çoklu ilaç direncinden sorumlu mekanizmalar ............30
Şekil 2-7: Tirozin kinaz inhibitörlerin etki mekanizması..............................................33
Şekil 2-8: WT1 genin yapısı ........................................................................................40
Şekil 2-9: WT1 geninin izoformları .............................................................................41
Şekil 2-10: WT1 Proteinin Yapısı................................................................................42
Şekil 2-11: WT1 geninin transkripsiyonu düzenlenme mekanizması...........................48
Şekil 3-1: WT1 geninin Nested PCR şeması ................................................................59
Şekil 3-2: Probun bağlandığı bölge..............................................................................63
Şekil 4-1: Birinci PCR sonuçları..................................................................................68
Şekil 4-2: Birinci PCR Sonuçları (Devam) ..................................................................69
Şekil 4-3: Hastaların ikinci PCR Sonuçları ..................................................................69
Şekil 4-4: Hastaların ikinci PCR Sonuçları (Devam)....................................................70
Şekil 4-5: Kontrollerin ikinci PCR sonuçları................................................................71
Şekil 4-6: BCR/ABL translokasyonu D-FISH sinyal şekilleri ......................................73
Şekil 4-7: Aynı hücrede farklı filtrelerle alınan resimlerdeki değişiklikler....................74
Şekil 4-8: Farklı hücre yapılarında Philadelphia kromozomu .......................................77
Şekil 4-9: Farklı hastalarda 3 füzyon (3F) sinyal dağılımı............................................78
Şekil 4-10: Farklı hastalarda 2R2G normal sinyal dağılım şekli ...................................78
Şekil 4-11 Farklı hücrelerde delesyona ait tipik sinyaller .............................................79
Şekil 4-12: Hastalarda görülen farklı atipik sinyal şekilleri ..........................................80
 11

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ

ABL: Abelson murine leukemia virus (A-MuLV) onkogeni

ALL: Akut lenfoblastik lösemi

AML: Akut myelojenik lösemi

BCR /ABL: BCR ve ABL genlerini içeren füzyon geni

BCR: Break point cluster region geni

cDNA: Complementary DNA (single – stranded DNA)

CEP110: Centrosome-associated protein 110

D-FISH: Çift Renk Çift Füzyon FISH (Dual color dual fusion FISH)

EDTA: Etilendiamintetraasetikasit

EGR1: Epidermal growth factor receptor 1

EtOH: Etil Akol

FAB: French-American-British cooperative group classification

FGFR1: Fibroblast growth factor receptor 1

FIP1L1: FIP1-like 1 geni

FISH: Flüoresan in situ hibridizasyon

FOP: FGFR1 oncogene partner

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

G-CSF: Granulosit koloni-tetikleyici faktör

GM-CSF: Granulosit-makrofaj koloni-tetikleyici faktör

H4: Histone 4

HERV-K: Human endogenous retrovirus protein (K family)

HIP1: Huntingtin interacting protein 1

HLA: Human leukemia antigen

IL-3: interlökin 3
 12

JAK2: Janus kinaz 2

KML: Kronik myelojenik lösemi

MML: Mixed lineage leukemia geni

MRD: Minimal residual disease

mRNA: messenger RNA

PBS: Fosfat tamponu

PDGFRA: Platelet-derived growth factor receptor α

PDGFRB: Platelet-derived growth factor receptor β

Ph: Philadelphia kromozomu

PK - FISH: Periferik Kan yaymasında Flüoresan in situ hibridizasyon

RAB5: Rabaptin-5 geni

RT PCR: Ters transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu

SCF: Kök hücre faktörü

siRNA: Small interference RNA

TEB: Tris Borat Tamponu

TEL: Translocation E26 transforming-specific leukemia protein

WAGR: Wilms’ tümör, aniridia, genitoüriner anomaliler ve mental retardasyon

WT1: Wilms’ tümör geni 1

ZNF198: Çinko parmak proteini 198

 13

ÖZET

Shyqyriu E. Kronik Myelojenik Lösemili hastalarda WT1 gen ekspresyonu ve Genetik

Değişikliklerin Araştırılması. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Temel
Onkoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. 2006.

Kronik myeloid lösemi (KML) günümüzde en çok araştırılan kanserlerden

biridir. Wilms’ tümör geni 1 (WT1) mezotelyal dokularda ve ürogenital organların
gelişiminde rol oynayan, çinko-parmak yapısına sahip bir transkripsiyon faktörüdür.
İmmatür hematopoetik öncül hücrelerde yüksek seviyede ifade edilmesine ve
farklılaşma sırasında ekspresyonunda görülen azalmaya dayanarak WT1 geninin
hematopoezde etkili olabileceği düşünülmüştür. Akut lösemilerde, yüksek seviyede
ifade edilmesi ve somatik mutasyonlarının görülmesi nedeniyle WT1 geninin lösemi
gelişiminde etkili olabileceği öne sürülmüştür. WT1 gen ekspresyonunun KML
prognozu ile ilişkisi halen araştırılmaktadır. Bu çalışmada 57 KML hastası ve 50
sağlıklı bireyden oluşan gruplarda WT1 gen ekspresyonu nested RT-PCR yöntemi ile
değerlendirilmiştir. Kontrol geni olarak GAPDH geni kullanılmıştır. KML hastalarının
%85,9’unda (49/57) WT1 ekspresyonu pozitif bulunmuştur. WT1 ekspresyonu sağlıklı
bireylerin %38’inde (19/50) pozitif bulunmuştur. WT1 geninin KML hastaları ile
kontrol grubunda tespit edilen ekspresyon değerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı
fark gözlenmiştir (p < 0,001).
KML hastalarının %95’inde görülen t(9;22)(q34;q11) Philadelphia
kromozomunun varlığı BCR ve ABL genlerinin füzyonuna neden olmaktadır. BCR-
ABL füzyonunun periferik kan yaymasında flüoresan in situ hibridizasyon (PK-FISH)
yöntemi ile değerlendirilmesi hastaların takibinin daha sık ve pratik bir şekilde
yapılması için yeni bir yaklaşım olabilir. Bu çalışmada değişik klinik fazlarda bulunan
35 KML hastasının periferik kan yaymasından BCR-ABL füzyonu değerlendirilmiştir.
Hastalığın klinik fazı ile PK-FISH sonuçları arasında anlamlı ilişki bulunmuştur (p <
0,001). FISH ile yapılan inceleme sonucunda belirlenen Philadelphia yüzdesinin WT1
ekspresyonu ile karşılaştırılması istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P = 0,0488).
Sonuç olarak, çalışmamızda WT1 gen ekspresyonunun lösemide ve daha az ölçüde de
normal hücrelerde proliferasyonun moleküler belirteci olabileceği öne sürülmüştür.

Anahtar Kelimeler: WT1; Nested PCR; FISH; KML; BCR-ABL.

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından T–

780/27122005 no’lu proje olarak desteklemiştir.
 14

ABSTRACT

Shyqyriu E. WT1 gene expression and genetic alternations in patients with Chronic
Myelogenuos Leukemia. Istanbul University, Institute of Health Sciences, Basic
Oncology Department. Master Thesis. Istanbul. 2006.

Chronic myelogenuos leukemia (CML) is probably the most extensively

studied human malignancy. The Wilms’ tumor gene 1 (WT1) is a zinc-finger
transcription factor involved in the development of urogenital organs and mesothelial
tissues. Based on the fact that WT1 is highly expressed in immature hematopoietic
progenitor cells, followed by a rapid downregulation during differentiation, a role of
WT1 in hematopoiesis was suggested. Overexpression of WT1 and presence of somatic
mutations are frequently found in acute leukemia, indicating that WT1 may be involved
in the pathogenesis of leukemia. In CML patients, the WT1 expression pattern and its
correlation with disease progression have not been well documented. Herein WT1
expression was assessed by nested RT-PCR technique relative to the control gene
GAPDH in 57 CML patients and 50 healthy volunteers. WT1 expression was detected
in 85,9% (49/57) of the CML patients. WT1 expression was detectable in 38% (19/50)
of volunteers. The difference was highly significant (p < 0,001).
The Philadelphia translocation t(9;22)(q34;q11) is present in 95% of KML
patients and results in the fusion of the BCR and ABL genes. Evaluation of the BCR-
ABL fusion using interphase fluorescence in situ hybridization on peripheral blood
smears (PB-FISH) might be another approach allowing more frequent and reliable
follow-up of the patients. In this study the BCR-ABL fusion was evaluated in peripheral
blood smears of 35 CML patients at different clinical phases. A significant correlation
was found between PB-FISH results and the clinical phase (p < 0,001). Also the ratio of
Philadelphia chromosome, calculated by FISH analysis correlated with WT1 expression
(P = 0,0488). In conclusion, our results support the view that WT1 gene is a surrogate
marker of proliferation in CML and to a lesser degree in normal hematopoiesis.

Key Words: WT1; NESTED PCR; In situ hybridization, Fluorescence; CML chronic;
BCR-ABL

The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project
No. T-780/27122005.
 15

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Kronik myelojenik lösemi (KML) günümüzde en çok araştırılan kanserlerden

biridir. 1960 senesinde belirli bir lösemi tipiyle bağlantılı olduğu bilinen ilk kromozom
anomalisi olan Philadelphia kromozomunun tanımlanması kanser biyolojisinde bir
dönüm noktası olmuştur (1).

WT1 geni ilk olarak 1990 senesinde, WAGR (Wilms tümörü, aniridia,
genitouriner anomaliler ve mental retardarasyon) sendromlu hastalarda delesyonu
görülen 11p13 kromozom bölgesine haritalanan bir cDNA olarak tanımlanmış, ilk
klonu, WT33, B-hücreli lösemi hücre soylarından izole edilmiştir (2,3).

WT1 Geni EGR1 çinko-parmak yapısı gösteren transkripsiyon faktörüne

benzeyen bir protein kodlamaktadır. Yapıda ayrıca transkripsiyonun baskılanmasında
(ekson 1) ve aktivasyonunda (ekson 3,4) görev alan iki fonksiyonel bölge
bulunmaktadır (4,5).

WT1 pediyatrik bir böbrek tümörü olan Wilms' tümöründe tümör baskılayıcı
gen olarak tanımlanmıştır (6,7). WT1’in myeloid ve lenfoid lösemi hücre soylarında ve
lenfoid lösemilerin %80'inde, myeloid lösemilerin ise %90'ında eksprese olduğu
bildirilmiştir (8,9).

Günümüzde WT1 geninin löseminin patogenez ve tedavisinde önemli rol

oynadığına işaret eden veriler dikkat çekmektedir. Yeni çalışmalar WT1 mRNA'sının
ileri KML vakalarında (akselere veya blast krizi) moleküler takip için marker olarak
kullanılabileceğine işaret etmektedir (10).

KML hastalarında WT1’in MRD (Minimal Residual Disease) tespiti için BCR-
ABL’nin yanı sıra kullanılabilecek yeni bir moleküler marker olduğu ileri sürülmüştür
(11,12,13). En yüksek WT1 ekspresyonu immatür fenotipli lösemilerde, örneğin
KML’de blast krizi sırasında görülmektedir (14).

WT1 geninin KML'deki ekspresyonu hakkında çeşitli çalışmalarda farklı

sonuçlar elde edilmiştir. Northern blot ve RT-PCR analiz sonuçlarına göre WT1 geninin
aşırı ekspresyonu sadece blast krizi fazında görüldüğü, kronik ve akselere fazda tespit
edilmediği bildirilirken, kantitatif RT-PCR analizi ile ekspresyonun bütün KML
hastalarında görüldüğü, ancak ekspresyon seviyesinin farklılıklar gösterdiği ileri
 16

sürülmüştür (15,16). siRNA tekniğini kullanarak yapılan bir çalışmada WT1’in kronik
myelojenik lösemi hücrelerindeki terapötik stratejiler için uyumlu bir hedef olabileceği
belirtilmiştir. (17)

WT1 geni tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesine rağmen, lösemilerde WT1
geninin yaban tipi yüksek seviyelerde ifade edilmektedir (18). Ayrıca, WT1 geninin
yüksek ekspresyonu akciğer, kolon, meme, tiroid, pankreas duktal karsinomu, baş
boyun skuamöz hücreli karsinomu, astrositik tümörler, kemik ve yumuşak doku
sarkomları gibi çeşitli solid tümörlerde de gösterilmiştir (19,20).

t(9;22)(q34;q11) Philadelphia (Ph) kromozomunu ve BCR-ABL füzyon genini

oluşturur. Bu anomali KML hastalarının %95’inde görülmektedir. İnterfaz FISH, BCR-
ABL füzyonunun tespitinde konvansiyonel sitogenetik analizinin dezavantajlarını
aşabilen bir yöntemdir (21). Periferik kan yaymasından yapılan FISH KML hastalarının
takibi için uygulanması kolay ve güvenilir bir yöntemdir (22).

Çift renk çift füzyon D-FISH yöntemi, yüksek spesifitesi ve iki füzyon sinyali
vermesi sayesinde interfaz çekirdeklerinde düşük seviyedeki BCR-ABL füzyonunu dahi
tespit edebilmektedir. Yapılan çalışmalarda cut-off değerinin %0.079’a kadar indiği ve
bu nedenle yöntemin MRD tespiti için kullanılabileceği öne sürülmüştür (23).

t(9;22)(q34;q11)’nin kırılma noktalarında derivatif kromozom 9’un delesyonları

tanımlanmıştır (24). Bu delesyonlar translokasyonun meydana gelişi sırasında oluşan
büyük delesyonlardır ve KML hastalarının %15’inde bulunurlar (25). Delesyonların
varlığı konvansiyonel tedavi (interferon veya hidroksiüre) alan KML hastaları için kötü
prognoz habercisidir (26). İmatinib tedavisi gören hastalarda ise kromozom 9
delesyonlarının prognoz ile ilişkisi halen araştırılmaktadır.

Çalışma bu bilgiler ışığında farklı fazlardaki kronik myelojenik lösemili

hastalarda WT-1 gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla planlanmıştır. WT1
ekspresyonunun KML ile ilişkisini saptamak için veriler sağlıklı kontrollerdeki
ekspresyon ile karşılaştırılacaktır. Ayrıca D-FISH yöntemi ile periferik kan
yaymalarından BCR-ABL füzyonu incelenecek ve bu yöntemle elde edilen sonuçların
WT1 ekspresyonu ile ilşkisi araştırılacaktır. Çalışmada, WT1 geninin normal
hematopoez ve lösemideki rolü hakkında mevcut bilgilere katkıda bulunmayı
amaçlanmıştır.
 17

2. GENEL BİLGİLER

Son yıllarda yapılan kanser araştırmaları kanser kök hücresi üzerinde

yoğunlaşmış durumdadır. Bu görüşe göre bir bitkinin tekrar kökünden büyümesi gibi
tümörler de kanser kök hücrelerinden köken alan kanser hücreleri ile devamlı
beslenmektedirler. Eğer bu hipotez doğru ise kanserin tedaviden sonra tekrar etmesi,
uygulanan tedavinin çibanın sadece yaprak ve gövdesini kesip köklerini yerinde
bırakmasından kaynaklanmaktadır.

Kanser kök hücreleri tipik tedavilere karşı direnç gösterirler. Apoptoz ve

anjiyogenez üzerinde yapılan araştırmaların hala kanser tedavisine beklenen çözümü
getirememiş olması, biyologların kanser gelişimi ile ilgili önemli bir noktayı gözden
kaçırmış olabileceklerini düşündürmektedir. Araştırmacılar kanser kök hücresi fikrinin
kanser hakındaki anlayışımıza yeni bir boyut getireceğine inanmaktadırlar (27).

Lösemi, kanser kök hücresi çalışmaları için en uygun kanser tipidir. Çünkü
kanser hücrelerinin ve myeloid kök hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu alınan
kandan çok kolay bir şekilde yapılabilmektedir. Lösemilerde görülen çeşitli
translokasyonlar BCR-ABL ve MLL-AF9 gibi füzyon genlerinin oluşmasına neden
olmaktadır. Hücresel farklılaşma, hücrelerin kendini yenileme gibi immatür özellikleri
kayb ederek oluşturacağı hücreye ait özellikleri geliştirmeleri ile sonuçlanan tek yönlü
bir olaydır. Kansere ait bazı genetik değişiklikler örneğin MML-AF9 translokasyonu,
myeloid kök hücrelerinde bazı kök hücreye spesifik genlerin anormal ekspresyonuna
neden olmaktadır. Bu şekilde hücreler tekrar kendilerini yenileme özelliği kazanırlar ve
kanser kök hücrelerine dönüşürler. Kanser kök hücreleri löseminin başlamasını ve
ilerlemesini sağlamaktadırlar. Bu konu üzerindeki araştırmalar devam etmekte ve
yakında kanser tedavisinde yeni ve kesin bir çözüm getirecekleri umulmaktadır (28).
 18

2.1.Kronik Myelojenik Lösemi

Kronik Myelojenik Lösemi (KML) aynı zamanda kronik myeloid lösemi, kronik
granulositik lösemi olarak da tanımlanır. KML pluripotent hematopoetik kök
hücrelerinde kazanılan genetik değişikliklerden kaynaklanan klonal bir hastalıktır.

Değişikliğe uğrayan kök hücreleri, normal hematopoezin yerine geçen ve total

myeloid kitlesinin büyük miktarda artmasına neden olan bir diferensiye hücre
populasyonu oluşturur (29). 1960’ta Philadelphia (Ph) kromozomunun tanımlanması
KML araştırmalarında önemli bir dönüm noktası oluşturmuştur (30). 1980’lerde BCR-
ABL kimerik geninin ve kodladığı onkoprotein tanımlanmıştır (31). Daha sonra, BCR-
ABL geni klonlanıp retroviral bir vektör ile sıçan hemapoetik kök hücrelerine
nakledilmiş ve değişime uğrayan kök hücrelerin sıçanlarda insandaki KML hastalığına
benzeyen bir hastalığı oluşturduğu gözlenmiştir (32).

2.1.1.Sınıflandırma

KML hastalarının çoğunda; splenomegali, lökositoz ve Ph kromozomunun

varlığı ile nitelendirilen homojen bir hastalık görülür. Hastaların küçük bir kısmında ise,
tipik hastalık ile benzerliği az olan atipik KML, kronik myelomonositik lösemi veya
kronik netrofilik lösemi olarak adlandırılan bir hastalık formu görülür. Çocuklarda ise
juvenil kronik myelomonositik lösemi olarak bilinen bir hastalık görülebilmektedir. Bu
KML varyantlarının hiçbirinde Ph kromozomuna rastlanmaz (33).

2.1.2.Epidemiyoloji ve Etiyolojisi

KML’nin insidansı dünya çapında sabittir. Batılı ülkelerde görülme sıklığı yılda
100.000 populasyonda 1,0-1,5 arasındadır ve erişkin lösemi olgularının %15-20’sini
oluşturmaktadır. Her yaşta görülebilsede 20 yaş altında nadirdir. Belirtiler ortalama 50-
60 yaş arasında görülür. İnsidansı erkeklerde kadınlara oranla daha yüksektir.
 19

Türkiye’de sıklığı bilinmemektedir, Türk Hematoloji Derneği Kronik Lösemi Alt

Komitesi tarafından epidemiyolojik bir çalışma başlatılacaktır (34).

KML gelişme riski yüksek doz radyasyona maruz kalındığında artar. Örneğin
1945’te Japonya’da patlayan atom bombasından sonra sağ kalanlar ve ankilozan
spondilit tedavisi için ışın alan hastalarda görülen risk artışı buna örnek oluşturmaktadır
(35). Hiçbir yatkınlık faktörü tanımlanmamıştır. Olgular sporadik olarak
değerlendirilmektedir. Ailevi yatkınlık gösterilmemiştir ve HLA genotipleri ile belirli
bir bağlantı ispatlanmamıştır. Gelişmesinde rol oynayan herhangi bir enfeksyon ajanı
belirlenmemiştir.

Klinik olarak KML iki fazlı bir hastalıktır. Genelde teşhis ilk kronik, sabit veya
ağrısız fazda konur ve birkaç sene sonra hastalık kendiliğinden daha ileri bir faza geçiş
yapar. İleri faz erken akselere faz ya da geç akut blastik faz diye iki alt gruba ayrılır.

Teşhis konulmadan önceki hastalık süreci halen cevaplanmamış bir sorudur.

Eğer hastalığın tek bir kök hücrede gelişen transformasyon olayı ile başladığı
varsayılırsa, bu transformasyonun gerçekleşmesi hastalığın klinik bulgularının
görülmesinden 5-10 sene önce olabilir. Bu değerlendirme lökositlerin teşhis öncesi ve
teşhis sonrası bölünme hızlarının çok farklı olmadığı varsayımına ve atom bombalarının
radyasyonuna maruz kalanlarda en erken tespit edilen KML insidans artışının 7 yıl
sonra olduğu gözlemine dayalıdır.

KML teşhisi konduğunda hastalar genelde kronik fazdadır. Bu kronik faz tipik
olarak 2-7 yıldır, ama nadiren 15 veya 20 yıldan fazla devam edebilir. Spontan
remisyonlar daha da nadirdir. Vakaların yarısında kronik faz birdenbire öngörülemeden
daha agresif bir faza dönüşür. Önceleri ‘blast krizi’ olarak tanımlanan bu faza
günümüzde akut veya blastik transformasyon denmektedir. Vakaların diğer yarısında,
akselere faz olarak bilinen bir ara faz sayesinde hastalık tedricen gelişir. Myeloblastik
ve lenfoblastik özellikleri olan blastik tranformasyondan önce akselere faz, aylar veya
yıllar sürebilir. Blastik faz geliştikten sonra sağkalım 2-6 ay arasındadır (33).
 20

2.1.3. Evreleme

Kronik faz, süresini tahmin edebilmek amacıyla alt sınıflara ayrılmıştır. En çok
kullanılan sınıflama, Sokal ve arkadaşları tarafından tanımlanmış olan sınıflamadır. Bu
sınıflama teşhis sırasındaki hasta yaşı, blast hücre sayısı, dalak büyüklüğü ve trombosit
sayımına dayalıdır.

Lökosit bölünme zamanı yavaş olan hastalarda hızlı bölünme zamanı olan
hastalara kıyasla sağkalım süreleri daha uzundur. Ayrıca hastanın ilk tedavi sırasındaki
cevabı sağkalım süresi hakında bilgi verir; örneğin, teşhis sonrası ilk senede lökosit
sayımını kontrol etmek amacıyla düşük seviyede sitotoksik ilaçlar veya interferon α
(INF- α) tedavisi ile tam sitogenetik cevaptan sonra elde edilmesi iyi prognostik
faktördür.

Kötü prognoz faktörleri olan 9. ve 22. kromozomlar arasındaki translokasyon

sonucu oluşan derivatif kromozom 9 (der9) üzerinde delesyonlar ve lösemi hücrelerinde
kromozom telomerlerinin hızlı kısalması gelecekte KML hastalarını evrelemek için
kullanılabilir. Hastalığın toplam sürecini tahmin etmek için en bilgi verici yaklaşım
BCR-ABL gen ekspresyon profilinin çıkarılması olabilir (36).

2.1.4. Sitokinetiği

Genellikle KML’nin gelişmesi, tek bir pluripotent hematopoetik kök hücresinin

BCR-ABL füzyon genini taşıyan Ph kromozomunu edinmesi sayesinde olur. Ph
kromozomu, lösemi öncül hücrelerine çoğalma önceliği kazandırır ve böylelikle
zamanla normal iliğin yerini lösemik myeloid bir kitle alır (37). Bu kitle genişleyerek
normal yağ boşlukların yerini doldurur ve yetişkinlerde normalde hematopoeze
katılmayan uzun kemik bölgelerini işgal eder. Artan myelopoez öncelikle granulosit
serilerini kapsar, megakaryositler ve trombosit sayıları da genellikle artar (29). Şekil 2-
1.
 21

Şekil 2-1: KML hücrelerinin oluşumu

KML kendini yenileyen hematopoetik kök hücrelerin BCR-ABL füzyon ürününü ifade etmesi ile başlayan iki fazlı
bir hastalıktır. Kök hücreleri myeloid öncül hücrelerine (MOH) dönüşebilirler. Bunlar da daha sonra, granulosit ve
makrofaj öncül hücrelerine (GMOH), ve de megakaryosit ve eritrosit öncül hücrelerine (MEOH) dönüşürler. Kök
hücreleri ayrıca T ve B lenfositlerin öncül hücreleri olan lenfoid öncül hücrelerine (LOH) dönüşebilirler. KML’nin
kronik fazı granulositik hücrelerin sayısının artmasıyla karakterize edilir. BCR-ABL dışında ek genetik
değişikliklerin eklenmesiyle KML kronik fazdan blast fazına geçer. Blastik faz myeloid veya lenfoid blast
hücrelerinin birikmesi ile karakterize edilir. KML kök hücreleri pluripotent olmasına rağmen B-hücre üretimi çok
düşük seviyeye iner, T hücre öncüllerine nadiren rastlanmaktadır. BCR-ABL geninin ekspresyonu lenfopoyezi ve
özellikle T-hücrelerin gelişimini etkiler. (38)

Teorik olarak, myeloid öncül hücrelerin bağımsız proliferasyonu hematopoezin

fizyolojik tetikleyicilerine karşı duyarlılığın artmasına veya normal baskılayıcılarına
karşı duyarlılığın kaybolmasına bağlı olabilir. Bu durumdan yola çıkarak, KML öncül
hücrelerinin hematopoetik büyüme faktörlerine karşı duyarlılığını hesaplama yönünde
çok çaba sarfedilmiştir. Özellikle granulosit koloni-tetikleyici faktör (G-CSF),
granulosit-makrofaj koloni-tetikleyici faktör (GM-CSF), interlökin 3 (IL-3), kök hücre
faktörü (SCF) ve eritropoetin gibi büyüme faktörleri kullanılmıştır. Bağımsız
proliferasyonun G-SCF ve IL-3 faktörlerini kapsayan bir otokrin döngüye bağlı
olabileceğine dair bazı deliller bulunmaktadır. (39,40).
 22

2.1.5. Sitogenetiği

Bir çok onkogen lösemi ve lenfomalarda bulunan kromozom değişikliklerini

içeren kırılma noktalarında yer alır. Bir translokasyonun diğer kırılma noktasında
fonksiyonel önemi olan başka bir gen bulunur. Translokasyon sonucunda farklı
bölgelerde yer alan genler bir araya gelir ve yeni genlerin kontrolüne geçerler. Bu
durumda düzensizlik ve anormal ekspresyon görülür. İkinci bir seçenek olarak anormal
aktiviteye sahip yeni bir füzyon geni oluşabilir. Translokasyon sonucu oluşan
değişiklikler Şekil 2-2’de kısaca anlatılmıştır.

Ekspresyonun
A B
düzenlenmesi

Füzyon Proteinin Oluşması Normal Proteinin Yüksek Ekspresyonu

Şekil 2-2: Translokasyonların gen ekspresyonunu etkileme yolları

Birinci yolda anormal aktiviteye sahip yeni bir füzyon geni meydana gelmesi sayesinde gen ekspresyon seviyesinin
değişmesi görülmektedir. İkinci yolda yer değiştirme genin sürekli aktif halde bulunan başka bir genin yanında yer
almasına neden olur ve sürekli ekspresyon ile sonuçlanır (41).

Hematolojik hastalıklarda etkilenen hücrelerin sitogenetik incelemesi hastalığın

teşhis ve sınıflandırması açısından önemlidir. Örneğin, akut lösemilerde karyotipin
belirlenmesi tedaviyi etkileyen prognostik bir faktördür. Ayrıca, sinsi lösemilerde
yapılan sitogenetik incelemeler ile hastalığın daha agresif bir faza geçişi öngörülebilir.
Ayrıca, kemik iliği transplantasyonunun sonucu öngörülebilir ve daha sonra
uygulanacak tedaviler için fikir verebilir. Tablo 2-1’de kronik myeloproliferatif
hastalıklarda en çok rastlanan sitogenetik değişiklikler özetlenmiştir.
 23

Tablo 2-1: Kronik myeloproliferatif hastalıklarda görülen sitogenetik anomaliler

Lösemi Tipi Sitogenetik Anomaliler Füzyon proteinleri
KML veya ALL t(9;22) (q34;q11) BCR-ABL
BCR-ABL negatif KML t(8;22)(p11;q11) BCR-FGFR1
Atipik KML t(4;22)(q12;q11) BCR-PDGFRA
Atipik KML / BCR-ABL negatif KML t(9;12)(q34;p13) TEL-ABL
Atipik KML / BCR-ABL negatif KML t(9;12)(q24;p12) TEL-JAK2
Atipik KML / BCR-ABL negatif KML t(9;22)(p24;q11) BCR-JAK2
KMML / atipik KML t(5;12)(q31-33;p13) TEL-PDGFRB
KMML / atipik KML t(5;7)(q33;q11) HIP1-PDGFRB
KMML / atipik KML t(5;17)(q33;p13) RAB5-PDGFRB
KMML / atipik KML t(5;10)(q33;q21) H4-PDGFRB
8p Myeloproliferatif sendrom t(8;13)(p11;q12) ZNF198-FGFR1
8p Myeloproliferatif sendrom t(6;8)(q27;p11) FOP-FGFR1
8p Myeloproliferatif sendrom t(8;9)(p12;q33) CEP110-FGFR1
8p Myeloproliferatif sendrom t(8;19)(p12;q13) HERV/K-FGFR1
Hipereozinofilik sendrom del(4)(q12) FIP1L1-PDGFRA
Bazı KML hastalarında Ph kromozomu dışında farklı sitogenetik anomaliler görülür. Bu hastalarda rastlanan en
yaygın translokasyonlar t(5;12)(q33;p13) ve t(18;13)(p11;q12)’dir. Her iki translokasyonun oluşturduğu füzyon
proteinlerin bir kısmı reseptör tirozin kinaz kodlamaktadır. Bu translokasyonlar BCR-ABL onkoproteini tarafından
aktive edilen yollara benzeyen sinyal iletim yollarını aktive ederek KML gelişmesine neden olurlar (42).

Philadelphia kromozomu KML’deki lösemi hücrelerinde görülen karakteristik

sitogenetik anomalidir. İlk zamanlarda Ph1 olarak nitelenen bu kromozom şimdi der22q-
veya Ph kromozomu olarak tanımlanmaktadır. Kromozom 22 ve kromozom 9’un uzun
kolları arasında kromozomal materyelin karşılıklı yer değişmesi sonucunda oluşur. Bu
olay t(9;22)(q34;q11) olarak adlandırılır.
 24

t(9;22) translokasyonu Ph kromozomunda BCR-ABL füzyon genini ve aynı

zamanda derivatif 9q+ kromozomunda ABL-BCR olarak isimlendirilen füzyon genini
oluşturur. Ph kromozomunun oluşma mekanizması hala bilinmemektedir (43).

Bu translokasyonlar sadece söz konusu iki kromozomu kapsadıkları zaman

basit olarak tanımlanırlar, ancak hastaların %10’unda kromozom 9 ve kromozom 22’ye
ilaveten iki farklı kromozomu kapsayan kompleks translokasyonlar görülür. KML
hastalarında, Ph kromozomu bütün myeloid hücre soylarında, bazı B hücrelerinde ve T
hücrelerin çok küçük bir kısmında bulunmaktadır. Vücuttaki diğer hücrelerde
bulunmamaktadır. 1960 senesinden beri lösemi hücrelerinin tanınmasında
kullanılmasına rağmen, gerçek patojenik öneminin anlaşılması 1980’lerde, BCR-ABL
kimerik genini tanımlanmasından sonra olmuştur.

Hastaların %15’i kromozom 9’da küçük delesyonlar taşır. Bu delesyonların Ph

kromozomu üzerinde BCR-ABL füzyonu oluşması sırasında meydana geldikleri
düşünülmektedir ve nispeten kötü prognoz belirticileridir (44,45). Nadiren, klinik olarak
tipik KML bulguları taşıyan bazı hastalar Ph kromozomuna sahip olmamalarına rağmen
moleküler olarak tipik p210 onkoproteinini kodlayan BCR-ABL genine sahiptirler (46).

Bazı hastalar, kronik faz sürecinde ek klonal sitogenetik anomaliler kazanır.

Önceden bu değişikliklerin alkilleyici ajanlarından kaynaklanabileceği düşünüldüyse de
artık spontan olarak meydana gelebildikleri anlaşılmıştır. Tesadüfi olmayan +8, +Ph,
iso17q veya +19 gibi değişikliklerin oluşması bazen bu yeni klonların
genişleyeceklerini ve blastik tansformasyonunun birkaç hafta veya ay içerisinde
gelişeceğini işaretlemektedir. Bazen bu klonlar, iso17q hariç, senelerce klinik olarak
önemsiz kalabilirler (47).
 25

2.1.6. Moleküler Biyolojisi

1980’lerde KML hastalarında, kromozom 9’da yer alan ve bir non-reseptör

tirozin kinaz kodlayan ABL protoonkogeninin kromozom 22’ye transloke olduğu
ispatlandı (48). 1984’te farklı KML hastalarında kromozom 22’deki genomik kırılma
noktalarının, nispeten küçük, 5.8 kb’lık bir bölgede kümeleşmiş olarak bulunduğu
gösterildi ve bu bölgeye ‘kırılma noktaların küme bölgesi’ break point cluster region
(BCR) adı verildi (49). Daha sonra, bu bölgenin, BCR geni olarak bilinen büyük genin
orta kısmını oluşturduğu anlaşıldı ve bu bölgenin adı ‘majör kırılma noktaların küme
bölgesi’ (M-BCR) olarak değiştirildi (50).

2.1.6.1. ABL ve BCR genleri

ABL geni Abelson murine leukemia virus (A-MuLV) tarafından taşınan v-abl
onkogenin insandaki eşdeğeridir ve bir nonreseptör tirozin kinaz kodlar (51). ABL
proteininin 145-kd ağırlığında iki izoformu vardır (52). ABL geninin genomik kırılma
noktasının konumu ise çok değişkendir, ama her zaman ikinci eksonun (a2) yukarısında
yer alır. ABL hücre siklüsunun düzenlenmesinde (53,54), genotoksik strese karşı
hücresel cevap (55) ve integrin sinyal iletim yolları sayesinde hücresel çevre hakında
bilgi iletmesinde görev alır (56).

BCR proteini 160 kd ağırlığındadır (52). İlk eksonu substratları BAP-1 ve BCR
olan bir serin-treonin kinaz kodlar (57). Molekülün merkezinde NF-κB transkripsiyon
faktörünü aktive eden GTP-GDP geçişini tetikleyen, plecktrin-homology (PH) ve dbl-
like domainler yer alır (58). Proteinin karboksil ucu GTPaz aktivitesine sahiptir (59).
Ayrıca, BCR farklı tirozin kısımlarından fosforile edilebilir (60).

Ph translokasyonu kromozom 22’deki BCR geninin 5’-sekanslarının kromozom

9’daki 3’-ABL sekanslarının füzyonu ile oluşur. Bu translokasyon sonucunda 8.5 kb’lık
bir RNA olarak transkribe edilen, moleküler ağırlığı 210 kDa olan bir protein kodlayan
ve kimerik bir gen olan BCR-ABL meydana gelir. p210BCR-ABL onkoproteini normal
ABL proteininden çok daha fazla tirozin kinaz aktivitesi olan bir proteindir (50,61).
Şekil 2-3.
 26

RESEPTÖR LİGAND FÜZYON

TİROZİN KİNAZ PROTEİNİ

SİNYAL LİGAND’A DEVAMLI

YOK BAĞLI SİNYAL SİNYAL

a) b) c)

Şekil 2-3:BCR/ABL Füzyon proteininin aktivitesi

A) Ligand bağlanmadığı zaman reseptör hücreye sinyal iletmiyor. B) Ligandın varlığında hücreye sinyal iletiliyor. C)
Füzyon proteini ise ligandın yokluğunda devamlı olarak hücreye sinyal iletiyor (41).

KML’de, M-BCR’deki kırılmanın hangi eksonlar arasındaki intronda yer

aldığına bağlı olarak BCR-ABL transkriptinin iki formu tanımlanır. Eğer kırılma, b2 ve
b3 eksonların arasındaki intronda yer alıyorsa b2a2 mRNAsı elde edilir. Kırılma b3 ve
b5 eksonları arasında ise b3a2 mRNA’sı elde edilir. Hastaların çoğunda b2a2 veya b3a2
özeliklerini taşıyan transkriptler bulunur, nadiren hastaların lösemi hücrelerinde her iki
transkripte de rastlanır (62). KML hastaları için BCR-ABL transkriptinin çeşidinin
herhangi bir prognostik önemi yoktur. Ayrıca, der9q+’da bulunan resiprokal ABL-BCR
geni hastaların %70’inde ifade edilmesine rağmen, bu genin ekprese edilmesi veya
edilmemesi herhangi bir prognostik önem taşımamaktadır (43). Şekil 2-4, BCR ve ABL
genlerinin yapılarını ve translokasyon sonucunda oluşan farklı transkriptleri daha
detaylı olarak anlatmaktadır.
 27

Kromozom 22
5' 3'
BCR
e1 b1 b2 b3 b4 b5 e19 e23

m-BCR M-BCR µ -BCR

Kromozom 9
ABL 5' 3'
b1 1a a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11

P190
e1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11
e1a2
P210
e1 b1 b2a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11
b2a2
P210
e1 b1 b2 b3a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11
b2a3
P230
e1 b1 b2 b3 b4 b5 e19 a2 a3 a4 a5 a6 a7 a8 a9 a10 a11
b2a2

Şekil 2-4: BCR ve ABL genleri ve füzyon sonucu oluşan transkriptler

ABL ve BCR genlerin üzerindeki kırılma noktaları ve bu farklı kırılma noktalarından ortaya çıkan transkriptler. p190
Bcr/Abl proteini ALL’de, p210 Bcr/Abl KML’de, p230 Bcr/Abl ise KNL’de daha çok rastlanmaktadır (63).

Bazı yetişkin Ph pozitif akut lenfoblastik lösemi (ALL) hastalarının lösemi

hücrelerinde, BCR-ABL füzyon geni bulunur. Ph-pozitif ALL hastalarının üçte birinde,
BCR-ABL geninin moleküler özellikleri KML ile aynıdır, diğer üçte ikisinde ise
genomik kırılma noktası BCR geninin ilk eksonunda yer alır. Bu bölge minor kırılma
nokta kümesi m-BCR olarak adlandırılır. BCR-ABL geni BCR geninin ilk eksonunun
(e1), ABL geninin ikinci eksonu (a2) ile birleşmesinden meydana gelir. Bu genin
mRNAsı e1a2 olarak adlandırılır ve 190 kDa ağırlığında p190BCR-ABL proteinini kodlar
(50). KML hastalarında çok nadiren p210 yerine p190 proteini görülür. Kronik
nötrofilik lösemili hastalarında Ph kromozomunun bulunması da nadirdir, bu hastalarda
daha çok, e19a2 füzyon genine bağlı p230bcr-abl onkoproteini oluşur (64).
 28

2.1.6.2. BCR/ABL füzyon proteini ve Sinyal İletim Yolları

BCR-ABL onkoproteininin kök hücrelerinin kinetiğini değiştirme mekanizması

halen çok iyi tanımlanmamıştır. Yapı olarak Bcr/Abl onkoproteini birçok domaine
sahiptir. Abl sekansları Src-homology (SH2 ve SH3) domainlerini, tirozin kinaz
domainlerini, DNA-bağlanma domainini, aktin-bağlanma domainini, çekirdek
lokalizasyon domainini ve nukleer eksport sinyalleri gibi farklı domainleri
kodlamaktadır (65).

Bcr kısmında ise, coiled-coil oligodimerizasyon domaini, serin-treonin kinaz

domaini, pleckstrin homology (PH) domaini, Dbl/cdc24 guanin nukleotid değiştirme
faktörü homolojisi, SH2 ve Grb2 bağlanma bölgeleri ve tirozin fosforilizasyon bölgeleri
kodlanmaktadır (66).

Bcr/Abl kinazların ekspresyonu hücresel proliferasyonu tetikler (67), apoptozu

azaltır (68,69), sitokinlere bağlı büyümeyi artırır (70), kemik iliği stromasına
bağlanmayı azaltır ve hücre iskeletinde anomalilere yol açar (71).

Bcr/Abl füzyon proteinin onkogenik aktivitesi transformasyona yol açan çeşitli

sinyal treonin yollarını aktif hale getirerek ortaya çıkar. Etkilenen moleküller arasında:
Myc, Ras, c-Raf, MAPK/ERK, SAPK/JNK, Stat, NFKB, PI-3 kinaz ve c-Jun sinyal
moleküleri yer alır (72-74). BCR/ABL füzyon proteini, RAS/MAPK, PI-3 kinaz, c-
CBL ve CRKL sinyal iletim yollarını aktive eder, ayrıca proliferasyon ve
transformasyonda önemli rol oynayan JAK-STAT ve Src sinyal iletim yollarının
aktivasyonunda da görev alır. Apoptozun baskılanması, PI-3 ve RAS yollarının aktive
edilmesi ile BCL-2 ve AKT proteinleri sayesinde olur (63). Şekil 2-5’te BCR-ABL
pozitif hücrelerde sinyal iletim yolları gösterilmiştir.
 29

BCR-ABL ONKOPROTEİNİ

GRB-2
SHC DOK RAS-GAP CBL CRK HÜCRE İSKELET
SOS CRKL PROTEİNLERİ
PI3-K

RAS-GDP RAS-GTP

STAT1- SİTOPLAZMA
STAT5 AKT
RAF-1
SAPK
MEK1
MEK2 BAD

ERK BAD 14-3-3

BCXLL BCXLL
MYC 14-3-3

MİTOKONDRİ -FOSFOR
ÇEKİRDEK

Şekil 2-5: Sinyal iletim yolları

BCR-ABL onkoproteininin hücresel etkileri çeşitli proteinlerle olan etkileşim sonucunda meydana gelir. Etkilenen
proteinler transkripsiyonun aktivasyonu veya baskılanması, apoptoz sinyallerinin mitokondri tarafından işlenmesi,
hücre iskelet proteinlerinin organizasyonu ve inhibitör proteinlerin degradasyonunda rol oynamaktadırlar (42).

Hastalığın ilerlemesinde temel rol oynayan moleküler olaylar halen

bilinmemektedir. Ph-pozitif klonlarda ilave olarak başka genetik değişikliklerin
meydana gelmesi muhtemeldir. Ek olarak meydana gelen değişikliklerin birikerek kritik
bir düzeye ulaşması ile klinik olarak tanımlanabilen değişiklikler görülmeye başladığı
düşünülmektedir. Bu aşamada lösemi hücreleri mutlaka yukarıda bahsedilen sitogenetik
değişikliklerden birine sahiptir. Myeloid transformasyondaki KML hastalarının
%20’sinde, kolon karsinomu ve çeşitli solid tümörlerinin ilerlemesinde rol oynayan
p53 tümör supresör geninde delesyonlar veya nokta mutasyonları görülür.
Megakaryoblastik transformasyondaki KML hastalarında, nadiren retinoblastoma (RB)
geni delesyona uğrar ayrıca LYN, EVI-1 ve MYC genlerinde değişiklikler meydana
gelir. Lenfoid transformasyonu olan hastaların yarısında, normalde sikline bağlı kinaz-
4’ü engellemekte rol oynayan p16 geni homozigot delesyona uğramıştır. Yukarıda
bahsedilen sitogenetik değişikliklerin temelini oluşturan moleküler değişiklikler halen
tanımlanmamıştır (73).
 30

2.1.7. Çoklu ilaç direnci

Çoklu ilaç direnci (multidrug resistance- MDR) tümör hücrelerinin belli bir ilaç
sınıfına ve aynı zamanda farklı bir hedefe yönelik yapılan kemoterapiye karşı
gösterdikleri direnç olarak tanımlanmaktadır. İlk olarak 1970 senesinde kullanılan bu
tanım günümüzde antrasiklin veya vinka alkaloidlerine maruz kalan kültür edilen tümör
hücrelerinde görülen en yaygın fenotiptir.

MDR fenotipi ksenobiyotik olarak tanımlanan sitotoksik ajanlara karşı direnç

görülmesidir. Direnç gelişen hücrelerde intraselüler ilaç konsantrasyonu düşüktür ve
genellikle ilacın dışarı atılmasını sağlayan, ABC ‘ATP-bağlayan kasetler’ ailesine ait
transport proteinlerinin ekspresyonu görülür.

İlaç direncine yol açan diğer mekanizmalar arasında DNA tamirinin artması ve
ilaca bağlı-apoptozun engellenmesi yer alır. Apoptoz tümör hücrelerine mikroçevreden
gelen güçlü sağkalım sinyalleri veya apoptoz yolundaki bir bozukluk nedeniyle
engellenir (75). Lösemi hücrelerinde çoklu ilaç direncinden sorumlu mekanizmalar
Şekil 2-6’da gösterilmiştir.

LÖSEMİ HÜCRESİ

KEMOTERAPİ
3-SAĞKALIM
SİNYALLERİ

4-DNA TAMİR
MEKANİZMALARI 2-APOPTOZUN 1-ABC PROTEİNLERİ
ENGELLENMESİ

Şekil 2-6: Lösemi hücrelerinde çoklu ilaç direncinden sorumlu mekanizmalar

Farklı direnç mekanizmaların arasında: ABC proteinlerinin sayesinde ilaçların hücre dışında atılması (1), Apoptozun
engellenmesi (2), hücre kendine sağkalım sinyali vermesi (3) ve DNA tamir mekanizmaların sayesinde hücrenin
hasarı tamir etmesi (4) (75).
 31

2.1.8.Klinik Özellikleri

Eskiden hastaların çoğu splenomegali, hemoraji veya kansızlık semptomları ile

doktora başvururken, günümüzde yapılan rutin kan sayımları sayesinde, KML teşhisi
hastaların %50’sine semptomların belirlenmesinden önce konmaktadır. Semptomlar
arasında: letarji, enerji kaybı, nefes darlığı, kilo kaybı veya hemoraji yer almaktadır.
Terlemenin artması tipiktir. Spontan ezikler, diş etleri, bağırsak veya idrar yollarında
kanama yaygındır. Görme bozuklukları oluşabilir. Ateş ve lenfadenopati kronik fazda
nadirdir. Teşhis sırasında hastaların %50-70’inde splenomegali vardır. Lökosit
sayılarında artma görülür (76).

2.1.8.1.Kronik Faz

Hastalarda dalak büyümesi ile beraber kansızlık görülür. Hemoglobin

konsantransyonu hastalığın başlangıcında normal seviyededir. Lökosit sayısı teşhis
sırasında 20-200x109/L sınırları arasındadır. Periferik kan yaymalarında blast
formlarından olgun nötrofillere kadar, granulositlerin bütün formlarına rastlamak
mümkündür. Blast hücrelerinin yüzdesinin %12’den daha fazla olması hastanın akselere
veya transformasyon fazında olduğunu gösterir. Eozinofil ve bazofillerin yüzdeleri
artar, bazofiller teşhis sırasında tespit edilmemektedirler. Lenfosit ve monositlerin
mutlak sayıları artar, ama yüzdeleri azalır. Trombositler genellikle artar. Bazen
çekirdekli eritrositlere rastlanır. Kronik fazda blast hücreler %2-10 arasındadır (77).

2.1.8.2. İleri Faz

Blastik faz veya blast transformasyonu %30’dan fazla blast hücre varlığı ile
tanımlanır. Hastaların %70’inde blast hücreleri myeloid olarak sınıflandırılan ve akut
myelojenik lösemi (AML)’de bulunan hücrelere benzerler. Bu hücreler myeloblastik,
monoblastik, eritroblastik veya megakaryoblastik hücreleri olabilirler. Hastaların
%20’sinde lenfoid blast hücreleri vardır. Geriye kalan hastalarda (%10) blast hücre
transformasyonları karışık myeloid ve lenfoid özellikleri taşır (77).
 32

2.1.8.3.Biyokimyasal Değişiklikler

KML’de görülen biyokimyasal değişiklikler genellikle KML’ye özgün değildir.

Serum ürik asid ve serum alkalen fosfataz seviyeleri artabilir ama genelde normaldir.
LDH (laktat dehidrogenaz) seviyesi artmaktadır. Serum K+ seviyesi kan almadan sonra
lökositlerden veya trombositlerden sızan potasyum sayesinde artmaktadır. Bu
+
durumda, yeni alınan sitratlı kandaki K seviyesi genellikle normaldir. B12 serum
vitamininin seviyesi ve B12 bağlama kapasitesi yükselen transkobalamin I seviyesine
bağlı artmaktadır. Transformasyonda serum ürik asit seviyesi artar ve kemik yıkımına
bağlı olarak hiperkalsemi görülür (42).

2.1.9. Tedaviler

Genç hastalarda allojenik kemik iliği transplantasyonu (KİT) olanakları

araştırılır. Tedaviye bulgular ortaya çıktıktan sonra başlanır. Günümüzde allojenik KİT
için uygun olmayan hastalar için en uygun tedavi Imatinib tedavisidir. Hidroksiüre
Imatinib yokluğunda kısa süreliğine uygun bir alternatiftir. INF-α ve busulfan genel
kullanımdan çok özel endikasyonlar için uygundur (42).

2.1.9.1. Imatinib Mesylate

Imatinib mesylate ayrıca Glivec, Gleevec, STI571 veya CGP 57148B gibi diğer
isimleriyle de tanınmaktadır. İlk klinik denemeleri 1998 senesinde yapılmıştır. ABL
tirozin kinaz inhibitörü olan Imatinibin kimyasal yapısı 2-fenilaminopirimidindir. İlk
önceleri etki mekanizmasının normalde ATP bağlayan BCR-ABL bölgesini meşgul
ederek enzimden sonra yer alan yolaklarda bulunan moleküllerin fosforlanma
kapasitesini azaltması olduğu düşünülmüştür. Günümüzde asıl etki mekanizmasının
BCR-ABL onkoproteinin ABL kısmını inaktif halde tutacak şekilde yakın bir bölgeye
bağlanması olduğu düşünülmektedir (42). Şekil 2-7’de Imatinibin bilinen etki
mekanizması anlatılmıştır.
 33

A. B.
BCR-ABL BCR-ABL

ATP IMATINIB

Substrat Substrat

— Tirozin
Hedef Hedef
— Fosfat protein protein

Şekil 2-7: Tirozin kinaz inhibitörlerin etki mekanizması

Gleveec BCR-ABL kinazın bağlama bölgesine bağlanmak için ATP ile yarışır. ATP’nin bağlanması ile BCR-ABL
substratın üzerinde yer alan tirozini fosforile eder (A) ve aktifleşen substrat hedef proteine bağlanır. Gleveec ATP ile
aynı şekilde BCR-ABL proteinine bağlanır ama substrat için gerekli olan fosfor grubunu taşımaz. Substrat inaktif
halde olduğu için bağlanma sonrası gerçekleşecek olan zincir reaksiyonlar engellenir ve hedef proteine bağlanmak
için gereken yapıyı oluşturamaz (B) (78).

İlaç hastaların %80’inde hızlı klinik ve sitogenetik cevap sağlamaktadır.

Genellikle günde 400mg’lık dozlarla verilmektedir. Yan etkileri arasında mide bulantısı,
baş ağrısı, döküntü, infraorbital ödem, kemik ağrıları ve bazen sıvı kaybı
sıralanmaktadır. Toksik etkisi INF-α tedavisine oranla daha azdır.

İlaca devam etme süresi hastaların verdiği sitogenetik cevaba bağlıdır. Tam
sitogenetik cevap veren hastaların bazıları cevaptan sonra ilaç kesildiği takdirde tekrar
Ph-pozitif evresine dönerken bazıları aylar veya senelerce remisyonda kalırlar. Bu
nedenle ilaca bir müddet devam etmek önerilmektedir. Bir senelik tedaviye rağmen
majör sitogenetik cevap göstermeyen hastalarda (örneğin kemik iliğinde %60’ından
fazla Ph-negatif olanlar) imatinib yerine farklı yaklaşımlar kullanılmalıdır.

Tam sitogenetik remisyona ulaşan hastalarda bile RT-PCR yöntemi ile düşük
seviyede BCR-ABL transkriptleri tespit edilmektedir. Bu sonuç Imatinibin tek başına
bütün KML kanıtlarını yok edemediğini göstermektedir. Imatinib tam sitogenetik cevap
sağlaması ve rezidüel BCR-ABL transkriptlerinin düşük seviyede olması nedeniyle
günümüzde tercih edilen tedavi olarak tanımlanmıştır.
 34

Sitogenetik ve hematolojik incelemeler sayesinde KML hastalarında Imatinib’e

karşı oluşan hücresel cevabı ölçmek mümkündür. Tam sitogenetik remisyonda olmayan
hastalarda BCR-ABL geninin flüoresan in situ hibridizasyon (FISH) ile incelenmesi
mümkündür. Sitogenetik remisyona ulaşmış hastalarda BCR-ABL transkriptleri için
uygulanabilecek tek yöntem kantitatif RT-PCR yöntemidir. Kantitatif RT-PCR
sayesinde cevabın seviyesi ve relaps başlangıcının tespiti mümkündür. Alınan sonuçlara
bağlı olarak, KİT gibi yeni törapetik stratejiler geliştirilmektedir.

Teşhis konduktan sonra ilk iki sene kronik fazda olan KML hastalarında
Imatinib direnci nadiren gelişmektedir. Direnç daha çok imatinibe geç kronik fazda
başlayan ve öncesinde başka tedavi yöntemleri ile tedavi görmüş hastalarda
görülmektedir. Myeloid blast krizinde tedaviye alınan hastaların %70’inde ve lenfoid
blast krizinde tedaviye başlayan bütün hastalarda direnç gelişmektedir.

Direnç farklı mekanizmalar sayesinde gelişmektedir. ABL kinaz domaininde

nokta mutasyonların birikmesi, BCR-ABL onkoproteininin yüksek ekspresyonu, ilacın
hücelerden hızlı bir şekilde atılmasını sağlayan P-glikoproteinin yüksek ekspresyonu ve
BCR-ABL geninin amplifikasyonu bilinen direnç mekanizmalarındandır.

Şimdiye kadar imatinibe karşı direnç seviyeleri farklı olan hastalarda en az 20

nokta mutasyonu tespit edilmiştir. Her biri BCR-ABL onkoproteinin ABL kinaz
kısmında yer alan farklı amino asidlerin kodlanmasına neden olmaktadır. T315I olarak
bilinen treonin yerine izolösin gelmesine neden olan mutasyonu taşıyan hücreler
imatinibin baskılama etkisine karşı özellikle dirençli olurlar. Diğer mutasyonları taşıyan
hücrelerde daha az direnç gelişir.

Yapılan son araştırmalar ABL kinaz domaininin P-döngüsü olarak bilinen

fosfat-bağlayan döngüde bu tür değişikliklerin yer almasının hastalığın ilerlemesinin ve
düşük sağkalım oranının habercisi olabileceğine dair deliller öne sürmektedir.
Muhtemelen bu subklonlar imatinib tedavisinin başlamasından önce mevcuttur, yaban
tip molekülün imatinib tarafından inhibe edilmesi ile çoğalmalarına olanak vermektedir
(42).
 35

2.1.9.2. Hidroksiüre

Hidroksiüre olgunlaşmış myeloid öncül hücrelerini hedefleyen bir ribonukleotid

reduktaz inhibitörüdür. Farmakolojik etkisi hızlı ve geri dönüşümlüdür. Tedaviye günde
1-2 g ile başlanır ve devam edilir. Günler içerisinde lökosit sayısı azalmaya başlar ve
dalak küçülmesi gözlenir.

İlacın yan etkileri azdır. Yüksek seviyelerde mide bulantısı, ishal, veya farklı
gastrointestinal rahatsızlıklara neden olmaktadır. Deri döküntüleri ve ülser nadir
görülürler. İmatinib’e karşı direnç geliştiren hastalarda hücre sayısının hızla
düşürülmesi için hidroksiüre kullanımı uygundur (42).

2.1.9.3. Interferon-α

Interferon-α antiviral ve antiproliferatif özelliklere sahip büyük bir protein

ailesinin üyesidir. 1980’lerde yapılan çalışmalarda KML hastalarının %70-80’inde
başarılı bir tedavi olduğu gösterilmiştir. Daha sonraki çalışmalar, INF-α’nın
hidroksiüre’ye kıyasla sağkalım oranını daha çok yükselttiğini göstermiştir.

1980’ler INF-α, hidroksiüre ve busulfan primer tedavi olarak kullanılırken;

Imatinib piyasaya sürüldükten sonra bu tedavilerin yerini almıştır. Günlük dozları 3-5
megaunits/m2 olup subkutan injeksiyon olarak verilmektedir.

Yaşlı hastalarda toksisite yaygındır, ama geri dönüşümlüdür. Hastaların küçük

bir kısmında ilaç tolere edilmemektedir ve letarji, anoreksi, kilo kaybı, depresyon gibi
yan etkilere yol açmaktadır (42).

2.1.9.4. Busulfan

Busulfan veya 1,4-dimetansulfoniloksikutan, günümüzde çok kullanılmayan çok

fonksiyonlu bir alkilleyici ajandır. İlkel kök hücrelerini hedeflemekte ve kullanımına
son verildikten sonra etkisi bir kaç hafta boyunca devam etmektedir. 1960-1980 seneleri
arasında KML tedavisinde öncelikli yere sahip olmuştur. Bazı hastalarda busulfanın
 36

normal dozlarına karşı aşırı duyarlılığa bağlı şiddetli ve geri dönüşümsüz ilik
hipoplazisinin eşlik ettiği pansitopeni görülebilir.

Tedaviye başladıktan sonra gonadal yetersizlik, deri pigmentasyonu, pulmoner

fibrozis ve wasting sendromu gibi toksik etkilere neden olabilir. Bu yan etkilerine
rağmen ilaç yaşlı hastalarda tek doz olarak 4-5 hafta aralıklarla kullanılabilmektedir
(42).

2.1.9.5. Homoharringtonin

Homoharringtonin, yarısentetik bir bitki alkaloidi olup kronik faz KML’de

kullanılan ilaçlardan biridir. Bu ilaç, KML hücrelerinde apoptozu artırır. Hastaların %
60 – 70’inde hematolojik ve %25’inde majör sitogenetik cevap oluşturur. INF-α ile
beraber kullanıldığında daha iyi sonuç vermektedir. Günümüzde araştırılmakta olan bir
ilaçtır (42).

2.1.9.6. Kemik iliği transplantasyonu

Allojenik KİT tedavisi genç ve HLA’sı uygun bir vericisi olan hastalara
uygulanmaktadır. Elli yaş üstündeki hastalar genellikle bu tedaviye alınmamaktadırlar.
KİT tedavisi uygulanan hastaların 5 yıllık lösemisiz sağkalım oranları %60-80
arasındadır. Transplantasyona bağlı ölüm %20, relaps ise %15 oranında görülmektedir.

Hematolojik bulgusu olmayan hastaların takibi, devamlı yapılan sitogenetik

incelemeler sayesinde veya kandaki BCR-ABL füzyon geninin transkriptlerini düşük
seviyelerde tespit edilebilen daha duyarlı olan RT-PCR yöntemi ile yapılabilir.

Günümüzde beyaz ırka dahil olan hastaların %50’si için serolojik olarak uygun
olup akraba olmayan vericiler bulunabilmekte, diğer etnik gruplar için oran
düşmektedir. HLA sınıf I ve II belirlemesinde moleküler yöntemler serolojik
yöntemlerin yerine geçmiştir, ve her beş gen için HLA-A, -B, -C, -DR ve –DQ uygun
olan vericiyi bulma olasılığı düşüktür.
 37

Hastaların %10-30’unda allojenik KİT’ten sonra 3 yıl içerisinde relaps

oluşmaktadır. Relaps sessizce gelişir, ilk önce yükselen BCR-ABL transkriptlerin sayısı
artar, daha sonra Ph-pozitif metafazlar görülür, son aşamada kronik faz KML’nin
hematolojik özellikleri gelişir. KİT’ten sonra hastalar RT-PCR ve sitogenetik
çalışmalarla takip edilmelidir. Bazı hastalarda sitogenetik remisyondan direkt akselere
faza geçiş görülür.

Günümüzde, allojenik KİT’ten sonra BCR-ABL transkript sayı artışı veya Ph-
pozitif hücre artışı ile beraber relapse giren hastalar için genellikle dereceli verici
lenfosit transfüzyonu (DLI) tedavisi uygulanmakta bazı merkezlerde ise imatinib
tedavisine devam edilmektedir (42).

2.1.10. Kronik Myeloid Lösemi Varyantları

2.1.10.1. Ph-negatif kronik myeloid lösemi

Hematolojik olarak KML özelliklerini taşıyan hastaların %6’sında Ph

kromozomu bulunmamaktadır. Bu hastaların yarısında BCR-ABL geni moleküler
yöntemler ile gösterilebilir. Yerleşim olarak genellikle normal 22q kromozomunda
bazen de 9q kromozomunda yer almaktadır. Bu tip hastaların klinik seyirleri Ph-pozitif
KML hastaları ile aynıdır. Imatinib, hidroksiüre veya INF-α tedavilerine düşük seviyede
cevap verirler. Genel sağkalım oranları Ph- pozitif KML hastalarından daha düşüktür
(77).

2.1.10.2. Kronik myelomonositik lösemi

KMML yaşlı erkeklerde görülen nadir, myeloproliferatif bir hastalıktır. Kliniği

KML’ye benzemesine rağmen kemik iliği incelemesinde Ph kromozomu
9
bulunmamaktadır. Monositlerin sayısı 50x10 /L seviyesine kadar yükselebilir. Eritroid
dizi ve granolusitlerin dizisinde displastik değişiklikler görülmektedir.
 38

Hastaların büyük kısmında ETV ve PDGFRB genleri ile ilişkilendirilmiş t(5;12)

translokasyonu veya ZNF198 ve FGFR1 genleri ile ilişkilendirilmiş t(8;13)
translokasyonu bulunmaktadır. PDGFRB ve FGFR1 reseptör tirozin kinaz genleridir ve
BCR-ABL’deki ABL’nin aktivasyonuna benzeyen mekanizmalarla
aktifleştirilmektedirler. Bu iki translokasyona bağlı olan lösemiler yüksek seviyede
eozinofili ve bazofilinin yokluğuyla tanımlanmaktadır. Genelde t(5;12) lösemileri
imatinibin düşük dozlarına olumlu cevap vermekte, t(8;13) lösemilerinde ise aynı cevap
alınmamaktadır (77).

2.1.10.3. Eozinofilik lösemi

Geçmişte eozinofil sayısı yüksek olan vakalar hipereozinofilik sendrom (HES)

olarak sınıflandırılmıştır. Bu vakalardan bazılarının imatinib tedavisine olumlu cevap
verdikleri gözlenmiştir. Cevap alınan hastaların bazılarında kromozom 4’te yer alan
FIP1L1-PDGFRA füzyon geni bulunmaktadır. Belirli bir füzyon geni bulunmayan diğer
vakalarda kan ve kemik iliğindeki immatür hücrelerin sayısı artmakta ve myeloid
hücrelerde klonal bir sitogenetik anomalinin bulunması eozinofilik lösemi tanısının
konulmasına neden olmaktadır (77).
 39

2.2. WT1 geni

WT1 geni ilk olarak çocukluk çağında görülen Wilms’ tümöründe her iki
allelinin inaktifleştiğinin gösterilmesi ile tanımlanmıştır.

WT1 genin ilk klonu olan WT33, ilk defa 1990 senesinde B hücreli lösemi
hücrelerinden klonlanmıştır. Günümüzde WT1 anti-lösemik terapilerde önemli
hedeflerden biri olarak araştırılmaktadır. WT1 geninin normal hematopoezdeki rolü
günümüzde hala çok iyi bilinmemektedir. WT1 gen ekspresyonunun lösemi
oluşumundaki kesin rolü hakında yapılan araştırmalar çelişkili sonuçlar vermiştir ve bu
konudaki araştırmalar halen devam etmektedir (2,3).

2.2.1. Genin yapısı

WT1 geni ilk olarak 1990 senesinde WAGR (Wilms tümörü, aniridia,
genitouriner anomaliler ve mental retardarasyon) sendromlu hastalarda delesyona
uğrayan ve 11p13 kromozom bölgesinde haritalanan bir cDNA olarak tarif edilmiştir
(2,3).

WT1 geninin kodladığı proteinin karboksil ucunda dört tane çinko-parmak yer
alır. Çinko parmakların yapısı, iki tane sistein iki tane histidin içeren C2-H2
tipindedirler. Bu yapı EGR1 transkripsiyon faktörünün yapısına benzemektedir. Çinko
parmaklar, DNA üzerinde yer alan 5’-GCGTGGGAGT-3’ bölgesine bağlanmaktadırlar
(79).

50 kb uzunluğunda olan WT1 geninin 10 eksonu bulunmaktadır. 3.2 kb

uzunluğunda bir mRNA kodlar. WT1 geninden 4 farklı transkript ifade edilebilir. Bu
farklı transkriptler 9’uncu eksonun 3’ kısmını ve 5’inci eksonu etkileyen alternatif
kırpılmadan kaynaklanmaktadırlar (80). Şekil 2-8’de genin yapısı gösterilmiştir.
 40

EKSONLAR
KTS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5’ 3’

2. Kırpılma Noktası 1. Kırpılma Noktası

-17aa / + 17aa -KTS / +KTS

Şekil 2-8: WT1 genin yapısı

WT1 geni ~50 kb civarında ve 11. kromozomun 11p13 bölgesinde yer almaktadır. 10 eksondan oluşmuştur ve iki
farklı kırpılma bölgesi içermektedir. Ekson 5’teki kırpılma 17 amino asid kodlayan bir bölgeyi ortadan
kaldırmaktadır. Ekson 9’daki kırpılma ise çinko parmağın DNA’yı bağlama özgüllüğünü etkileyen bir değişikliğe yol
açar. Bu değişiklik WT1 proteininin 3. ve 4. çinko parmakları arasında üç aminoasidin: Lizin, Treonin, Serin veya
KTS olarak isimlendirilen bölgenin eklenmesine neden olur. WT1(-KTS) izoformu transkripsiyonun
düzenlenmesinde WT1(+KTS) izoformu ise mRNA’nın son halini almasında rol almaktadır. Farklı WT1 molekülleri
translasyonun farklı başlama kodonlarından başlaması, RNA düzeltme, ve posttranslasyonel değişmelere bağlı
oluşmaktadır (80).

WT1’in yaygın olan dört tane izoformu vardır; her iki kırpılma noktasını içeren
17AA (+) / KTS (+), sadece birinci kırpılma noktasını içeren 17AA (+) / KTS (-),
sadece ikinci kıpılma noktasını içeren 17AA (-) / KTS (+), ve hiçbirini içermeyen 17AA
(-) / KTS(-). Bu dört izoformun ağırlıkları 52-54 kDa arasında değişmektedir.

Ayrıca, ekson 6'da 280. kodonda meydana gelen RNA düzeltme mekanizması
sayesinde ve iki pozisyonda farklı translasyon başlama kodonları kullanılmasından
dolayı ekstra fonksiyonel WT1 protein izoformları oluşur (81-83).

Translasyonun AUG kodonun yerine, daha yukarıda yer alan CUG kodonundan
başlaması normal izoformlardan daha büyük olan ve moleküler ağırlığı 60-62 kDa
arasında değişen dört farklı WT1 protein izoformun oluşmasına neden olur.

Translasyonun ikinci bir AUG kodonundan başlaması moleküler ağırlıkları 36-

38 kDa arasında olan ve N-terminalinde trunkasyona uğramış WT1 proteinlerin
oluşmasına neden olur (82,83).
 41

Alternatif kırpılma, alternatif translasyon başlama yerleri ve RNA düzeltme

mekanizmaları sayesinde WT1 geni proliferasyon, farklılaşma ve apoptozda etkileri
olan 24 farklı protein kodlayabilmektedir (84).

Oluşan izofromların yapısı Şekil 2-9’da gösterilmiştir.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(+)17AA (+)KTS ZF1 ZF2 ZF3 ZF4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(+)17AA (-)KTS ZF1 ZF2 ZF3 ZF4

1 2 3 4 6 7 8 9 10

(-)17AA (+)KTS ZF1 ZF2 ZF3 ZF4

1 2 3 4 6 7 8 9 10

(-)17AA (-)KTS ZF1 ZF2 ZF3 ZF4

Şekil 2-9: WT1 geninin izoformları

WT1’in yapısı tipik bir transkripsiyon faktörünün yapısına benzer. Yapısında

DNA’ya bağlanan çinko parmak domaini ve düzenleyici fonksiyona sahip prolin ve
glutaminden zengin domaini olmak üzere iki fonksiyonel domain yer almaktadır (85).
Protein yapısında tanımlanan iki fonksiyonel domainlerinden biri transkripsiyonun
baskılanmasında (ekson 1) diğeri transkripsiyon aktivasyonunda (ekson 3 ve 4) rol
oynamaktadır (4).

Aynı zamanda, WT1 proteini RNA ve U2AF65 kırpılma faktörü ile C-

terminalindeki çinko parmaklar sayesinde geçici etkileşimler oluşturmaktadır (86,87).
RNA ile etkileşim WT1'in N-ucunda bulunan UIA kırpılma faktöründeki RNA tanıma
motifine benzeyen RTM yapısı sayesinde oluşmaktadır (88). WT1 proteinin yapısı Şekil
2-10'da gösterilmiştir.
 42

Çinko Parmak Yapıları

Çekirdek Lokalizasyonu

RNA BASKILAMA AKTİVASYON

Tanıma
Motifi

Pro / Glu zengin Yapı

1. KIRPILMA 2. KIRPILMA
Kendisiyle Asosayonu
NOKTASI NOKTASI

Şekil 2-10: WT1 Proteinin Yapısı

WT1 proteininde yer alan farklı fonksiyonel yapılar (89).

WT1 ilk olarak çocuklarda görülen ve böbreği etkileyen Wilms' tümöründe rol
oynayan tümör baskılayıcı gen olarak tanımlanmıştır. Allel kaybı ve mutasyon analizi
sayesinde sporadik Wilms' tümörlerinin %10'unda WT1 geninin Knudson iki vuruş
hipotezindeki gibi tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonuna neden olan homozigot
inaktifleştirici mutasyonlar taşıdığı ispatlanmıştır. Wilms' tümöründeki mutasyonlar
genelde çinko parmak kısmında yer alan delesyonlardır (90-91).

Bu mutasyonlar WT1 çinko parmaklarının büyümeyi etkileyen önemli promotor

bölgelerine bağlanmalarını engellemektedir. WT1 geni yüksek ekspresyonu sadece
lösemilerde değil, aynı zamanda akciğer kanserinde, kolon kanserinde, ve pankreas
karsinomlarında gözlenmiştir (18,19)

WT1'in hedef genleri hücre proliferasyonunda, farklılaşma, apoptoz ve cinsiyet

belirlenmesinde rol oynayan genlerdir. Bunlar IGF ailesinin üyeleri, EGFR, TGFB,
BCL2, PDGFA, CSF1, Amphiregulin, E-Cadherin, Ornithine dekarboksilaz, p21,
hTERT ve DAX-1 genleridir (93-105).
 43

WT1+ ve KTS- izoformlarının çekirdek içerisinde yer alan kırpılma

mekanizmalarıyla direkt etkileşim içerisinde olmaları nedeniyle, transkripsiyon sonrası
gen düzenlenmesinde önemli bir rol oynadıkları öne sürülmektedir. KTS+ izofromları
kırpılma faktörleri ile çekirdekte yer almakta, KTS- izoformları ise DNA transkripsiyon
faktörleri ile etkileşim içerisinde bulunmaktadır (86,106,107). KTS + izoformları
RNA’ya bağlanabilir (87,88).

2.2.2. Lösemide WT1 Geninin Rolü

WT1 geninin ilk klonu olan WT33, B-hücreli lösemi kök hücrelerinden izole
edilmiştir (2). Bunun ardından WT1 geninin myeloid ve lenfoid lösemi kök
hücrelerinde ileri seviyelerde ifade edildiği gözlenmiştir. Ayrıca, lenfoid lösemilerin %
80’inde ve myeloid lösemilerin %90’ında ifade edilmektedir (8,9).

WT1 ekspresyonunun en yüksek seviyeleri KML blast krizi gibi immatür

fenotipli lösemilerde görülmektedir. Normal periferik kan hücreleri ise WT1’i çok
düşük seviyelerde ifade ederler. Genelde WT1 geninin lösemideki ekspresyonu yaş,
karyotip veya FAB alttipine bağlı değildir. Bazı çalışmalar WT1 geninin
ekspresyonunun MRD için marker olarak kullanılabileceğini göstermiştir. Ayrıca
yüksek WT1 ekspresyonu olan hastaların sağkalım oranlarının WT1’i düşük seviyelerde
ifade edenlerden daha düşük olduğu gözlenmiştir (14,18).

WT1 geninin ekspresyonu myelodisplastik sendrom ve akut lösemilerde hastalık

ilerleme takibi ve relaps için marker olarak kullanılmıştır (108-110). Diğer çalışmalar,
WT1 ekspresyonunun negativitesinin daha uzun hastalıksız sağkalımla, remisyondan
sonra sağkalımla veya KİT sonrası sağkalımla ilişkili olmadığını göstermiştir (111,112).

WT1 ekspresyonunun prognostik marker olarak önemi hala tartışılmaktadır ve

bu konuda kesin bir karar verebilmek için farklı merkezlerde standart protokollerle ve
farklı lösemi alt tipleri ile yapılmış araştırmalar gerekmektedir (5).
 44

Yapılan bazı araştırmalar WT1 gen ekspresyonunun normal progenitör

hücrelerde düşük seviyelerde olduğunu ve lösemi hücrelerinde transformasyon
sürecinde kazanılan bir değişiklik olduğunu göstermiştir (113,114). Bu nedenle WT1
geninin immünoterapi için uygun bir gen olduğu düşünülmüştür (115). Ama diğer
çalışmalar, WT1 gen ekspresyonunun erken progenitör hücrelerde de görüldüğünü
göstermiştir (116-118).

Bazı çalışmalar, WT1 transkriptini hedefleyen WT1 antisens oligonukleotidlerle

yapılan muamelenin WT1 genini ifade eden lösemilerde regresyona neden olduğunu
göstermiştir (119,120). Bu sonuçlar WT1 geninin Wilms’ tümöründe tümör süpresör
gen olarak rol oynamasına karşılık, lösemilerde onkogenik etkisi olduğunu ve devamlı
hücre proliferasyonu için gerekli olduğunu göstermiştir (5).

WT1’in etkileşim içerisinde bulunduğu proteinler arasında p53, par-4, Hsp70,

UBC9, Ciao1 ve SF-1 proteinleri bulunmaktadır. WT1 proteininin bu proteinlerle olan
etkileşimi hücreye özgündür ve belirli hücrelerde WT1 transkriptinin fonksiyonel
özelliklerini belirlemektedir (121-125).

İn vivo WT1 farklı fosforilasyon fazlarında bulunabilir. C-AMP bağımlı protein

kinaz (PKA) WT1 proteinine iki farklı yerde fosfor ekleyerek WT1’in çinko
parmaklarının DNA-bağlama kapasitelerini yok etmektedir. Lösemi hücrelerinde
WT1’in fosforilasyon hali, hücrelerin WT1 ekspresyonunun değişmesine karşı
verdikleri yanıt şeklini etkileyen önemli bir faktör olabilir (126).

WT1 tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesine rağmen, WT1’in lösemideki rolü
hala çok net değildir (8,127,128). WT1’in lösemide onkogenik bir rol oynadığı öne
sürülmüş ama hala ispatlanmamıştır. WT1 geninin yüksek seviyede ekspresyonu,
farklılaşma ve apoptozun baskılanması, proliferasyonun artması gibi farklı
mekanizmalar sayesinde malign fenotipin devam etmesinde önemli olabilir (129).

WT1’in antisens baskılanması lösemi hücrelerinin büyümesini engellemektedir

(130,131). WT1’in lösemideki rolü net olmasa da, teşhis ve tedavi açısından önemli
olduğu kesindir. AML’de WT1 varlığı ve ekspresyon seviyesi prognoz ve relaps
tahmininde marker olarak kullanılabilir (132). WT1’e bağlı immünoterapi araştırmaları
klinik öncesi aşamadadır (133,18).
 45

2.2.3. Lösemide WT1 mutasyonları

AML’lerin %15’ninde WT1 gen mutasyonları görülmüştür. Bu mutasyonlar

genelde missens mutasyonları ve WT1 proteininin kısalmasına neden olan delesyonlar
ve insersiyonlardan oluşmaktadır. Çinko parmakların kısmi veya total kaybından
kaynaklanan mutant proteinler DNA’ya bağlanma kapasitesini yitirirler (135). AML’de
WT1 mutasyonları agresif tip ve kötü prognoz habercileridir.

Genelde, lösemide görülen WT1 mutasyonları heterozigot durumdadır ve diğer

kromozomal anomalilerle beraber görülürler (136). Normal WT1 proteini dimerler
oluşturduğuna göre heterozigot mutantların etki mekanizmasının “dominant negatif”
olabileceği düşünülmektedir. Böyle bir durumda mutant allelin kodladığı protein yaban
tip proteinin transkripsiyon özelliklerini etkilemektedir (137).

Yapılan çalışmaların sonuçları bu görüşü desteklemektedir ve WT1 geninin

onkogenik aktivitesinin transkripsiyonu baskılama fonksiyonu kazanması ile ilişkili
olduğu ispatlanmıştır (138). WT1 mutantları, myeloid progenitör hücrelerin
diferansiyasyonunda etkili olan WT1’in hedef genlerini aktif bir şekilde baskılayabilir.

Denys Drash sendromunda görülen bazı WT1 mutasyonları AML’de görülen

mutasyonlarla aynıdır ama bu sendromu taşıyan hastalarda lösemi veya hematopoetik
anomaliteler görülmemektedir. Yaban tip WT1 geninin hematopoezde önemli olmadığı
ve WT1 mutasyonlarının lösemide ek kromozomal veya genetik anomalilerle beraber
görüldüğünde onkogenik etkiye sahip olduğu ileri sürülmüştür (5).

AML’de görülen WT1 mutasyonları arasında çinko parmak domainin etkileyen

mutasyonlar da görülmektedir. Bu mutasyonlar WT1(-KTS) izoformunun yer
değiştirmesine ve protein transkripsiyon faktörü olarak rol oynadığı çekirdekten nüklear
zar üzerindeki KTS+ izoformların yerini almasına neden olmaktadır (5).

Ayrıca, AML ve Denys Drash sendromunda bulunan WT1 yanlış eşleşme

mutasyonları U2AF65 kırpılma faktörüne bağlanma afinitesini artırmaktadır. Sonuç
olarak, WT1 izofromları hücresel kırpılma mekanizmalarıyla olan etkileşim sonucunda
lösemi hücrelerinde onkogenik etkiye sahip olabilirler(136).
 46

WT1’in hücre döngüsü kontrollerinde ve sitotoksik ajanlara karşı apoptoz

yanıtında önemli olması WT1’in ilaç direnci ile ilişkisi olabileceğini düşündürür.
Mutant WT1’in ilaç direnci ile ilişkisini araştırmak için McCoy ve ark, yaban tip WT1
geninin, K562 hücrelerinde multidrug resistance-1-promoter (MDR-1)’in negatif
düzenleyicisi olduğunu ispatlamıştır. MDR1 proteininin negatif düzenlenmesinin
kaybedilmesi, MDR1 seviyesinin artmasına neden olur, bu da WT1 mutasyonlarının
DNA’ya bağlanan çinko parmaklarını etkilemelerinden kaynaklanabilir (139).
 47

2.2.4. WT1 sinyal iletim mekanizması

Kanser’in özelliklerinden biri proliferasyon kontrolünün bozulmasıdır. WT1

ekspresyonunun baskılanması, HER2/Neu yüksek seviyede ifade eden meme kanseri
hücrelerinde G1, K562 hücrelerinde G2/M geçişini tetiklemesi WT1’in hücre
döngüsünün tetiklenmesinde önemli olduğunu göstermiştir (140). Ayrıca, 17AA+KTS-
izoformunun antiapoptotik Bcl-2 geninin ekspresyon seviyelerinin yükselmesine neden
olması, WT1 geninin apoptoz baskılanmasında önemli rol oynabileceğini göstermiştir
(97).

WT1 farklı fonksiyonları olan hedef genleri etkilemekte ve ayrıca kendi

kendisini düzenleyebilmektedir. Tablo 2-2’de WT1 geninin hedef genleri sıralanmıştır.

Tablo 2-2: WT1 geninin hedef genleri

Büyüme Faktör reseptörleri Transkripsiyon faktörleri

IGF1R WT1

RARα EGR1

EGFR c-myb

Insulin R MyoD

Büyüme Faktörleri Bcl-2

IGF2 Pax2

PDGF-A c-myc

TGF-β1 Diğer

CSF-1 Midkine

Inhibin-α ODC

Ekstraselüler matriks yapıları novH

Syndecan Gαi-2
 48

WT1 proteini hücresel veya kromozomal yapıya bağlı olarak transkripsiyonu

tetikleyen veya baskılayan faktör olarak davranmaktadır (141,142). Karboksil terminusu
DNA’ya bağlanmasını sağlayan dört tane çinko parmak domain barındırmaktadır (80).
WT1 genellikle EGR-1 geninin GC yapısı ile zengin DNA-bağlama motiflerine
bağlanmaktadır (142).

WT1’in düzenlediği genler arasında büyüme ve hücresel diferansiyasyonda rol

oynayan genler ve cinsiyetin belirlenmesinde rol oynayan genler vardır. (Ör: SRY, SF1
ve MIS) (143-146).

WT1 genini düzenleyen genler arasında paired box genleri PAX2, PAX8 ve
globin transkripsiyon faktörü 1 (GATA) genleri yer almaktadır (147-149).

WT1 transkripsiyon faktörü olarak 45 farklı hedef gen ile etkileşim içerisindedir.
Şekil 2-11’de transkripsiyonun düzenlenmeside rol oynayan genlerden bazıları
özetlemiştir.

DNA’ya Bağlanan
Pax 2
SF 1 Transkripsyon Faktörleri
p63 / p73

? BMZF 2
SREBP - +
- -
p53
SRY +
+/-
+ WT1 Hsp 70
CBP +
-
BASP 1
- ?
U2AF
WTIP - +/- ?
Transkripsyon Ciao 1 WTAP RNA Düzeltme
Par-4
Düzenleyecileri Faktörleri

Şekil 2-11: WT1 geninin transkripsiyonu düzenlenme mekanizması

WT1 ile etkileşime giren ve WT1’in etkilediği farklı faktörler (134).

Ayrıca, WT1 transkripsiyon kofaktörü olarak ve RNA-kırpılması gibi post-

transkripsiyonel düzenlenmelerde de rol oynamaktadır (150).
 49

2.2.5. WT1 geninin onkogenik aktivitesi

WT1 geninin kodladığı protein, çeşitli genlerin transkripsiyonel

düzenlenmesinde önemlidir. Bu genler arasında PDGF-A zinciri (151), CSF-1 (152),
IGF-II (153), IGF-IR (94), ve RAR-α genleri vardır (155). Ayrıca, WT1 proteini RNA
metabolizmasında da önemli rol oynamaktadır (156).

WT1 geninin yüksek ekspresyonu akciğer, kolon, meme, tiroid, pankreas duktal
karsinomu, baş boyun skuamöz hücreli karsinomu, astrositik tümörler ve kemik ve
yumuşak doku sarkomları gibi çeşitli solid tümörlerde gösterilmiştir.

WT1 geni tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesine rağmen, WT1 geni yaban
tipi lösemilerde yüksek seviyelerde ifade edilmektedir (18). WT1 geninin çeşitli kanser
tiplerinde tümör baskılayıcı gen yerine onkogenik etkiye sahip olduğunu ispatlayan
bulgular şunlardır:

i. WT1 mRNA’sının yüksek ekspresyonunun lösemilerde ve meme kanserinde

kötü prognoz ile ilişkilendirilmesi (18, 157) ayrıca testiküler germ hücreli
tümörlerde ve baş boyun yası epitel hücreli karsinomda, ileri tümör evresi ile
ilişkilendirilmesi ( 158, 159).

ii. WT1 genini ifade eden lösemilerin ve solid tümörlerin büyümesinin WT1
antisens oligomerleriyle engellenmesi (119, 120, 160, 161).

iii. Myeloid progenitör hücrelerde ve normal myeloid hücrelerde, granulosit koloni

tetikleyici faktöre (G-CSF) cevaben WT1(+17AA +KTS) izoformunun ifade
edilmesine bağlı olarak farklılaşmanın engellenmesi ve proliferasyonun
tetiklenmesi (162, 163).

iv. Farelerde, WT1 mRNA’sını yüksek seviyelerde ifade eden kemik iliği
hücrelerinin lösemi hücrelerine dönüşmesi (114).

v. Transgenik farelerde Lck-promotörüne bağlı WT1(+17AA -KTS) izoformunun

T lenfoid hücrelerin farklılaşmasının engellemesi (164).
 50

WT1 geninin dört izoformu farklı fonksiyonlara sahiptir ve lösemi ve tümör

gelişiminde önemli rol oynamaktadır. WT1 geninin 17AA+KTS+ izoformu kanser
hücrelerinin büyümesinde etklidir (127). WT1 geninin 177AA+KTS- izoformu ise
lenfoid tümörlerin gelişmesinde rol oynamaktadır (164). 17AA-KTS+ izoformu ise
farklı tümörlerde G1/S fazları arasında geçişin ve farklılaşmanın hızlanmasında etkili
olduğu için tümör baskılayıcı olduğu düşünülmüştür (103, 166). 17AA-KTS+
izoformunun fonksiyonu halen çok iyi belirlenmemiştir.

WT1 geninin promotor bölgesi p53 ve Rb gibi tumor baskılayıcı genlerin

promotor bölgeleri ile ortak benzerlikler taşımaktadır ve polimeraz II promotor
ailesinin üyesidir (167,168). WT1 ekspresyonunu düzenleyen diğer yapılar, birinci
eksonun promotor bölgesinden 50 kb uzaklığında 3’ yönünde yer alan enhancerlardır.
WT1’in düzenleyici sekansları: PAX2, PAX8, Sp1, NF-κB, IL6, PEA3 ve WT1
transkripsiyon faktörlerin bağlanması için uygun motifler içerir (165).
 51

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Gereç

3.1.1. Materyal

Bu çalışmada Ekim 2005 - Haziran 2006 tarihleri arasında İstanbul Üniversitesi

İstanbul Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı Hematoloji Polikliniğinde takip
edilen 38 hastadan ve İ.Ü. Onkoloji Enstitüsü’ne başvuran 25 hastadan toplam 63
kronik myelojenik lösemili hastadan alınan periferik kan ve kontrol grubunu oluşturan
51 sağlıklı bireyden alınan periferik kan kullanılmıştır. Hastalarda WT1 ekspresyon
seviyeleri ve FISH incelenmesi yapılmıştır. En az deneylerin biri için sonuç alınan
toplam 59 (yaş ort. 45,32 ± 13,67) hasta olmuştur. Hasta grubu 31 kadın ve 28 erkekten
oluşmuştur. Ayrıca sonuç alınan 50 (yaş ort. 34,48 ± 9,34) kontrolde WT1 ekspresyonu
incelenmiştir. Kontrol grubu 27 kadın ve 23 erkekten oluşmuştur. Tablo 3-1 ve 3-2
hasta ve kontrol gruplarının cinsiyet ve yaş ortalamalarına göre dağılımını
göstermektedir.

Tablo 3-1: Yaş ortalaması ve cinsiyete göre hastaların dağılımı

Kadın Erkek Toplam

35 ≤ 15 15 30

35 > 16 13 29

Toplam 31 28 59

Tablo 3-2: Yaş ortalaması ve cinsiyete göre kontrollerin dağılımı

Kadın Erkek Toplam

35 ≤ 20 13 33

35 > 7 10 17

Toplam 27 23 50
 52

WT1 geninin ekspresyonunu incelemek için periferik kandan öncelikle

lenfositler izole edildi. Daha sonra hücreden RNA izolasyonu yapıldı. Kronik ve
akselere fazındaki hastalarda ve sağlıklı bireylerde WT1 geninin ekspresyonu RT-PCR
yöntemi ile karşılaştırıldı. Kontrol geni olarak GADPH geni kullanıldı.

KML hastalarındaki sitogenetik değişiklikleri FISH yöntemi ile incelemek için

periferik kandan alınan bir damla kan, damlatılarak direkt yayma hazırlamak için
kullanıldı. Ayrıca kandan direkt yayma tekniğinin uygulanamadığı hastalar için
hücreden yayma tekniği kullanılarak izole edilen lenfositlerden yaymalar hazırlandı.

Çalışma İ.Ü. Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji ABD’nda gerçekleştirildi.

Çalışma İ. Ü. İstanbul Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurulu tarafından 1501 sayı ve
09/10/2005 tarihli etik kurul kararı ile uygun görülmüştür.

3.1.2. Kimyasal maddeler ve malzemeler

Hidroklorik asit (HCl), Kloroform, Sodyum Dodesil Sulfat (SDS), Sodyum

Hidroksit (NaOH), Sodyüm Klorür (NaCl), Tris (hidroksimetil) metilamin [Merck].

Etanol, İzopropanol [RIEDEL DE HAEN].

Ficoll Histopaque [BIOCHROM AG]

Taq DNA Polimeraz, dNTP’ler (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Magnezyum

klorür (MgCl2), 10X PCR tamponu, cDNA sentez kiti [FERMENTAS].

Agaroz, Etilen-diamin-tetraasetikasit (EDTA), Etidyum Bromür (EtBr), Fosfat

Tamponu PBS tablet, Fenol [SİGMA].

İzotonik (%0.9) sodyum klorür solüsyonu [Baxter]

Metanol, Asetik Asid [Merck]

Polilizin kaplı (pozitif yüklü) lam, Lamel [Menzel Glaser]

Tridity G [AppliChem]

Primerler [BIOBASIC].
 53

Tissue Conversion Kiti; BCR-ABL t(9;22) Çift renk Çift füzyon translokasyon
probu, Nonidet P40 (NP-40), DAPI [Q-BIOGENE]

Fiksogum [MARABU]

3.1.3. Kullanılan Cihazlar

Flüoresan mikroskop (Olympus BX51), Image analyzer, Manyetik karıştırıcı

(Electro-mag, Snijder), Su banyoları (Nüve BM102 / Kotterman), Vortex (Nüve NM
110), Buzdolabı (Profilo), Hibridizer (DakoCytomation), Mikrodalga Fırın (Arçelik),
Santrifüj (Heraeus, Hettich ve Jouan), Elekroforez tankı (BRL), Güç Kaynağı (BRL),
Jel Dökümantasyon Cihazı (Vilber Lourmat), Hibridizasyon fırını (Biometra), Etüv
(Heraeus, Electro-Mag), PCR Cihazı (Techne), Hassas Terazi (Chyo), Pipetler (Gilson),
Spektrofotometre (Nanodrop), pH Metre (N.E.L.), Otoklav (Erna), Derin Dondurucu
(-20ºC) (Ariston), Derin Dondurucu (-80ºC) (Nuaire), Bidistile Su Cihazı (Kotterman).

3.1.4. Tampon ve Çözeltiler

3.1.4.1. Lenfosit İzolasyonu ve Jel Elektroforezi Tampon ve Çözeltiler

1X PBS (Fosfat Tamponu) (1 lt, pH : 7,4):

0,01 M Fosfat Tamponu

0,0027 M KCl

0,137 M NaCl

Etidyum Bromür:

10 mg / ml

10X Tris- Borat Tamponu (TEB): (1 lt)

0,88 M Borik asit

5 M Tris Bazı

0,02 M EDTA ( pH: 8,0 )

 54

10X Yükleme Tamponu: (2 ml)

% 1 SDS (Sodyum dodesil sülfat)

5 mg BFB (Bromofenolblue)

2 ml Gliserol

3.1.4.2. FISH’te kullanılan tampon ve çözeltiler

Etanol Serileri:
%70, %80, %95, %100 Etanol dH2O ile hazırlanır

Fiksatif (3:1):
30 ml Asetik Asit
90 ml Metanol

2X SSC:
50 ml 20X SSC
450 ml Distile Su (pH 7.0, +4ºC’de saklanır)
500 ml Total

2X SSC / %0,5 NP-40:

200 µl NP-40

4 ml 20X SSC

5.8 ml dH2O

40 ml

Ön İşlem Solüsyonu (% 30):

30 ml 2X SSC

12 g Ön İşlem Solüsyonu (45ºC’ 5-10 dakika)

40 ml (aynı gün içerisinde kullanılır)

 55

1X PBD:

100 ml 10X PBD (homojen olmalı)

900 ml Distile Su

1000 ml ( +4ºC’de saklanır)

1X Yıkama Tamponu (0,5 SSC / %0,1 SDS):

100 ml 10X Yıkama tamponu (homojen)

900 ml Distile Su

1000 ml Toplam (+4ºC’de saklanır)

Arka plan boyası:

DAPI / Antifade (0,1 µl/ml)

 56

3.2. YÖNTEMLER

3.2.1. Moleküler Biyoloji

3.2.1.1. Kandan Lenfosit İzolasyonu

Hastalardan ve kontrol grubundan EDTA’lı tüplere alınan 10 cc kan % 0.9’luk

sodyum klorür solüsyonu ile 1:1 oranında sulandırıldıktan sonra periferik kan
lenfositleri Ficoll Histopaque yoğunluk gradienti yöntemi ile ayrıştırıldı. Lenfosit
izolasyonu aşamaları Tablo 3-3’te gösterilmiştir.

Tablo 3-3: Kandan Lenfosit İzolasyonu

10 cc EDTA’lı kan + 10 ml %0.9 NaCl

↓
3ml Ficoll-Histopaque üzerine yüklenir
↓
1500 rpm’de 30 dakika santrifüj
↓
Lenfosit fazı toplanır
↓
1500 rpm’de 10 dakika santrifüj
↓
Üst sıvı dökülür
↓
Hücreler Fosfat tamponu (PBS) içinde süspanse edilir
↓
1 ml olarak cryo tüplerine aktarılır
↓
1500 rpm’de 5 dakika sanrifüj
↓
Üst sıvı dökülür
↓
Hücreler -80°C derin dondurucuda saklanır.
 57

3.2.1.2. Lenfositlerden RNA İzolasyonu

Total RNA izolasyonu için tek adımlı RNA izolasyon solüsyonu kullanılmıştır.
WT1 geninin değişik fazlardaki ekspresyonunu ve sağlıklı bireylerdeki ekspresyonunu
karşılaştırmak için toplam 113 bireyden RNA izolasyonu yapılmıştır. İzolasyon için
yaklaşık 5~10 x 106 hücre kullanılmıştır. Elde edilen RNA örnekleri -80ºC’de
saklanmıştır. RNA izolasyon aşamaları Tablo 3-4’te gösterilmiştir.

Tablo 3-4: Hücrelerden RNA izolasyonu

5~10 milyon hücre + 1 ml Tridity G; homojenizasyon

↓
5-10 dakika 15-30ºC’de inkübasyon
↓
Karışım + 200 µl Kloroform, 15 saniye sallanarak karıştırılır
↓
12000 g’de +4 ºC’de 15 dakika santrifüj
↓
Üst faz + 550 µl İzopropil alkol
↓
12000 g’de +4 ºC’de 10 dakika santrifüj
↓
Pellet + 1 ml %75 Etanol
↓
7500 g’de +4 ºC’de 5 dakika santrifüj
↓
Üst faz dökülür. Pellet oda sıcaklığında kurutulur.
↓
Total RNA + 5 -15 µl RNase free su
↓
60 ºC’de 5 dakika inkübasyon
 58

3.2.1.3. cDNA Sentezi

İzole edilen Total RNA kullanılarak cDNA sentez kiti ile örneklerden cDNA
sentezi yapıldı. Her örnek için kullanılan reaksiyon karışımı ve yöntem Tablo 3-5’de
gösterilmiştir.

Tablo 3-5: cDNA sentez yöntemi

Her örnek için toplam reaksiyon hacmi 20 µl olacak şekilde hazırlanır.

↓
1. Reaksiyon karışımı hazırlanır:
Total RNA 0,1 -5 µg
Oligo(dT)18 primer (0,5 µg / µl) 1 µl
DEPC’li su 12 µl
↓
70 ºC’de 5 dakika inkübasyon
2. Reaksiyon karışımı hazırlanır:
5X Reaksiyon tamponu 4 µl
Ribonükleaz inhibitörü 1 µl
dNTP karışımı (10 mM) 2 µl
↓
37 ºC’de 5 dakika inkübasyon
RT enzimi eklenir 1 µl
↓ 20µl
42 ºC’de 5 dakika inkübasyon
↓
70 ºC’de 10 dakika inkübasyon
↓
Örnekler buza alınır ve -20 ºC’de saklanır.
 59

3.2.1.4. NESTED PCR

Örneklerden izole edilen RNA’larının degradasyon durumunu saptayabilmek

için tek zincirli cDNA’dan GAPDH geninin 598 bç’lik bir bölgesini çoğaltmak için
uygun primerler kullanıldı.

Hasta ve sağlıklı bireylerde 100-10-2 seviyedeki WT1 ekspresyonunu belirlemek

için PCR reaksiyonu 30 döngü için dış primerlerle yapıldı. Daha düşük (10-2-10-3)
seviyelerdeki WT1 ekspresyonunu görüntüleyebilmek için ikinci PCR 30 döngü için iç
primerlerle yapıldı. WT1 ve GAPDH genlerinin çoğalması için kullanılan primer
dizileri (Şekil 3-1 ve Tablo 3-6) , PCR karışımları (Tablo 3-7 ve 3-9) ve PCR şartları
(Tablo 3-8 ve 3-10) aşağıda gösterilmiştir.

OS: 5’-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3’
OA: 5’-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3’

IS: 5’-GCTGTCCCACTTACAGATGCA-3’
IA: 5'-TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTT-3’
OS OA
IS IA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

17AA Kırpılma KTS Kırpılma

Noktası Noktası

Şekil 3-1: WT1 geninin Nested PCR şeması

OS: Dış Primer sens, OA: dış primer antisens, IS: iç primer sens, IA: iç primer antisens.
 60

Tablo 3-6: GAPDH Geninin Primer Dizileri

GAPDH F: 5’- CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA -3’

GAPDH R: 5’- TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC -3’

Tablo 3-7: Birinci PCR için Reaksiyon Karışımı

Reaksiyon Karışımı Miktar (µl)

10X PCR Tamponu 5

10 mM dNTP karışımı 0,5

25 mM MgCl2 3

30 mM GAPDH F primer 0,3

30 mM GAPDH R primer 0,3

30 mM WT1 OS primer 0,5

30 mM WT1 OA primer 0,5

5u/µl Taq Polimeraz 0,3

cDNA 2

dH2O 37,6

Toplam 50

Tablo 3-8: Birinci PCR için Reaksiyon Şartları

Aşamalar Sıcaklık Zaman Döngü Sayısı

Birinci PCR 30

Denatürasyon 94 ºC 1 dk

Yapışma 64 ºC 1 dk

Uzama 72 ºC 2 dk
 61

Tablo 3-9: İkinci PCR için Reaksiyon Karışımı

Reaksiyon Karışımı Miktar (µl)

10X PCR Tamponu 5

10 mM dNTP karışımı 0,5

25 mM MgCl2 3

30 mM GAPDH F primer 0,3

30 mM GAPDH R primer 0,3

30 mM WT1 OS primer 0,5

30 mM WT1 OA primer 0,5

5u/µl Taq Polimeraz 0,3

Birinci PCR ürünü 1

dH2O 38,6

Toplam 50

Tablo 3-10: İkinci PCR için Reaksiyon Şartları

Aşamalar Sıcaklık Zaman Döngü Sayısı

İkinci PCR 30

Denatürasyon 94 ºC 1 dk

Yapışma 64 ºC 1 dk

Uzama 72 ºC 2 dk
 62

3.2.1.5. Elektroforez İşlemleri

Yürütülecek materyellere bağlı olara agaroz jeller farklı konsantrasyonlarda

hazırlandı. PCR sonuçlarının incelenebilmesi için %2’lik, RNA için %1,5’luk agaroz jel
hazırlandı. Jellerin hazırlanması için 0,5X TEB tamponu kullanıldı. Hazırlanan jel 56
ºC’ye soğutulduktan sonra örneklerin gözlenebilmesi için son konsantrasyon 0,5 µg / ml
olacak şekilde etidyum bromür eklendi. 20 dişli taraklar yerleştirildikten sonra jel 1 mm
kalınlığında 14 X 11,5 cm boyutundaki jel tabağına döküldü. Polimerizasyon
gerçekleştikten sonra içerisinde 0,5X TEB bulunan elektroforez tankına yerleştirildi.
Taraklar çıkarıldıktan sonra 10X yükleme tamponu kullanılarak örnekler jeldeki ceplere
yüklendi. PCR ürünlerinin kontrolü için örnekler 160 V’ta 30 dakika yürütüldü. RNA
örneklerinin kontrolü için örnekler 120 V’ta 15 dakika yürütüldü. Elektroforez
işleminden sonra jeller UV ışık altında incelenerek jel dokümentasyon sistemi ile
değerlendirildi.
 63

3.2.2. Flüoresan İn Situ Hibridizasyon (FISH)

FISH yöntemi nükleik asid sekanslarını flüoresan işaretli problar aracılığı ile
saptamaya olanak sağlayan bir yöntemdir. Metafaz veya interfaz aşamasında bulunan
hücrelerinde kromozomal anomalileri veya genlerin kromozomlar üzerindeki yerini
saptamada kullanılır. FISH yönteminde kullanılabilen uygun örnekler; periferik kan,
kemik iliği, sitolojik örnekler veya parafine gömülmüş dokulardır. Çift renk çift füzyon
probları FISH’te kullanılan en duyarlı problardandır, yanlış pozitiflik oranları < %1
olup diğer problardan çok daha düşüktür. Kronik Myeloid Lösemi genetik olarak
t(9;22)(q34;q11) dengeli translokasyonu ile tanımlanmıştır. Translokasyonun sonucunda
22. kromozomun derivatifi olan Philadelphia (Ph) kromozomu üzerinde BCR/ABL
füzyon geni oluşmaktadır. BCR-ABL çift renk çift füzyon probu periferik kan
yaymalarında t(9;22) dengeli translokasyonu tespit etmek üzere tasarlanmıştır. Probun
yapısı ve bağlanma yerleri Şekil 3-2’de gösterilmiştir. ABL (9q34) genine özgün DNA
probu rhodamine floroforu (kırmızı) ile direkt olarak işaretlenmiştir. BCR (22q11) geni
ise dGreen (yeşil) ile işaretlenmiştir. 22x22 mm boyutunda bir lam için 10 µl prob
kullanılır.

9q34 Bölgesi
Ekson 1b

Ekson 11
Ekson 1a

Ekson 2

Sentromer Telomer
ASS geni ~ 65 NUP214

ABL

345 kb 410 kb
22q11 Bölgesi

IGLC1 BCR IGLL1

350 kb 500 kb

Şekil 3-2: Probun bağlandığı bölge

BCR/ABL çift renk çift füzyon DNA probu bilinen tüm kırık noktaları ile kesişmez. BCR ve aBL genlerinin 5’ ve 3’
uçlarına yakın bölgelere hibridize olur. Abl bölgesi rhodamine (kırmızı), BCR bölgesi ise dGreen (yeşil) fluroforları
ile işaretlenir.
 64

3.2.2.1. Periferik kandan direkt yayma tekniği

EDTA’lı kandan alınan bir damla kan silanize lam üzerine konuldu ve ikinci bir
lam kullanılarak, hematolojide kullanılan klasik yayma tekniği ile lam üzerine üniform
olarak yayıldı.

Lam kuruması için oda sıcaklığında bekletildi. Örneğin yayıldığı yer elmas
kalem ile işaretlendi. Lamlar yeni hazırlanmış fiksatif (3:1 metanol ve asetik asid) ile
dolu şalede oda sıcaklığında, 10 dakika inkübe edildi.

Lamlar direkt olarak kullanılmadığı için, ikişer dakika sırası ile % 70, % 85 ve
100% etanol’den geçirildikten sonra -20°C’de saklandı.

3.2.2.2. Lenfositlerden yayma tekniği

Direkt yayma tekniğinin uygulanamadığı vakalarda izole edilen lenfositlerden

bir miktar yayma için kullanıldı. Cryo tüplerde saklanan lenfositlere 1ml fiksatif eklendi
ve hücreler yerlerinden kaldırıldı. 1 ml’lik karışım silanize lam üzerinde yayıldı.

Kuruduktan sonra lam sırası ile % 70, % 85 ve 100% etanol’de dehidrate edildi
ve sonra -20°C’de saklandı.

3.2.2.3. Ön İşlem ve Prob uygulanması

Silanize lamlar fiksatif ve etanol serilerinden geçirildikten sonra, -20°C’de 2-3

ay boyunca saklandı. Probu uygulamadan önceki aşamalar Tablo 3-11’de gösterilmiştir.
Sıcaklığı çok önemli olan enzim ve çalışma solüsyonlarının ısı ayarı için su banyoları
kullanıldı. Enzim parçalamasından sonra lamlar lenfosit durumunu tespit etmek için
mikroskopta incelendi ve elmas kalemle prob uygulamasına en uygun bölgeler
işaretlendi.
 65

Tablo 3-11: Ön İşlem aşamaları

Ön İşlem

%30 Ön İşlem solüsyonu 45 ºC 15 dk

2X SSC pH 7.00 Oda sıcaklığı 5-10 sn

Protein Parçalaması

Protein Parçalama Solüsyonu 45 °C 10 dk

2X SSC pH 7.00 Oda sıcaklığı 5-10 sn

% 70 EtOH 1 dk

%85 EtOH 1 dk

% 100 EtOH 1 dk

Lamlara uygulanan ön işlem

2X SSC/%0,5NP-40 pH 7.00 37 °C 30 dk

% 70 EtOH 1 dk

%85 EtOH 1 dk

% 100 EtOH 1 dk

3.2.2.4. Probun hazırlanması

Kullanıma hazır olan probun -20°C’den çıkarılıp oda ısısına gelmesi sağlandı.
Prob uygulama sırasında ışıktan korunmalı ve prob uygulaması sonrasındaki bütun
aşamalar karanlıkta gerçekleştirilmelidir. Prob ve lamın üzerindeki hedef DNA
aşağıdaki tabloda (Tablo 3-12 ) gösterildiği gibi beraber denatüre edildi.
 66

Tablo 3-12: Prob uygulama aşamaları

Kodenatürasyon

22x22 mm2 alan için 10 µl Prob

Fiksogum ile kapatılır

Denatürasyon 75°C 5 dk

Hibridizasyon 37°C 22 sa

3.2.2.5. Hibridizasyon sonrası yıkamalar

Hibridizasyon bittikten sonra, lamelleri çevreleyen yapıştırıcı pens ile uzaklaştırıldı.

Lamel uzaklaştıktan sonra lamlar yıkama tamponundan geçirilidi. Hibridizasyon ve
yıkama aşamaları sırasındaki sıcaklık dereceleri ve tamponların yoğunluğu iyi bir FISH
sonucu için önemlidir. Sinyalin kaybolmasına veya probun non-spesifik bölgelere
bağlanmasına neden olabilir. Hibridizasyon sonrasındaki aşamalar Tablo 3-13‘te
gösterilmiştir.

Tablo 3-13: Hibridizasyon sonrası aşamalar.

Hibridizasyon sonrası

Lamel kaldırılır 1X PBD içerisinde Oda sıcaklığı

Yıkama 1X Yıkama Tamponu 65°C 5dk

1X PBD RT 5 dk

Counterstain 15µl DAPI /ANTIFADE

 67

4. BULGULAR

4.1.Hasta ve kontrol grubunun özellikleri

Hastalığın farklı fazlarında bulunan kronik myelojenik lösemili 63 hastada RT-

PCR yöntemi ile WT-1 gen ekspresyonunu incelemek için periferik kandan lenfosit
izolasyonu yapıldı. FISH yöntemi ile BCR-ABL füzyonunu incelemek üzere periferik
kandan yayma preparatlar hazırlandı.

WT1 gen ekspresyonu incelenen hastalardan 57 tanesinde sonuç elde

edilebilmiştir. 6 hastada RNA izolasyon, cDNA sentez ve kontrol PCR aşamaları 2 kez
tekrarlanmış olmasına rağmen sonuç elde edilememiştir. Kontrol grubu olarak 50
sağlıklı bireyden alınan periferik kan kullanılmıştır.

Toplam 50 hastada FISH uygulanmıştır. Direkt yayma tekniğinin

uygulanamadığı vakalarda hücreden yayma tekniği kullanılarak izole edilen
lenfositlerden yaymalar hazırlandı. İzole edilmiş lenfositlerden hazırlanan 15 preparata
FISH uygulanmış ancak her bir örnek için üç farklı yayma ve ön işlem aşaması
uygulanmış olmasına rağmen hibridizasyon gerçekleşmemiştir. Toplam 35 hastadan
sonuç elde edilebilmiştir.

Tablo 4-1 deneylerin en az birinden sonuç alınan toplam 59 hastanın klinik faz
ve cinsiyete göre dağılımını göstermektedir.

Tablo 4-1: Hastaların klinik bulgularına göre dağılımı

Kadın Erkek Toplam

Akselere Faz 11 6 17

Kronik Faz 13 9 22

Bilinmeyen* 6 14 20

Toplam 30 29 59
* Bilinmeyen olarak gösterilen grup, RT-PCR yöntemi ile p210 pozitif olarak saptanmış ama klinik bilgisine
ulaşılamayan hasta grubudur.
 68

4.2. WT1 Ekspresyonunun Sonuçları

Hasta ve kontrol grubunun periferik kanından izole edilen RNA’lardan cDNA

sentezlendi. cDNA’lar kullanılarak RT-PCR yapıldı, sonuçlar jel dokümentasyon
sistemi ile UV ışık altında değerlendirildi. Marker olarak ΦX174/Hae kullanıldı. İzole
edilen RNA’ların miktarını belirlemek için 1 µl RNA spektrofotometre ile ölçüldü.

WT1 gen ekspresyonunu değerlendirmek için nested-PCR yapıldı. WT1 geninin

ekspresyon düzeyini tespit etmek için GAPDH geni pozitif kontrol olarak kullanıldı.
Negatif kontrol olarak her PCR’da su kullanıldı. GAPDH, PCR’ın ilk ve ikinci
aşamasında 598 bç WT1 geni de PCR’ın ikinci aşamasında 343 bç büyüklüğünde bant
vermektedir. Birinci PCR’ın sonucunda 20 hastadan elde edilen sonuçlar Şekil 4-1 ve
Şekil 4-2’de gösterilmiştir.

M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Şekil 4-1: Birinci PCR sonuçları

M: Marker. 1 – 13 arasında GAPDH pozitif hastalar.
 69

M 14 15 16 17 18 19 20

-598 bç

Şekil 4-2: Birinci PCR Sonuçları (Devam)

M: Marker. 14 – 20 arasında GAPDH pozitif hastalar. 21 negatif kontrol.

Toplam 57 hastanın 49’unda (%85,9) WT1 ekspresyonu pozitif bulundu. WT1

pozitif hastalarda 343 bç’inde bant görülmesi yanı sıra, bazı WT1 pozitif hastalarda 232
bç’inde bant gözlenmiştir. Şekil 4-3 ve Şekil 4-4’te hastaların ikinci PCR Sonuçları
gösterilmiştir. (M: Marker)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-598 bç
-343 bç
-232 bç

Şekil 4-3: Hastaların ikinci PCR Sonuçları

M: Marker. 1,2,7,9,11 ve 12 WT1 negatif hastalar. 3,4,5,6,8 ve 13 WT1 pozitif hastalar. 10 WT1 geni için iki bant
veren hasta. 14 negatif kontrol.
 70

M
14 15 16 17 18 19 20 21

-598 bç
-343 bç

Şekil 4-4: Hastaların ikinci PCR Sonuçları (Devam)

M: Marker. 14,17,18,19 ve 20 WT1 pozitif hastalar. 15 ile 16 WT1 negatif hastalar. 21 negatif kontrol.

Hastalardan elde edilen WT1 ekspresyon sonuçları Tablo 4-2’de gösterilmiştir.

Tablo 4-2: Hastaların PCR sonuçları

Kadın Erkek Toplam

WT1 Pozitif 26 (%89,7) 23 (%82,1) 49

WT1 Negatif 3 (%10,3) 5 (%17,9) 8

Toplam 29 28 57
 71

50 sağlıklı kontrolün 31’inde (%62) WT1 ekspresiyonu negatif bulundu. 19 kontrolde

(%38) WT1 gen ekspresyonu saptandı. Kontrollerin ikinici PCR sonuçları Şekil 4-5’te
gösterilmiştir.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-598 bç
-343 bç

Şekil 4-5: Kontrollerin ikinci PCR sonuçları

GAPDH 598 bç büyüklüğünde, WT1 geni 343 bç bant vermektedir. 4. ve 6. örnekte WT1 geninin bantı mevcut. 14.
örnek negatif kontrol (M: Marker)

Kontrollerden elde edilen WT1 ekspresyon sonuçları tablo 4-3’te gösterilmiştir.

Tablo 4-3: Kontrol Grubunda PCR sonuçları

Kadın Erkek Toplam

WT1 Pozitif 11 (%40,7) 8 (%34,8) 19

WT1 Negatif 16 (%59,3) 15 (%65,2) 31

Toplam 27 23 50
 72

4.3. FISH incelenmesinin değerlendirmesi

Periferik kan hücrelerinde BCR/ABL translokasyonu çift renk çift füzyon D-

FISH probu kullanılarak interfaz FISH ile değerlendirilmiştir. BCR/ABL çift renk çift
füzyon probu yeniden düzenlenen iki kromozomu da iki farklı füzyon (F) sinyali olarak
saptamaktadır. Ayrı ayrı kırmızı (R) veya yeşil (G) sinyaller normal olan 9. ve 22.
kromozomları tespit etmektedir. Normal bir hücrede görülmesi beklenen 2R2G sinyal
şeklidir.

Translokasyon varlığında 1R1G2F şekli oluşur. Bunların dışında kalan diğer

sinyal şekilleri farklı translokasyonları, der(9) veya der(22) üzerindeki delesyonları, çift
Ph kromozomunu veya farklı karmaşık düzenlemeleri göstermektedir. Hastalarda
görülen sinyal şekilleri değerlendirilirken çift renk çift füzyon BCR/ABL probu ile
KML hastalarında rastlanan en yaygın sinyal şekilleri araştırılmış ve gözlenen sinyaller
bunlara dayanarak değerlendirilmiştir. Şekil 4-6’da KML’de rastlanan en yaygın sinyal
şekilleri yer almaktadır.
 73

NORMAL İNTERFAZ HÜCRELERİ:

2R2G; 1R1G1F; 2F;

2 KIRMIZI 2 YEŞİL 1 KIRMIZI 1YEŞİL 1 FÜZYON 2 FÜZYON

TÜMÖRE ÖZGÜN PATERNLER:

1R1G2F; 3F; 1R1G3F;

1 KIRMIZI 1YEŞİL 2 FÜZYON 3 FÜZYON 1 KIRMIZI 1YEŞİL 3 FÜZYON

VARYANT TÜMÖR PATERNLER:

2R2G1F; 3R2G1F;
2 KIRMIZI 2 YEŞİL 1 FÜZYON 3 KIRMIZI 2 YEŞİL 1 FÜZYON

DELESYON: der9 DELESYON: der22

1R2G1F; 2R1G1F;
1 KIRMIZI 2 YEŞİL 1 FÜZYON 2 KIRMIZI 1 YEŞİL 1 FÜZYON

Şekil 4-6: BCR/ABL translokasyonu D-FISH sinyal şekilleri

 74

Mikroskop incelemesi sırasında yalnızca odaklanan planda bulunan sinyaller net

görülmektedir ve bu plan dışında kalan sinyalleri görmek için odak uzaklığını
değiştirmek gerekir. Sinyalin elde edilmesi zor olduğu olgularda bilgisayar aracılı
görüntüleme ve analiz yazılımlarından yararlanılır. Ancak bu durumda yine odaklanan
plan dışında kalan sinyallerin görülmesinde problem yaşanabilir. Sinyallerin üst üste
gelme ve iki sinyal yerine tek sinyal görülmesi olasılığı vardır. Bu nedenle sinyal şeklini
yorumlarken her sinyal için ayrı odak ayarı yapmak gerekebilir. Aşağıdaki resim, her
renk ayrı incelendiğinde, sinyallerin net görülebildiği ama bütün sinyaller bir arada
incelendiğinde, yeşil sinyallerin görülemediği bir hücre örneğidir. Şekil 4-7.

A B

C D

Şekil 4-7: Aynı hücrede farklı filtrelerle alınan resimlerdeki değişiklikler

A. SPO (kırmızı) filtre ile alınan görüntüde ABL genine ait 3 sinyal görülmektedir. B. FITC (yeşil) filtre ile alınan
görüntüde BCR genine ait 3 sinyal görülmektedir. C. DAPI (mavi) ile boyanan çekirdekteki kromatin. D. Bütün
sinyalleri bir arada gösteren filtre ile alınan görüntüde iki ayrı kırmızı sinyal iki ayrı yeşil sinyal ve birde sinyallerin
üst üste gelmesinden dolayı turuncu renkte görülen füzyon sinyali görülmektedir. Şekildeki sinyal dağılımı
2R2G1F’tir.
 75

4.3.1. Sinyallerin değerlendirilmesi

Kırmızı ve yeşil sinyaller sırasıyla ABL ve BCR genlerini göstermekte, arka

plan kromatini ise mavi renkte görülmektedir. Mikroskopla yapılan incelemede
çekirdeklerin arasında morfolojisi tam olan, çekirdek sınırları üst üste gelmeyen ve en
az 6 sinyal (3 kırmızı ve 3 yeşil) veren hücreler sayılmıştır. Üst üste gelen veya kesişen
kırmızı ve yeşil sinyallerin varlığında alınan sinyal füzyon sinyali olarak tanımlanmıştır.

Çekirdekler gözlenen sinyallere bağlı olarak normal, füzyon, tipik delesyon ve

atipik delesyon olarak sınıflandırılmıştır. Çalışmamız sırasında rastlanan sinyal şekilleri
aşağıdaki Tablo 4-4’te gösterilmiştir.

Tablo 4-4: Sinyal dağılım şekillerinin sınıflandırılması

Normal Füzyon Tipik Delesyon Atipik Paternler

2R2G 1R1G2F 2R1G1F 4R2G1F 2R1G2F 1G2F 1R2F 2R3G

1R1G1F 1R1G3F 1R2G1F 2R2G3F 2R1G3F 1R1G 1G3F 2G2F

2F 1R1G4F 1R2G2F 3R2G1F 2R1G 3R2G 2R2F

2R2G1F 2R2G2F 1R3F 3R3G 1R2G 2R4G

3F 3R1G1F 2G1F 2R1F 4F 1R

4.3.2. D-FISH yönteminin normal hücre aralığı

Çalışmada kullanılan prob ile yapılan değerlendirmeler için bazı çalışmalarda

100, diğerlerinde 200 hücre sayılması önerilmiştir. Çalışmamızda sinyal şekillerinde
herhangi bir değişiklik rastlanmayan hastalarda en az 100, farklı şekillere rastlanan
hastalarda ise en az 150 hücre sayılmıştır. Füzyon gözlenen hücrelerde cut-off değeri
olarak farklı araştırmalarda interfaz D-FISH için 0.25%, 0.9% ve 0.8% değerleri
önerilmiştir. Çalışmamızda üretici firmanın önerdiği ≥%1 değeri cut-off değeri olarak
alınmıştır ve bu değerin altında bulunan hastalar Philadelphia-negatif olarak
değerlendirilmiştir.
 76

Sonuç elde edebildiğimiz 35 hastadan 5’i Philadelphia-negatif bulunmuştur.

Geriye kalan hastalarda (n=30) hesaplanan Phildelphia-pozitif hücrelerin yüzdesi %2 ile
%90 arasında değişiklik göstermiştir. Philadelphia pozitifliği yüzde değeri aşağıdaki
denkleme göre hesaplanmıştır:

Füzyon + Delesyon + Atipik

x 100 = Philadelphia yüzdesi

Toplam hücre sayısı

Değerlendirme sırasında çekirdek DAPI ile boyandığı için çekirdeklerin şekilleri

saptanabilir. Ama sitoplazma görülemediği, dolayısıyla çekirdeğin sitoplazmaya oranı
belirlenemediği için hücre çeşitlerini tam anlamıyla ayırmak mümkün değildir. Ancak
çekirdek yapılarına göre granulosit ve monositleri ayırmak mümkündür ve normal
sinyal veren hücrelerde granulosit-monosit ayrımı yapılmıştır.

Hastalara uygulanan FISH sonuçları Tablo 4-5’te gösterilmiştir.

Tablo 4-5: Hastaların FISH sonuçları

Akselere Faz Kronik Faz Toplam

Ph Pozitif 17 (%100) 13 (%72,2) 30

Ph Negatif 0 (%0) 5 (%27,8) 5

Toplam 17 18 35

1R1G1F sinyal şekli, incelenen hücrelerde 1R1G2F gibi herhangi bir füzyon
şekli gözlenmediği zaman normal, hücrelerde en az bir tane olmak üzere füzyon şekli
gözlendiğinde ise delesyon olarak değerlendirilmiştir.
 77

Hastalarda rastlanan en yaygın sinyal şekli Philadelphia kromozomunun simgesi

olan 1R1G2F şeklidir. Bu şekil yaygın olarak hem monositlerde, hem de granulositlerde
gözlenmiştir. Granülosit çekirdek yapısı nedeniyle kolaylıkla monositten ayırt
edilebilmektedir. Farklı hücrelerde görülen Philadelphia kromozomuna ait sinyal şekli
1R1G2F Şekil 4-8’de gösterilmiştir.

A B C

D E F

Şekil 4-8: Farklı hücre yapılarında Philadelphia kromozomu

A-B Monositlerde Philadelphia kromozomu. C-F: Granulositlerde Philadelphia kromozomu. Şekilde yer alan sinyal
dağılımı 1R1G2F’dir.
 78

Philadelphia kromozomuna ait farklı bir sinyal şekli 3F’tir. Bu sinyal şeklinde
ayrı yerlerde bulunan BCR ve ABL genlerinin sinyalleri hücrenin üç boyutlu yapısı
nedeniyle üst üste gelen sinyaller olarak görünmektedir. Şekil 4-9’da buna örnek olarak
farklı hücrelerde 3F şekilleri gösterilmiştir.

Şekil 4-9: Farklı hastalarda 3 füzyon (3F) sinyal dağılımı

Philadelphia pozitif olarak değerlendirilen hastalarda füzyon sinyal dağılım

şeklinin yanısıra normal sinyal dağılımına sahip hücreler de gözlenmiştir. Bu hücrelerde
görülen dağılım şekli 2R2G şeklidir. Şekil 4-10’da farklı hücrelerde 2R2G sinyal
dağılımına örnekler görülmektedir.

Şekil 4-10: Farklı hastalarda 2R2G normal sinyal dağılım şekli

 79

Çoğu hastada BCR-ABL füzyonu yanı sıra delesyonlara ait tipik sinyal
şekillerine rastlanır. Çalışmamızda delesyon ile ilişkili sinyaller olarak değerlendirilen
şekiller arasında: 1R2G1F, 1R1G1F ve 2R1G1F yer almaktadır. Bunlara örnek olarak
farklı hücrelerde gözlenen tipik delesyon sinyal dağılımları Şekil 4-11’de gösterilmiştir.

A B C D

Şekil 4-11 Farklı hücrelerde delesyona ait tipik sinyaller

A. 1R2G1F. B. 1R1G1F . C. 1R1G1F D. 2R1G1F
 80

Bazı lösemi hücrelerinde az sıklıkla da olsa delesyonlara ait farklı sinyal

şekillerine rastlanmıştır. Bu şekillerin sayısı çok az olduğundan hepsi atipik delesyon
sinyalleri adı altında toplanmıştır. Bu değişik sinyal dağılımları Şekil 4-12’de
gösterilmiştir.

A B C

D E F

G H I

Şekil 4-12: Hastalarda görülen farklı atipik sinyal şekilleri

A. 2R2G1F. B. 2R2G1F. C. 3R3G. D. 1R2G2F. E. 2G2F. F. 1R2G1F G. 2R2G1F. H. 2R1G2F. I. 3R2G1F
 81

4.4. İstatistikler

Hasta ve kontroller arasında WT1 gen ekspresyonu χ2 testi ile

karşılaştırıldığında fark yüksek seviyede anlamlı bulunmuştur. Veriler Tablo 4-6’da
gösterilmiştir.

Tablo 4-6: Hastalar ve kontroller arasında WT1 gen ekspresyonunun karşılaştırılması

Hasta Kontrol

WT1 Pozitif 49 (%85,9) 19 (%38) X2: 26,455

WT1 Negatif 8 (%14,1) 31 (%62) s.d. = 1

Toplam 57 50 p< 0,001

WT1 gen ekspresyonu ve klinik fazı bilinen 33 hastanın fazlarla ekspresyon

arasındaki istatistiksel anlamlığı incelemek için Fisher testi uygulanmış ve sonuçlar
anlamlı bulunmuştur (Tablo 4-7).

Tablo 4-7: Hastalarda fazlara göre WT1 ekspresyonu

Akselere Kronik

WT1 Pozitif 12 (%100) 14 (%66,67) p = 0,0319

WT1 Negatif 0 (%0) 7 (%33,33)

Toplam 12 21
 82

Philadelphia pozitifliği yüzdesi ve WT1 ekspresyonu arasındaki ilişkiyi

incelemek için öncelikle FISH yöntemi ile alınan sonuçlar iki gruba ayrılarak
sınıflandırılmıştır. Philadelphia yüzdesi %32’den daha yüksek olan hastalar tedaviye
karşı kısıtlı cevap veren, yüzdesi daha düşük olan hastalar ise olumlu cevap veren
hastalar grubunda değerlendirilmiştir.

FISH sonuçları ve klinik fazları bilinen 35 hastanın FISH sonuçlarının klinik

fazlara göre karşılaştırılması için Fisher testi uygulanmış ve sonuçlar anlamlı
bulunmuştur (p< 0,001) (Tablo 4-8).

Tablo 4-8: Hastalarda klinik fazlara göre Philadelphia kromozom pozitifliği

Akselere Kronik

≥ %33Philadelphia
16 (%94,1) 0 (%0) p< 0,001

≤ %32 Philadelphia 1 (%5,9) 18 (%100)

Toplam 17 18

FISH ile yapılan inceleme sonucunda belirlenen Philadelphia yüzdesinin WT1

ekspresyonu ile karşılaştırılması Fisher testi ile yapılmış ve sonuçlar istatistiksel olarak
anlamlı bulunmuştur (Tablo 4-9).

Tablo 4-9: Hastalarda FISH sonucu ve WT1 ekspresyonunun karşılaştırılması

≥ %33Philadelphia ≤ %32 Philadelphia

WT1 Pozitif 15 (%100) 13 (%72,2) p = 0,0488

WT1 Negatif 0 (%0) 5 (%27,8)

Toplam 15 18
 83

FISH incelemesi sırasında ileri faz hastalarında granulosit yapısı gösteren

çekirdeklerde BCR/ABL füzyonunun sık olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle normal
2R2G sinyal dağılımı gösteren granulositlerin sayısının toplam normal çekirdeklerin
sayısına oranı ile hastaların bulunduğu faz ve Philadelphia yüzdesi arasındaki ilişki
istatistiksel olarak incelenmiştir. Tablo 4-10 ve Tablo 4-11’de sırasıyla normal
granulositler ile hastalık fazı ve normal granulositler ile Philadelphia yüzdesi arasındaki
ilişki gösterilmiştir. İki durumda sonuçlar istatistiksel olarak yüksek derecede anlamlı
bulunmuştur.

Tablo 4-10: Normal granulositlerin faz ile ilişkisi

Akselere Kronik

G / Toplam 2R2G < 1/3 9 (%69,2) 0 (%0) p < 0,001

G / Toplam 2R2G ≥ 1/3 4 (%30,8) 16 (%100)

Toplam 13 16

Bu incelemede her iki parametreye dair verileri bulunan 29 hastanın sonucu incelenmiştir.

Tablo 4-11: Normal granulositlerin Philadelphia yüzdesi ile ilişkisi

≥ %33Philadelphia ≤ %32 Philadelphia

G / Toplam 2R2G < 1/3 10 (%71,4) 0 (%0) p < 0,001

G / Toplam 2R2G ≥ 1/3 4 (%28,6) 17 (%100)

Toplam 14 17

Bu incelemede Philadelphia yüzdesi hesaplanan ve granulosit sayısı saptanmış 31 hastanın sonucu

değerlendirilmiştir.
 84

5. TARTIŞMA

Akciğer, kolon, meme, tiroid, pankreas duktal karsinomu, baş boyun skuamöz
hücreli karsinomu, astrositik tümörler, kemik ve yumuşak doku sarkomları gibi çeşitli
solid tümörlerde WT1 geninin yüksek ekspresyonu gösterilmiştir (19,20). WT1 geninin
yaban tipi lösemilerde de yüksek seviyelerde ifade edilmektedir (18).

WT1 geninin KML'deki ekspresyonu hakkında çeşitli çalışmalarda farklı

sonuçlar elde edilmiştir (15, 16). WT1 tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesine
rağmen, WT1’in lösemideki rolü hala çok net değildir (8,127,128). Bazı çalışmalar,
WT1 geninin Wilms’ tümöründe tümör süpresör gen olarak rol oynamasına karşılık,
lösemilerde onkogenik etkisi olduğunu ve devamlı hücre proliferasyonu için gerekli
olduğuna işaret etmektedir (5). WT1 geninin yüksek seviyede ekspresyonu, farklılaşma
ve apoptozun baskılanması, proliferasyonun artması gibi farklı mekanizmalarla malign
fenotipin sürdürülmesini uyarabilir (129).

WT1 geninin lösemideki rolünü incelemek amacı ile hastalar ve sağlıklı

kontroller arasında genin ekspresyonu karşılaştırılmıştır. WT1 ekspresyonu bakımından
hastalar ve kontroller arasında anlamlı derecede fark gözlenmiştir. Bu durum Goldman
ve ark. (12) tarafından 22 Philadelphia pozitif KML hastasında real time PCR’la yapılan
çalışmanın sonuçları ile uyumludur. Söz konusu çalışmada incelenen 40 sağlıklı bireyde
düşük, KML hastalarında yüksek seviyede WT1 ekspresyonu tespit edilmiştir.

Çalışmaya dahil edilen 50 kontrolün 19’unda (%38) WT1 ekspresyonu pozitif

bulunmuştur. Sağlıklı bireylerde periferik kanda WT1 ekspresyonu daha önce farklı
çalışmalarda da gözlenmiştir (11, 13, 18, 171, 172). Çalışmamızda WT1 pozitif olarak
değerlendirilen sağlıklı bireylerin sayısının diğer çalışmalara kıyasla daha yüksek
olması kontrol sayısının fazla olmasından kaynaklanabilir.

Çalışmamızda farklı fazlardaki kronik myelojenik lösemili hastalarda WT-1 gen

ekspresyonu değerlendirilmiştir. 57 hastanın 49’unda (%85,9) WT1 gen ekspresyonu
ikinci PCR aşamasında pozitif bulunmuştur. Akselere fazda bulunan hastaların hepsi
WT1 pozitif bulunmuştur. Kronik fazdaki 7 hastada ekspresyon gözlenmemiştir.
Hastalardaki WT1 ekspresyonu ve hastaların bulunduğu klinik faz arasındaki ilişki
 85

istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bu sonuç Liu ve ark. (154) tarafından 33 KML
hastasında RT-PCR’la yapılan çalışmanın sonuçları ile uyumludur. Söz konusu
çalışmada blast fazında bulunan 18 hastanın 15’inde, akselere fazda bulunan 5 hastanın
birinde ve kronik fazda bulunan 10 hastanın bir tanesinde WT1 ekspresyonu
gözlenmiştir. Ayrıca Le Coutre ve ark. (10) tarafından 16 akselere faz KML hastasında
real time PCR’la yapılan değerlendirmede de bütün hastalarda ekspresyon bildirilmiştir.

Bazı pozitif hastalarda gözlenen ikinci bandın WT1’in daha kısa bir izoformu
olan WT1s olabileceği düşünülmektedir. WT1 geninin bu izoformu lösemilerde yüksek
seviyelerde ifade edilen ve onkogenik özelliklerine sahip olan bir proteindir (170).

Çalışmamızın özgün yönü periferik kan yaymasından hazırlanan örnekte FISH

yönteminin uygulanmasıdır. Bu işlem bilgimiz çerçevesinde Türkiye’de ilk kez
uygulanmaktadır. D-FISH yöntemi yüksek özgünlüğü ve verdiği iki füzyon sinyali
nedeniyle interfaz çekirdeklerinde düşük seviyede BCR-ABL gen füzyonunu bile tespit
edebilmektedir. Çalışmamızda ≥%1 değeri cut-off değeri olarak kullanılmış ve bunun
altında kalan değerler Philadelphia-negatif olarak kabul edilmiştir.

Çalışmada kullanılan prob için sayılması gereken hücre sayısı açısından 100 ile
200 arasında değişik öneriler mevcuttur (23, 173-176). Çalışmamızda sinyal dağılım
şeklinde herhangi bir değişikliğe rastlanmayan hastalarda en az 100, farklı sinyal
şekilleri rastlanan hastalarda ise en az 150 hücre sayılmıştır.

FISH sonucu elde edilen 35 hastanın 30’unda (%85,3) Philadelphia kromozomu

pozitif bulunmuştur. KML hastalarının klinik fazları ve Ph pozitifliği arasındaki ilişki
istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Ph yüzdesi yüksek olan hastaların klinik olarak
daha ileri fazlarda olduğu gözlenmiştir. Bu sonuç yöntemi doğrulamak açısından önemli
bir sonuçtur. Füzyon taşımayan parçalı çekirdekli hücre sayısının azalması ile akselere
faz ve Philadelphia pozitifliği yüzdesi artışı arasında anlamlı ilişki bulunmuştur.

KML’nin konvansiyonel sitogenetik analizi kültürde çoğalan az sayıda

bölünebilen myeloid hücrelerle sınırlıdır. Çalışmamızda kullanılan interfaz FISH
yöntemi ise hücrelerin mitotik hızı veya soylarına ilişkin ayırım yapılmadan, çok sayıda
hücrenin değerlendirilmesine olanak vermektedir. Ph-pozitif metafazların sayısı
interfazda belirlenen BCR-ABL pozitif hücrelere kıyasla daha yüksektir. Interfaz FISH
ile löseminin gelişmesinde etkili olmayan hücrelerin de değerlendirilmeye alınıyor
olması sonuçların arasındaki %10 dolayındaki farklılığı açıklayabilir (176).
 86

Diğer yandan çalışmamızda periferik kan yaymaları üzerinde interfaz FISH

incelemesi yapılmıştır. Preparat DAPI ile boyandığı için çekirdeğin yapısını
mikroskopla görmek mümkün olduğu halde çekirdek/sitoplazma oranını belirlemek
mümkün olmadığı için hücreleri morfolojilerine göre ayırmak mümkün değildir. Sadece
granulositleri (parçalı çekirdekli yapıları) monositlerden (yuvarlak çekirdekli
yapılardan) ayırmak mümkündür. KML’de BCR-ABL füzyonu B-lenfositlerde
görülmektedir, yaymada sıkça rastlanan T-lenfositlerinde ise füzyon görülmemektedir.
Monositlerde füzyona rastlanmakla birlikte D-FISH yöntemi ile monositleri T-
lenfositlerinden ayırmak olanaksızdır. Bundan dolayı sayım sırasında füzyon taşımayan
hücrelerin de sayılmasıyla bulunan Philadelphia yüzdesi konvansiyonel sitogenetik
yöntemi ile bildirilen Philadelphia yüzdesinden daha düşük olabilir.

Çalışmamızda WT1 ekspresyonu FISH sonucunda elde edilen Philadelphia

yüzdesi ile karşılaştırıldığında bu iki parametrenin birbiriyle ilişkili oldukları
görülmüştür.

WT1 günümüzde panlösemik bir belirteç olarak tanımlanmaktadır.

Çalışmamızın amacı farklı klinik fazlarda bulunan hastalarda WT1 ekspresyonunu
incelemek ve ayrıca bu hastalarda interfaz D-FISH yöntemi ile hastaların araştırmaya
katıldıkları andaki klinik fazlarını doğrulamaktı. Yapılan istatistiksel hesaplamaların
sonucundan WT1 ekspresyonunun KML hastalarında %85,9 oranında görüldüğü ve
hastaların klinik faz ve Philadelphia yüzdeleri ile ilişkili olduğu anlaşılmıştır.

Çalışmamız periferik kan yaymasından yapılan FISH yönteminin KML

hastalarının takibi için uygulanması kolay ve güvenilir bir yöntem olduğunu
göstermiştir. Buna ek olarak değerlendirme sırasında, özellikle de tedaviden sonra,
periferik kanda bulunan çok sayıda BCR-ABL(-) CD3(+) T hücresinin
değerlendirmeden çıkartılması daha güvenilir sonuçlar verecektir (176). Bu nedenle
interfaz FISH yönteminin immunhistokimyasal yöntemler ile birlikte değerlendirilmesi
sonuçların doğruluğunu artıracaktır.
 87

KAYNAKLAR

1-Nowell P, Hungerford D. A minute chromosome in human chronic

granulocytic leukemia. Science 1960; 132: 1497.

2- Call K, Glaser T, Ito C, Buckler A, Pelletier J, Haber D ve ark. Isolation and

characterization of a zincfinger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms’
tumor locus. Cell 1990; 60: 509 - 520.

3- Gessler M, Poustka A, Cavenee W, Neve R, Orkin S, Bruns G. Homozygous

deletion in Wilms’ tumors of a zinc-finger gene identified by chromosome jumping.
Nature 1990; 343: 774–778.

4- Wang Z-Y, Qui Q. Deuel T. The Wilms tumor gene product WT1 activates or
suppresses transcription through separate functional domains. J Biol Chem 1993; 268:
9172–9175.

5- Algar E. A review of the Wilms' tumor 1 gene (WT1) and its role in
hematopoiesis and leukemia. J Hematother Stem Cell Res 2002; 11: 589–599.

6- Ton C, Huff V, Call K, Cohn S, Strong L, Housman D ve ark. Smallest region

of overlap in Wilms tumor deletions implicates an 11p13 zinc-finger gene as a disease
locus. Genomics 1991; 10: 293–297.

7- Tadokoro K, Fujii H, Oshima A, Kakizawa Y, Shimiza K, Sakai A ve ark.

Intragenic homozygous deletion of the WT1 gene in Wilms tumour. Oncogene 1992; 7:
1215–1221.

8- Miwa H, Beran M, Saunders G. Expression of the Wilms tumor gene ( WT1 )

in human leukemias. Leukemia 1992; 6: 405–409.

9- Miyagi T, Ahuja H, Kubota T, Kubonishi I, Koeffler H, Miyoshi I.

Expression of the candidate Wilms tumor gene, WT1, in human leukemia cells.
Leukemia 1993; 7: 970–977.

10- Na IK, Kreuzer KA, Lupberger J, Dorken B, Coutre P. Quantitative RT-PCR

of Wilms tumor gene transcripts (WT1) for the molecular monitoring of patients with
accelerated phase bcr/abl + CML. Leuk Res 2005; 29: 343–345.
 88

11- Uzunel M, Ringden O. Poor correlation of kinetics between BCR-ABL and

WT1 transcripts levels after allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow
Transplantation 2004; 33: 47–52.

12- Chen ZX, Kaeda J, Saunders S, Goldman JM. Expression patterns of WT–1
and Bcr-Abl measured by TaqMan quantitative real-time RT-PCR during follow-up of
leukemia patients with the Ph chromosome. Chin Med J 2004; 117: 968–971.

13- Kletzel M, Olzewski M, Huang W, Chou PM. Utility of WT1 as a reliable

tool for the detection of minimal residual disease in children with Leukemia. Ped Dev
Path 2002; 5: 269–275.

14- Bergmann L, Miething C, Maurer U, Brieger J, Karakas T, Weidemann E,

Hoelzer. High levels of Wilms’ tumor gene (wt1) mRNA in acute myeloid leukemias
are associated with a worse long-term outcome. Blood 1997; 90: 1217–1225.

15- Fukahori S. Quantification of WT1 mRNA by competitive NASBA in AML

patients. Kurume Med J 2001; 48: 129-134.

16- Kreuzer KA, Saborowski A, Lupberger J, Appelt C, Na IK, le Coutre P ve

ark. Fluorescent 5'-exonuclease assay for the absolute quantification of Wilms' tumour
gene (WT1) mRNA: implications for monitoring human leukaemias. Br J Haematol
2001; 114: 313-318.

17- Gadzicki D, von Neuhoff N, Steinemann D, Just M, Busche G, Kreipe H ve

ark. BCR-ABL gene amplification and overexpression in a patient with chronic myeloid
leukemia treated with imatinib. Cancer Genet Cytogenet 2005; 159:164-167.

18- Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, Nakagawa M, Yamagami T, Miwa H ve

ark. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal
residual disease in acute leukemia. Blood 1994; 84: 3071-3079.

19- Oji Y, Miyoshi S, Maeda H, Hayashi S, Tamaki H, Nakatsuka S ve ark.

Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in de novo lung cancers. Int J Cancer
2002; 100: 297-303.

20- Oji Y, Yamamoto H, Nomura M, Nakano Y, Ikeba A, Nakatsuka S ve ark.

Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in colorectal adenocarcinoma. Cancer
Sci 2003; 94: 712-717.
 89

21- Dewald GW, Juneau AL, Schad CR, Tefferi A. Cytogenetic and molecular
genetic methods for diagnosis and treatment response in chronic granulocytic leukemia.
Cancer Genet Cytogenet 1997; 94: 59-66.

22- Bentz M, Cabot G, Moos M, Speicher MR, Ganser A, Lichter P ve ark.

Detection of chimeric BCR-ABL genes on bone marrow samples and blood smears in
chronic myeloid and acute lymphoblastic leukemia by in situ hybridization. Blood
1994; 83: 1922-1928.

23- Buno I, Wyatt WA, Zinsmeister AR, Dietz-Band J, Silver RT, Dewald GW.
A special fluorescent in situ hybridization technique to study peripheral blood and
assess the effectiveness of interferon therapy in chronic myeloid leukemia. Blood 1998;
92: 2315-2321.

24- Sinclair PB, Nacheva EP, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A ve ark.
Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis
subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood 2000; 95: 738-743.

25- Cohen N, Rozenfeld-Granot G, Hardan I, Brok-Simoni F, Amariglio N,

Rechavi G ve ark. Subgroup of patients with Philadelphia-positive chronic myelogenous
leukemia characterized by a deletion of 9q proximal to ABL gene: expression profiling,
resistance to interferon therapy, and poor prognosis. Cancer Genet Cytogenet 2001;
128: 114-119.

26- Kolomietz E, Al-Maghrabi J, Brennan S, Karaskova J, Minkin S, Lipton J ve

ark. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by
extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis. Blood 2001; 97:
3581-3588.

27- Abbott A. The root of the problem. Nature 2006; 442: 742-743.

28- Passegue E. Cancer biology: a game of subversion. Nature 2006; 442: 754-
755.

29- Carella AM, Melo JV, Goldman JM. Portofino International Conference on
Chronic Myeloid Leukemia. Exp Hematol 2001; 29:1147-1156.
 90

30- Nowell PC, Jackson L, Weiss A, Kurzrock R. Historical communication:

Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia followed for 27 years. Cancer
Genet Cytogenet 1988; 34: 57-61.

31- Shtivelman E, Gale RP, Dreazen O, Berrebi A, Zaizov R, Kubonishi I ve

ark. bcr-abl RNA in patients with chronic myelogenous leukemia. Blood 1987; 69: 971-
973.

32- Daley GQ, Van Etten RA, Baltimore D. Induction of chronic myelogenous
leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science
1990; 247: 824-830.

33- Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. Tumors of Haemopoietic and
Lymphoid Tissues, WHO Classification of Tumors. Lyon, France: IARC Press; 2001.

34- İlhan O. Kronik Miyelositer Lösemi. Erişim 17.07.2006,

www.osmanilhan.com/kronik_miyelosit.pdf.

35- Preston DL, Kusumi S, Tomonaga M, Izumi S, Ron E, Kuramoto A ve ark.

Cancer incidence in atomic bomb survivors. Part III. Leukemia, lymphoma and multiple
myeloma, 1950-1987. Radiat Res 1994; 137: 68-97.

36- Sokal JE, Cox EB, Baccarani M, Tura S, Gomez GA, Robertson JE ve ark.
Prognostic discrimination in good risk chronic granulocytic leukemia. Blood 1984; 63:
789-799.

37- Eaves CJ, Eaves AC. Stem cell kinetics. Baillieres Clin Haematol. 1997; 10:
233-257.

38- Takahashi N, Miura I, Saitoh K, Miura AB. Lineage involvement of stem

cells bearing the philadelphia chromosome in chronic myeloid leukemia in the chronic
phase as shown by a combination of fluorescence-activated cell sorting and
fluorescence in situ hybridization. Blood 1998; 92: 4758-4763.

39- Jiang X, Lopez A, Holyoake T, Eaves A, Eaves C. Autocrine production and

action of IL-3 and granulocyte colony-stimulating factor in chronic myeloid leukemia.
Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: 12804-12809.
 91

40- Holyoake TL, Jiang X, Jorgensen HG, Graham S, Alcorn MJ, Laird C ve
ark. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia
spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-
regulation of expression of interleukin-3. Blood 2001; 97: 720-728.

41- Campbell PJ, Bench AJ, Green AR. İçinde Hoffbrand AV, Catovsky D,
Tuddenham E, editor. Molecular Basis of Leukemia and Lenfoma. Postgraduate
Hematology. Blacwell; 2006. pp. 462-474.

42- Goldman JM, Mughal TI. İçinde Hoffbrand AV, Catovsky D, Tuddenham E,
editor. Chronic myeloid leukemia. Postgraduate Hematology. Blacwell; 2006. pp. 603-
618.

43- Melo JV, Gordon DE, Cross NC, Goldman JM. The ABL-BCR fusion gene
is expressed in chronic myeloid leukemia. Blood 1993; 81: 158-165.

44- Sinclair PB, Nacheva EP, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A ve ark.
Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis
subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood 2000; 95: 738-743.

45- Huntly BJ, Reid AG, Bench AJ, Campbell LJ, Telford N, Shepherd P ve ark.
Deletions of the derivative chromosome 9 occur at the time of the Philadelphia
translocation and provide a powerful and independent prognostic indicator in chronic
myeloid leukemia. Blood 2001; 98: 2879-2880.

46- Cortes JE, Talpaz M, Beran M, O'Brien SM, Rios MB, Stass S ve ark.
Philadelphia chromosome-negative chronic myelogenous leukemia with rearrangement
of the breakpoint cluster region. Long-term follow-up results. Cancer 1995; 75: 464-
470.

47- Johansson B, Fioretos T, Mitelman F. Cytogenetic and molecular genetic

evolution of chronic myeloid leukemia. Acta Haematol 2002; 107: 76-94.

48- Bartram CR, de Klein A, Hagemeijer A, van Agthoven T, Geurts van Kessel
A, Bootsma D ve ark. Translocation of c-ab1 oncogene correlates with the presence of a
Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature 1983; 306: 277-
280.
 92

49- Groffen J, Stephenson JR, Heisterkamp N, de Klein A, Bartram CR,

Grosveld G. Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited
region, bcr, on chromosome 22. Cell 1984; 36(1): 93-99.

50- Melo JV, Myint H, Galton DA, Goldman JM. P190BCR-ABL chronic
myeloid leukaemia: the missing link with chronic myelomonocytic leukaemia.
Leukemia 1994; 8: 208-211.

51- Abelson HT, Rabstein LS. Lymphosarcoma: virus-induced thymic-

independent disease in mice. Cancer Res 1970; 30: 2213-2222.

52- Laneuville P. Abl tyrosine protein kinase. Semin Immunol 1995; 7: 255-266.

53- Kipreos ET, Wang JY. Differential phosphorylation of c-Abl in cell cycle
determined by cdc2 kinase and phosphatase activity. Science 1990; 248: 217-220.

54- Sawyers CL, McLaughlin J, Goga A, Havlik M, Witte O. The nuclear

tyrosine kinase c-Abl negatively regulates cell growth. Cell 1994; 77: 121-131.

55- Yuan ZM, Shioya H, Ishiko T, Sun X, Gu J, Huang YY ve ark. p73 is

regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature
1999; 399: 814-817. Erratum: Nature 1999; 400: 792.

56- Lewis JM, Schwartz MA. Integrins regulate the association and
phosphorylation of paxillin by c-Abl. J Biol Chem 1998; 273: 14225-14230.

57- Reuther GW, Fu H, Cripe LD, Collier RJ, Pendergast AM. Association of
the protein kinases c-Bcr and Bcr-Abl with proteins of the 14-3-3 family. Science 1994;
266: 129-133.

58- Denhardt DT. Signal-transducing protein phosphorylation cascades

mediated by Ras/Rho proteins in the mammalian cell: the potential for multiplex
signalling. Biochem J 1996; 318: 729-747.

59- Diekmann D, Brill S, Garrett MD, Totty N, Hsuan J, Monfries C ve ark. Bcr
encodes a GTPase-activating protein for p21rac. Nature 1991; 351: 400-402.

60- Wu Y, Liu J, Arlinghaus RB. Requirement of two specific tyrosine residues

for the catalytic activity of Bcr serine/threonine kinase. Oncogene 1998; 16: 141-146.
 93

61- Ravandi F, Cortes J, Albitar M, Arlinghaus R, Qiang Guo J, Talpaz M ve

ark. Chronic myelogenous leukaemia with p185(BCR/ABL) expression: characteristics
and clinical significance. Br J Haematol 1999; 107: 581-586. Erratum: Br J Haematol
2000; 108: 461.

62- Melo JV. The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship
to leukemia phenotype. Blood 1996; 88: 2375-2384.

63- Inokuchi K. Chronic myelogenous leukemia: from molecular biology to

clinical aspects and novel targeted therapies. J Nippon Med Sch 2006; 73: 178-192.

64- Pane F, Frigeri F, Sindona M, Luciano L, Ferrara F, Cimino R ve ark.

Neutrophilic-chronic myeloid leukemia: a distinct disease with a specific molecular
marker (BCR/ABL with C3/A2 junction). Blood 1996; 88: 2410-2414. Erratum: Blood
1997; 89: 4244.

65- Zhang X, Wong R, Hao SX, Pear WS, Ren R. The SH2 domain of bcr-Abl
is not required to induce a murine myeloproliferative disease; however, SH2 signaling
influences disease latency and phenotype. Blood 2001; 97: 277-287.

66- Ghaffari S, Daley GQ, Lodish HF. Growth factor independence and
BCR/ABL transformation: promise and pitfalls of murine model systems and assays.
Leukemia 1999; 13: 1200-1206.

67- Jiang Y, Zhao RC, Verfaillie CM. Abnormal integrin-mediated regulation of

chronic myelogenous leukemia CD34+ cell proliferation: BCR/ABL up-regulates the
cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Kip, which is relocated to the cell cytoplasm and
incapable of regulating cdk2 activity. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 10538-10543.

68- Bedi A, Zehnbauer BA, Barber JP, Sharkis SJ, Jones RJ. Inhibition of
apoptosis by BCR-ABL in chronic myeloid leukemia. Blood 1994; 83: 2038-2044.

69- Jahagirdar BN, Miller JS, Shet A, Verfaillie CM. Novel therapies for
chronic myelogenous leukemia. Exp Hematol 2001; 29: 543-556.

70- Gishizky ML, Witte ON. Initiation of deregulated growth of multipotent

progenitor cells by bcr-abl in vitro. Science 1992; 256: 836-839.

71- Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999; 340: 1330-
1340.
 94

72- Cortez D, Reuther G, Pendergast AM. The Bcr-Abl tyrosine kinase activates
mitogenic signaling pathways and stimulates G1-to-S phase transition in hematopoietic
cells. Oncogene 1997; 15: 2333-2342.

73- Pendergast AM, Quilliam LA, Cripe LD, Bassing CH, Dai Z, Li N ve ark.
BCR-ABL-induced oncogenesis is mediated by direct interaction with the SH2 domain
of the GRB-2 adaptor protein. Cell 1993; 75: 175-185.

74- Skorski T, Bellacosa A, Nieborowska-Skorska M, Majewski M, Martinez R,

Choi JK ve ark. Transformation of hematopoietic cells by BCR/ABL requires activation
of a PI-3k/Akt-dependent pathway. EMBO J 1997; 16: 6151-6161.

75- Marie JP, Legrand O. İçinde Hoffbrand AV, Catovsky D, Tuddenham E,

editor. Multidrug resistance in leukemia. Postgraduate Hematology. Blacwell; 2006. pp.
603-618.

76- Greer JP, Rodgers GM,Foerster J,Paraskevas F, Lukens JN. İçinde Glader B,
editor. Wintrobe's Clinical Hematology. 11rd ed. Lipincott Williams&Wilkins, 2004.

77- Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization
(WHO) classification of the myeloid neoplasms.Blood 2002; 100: 2292-2302.

78- Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Leukemia
1996; 10: 751-756.

79- Joseph LJ, Le Beau MM, Jamieson GA Jr, Acharya S, Shows TB, Rowley
JD ve ark. Molecular cloning, sequencing, and mapping of EGR2, a human early
growth response gene encoding a protein with "zinc-binding finger" structure. Proc Natl
Acad Sci U S A 1988; 85: 7164-7168.

80- Haber D, Sohn R, Buckler A, Pelletier J, Call K, Housman D. Alternative

splicing and genomic structure of the Wilms’ tumor gene WT1. Proc Natl Acad Sci
USA 1991; 88 : 9618-9622.

81- Sharma P, Bowmann M, Madden S, Rauscher F, Sukumar S. RNA editing in

the Wilms’ tumor susceptibility gene WT1. Genes Develop 1994; 8: 720-731.

82- Bruening W, Pelletier J. A non-AUG translation iniation codon event

generates novel WT1 isoforms. J Biol Chem 1996; 271: 8646-8654.
 95

83- Scharnhorst V, Dekker P, van der Eb A, Jochemsen A. Internal translation

initiation generates novel WT1 protein isoforms with distinct biological properties. J
Biol Chem 1999; 274: 23456-23462.

84- Scharnhorst V, van der Eb A, Jochemsen A. WT1 proteins: functions in

growth and differentiation. Gene 2001; 273:141-161.

85- Morris JF, Madden SL, Tournay OE, Cook DM, Sukhatme VP, Rauscher FJ
3rd. Characterization of the zinc finger protein encoded by the WT1 Wilms' tumor
locus. Oncogene 1991; 6: 2339-2348.

86- Davies R, Calvio C, Bratt E, Larsson S, Lamond A, Hastie N. WT1 interacts

with the splicing factor U2AF65 in an isoform-dependant manner and can be
incorporated into spliceosomes. Genes Develop 1998; 12: 3217-3225.

87-Caricosole A, Duarte A, Larsson S, Hastie N, Little M, Holmes G ve ark.

RNA binding by the Wilms tumor suppressor zinc-finger proteins. Proc Natl Acad Sci
1996; 93: 7562-7566.

88- Kennedy D, Ramsdale T, Mattick J and Little M. An RNA recognition motif

in Wilms tumor protein ( WT1 ) revealed by structural modelling. Nature Genetics
1996; 12: 329-332.

89- Scholz H, Kirschner KM. A role for the Wilms' tumor protein WT1 in organ
development. Physiology 2005; 20: 54-59.

90- Little M, Prosser J, Condie A, Smith P, van Heyningen V, Hastie N. Zinc-

finger point mutations within the WT1 gene in Wilms’ tumour patients. Proc Natl Acad
Sci USA 1992; 89: 4791-4795.

91- Schumacher V, Schneider S, Figge A, wildhardt G, Harms D, Schmidt D ve

ark. Correlation of germ-line mutations and two-hit inactivation of the WT1 gene with
Wilms tumors of stromal-predominant histology. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:
3972-3977.

92- Algar EM, Kenney M, Simms L,Smith S, Kida Y, Smith PJ. Homozygous
intragenic deletion in the WT1 gene in a sporadic Wilms' Tumour with high levels of
expression of a truncated transcript. Human Mutation 1995; 5: 221-227.
 96

93- Tajinda K, Carroll J, Roberts C. Regulation of Insulin-like grwoth factor 1

receptor promoter activity by wild-type and mutant versions of the WT1 tumor
suppressor. Endocrinology 1999; 140: 4713-4724.

94- Werner H, Re G, Drummond I, Sukhatme V, Rauscher F, Sens D ve ark.

Increases expression of the insulin-like growth factor 1 receptor gene , IGF1R, in Wilms
tumor is correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT1 Wilms
tumor gene product. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 5828-5832.

95- Englert C, Hou X, Maheswaran S, Bennett P, Ngwu C, re G ve ark. WT1

suppresses synthesis of the epidermal growth factor receptor and induces apoptosis. The
EMBO Journal 1995; 14: 4662 - 4675.

96- Dey B, Sukhatme V, Roberts A, Sporn M, Rauscher F, Kim S. Repression of

the transforming growth factor –beta 1 gene by the Wilms tumor suppressor WT1 gene
product. Mol Endocrinology 1994; 8: 595-602.

97- Mayo M, Wang C, Drouin S, Madrid L, Marshall A, Reed J ve ark. WT1

modulates apoptosis by transcriptionally upregulating the BCL-2 proto-oncogene.
EMBO Journal 1999; 18: 3990-4003.

98- Wang Z, Madden S, Deuel T, Rauscher F. The Wilms tumor gene product
WT!, represses transcription of the platelet-derived growth factor A-chain gene. J Biol
Chem 1992; 267: 21999-22002.

99- Harrington M, Konicek B, Song A, Xia X, Fredericks W, Rauscher F.

Inhibition of the Colony Stimulating factor-1 promoter activity by the product of the
Wilms’ tumor locus. J Biol Chem 1993; 268: 21271-21275.

100- Lee S, Huang K, Palmer R, Truong V, Herlinger D, Kolquist K ve ark. The

Wilms tumor suppressor WT1 encodes a transcriptional activator of amphiregulin. Cell
1999; 98: 663-673.

101- Hosono S, Gross I, English M, Hajra K, Fearon E, Licht J. E-Cadherin is a

WT1 target gene. J Biol Chem 2000; 275: 10943-10953.

102- Moshier J, Skunca M, Wu W, Boppana S, Rauscher F, Dosescu J.

Regulation of ornithine decarboxylase gene expression by the Wilms tumor suppressor
WT1. Nucleic Acids Research 1996; 24: 1149-1157.
 97

103- Englert C, Maheswaran S, Garvin J, Kreidberg J, Haber D. Induction of

p21 by the Wilms’ tumor suppressor gene WT1. Cancer Res 1997; 57: 1429-1434.

104- Oh S, Song Y, Yim J, Kim T. The Wilms tumor 1 tumor suppressor gene
represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene. J Biol Chem
1999; 274: 37473-37478.

105- Kim J, Prawitt D, Bardeesy N, Torban E, Vicaner C, Goodyer P ve ark.

The Wilms’ tumor suppressor gene ( wt1 ) product regulates Dax-1 gene expression
during gonadal differentiation. Mol Cell Biol 1999; 19: 2289-2299.

106- Larsson S., Charlieu J-P, Miyagawa K, Engelkamp D, Rassouizadegan M,

Ross A ve ark. Subnuclear localization of WT1 in splicing or transcription factor
domains is regulated by alternative splicing. Cell 1995; 81: 391-401.

107- Ladomery M, Slight J, McGhee S, Hastie N. Presence of WT1, the Wilms

tumor suppressor gene product, in nuclear poly ( A )+ ribonucleoprotein. J Biol Chem
1999; 274: 36520-36526.

108- Ogawa H, Tsuboi A, Oji Y, Tamaki H, Soma T, Inoue K ve ark. Successful

donor leukocyte transfusion at molecular relapse for a patient with acute myeloid
leukemia who was treated with allogenic bone marrow transplantation : importance of
the monitoring of minimal residual disease by WT1 assay. Bone Marrow
Transplantation 1998; 21: 525-527.

109- Kim S, Yoo N, Hahn J, Lee S, Chong S, Min Y ve ark. Monitoring of WT-
1 gene expression in peripheral blood of patients with acute leukemia by
semiquantitative RT-PCR: Possible marker for detection of minimal residual leukemia.
Yonsei Medical J 1997; 38: 212-219.

110- Tamaki H, Ogawa H, Ohyashiki K, Ohyashiki J, Iwama H, Inoue K ve ark.

The Wilms’ tumor gene WT1 is a good marker for diagnosis of disease progression of
myelodysplastic syndromes. Leukemia 1999; 13: 393-399.

111- Gaiger A, Schmid D, Heinze G, Linnerth B, Greinix H, Kalhs P ve ark.

Detection of WT1 transcript by RT-PCR in complete remission has no prognostic
relevance in de novo acute myeloid leukemia. Leukemia 1998; 12: 1886-1894.
 98

112- Schmid D, Heinze G, Linnerth B, Tisljar K, Kusec R, Geissler K ve ark.

Prognostic significance of WT1 gene expression at diagnosis in adult de novo acute
myeloid leukemia. Leukemia 1997; 11: 639-643.

113- Inoue K, Ogawa H, Sonoda Y, Kimura T, Sakabe H, Oka Y ve ark.

Aberrant overexpression of the Wilms’ tumour gene ( WT1 ) in human leukemia. Blood
1997; 89: 1405-1412.

114- Osaka M, Koami K, Sugiyama T. WT1 contributes to leukemogenesis:

expression patterns in 7,12,dimethylbenz(a)anthracene ( DMBA )-induced leukemia. Int
J Cancer 1997; 72: 696-699.

115- Gaiger A, reese V, Disis M, Cheever M. Immunity to WT1 in the animal

model and in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2000; 96: 1480-1488.

116- Baird P, Simmons P. Expression of the Wilms’ tumor gene WT1 in normal
hemopoiesis. Experimental Hematology 1997; 25: 312-320.

117- Fraizer G, Patmasiriwat P, Zhang X, Saunders G. Expression of the tumor

suppressor gene WT1 in both human and mouse bone marrow. Blood 1995; 86: 4704.

118- Menssen H, Renkl H, Entezami M, Thiel E. Wilms’ tumor gene expression

in human CD34+ hematopoietic progenitors during fetal development and early
clonogenic growth. Blood 1997; 89: 3486.

119- Algar E, Kromynkh T, Smith S, Blackburn D, Bryson G, Smith P. A WT1

antisense oligonucleotide inhibits proliferation and induces apoptosis in myeloid
leukaemia cell lines. Oncogene 1996; 12: 1005-1014.

120- Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K, Ogawa H, Tatekawa T, Hirata M ve

ark. Growth inhibition of human leukaemic cells by WT1 ( Wilms’ tumour gene )
antisense oligonucleotides : implications for the involvement of WT1 in
leukaemogenesis. Blood 1996; 87: 2878-2884.

121- Maheswaran S, Park S, Bernanrd A, Morris J, Rauscher F, Hill D ve ark.

Physical and functional interaction between WT1 and p53 proteins. Proc Natl Acad Sci
USA 1993; 90: 5100-5104.
 99

122- Johnstone R, See R, Sells S, Wang J, Muthukkumar S, Englert C ve ark. A

novel repressor PAR4 modulates transcription and growth suppression functions of the
Wilms’ tumour suppressor, WT1. Mol Cellular Biol 1996; 16: 6945-6956.

123- Maheswaran S, Englert C, Zheng G, Lee S, Wong J, Harkin D ve ark.

Inhibition of cellular proliferation by the Wilms’ tumor suppressor , WT1, requires
association with the inducible chaperone Hsp70. Genes and Develop 1998; 12: 1108-
1120.

124- Wang Z, Qiu Q, Seufert W, Taguchi T, Testa J, Whitmore S ve ark.

Molecular cloning of the cDNA and chromosomal localization of the gene for human
ubiquitin-conjugating enzyme 9. J Biol Chem 1996; 271: 24811-24816.

125- Johnstone R, Wang J, Tommerup N, Vissing H, Roberts T, Shi Y. Ciao1 is

a novel WD40 protein that interacts with the tumor suppressor protein WT1. J Biol
Chem 1998; 273: 10880-10887.

126- Hubinger G, Schmid M, Linortner S, Manegold A, Bergmann L, Maurer U.

Ribozyme-mediated cleavage of wt1 transcripts suppresses growth of leukemia cells.
Exp Hematol 2001; 29: 1226-1235.

127- Menssen HD, Renkl HJ, Rodeck U, Maurer J, Notter M, Schwartz S ve ark.
Presence of Wilms’ tumor gene (wt1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the
majority of human acute leukemias. Leukemia 1995; 9: 1060-1067.

128- Cilloni D, Saglio G. WT1 as a universal marker for minimal residual

disease detection and quantification in myeloid leukemias and in myelodysplastic
syndrome. Acta Haematol 2004; 112: 79-84.

129- Loeb DM, Sukumar S. The role of WT1 in oncogenesis: tumor suppressor
or oncogene? Int J Hematol 2002; 76: 117-126.

130- Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K, Ogawa H, Tatekawa T, Hirata M ve

ark. Growth inhibition of human leukemic cells by WT1 (Wilms tumor gene) antisense
oligodeoxynucleotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis.
Blood 1996; 87: 2878-2884.
 100

131- Hubinger G, Schmid M, Linortner S, Manegold A, Bergmann L, Maurer U.

Ribozyme-mediated cleavage of wt1 transcripts suppresses growth of leukemia cells.
Exp Hematol 2001; 29: 1226-1235.

132- Weisser M, Kern W, Rauhut S, Schoch C, Hiddemann W, Haferlach T ve

ark. Prognostic impact of RT-PCR-based quantification of WT1 gene expression during
MRD monitoring of acute myeloid leukemia. Leukemia 2005; 19: 1416-1423.

133- Henderson RA, Mossman S, Nairn N, Cheever MA. Cancer vaccines and
immunotherapies: emerging perspectives. Vaccine 2005; 23: 2359-2362.

134- Roberts SG. Transcriptional regulation by WT1 in development. Curr Opin

Genet Dev 2005; 15: 542-547.

135- King-Underwood L, Renshaw J, Pritchard-Jones K. Mutations in the

Wilms’ tumour gene WT1 in leukaemias. Blood 1996; 87: 2171-2179.

136- King-Underwood L, Pritchard-Jones K. WT1 mutations occur mainly in

Acute Myeloid Leukaemia and may confer drug resistance. Blood 1998; 91: 2961-2968.

137- Carapeti M, Goldman J, Cross N. Dominant-negative mutations of the

Wilms’ tumor predisposing gene ( WT1 ) are infrequent in CML blast crisis and de
novo acute leukemia. European J Haematol 1997; 58: 346-349.

138- English M, Licht J. Tumor-associated WT1 missense mutants indicate that

transcriptional activation by WT1 is critical for growth control. J Biological Chem
1999; 274: 13258-13263.

139- McCoy C, McGee S, Cornwell M. The Wilms tumor suppressor, WT1,

inhibits 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate activation of the multidrug resistance-1
promoter. Cell Growth and Differentiation 1999; 10: 377-386.

140- Tuna M, Chavez-Reyes A, Tari AM. HER2/neu increases the expression of

Wilms' Tumor 1 (WT1) protein to stimulate S-phase proliferation and inhibit apoptosis
in breast cancer cells. Oncogene 2005; 24: 1648–1652.

141- Wang ZY, Qiu QQ, Enger KT, Deuel TF.A second transcriptionally active
DNA-binding site for the Wilms tumor gene product, WT1. Proc Natl Acad Sci U S A
1993; 90: 8896-8900.
 101

142- Rauscher FJ III, Morris JF, Tournay OE, Cook DM, Curran T. Binding of
the Wilms' tumor locus zinc finger protein to the EGR-1 consensus sequence. Science
1990; 250: 1259-1262.

143- Hossain A, Saunders GF. The human sex-determining gene SRY is a direct
target of WT1. J Biol Chem 2001; 276: 16817-16823.

144- Hossain A, Saunders GF. Role of Wilms tumor 1 (WT1) in the

transcriptional regulation of the Mullerian-inhibiting substance promoter. Biol Reprod
2003; 69: 1808-1814.

145- Nachtigal MW, Hirokawa Y, Enyeart-VanHouten DL, Flanagan JN,

Hammer GD, Ingraham HA. Wilms' tumor 1 and Dax-1 modulate the orphan nuclear
receptor SF-1 in sex-specific gene expression. Cell 1998; 93: 445-454.

146- Wilhelm D, Englert C. The Wilms tumor suppressor WT1 regulates early
gonad development by activation of Sf1. Genes Dev 2002; 16: 1839-1851.

147- Dehbi M, Gharemani M, Lechner M, Dressler G, Pelletier J. The paired-

box transcription factor, PAX2, positively modulates expression of the Wilms’ Tumor
suppressor gene. Oncogene 1996; 13: 447–453.

148- Dehbi M, Pelletier J. Pax-8-mediated activation of the WT1 tumor

suppressor gene. EMBO J 1996; 16: 4297–4306.

149- Wu Y-J, Fraizer GC, Saunders GF. GATA-1 transactivates the WT1
hematopoietic specific enhancer. J Biol Chem 1995; 270: 5944–5949.

150- Keilholz U, Menssen HD, Gaiger A, Menke A, Oji Y, Oka Y ve ark.

Wilms’ tumour gene 1 (WT1) in human neoplasia. Leukemia 2005; 19: 1318–1323.

151- Gashler AL, Bonthouron DT, Madden SL, Rauscher III FJ, Collins T,
Sukhatme VP. Human platelet-derived growth factor A chain is transcriptionally
repressed by the Wilms tumor suppressor WT1. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:
10984–10988.

152- Harrington MA, Konicek B, Song A, Xia XL, Fredericks WJ, Rauscher III
FJ. Inhibition of colony-stimulating factor-1 promoter activity by the product of the
Wilms' tumor locus. J Biol Chem 1993; 268: 21271–21275.
 102

153- Drummond IA, Madden SL, Rohwer-Nutter P, Bell GI, Sukhatme VP,
Rauscher III FJ. Repression of the insulin-like growth factor II gene by the Wilms
tumor suppressor WT1. Science 1992; 257: 674–678.

154- Huang Z, Xiao B, Chen S, Li S, Liu Y, Liu J. Studies of WT1 expression in

leukemia patients. Zhonghua Xue Ye Za Zhi 2002; 23: 367-369.

155- Goodyer P, Dehbi M, Torban E, Bruening W, Pelletier J. Repression of the

retinoic acid receptor-alpha gene by the Wilms' tumor suppressor gene product, wt1.
Oncogene 1995; 10: 1125–1129.

156- Niksic M, Slight J, Sanford JR, Caceres JF, Hastie ND. The Wilms' tumour
protein (WT1) shuttles between nucleus and cytoplasm and is present in functional
polysomes. Hum Mol Genet 2004; 13: 463–471.

157- Miyoshi Y, Ando A, Egawa C, Taguchi T, Tamaki Y, Tamaki H ve ark.

High expression of Wilms' tumor suppressor gene predicts poor prognosis in breast
cancer patients. Clin Cancer Res 2002; 8: 1167–1171.

158- Harada Y, Nonomura N, Nishimura K, Tamaki H, Takahara S, Miki T ve

ark. WT1 Gene Expression in Human Testicular Germ-Cell Tumors. Mol Urol 1999; 3:
357–364.

159- Oji Y, Inohara H, Nakazawa M, Nakano Y, Akahani S, Nakatsuka S ve

ark. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in head and neck squamous cell
carcinoma. Cancer Sci 2003; 94: 523–529.

160- Oji Y, Nakamori S, Fujikawa M, Nakatsuka S, Yokota A, Tatsumi N ve

ark. Overexpression of the Wilms' tumor gene WT1 in pancreatic ductal
adenocarcinoma. Cancer Sci 2004; 95: 583–587.

161- Oji Y, Suzuki T, Nakano Y, Maruno M, Nakatsuka S, Jomgeow T ve ark.

Overexpression of the Wilms' tumor gene W T1 in primary astrocytic tumors. Cancer
Sci 2004; 95: 822–827.

162- Inoue K, Tamaki H, Ogawa H, Oka Y, Soma T, Tatekawa T ve ark. Wilms'

tumor gene (WT1) competes with differentiation-inducing signal in hematopoietic
progenitor cells. Blood 1998; 91: 2969–2976.
 103

163- Tsuboi A, Oka Y, Ogawa H, Elisseeva OA, Tamaki H, Oji Y ve ark.

Constitutive expression of the Wilms' tumor gene WT1 inhibits the differentiation of
myeloid progenitor cells but promotes their proliferation in response to granulocyte-
colony stimulating factor (G-CSF). Leuk Res 1999; 23: 499–505.

164- Li H, Oka Y, Tsuboi A, Yamagami T, Miyazaki T, Yusa S ve ark. The lck

promoter-driven expression of the Wilms tumor gene WT1 blocks intrathymic
differentiation of T-lineage cells. Int J Hematol 2003; 77: 463–470.

165- Snarski E. Regulation of Wilms Tumor Gene 1 (WT1) expression. Freie

University Berlin. Doctorate Thesis. Berlin 2005; pp: 6-11.

166- Loeb DM, Evron E, Patel CB, Sharma PM, Niranjan B, Buluwela L ve ark.
Wilms' tumor suppressor gene (WT1) is expressed in primary breast tumors despite
tumor-specific promoter methylation.Cancer Res 2001; 61: 921–925.

167- Fraizer GC, Wu YJ, Hewitt SM, Maity T, Ton CC, Huff V ve ark.
Transcriptional regulation of the human Wilms' tumor gene (WT1). Cell type-specific
enhancer and promiscuous promoter. J Biol Chem 1994; 269: 8892-8900.

168- Hofmann W, Royer HD, Drechsler M, Schneider S, Royer-Pokora B.

Characterization of the transcriptional regulatory region of the human WT1 gene.
Oncogene 1993; 8: 3123-3132.

169- Ito K, Oji Y, Tatsumi N, Shimizu S, Kanai Y, Nakazawa T ve ark.

Antiapoptotic function of 17AA(+)WT1 (Wilms' tumor gene) isoforms on the intrinsic
apoptosis pathway. Oncogene 2006; 25: 4217-4229.

170- Hossain A, Nixon M, Kuo MT, Saunders GF. N-terminally Truncated WT1
Protein with Oncogenic Properties Overexpressed in Leukemia. J Biol Chem 2006; 281:
28122-28130.

171- Cilloni D, Gottardi E, De Micheli D, Serra A, Volpe G, Messa F ve ark.

Quantitative assessment of WT1 expression by real time quantitative PCR may be a
useful tool for monitoring minimal residual disease in acute leukemia patients.
Leukemia 2002; 16: 2115-2121.
 104

172- Olszewski M, Huang W, Chou PM, Duerst R, Kletzel M. Wilms' tumor 1

(WT1) gene in hematopoiesis: a surrogate marker of cell proliferation as a possible
mechanism of action? Cytotherapy 2005; 7: 57-61.

173- Primo D, Tabernero MD, Rasillo A, Sayagues JM, Espinosa AB, Chillon
MC ve ark. Patterns of BCR/ABL gene rearrangements by interphase fluorescence in
situ hybridization (FISH) in BCR/ABL+ leukemias: incidence and underlying genetic
abnormalities. Leukemia 2003; 17: 1124-1129.

174- Wan TS, Ma SK, Au WY, Chan LC. Derivative chromosome 9 deletions in
chronic myeloid leukaemia: interpretation of atypical D-FISH pattern. J Clin Pathol
2003; 56: 471-474.

175- Kowalczyk JR, Gaworczyk A, Winnicka D, Lejman M, Babicz M.

Fluorescence in situ hybridization BCR/ABL fusion signal rate in interphase nuclei of
healthy volunteer donors: a test study for establishing false positive rate. Cancer Genet
Cytogenet 2003; 142: 51-55.

176- Akel S, Kolialexi A, Mavrou A, Metaxotou C, Loukopoulos D, Yataganas

X. Efficiency of interphase fluorescence in situ hybridization for BCR/ABL on
peripheral blood smears for monitoring of CML patients: a comparison with bone
marrow findings. Clin Lab Haematol 2002; 24: 36.
 105

FORMLAR

GÖNÜLLÜ BİLGİLENDİRME FORMU

ÇALIŞMANIN ADI:
Kronik Myelojenik Lösemili hastalarda WT1 gen ekspresyonu ve Genetik Değişikliklerin
Araştırılması.

ÇALIŞMANIN AMACI:

WT1 geni (Wilms' tumor gene 1) bazı kan hastalıklarında hastalığın tespit ve takibi için önemli
bir belirleyicidir. Bu çalışma WT1 geninin bir kan hastalığı olan kronik myelojenik löseminin
oluşumu üzerindeki etkisini incelemek amacıyla yapılacaktır. Sizden muayene sırasında alınan
kemik iliği ya da periferik kan örnekleri kullanılarak (yaklaşık 20cc) WT1 geni çalışılacak; aynı
örnekler kullanılarak yine bu hastalığın teşhis ve takibinde önemli yere sahip olan Philadelphia
kromozomu incelemesi yapılacaktır.

ÇALIŞMANIN İÇERİĞİ:

Bu çalışmada İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Hematoloji Anabilim Dalında

muayene olurken sizden alınan periferik kan ya da kemik iliği kullanılacaktır. WT1 geninin
incelemek için periferik kan veya kemik iliğinden öncelikle lenfositler adını verdiğimiz hücreler
elde edilecektir. Daha sonra hücrelerden genleri elde edilecek ve WT1 geni incelenecektir.
Philadelphia kromozom analizi de yine aynı kan ya da kemik iliğinden başka bir yöntem
kullanılarak (FISH - Flüoresan İn-Situ Hibridizasyon) yapılacaktır.
Sizlerden elde edeceğimiz sonuçlar, bu incelemelerin her hastada uygulanmasının
yararlılığı hakkında fikir vereceği için sizden başka kişilerin tedavisi için de yardımcı olacaktır.
Çalışacağımız genlerin hastalığınız üzerindeki etkilerine dair ek bilgiler sağlanmış olacaktır.
Bu çalışma için sizden muayene sırasında alınan kemik iliği ve kandan başka bir şey
istenmeyecektir. Çok nadir durumlarda, sizden aldığımız kan örneği yetersiz olursa tekrar kan
alınması gerekebilir ancak yetersiz olsa dahi sizden bu çalışma için tekrar kemik iliği
alınmayacaktır. Araştırma sırasında sizi ilgilendirebilecek bir gelişme olduğunda bundan
muhakkak haberdar edileceksiniz. Bu işlemlerin hiç birisi için size bir ücret ödenmeyeceği gibi,
sizin veya sağlık masraflarınızı karşılayan kurumun araştırma için ek bir ücret ödemesi de
gerekmemektedir.
 106

BAŞLAMA VE BİTİŞ TARİHİ:

Çalışmanın Kasım 2005 tarihinde başlaması ve Kasım 2006 tarihinde bitmesi öngörülmektedir.

AÇIKLAMALAR:

Bu çalışmaya gönüllü olmaya karar verirseniz bu gönüllü bilgilendirilmiş onay formunu

imzalamanız gerekecektir. Sadece kendi rızanız ile hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın, doktor
kontrolünde alınacak kan veya kemik iliği örneğiniz ile bilimsel çalışmaya katılmış olacaksınız.
Sizden ayrıca araştırmaya yardımcı olacak bazı kişisel bilgileriniz (yaş, meslek, aile ağacı vb.)
istenebilir. Bilgileriniz uygulanmakta olan yasaların izin verdiği ölçüde kullanılacaktır. Etik
kurullar inceleme amacıyla medikal kayıtlardaki medikal kişisel bilgilerinize ve bu çalışma için
toplanan bilgilerle sınırlı olacaktır.

Bu çalışmada 50 hastanın örnekleri kullanılacaktır. Bu çalışma sonuçları bilimsel toplantılarda

veya yayınlarda sunulabilir, ancak bu sunumlarda kimliğiniz açıklanmayacaktır. Ayrıca sizden
araştırmayla ilgili olarak herhangi bir maddi talepte bulunulmayacak ve size de herhangi bir
ücret ödenmeyecektir. Katılmaya karar verdikten sonra da herhangi bir zamanda bu çalışmaya
katılmaktan vazgeçebilirsiniz. Bu karar tedavinizi etkilemeyecektir. Ayrıca bu araştırmaya
katılmayı karar verdiğiniz takdirde ileriye dönük olarak hastalığınız hakkında elde edilecek
bilgilerle bilim dünyasına konuyla ilgili olarak önemli derecede katkı sağlayacağınız kesindir.
Gönüllü olmaya karar verdiğiniz ve bu bilgilendirilmiş gönüllü onay ve rıza formunu
imzaladığınız takdirde yukarıda yazılanları okuyup kabul ettiğinizi ve hiçbir baskı ve zorlama
olmaksızın ailenizin bilgisi dahilinde sadece kendi rızanız ile karar verdiğinizi onaylamış
olacaksınız.

Çalışma için alınan materyaliniz yalnızca bu çalışmada kullanılacaktır. Herhangi bir soru ya da
sorun olduğu takdirde ilgili doktora (Dr. Selim Yavuz) 0212 414 20 00- 32435 no’lu telefondan
ulaşabilirsiniz.
 107

GÖNÜLLÜ ONAY FORMU

Gönüllüye (hastaya) araştırmadan önce verilmesi gereken bilgiler tarafıma sözlü olarak
ve yazılı olarak aktarıldı. Bu koşullarda söz konusu çalışmaya kendi rızamla katılmayı
kabul ediyorum.

HASTANIN:

Adı Soyadı:

Telefonu:

Adresi:

İmza:

Açıklamaları yapan doktorun:

Adı Soyadı:

İmza:

Tanıklık eden görevlinin:

Adı Soyadı:

İmza:
 108

ETİK KURUL KARARI

109
 110

ÖZGEÇMİŞ

Kişisel Bilgiler
Adı EVA Soyadı SHYQYRIU
Doğ.Yeri GRAMSH Doğ.Tar. 30/01/1981
Uyruğu ARNAVUT TCKim No ---
Email eva.shyqyriu@gmail.com Tel 0212 414 20 00 / 34189

Eğitim Düzeyi

Mezun Olduğu Kurumun Adı Mez. Yılı

Doktora
Yük.Lis. İ. Ü. Onkoloji Enstitüsü / Kanser Genetiği 2006
Lisans Boğaziçi Üniversitesi / Moleküler Biyoloji ve Genetik 2004
Lise Kolegji Privat OMAK / Arnavutluk 1999

İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın)

Görevi Kurum Süre (Yıl - Yıl)
1. -

Yabancı Okuduğunu KPDS/ÜDS (Diğer)

Konuşma* Yazma*
Dilleri Anlama* Puanı Puanı
Türkçe Çok iyi Çok iyi Çok iyi
İngilizce Çok iyi Çok iyi Çok iyi TOEFL 273 / 299
İtalyanca Çok iyi Çok iyi İyi
Arnavutça Çok iyi Çok iyi Çok iyi
Fransızca Çok iyi Çok iyi Çok iyi
*Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin

Sayısal Eşit Ağırlık Sözel

LES Puanı 58.560 54.995 51.430
GRE Puanı (Quant. Verb. Anal.) 640 420 4

Bilgisayar Bilgisi
Program Kullanma becerisi
Photoshop Çok iyi
Microsoft Office Çok iyi
Perl İyi
 111

Ödülleri:

Arnavutluk Ulusal Biyoloji Olimpiyatı, Arnavutluk üçüncüsü.

Sertifikaları:

Boğaziçi Üniversitesi, Yabancı Diller Yüksekokulu, Fransızca Dil sertifikası.

TÜBİTAK, Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü, Enzim ve

Fermantasyon Teknolojisi Laboratuarı, Staj sertifikası.

Beckman-Coulter, CEQ™ 8000 Genetik Analiz Sistemi, Kullanıcı eğitim kursu

seritifkası.

European School of Genetic Medicine, ESGM, 9. Kanser Genetiği Kursu (Hibrid)

Katılımcı sertifikası.

Özel İlgi Alanları (Hobileri): Basketbol, yüzme, sinema ve italyan müziği.