Guia de Lab Oratorio de Bioquimica 2011 Salud)

GUÍAS DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA
PARA CARRERAS DEL ÁREA DE LA SALUD
Coordinadora: Mg. ©Karin Figueroa S.

LABORATORIO DE BIOQUIMICA 2011
CALENDARIO DE ACTIVIDADES
FECHA PRACTICO
Carbohidratos
Aminoácidos
Proteínas
Enzimas
Lípidos (Colesterol) y Glicemia
Extracción de ADN
Controles recuperativos
Examen
Examen de Repetición
2
REGLAMENTO INTERNO LABORATORIOS

DEPARTAMENTO BIOLOGIA.
1. La Asistencia a Laboratorio es de un 100%.
2. El uso del delantal o cotona blanca es OBLIGATORIO, éste debe usarse abotonado, el pelo
debe llevarse tomado, NO se debe ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio, LOS
TELÉFONOS CELULARES SE DEBEN APAGAR.
3. Está prohibido ingresar al laboratorio con chalas o sandalias, se deben utilizar zapatos
cerrados que sirvan de protección
4. Se prohíbe ingresar a laboratorio con falda, o pantalones cortos, SOLO se permitirán el ingreso
con pantalones largos.
5. Se exige PUNTUALIDAD,
6. Los estudiantes que lleguen atrasados antes del término del control, podrán ingresar y rendir el
respectivo control de laboratorio (solo se aceptarán dos atrasos en el semestre), los
estudiantes que no tengan su delantal NO podrán ingresar al laboratorio, lo cual implica no
rendir el control respectivo siendo calificado con nota 1.0 (uno coma cero).
7. NO se aceptará recuperar laboratorios.
8. El uso de la Guía de Laboratorio es OBLIGATORIO, los estudiantes que no tengan su guía

de laboratorio se les calificará con nota 1.0 (uno coma cero).
9. EVALUACIONES:
9.1 En TODOS los laboratorios se realizará un control de entrada, que comprenderá

materia del LABORATORIO ANTERIOR Y DEL LABORATORIO A EFECTUARSE.
Este control tendrá una duración máxima de diez minutos.
9.2 Para cada tema de laboratorio se deberá realizar un informe (ver anexo elaboración de
informe)
9.3 Al final del semestre se realizará un EXAMEN DE LABORATORIO
9.4 Las ponderaciones de Laboratorio son:

• 40% : Controles de Laboratorio
• 30%: Informes
• 30% : Examen de Laboratorio
9.5 A LOS ALUMNOS QUE SEAN SORPRENDIDOS COPIANDO EN LOS CONTROLES,

O EN EL EXAMEN, SE LES RETIRARA LA PRUEBA, SIENDO CALIFICADOS CON
NOTA 1.0 (uno coma cero).
9.6 Cualqueir información es
9.7 NO SE ELIMINAN NOTAS.
3
LABORATORIO Nº 1
CARBOHIDRATOS
INTRODUCCION
Mg. ©Karin Figueroa S.
Lic. Patricia Arias
Los hidratos de carbono pertenecen los compuestos poli-funcionales que

contienen grupo carbonilo (aldehído o cetónico ) y grupos hidroxilo alcohólicos.
Por lo tanto, ellos poseen simultáneamente propiedades de aldehídos o cetonas y

de alcoholes polidroxilicos. Los hidratos de carbono comprenden un grupo amplio de
compuestos naturales que se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
Los monosacáridos, según el numero de átomos de carbono en la molécula, se

clasifican en triosas, terrosas, hexosas, heptosas, etc. La formula genérica de los
monosacáridos es CnH2nOn. Todos los monosacáridos naturales, teniendo en sus
moléculas átomos de carbono asimétricos , son ópticamente activos y giran en el plano de
la luz polarizada.
Los oligosacáridos y polisacáridos son hidratos de carbono complejos y al ser

calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se obtienen monosacáridos.
Los polisacáridos forman mediante la hidrólisis un gran número de moléculas de
monosacáridos, además poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en
agua o forman diluciones coloidales.
Los hidratos de carbono están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el

reino vegetal. Ellos constituyen los productos finales de la síntesis fotoquímica en plantas
verdes. Los animales, no aptos para la acumulación de energía solar, aprovechan las
sustancias acumuladas en las plantas. Los hidratos de carbono participan en la
construcción de las estructuras de los organismos vivos, sirven de material para la
biosíntesis de los compuestos de otras clases y juegan un papel importante en la
bioenergética de la célula. Los hidratos de carbono estan en la composición de los ácidos
nucleicos, las glicoproteínas, glicolípidos y en algunas vitaminas y coenzimas.
CLASIFICACION DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
a) Monosacáridos: Son generalmente sólidos bien cristalizados, solubles en agua, de

sabor más o menos dulce. Todos poseen propiedades reductoras, derivadas de
grupos carbonilos.
- Según su grupo funcional se pueden clasificar en adosas, si contiene un grupo
aldehído(-CHO), o cetosa si contiene el grupo cetona (>C=O)
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b) Disacáridos: Formados por dos unidades de azúcares simples siendo lo más

importante aquellas derivadas de las hexosas; los que por bloqueo o no de las
funciones reductoras se clasifican en:
1. - Disacáridos reductores ej: Maltosa, lactosa.

2. - Disacáridos no reductores ej: Sacarosa.
c) Polisacáridos: Son grandes moléculas formados por condensación de unidades de

monosacáridos. Los más comunes son: glicógeno, almidón, dextrinas y celulosa.
Cuando se obtienen materiales biológicos de estructuras desconocidas, se emplean
usualmente dos tipos de determinaciones para establecer la presencia de hidratos de
carbono.
Una de las propiedades de los carbohidratos que se emplean en su determinación

es el poder reductor (no todos los azúcares tienen esta propiedad).
El poder reductor de los carbohidratos está condicionado a la presencia de un

grupo aldehído libre o un grupo cetónico adyacente a un grupo hidroximetil.
En polisacáridos donde los grupos aldehídos o cetónicos libres se encuentran

comprometidos formando enlaces glicosídicos, dan valores negativos con el test reductor.
Estos enlaces glicosícos, son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia
de ácido, liberando monosacáridos que dan reacción reductora positiva.
Numerosos agentes oxidantes como Cu2+, Ag+ y ferricianuro de potasio pueden

oxidar a los azúcares reductores. En estas reacciones los carbohidratos sufren una serie
de degradaciones oxidativas mientras que la sustancia oxidante es reducida.
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO
Usando las diferencias de las propiedades químicas es posible identificar algunos

carbohidratos abundantes en la naturaleza a través de ciertos tests muy simples.
Una propiedad de los carbohidratos y que se emplea en su determinación es el poder
reductor. Esta propiedad está condicionada a la presencia de un carbono anomérico
libre, que es aquel más oxidado. Numerosos agentes oxidantes como Cu 2+ (Fehling,
Nelson), Ag+ (Tollens) y Ferricianuro (Park-Johnson) pueden oxidar a los azúcares
reductores. Todos los Monosacáridos son reductores, como lo son también la mayoría de
los Disacáridos, siendo una excepción importante la Sacarosa. Los Polisacáridos son NO
reductores por estructura.
Test de Fehling
El complejo ión cúprico-tartrato (reactivo de Fehling) es reducido en ambiente alcalino

para formar óxido cuproso (Cu2O), un precipitado pardo-rojizo. Cualquier carbohidrato que
dé positivo el test de Fehling se considerará como un azúcar reductor.
5
Test de Seliwanoff para Cetosas
Este test está basado en las reacciones de deshidratación (eliminación de H2O),

catalizada por ácidos fuertes, en que las Cetosas la acusan con mayor rapidez que las
Aldosas. Esta deshidratación conlleva a la formación de Furfurales. Estos Furfurales
luego reaccionan con Resorcinol dando lugar a un compuesto coloreado. En
consecuencia, las velocidades de desarrollo de color de un azúcar en presencia de HCI y
Resorcinol (reactivo de Seliwanoff), permite establecer si un azúcar es Cetosa o Aldosa.
Test de Barfoed
Este test diferencia entre Monosacáridos y Disacáridos reductores. Los iones cúpricos
(Cu2+) son reducidos por los azúcares reductores para dar óxido cuproso. En medio ácido
los monosacáridos reaccionan más rápido que los disacáridos.
Hidrólisis Acida
Los enlaces glicosídicos son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia
de ácidos inorgánicos enérgicos, liberando Monosacáridos los que darán reacción
reductora positiva al someterlos al test de Fehling.
Test de Iodo para Almidón

La fracción molecular de Amilosa del Almidón, tiene estructura helicoidal y es capaz de
atrapar moléculas de I2 (o I3 -) para dar un complejo de color azul oscuro.
OBJETIVOS
- Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo a su reactividad en

presencia de reactantes específicos.
- Identificar carbohidratos reductores.
- Verificar la hidrólisis presentes en distintas muestras
PARTE EXPERIMENTAL
En este práctico cada grupo recibe una Muestra Problema que debe ser
identificada y que puede ser cualquiera de los siguientes carbohidratos:
Glucosa, Fructosa, Lactosa, Sacarosa, Almidón u otros que se indicaran.
Para la identificación se debe realizar los siguientes tests a cada muestra patrón y a la
muestra problema. Sea metódico y ante alguna duda repita el análisis.
1.- Test de Fehling

Tome 1 punta de espátula de muestra (˜ 0.1 g) si ésta es sólida o 1 mL si ésta es líquida y
agregue 1 mL de reactivo de Fehling (0,5 mL del A y luego 0,5 mL del B). Se coloca el
tubo de ensayo en un baño de agua a ebullición por 5 min.(Use pinzas de madera y
coloque en el vaso piedras de ebullición). El test es positivo si se forma un precipitado
pardo-rojizo de Oxido Cuproso una vez enfriado.
6
2.- Test de Seliwanoff (Resorcinol: 3-hidroxi fenol)

Tome 1 punta de espátula de muestra si ésta es sólida o 1 mL si ésta es líquida y agregue
8 mL del reactivo de Seliwanoff, agitar. Colocar el tubo de ensayo en agua en ebullición
por 10 a 15 min. Si la muestra contiene Cetosa aparece una coloración rosada. Este
reactivo dá un color verdoso cuando en el medio hay pentosas.
3.- Hidrólisis Acida

Tome 2 mL de muestra si ésta es líquida o el doble de lo que ha estado utilizando, si ésta
es sólida y en este ultimo caso agregue 1 mL de agua destilada al tubo. Acidifique la
muestra con 0,5 mL de HCI conc. (¡Cuidado!). Colocar el tubo de ensayo en baño de
agua en ebullición por 15 a 20 min. Luego de enfriar neutralice con NaOH 10 % (p/v)
midiendo con papel pH. Los carbohidratos superiores no reductores deben liberar
azúcares más sencillas reductoras que se confirmarían por el test de Fehling.
4.- Test de Iodo para Almidón

Coloque 1 mL de muestra si ésta es líquida o 1 punta de espátula si esta es sólida y
agregue 5 gotas de la solución de yodo/etanol (Lugol). La formación de un color azul
intenso determina la presencia de Almidón.
Tabla de resultado Test
GLUCIDO Fehling Seliwanoff Test de iodo
Glucosa
Fructosa
Lactosa
Sacarosa
Sacarosa
Hidrolizada
Almidon
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LABORATORIO 2
TITULACIÓN DE AMINOACIDOS: Determinación de pK1, pK2, PI

Lic. Patricia Arias
INTRODUCCION
Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo básico (amino -NH2) y un
grupo ácido (carboxilo -COOH) unidos por un átomo de carbono, el carbono α
Fig. Nº1: Estructura básica de un aminoácido
Los α-aminoácidos difieren entre si por la cadena lateral (grupo -R) unida al
carbono-α. Las propiedades de los aminoácidos queda determinada por estructura de la
cadena lateral R. Es así como los aminoácidos se clasifican en Grupos R: apolares
alifáticos (Glicina (Gly), Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile), Prolina
(Pro), aromáticos (Fenilalanina (Fen), Tirosina (Tir), Triptófano (Tri), polares sin carga
(Serina (Ser), Treonina (Thr), Cisterna (Cys), Metionina (Met), Asparagina (Asn),
Glutamina (Gln), polares con carga negativamente (Aspartato (Asp), Glutamato (Glu),
polares con carga positivamente (Lisina (Lis), Arginina (Arg), Histidina (His).
Fig. Nº2: Ejemplos de estructuras de aminoácidos.
8
Fig. Nº3: Estructura zwitterión.
Dado que todos los aminoácidos poseen un grupo ácido y un grupo básico
presentan propiedades anfóteras. Es decir, son moléculas que puede donar y aceptar
protones. En una solución ácida los aminoácidos están completamente protonados (la
forma catiónica). Sí la solución es neutra, la mayoría de los aminoácidos existen como
iones dipolares, también llamados zwitterión. La carga neta de un ión dipolar es cero (la
forma neutra). El pH en el cual predomina la forma con carga neutra del aminoácido
se llama el punto isoeléctrico (pI). En una solución alcalina se encuentra
mayoritariamente la forma con carga negativa, completamente desprotonada (la forma
aniónica).
Fig. Nº4: Curva Titulación de Glicina 0,1 M A 25ºC. Las especies iónicas
predominantes en puntos clave de la titulación se muestran encima de la gráfica. Los recuadros
sombreados, centrados alrededor de pK1 =2,34 y pK2 = 9,60 indican las regiones de máximo poder
tamponante.
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OBJETIVOS
• Determinar el pKa1, pKa2 de un aminoácido sin carga

• Determinar el pKa1, pKa2, pKR y pI de un aminoácido ácido
• Determinar el pKa1, pKa2 , pKR y pI de un aminoácido básico
Materiales por grupo Reactivos
1 vaso pp 250 mL Solución de Gli 0,025 Molar pH=2,00

2 vasos pp de 100 mL Solución de Arg 0,025 Molar pH=2,00
1 pipetas aforadas de 25 mL Solución de Asp 0,025 Molar pH=2,00
1 pizeta Solución de NaOH 0,10 Molar
1 agitador magnético
1 barra magnética
1 bureta de 50 mL
1 soporte universal
1 pH-metro
1 pinza
1 doble nuez
Parte Experimental
1. Tome una alícuota de 25 mL de solución de glicina 0,025 Molar y viértala en un vaso pp

de 100 mL. Incluya la barra magnética y coloque sobre agitador magnético
2. Proceda a medir el pH. Registre este valor.
3. Ambiente una bureta de 50,0 mL con NaOH 0,10 Molar. Ahora llene la bureta con
NaOH 0,10 Molar (cuide que no queden burbujas en el vástago de la bureta y únala al
soporte universal)
4. Agregue NaOH 0,10 Molar en fracciones de 0,50 mL y mida el pH. (Cuide que la
agitación sea constante)
5. Repita el paso 4 hasta llegar a pH 12,0
10
11
LABORATORIO Nº3
PROTEINAS: Extracción y cuantificación de la caseína de la leche
Introducción
La purificación de proteínas es una actividad usual en el trabajo en Bioquímica. La

Caseína, la proteína primaria de la leche, es una fosfoproteína que existe en cuatro
formas: α, β, γ y δ caseína, cada una con composición aminoacídica diferente. Por lo
tanto la caseína es una mezcla heterogénea de componentes proteicos. La caseína
puede ser extraída y purificada de la leche por precipitación con sales o por pH.
Las proteínas son solubles principalmente por los residuos de aminoácidos polares y
cargados que establecen interacciones con el agua. Cualquier agente que rompa estas
interacciones proteínas/agua disminuirá la solubilidad de la proteína y precipitara.
La sal inorgánica más comúnmente utilizada es el Sulfato de Amonio que en solución se

encuentra altamente solvatado reduciendo el agua disponible para interactuar con la
proteína. Cada proteína posee una concentración de sal, sobre la cuál la proteína no
podrá permanecer en solución y precipitará.
El pH también ha sido utilizado efectivamente en la precipitación selectiva de proteínas.

Un cambio en el pH de la solución altera el estado iónico de una proteína pudiendo
llevarla a un estado de carga neutra (punto isoeléctrico), donde la solubilidad es mínima.
Las moléculas de proteína neutras no se repelen eléctricamente y tienden a agregarse
precipitando de la solución.
La Caseína puede ser separada por precipitación isoeléctrica a pH 4,6. La

Lactoalbúmina, junto a otras proteínas, permanece en solución de donde se puede
separar por adición de HCl hasta pH 3,0 donde la Lactoalbúmina es insoluble.
Cuantificación de Proteínas en Solución
Método de Biuret: cuando aquellas sustancias que contienen dos o más enlaces
peptídicos reaccionan con sulfato de cobre alcalino, se forma un complejo de color
púrpura. El color resulta de la coordinación de los átomos de nitrógeno peptídicos con los
iones Cu++. La intensidad del color depende de la concentración de proteína.
Se debe preparar una curva de calibración usando soluciones estándar de proteína.

Estas son tratadas con el reactivo de Biuret y se mide la absobancia a la longitud de onda
adecuada. La muestra de la proteína desconocida se trata igualmente y su concentración
se determina de la curva de calibración.
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OBJETIVOS
- Realizar de manera experimental la extracción de la proteína (caseína)

- Cuantificar la concentración de proteína por el método de Biuret
PARTE EXPERIMENTAL
a) Separación de la caseína
Cada grupo toma 5 ml de leche descremada y la diluyen a 25 ml con H2O destilada. Se

agrega lentamente (durante aprox. 5 min) 0,2 ml de HCl al 2%. El pH debe alcanzar a 4,5
(comprobar con pH metro), donde se observa precipitación de la caseína (pH isoeléctrico).
Agite por 5 min. Deje decantar en reposo por 15 min. Centrifugue. Descarte el
sobrenadante. El residuo se lava dos veces con 10 ml H2O destilada centrifugando cada
vez. Lave finalmente con 10 ml etanol dos veces.
El sólido centrifugado se redisuelve en 5 ml de NaOH 0,01 M. Si queda sólido en

suspensión, volver a centrifugar. La solución resultante se usa para la determinación de
proteína disuelta por el método de Biuret.
b) Determinación de proteínas por el método de Biuret
Preparar una solución estándar de proteína de concentración 10 mg/ml usando una

proteína patrón (Albúmina de suero de bovino) BSA.
En tubos de ensayo separados preparar cada una de las siguientes soluciones de
proteína a partir de la solución standard de la proteína patrón:
TUBO Nº ml de soluc. Estándar ml de agua

1 0 5,0
2 0,5 4,5
3 1,0 4,0
4 1,5 3,5
5 2,0 3,0
6 3,0 2,0
7 4,0 1,0
8 5,0 0
En tubos de ensayo separados se toma 1 ml de cada solución de proteína y se agrega,

cada tubo, 4 ml de reactivo de Biuret. Se dejan los tubos a temperatura ambiente por 20
minutos y luego se mide la absorbancia a 540 nm de cada solución usando el tubo Nº 1
como blanco. Construir el gráfico Absorbancia v/s concentración (mg/ml) de proteína en
papel milimetradoCurva de calibración
.
13
- Determinación de la concentración de caseína
Tomar 1,0 ml de solución de proteína aislada y tratarla de igual forma que las soluciones
de proteína patrón. Si la absorbancia no cae en el rango de la curva de calibración,
entonces se deben hacer diluciones a la muestra. Informar los mg de caseína por litro de
leche.
- Determinación de la concentración de una proteína en un muestra problema
Tomar 1 ml de la muestra problema y tratarla de igual forma que la solución anterior.

Informe la concentración de proteína en mg/ml de muestra.
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LABORATORIO Nº4
ENZIMOLOGIA : Extracción y Caracterización de la Fosfatasa

Acida de Aorta de Bovino
INTRODUCCION
Las enzimas son catalizadores biológicos, que aumentan la velocidad de una reacción,
disminuyendo la energía de activación de la misma. Se caracterizan por medio de Km,
constante de Michaelis-Menten y de la Vmáx. velocidad máxima de reacción. La
velocidad de una reacción se puede estimar:
a) midiendo la desaparición de sustrato en el tiempo o

b) midiendo la aparición de producto en el tiempo.
El termino fosfatasa se utiliza para describir a aquellas enzimas que catalizan la hidrólisis
de derivados del ácido ortofosfórico. Dependiendo del tipo de enlace que se hidroliza se
clasifican en:
a) Fosfomonoesterasa (enlace fosfoester)
b) Fosfodiesterasa (enlace fosfodiester)
b) Anhídrido fosfórico hidrolasa (enlace pirofosfato).
Las fosfomonoesterasas se clasifican en específicas (un único sustrato) y no especificas

(reconocen a varios sustratos distintos). Estas últimas, a su vez, dependiendo del pH
óptimo, se clasifican en alcalina o ácida.
Las fosfatasas están presentes en prácticamente todos los órganos animales. Se
encuentran involucradas en el metabolismo de carbohidratos, ácidos nucleicos,
fosfolípidos y en la formación de los huesos.
En este práctico se estudiará una fosfomonoesterasa no especifica que se extraerá de la

aorta de bovino y cuyo pH óptimo está en el rango ácido (fosfatasa ácida).
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Mecanismo de reacción:
Primera etapa: se une el grupo fosfato al grupo OH de un residuo serina del sitio activo
de la fosfomonoesterasa :
O- O-
E - OH + R -O - P = O R -OH + E -O - P = O
-O O-
Enzima Sustrato Intermediario
Segunda etapa: el intermediario se hidroliza regenerando la enzima :
O- O-
H2O + E-O-P=O E - OH + H-P=O
O- O-
En este práctico se usará como sustrato p-nitrofenilfosfato el que al hidrolizarse genera
para-nitrofenol. Este compuesto a pH alcalino presenta un color amarillo el cual puede ser
cuantificado por espectrofotometría a 410 nm. A esta longitud de onda el coeficiente de
extinción molar, εM, es = 17500 M-1 cm-1.
O- O-
E -OH + NO2 - - O-P=O E -O-P = O + NO2 - -OH
O O-
Para determinar la concentración del producto coloreado, se mide la absorbancia a 410
nm, frente a un blanco que contiene todos los reactivos menos el sustrato. Aplicando la
ley de Lambert y Beer, se calcula la concentración molar del producto formado.
Ley de Lambert - Beer : A = ε·c·l, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de

extinción molar, c es la concentración en moles/L y l es el diámetro de la celda.
La velocidad de reacción se obtiene al relacionar la cantidad de producto formado en el
tiempo, mediante la siguiente ecuación:
V = [p-nitrofenol] / ∆t
Donde v es la velocidad de la reacción enzimática, ∆t es el tiempo de incubación.

Para determinar los parámetros característicos de una enzima con comportamiento de
Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la concentración de sustrato frente a
16
la velocidad de la reacción. En un principio se observa que al aumentar la [S] aumenta la

velocidad de reacción, hasta que llega un momento en que aunque se aumente la [S], la
velocidad se mantiene constante. Esta es la Vmáx y se alcanza cuando la enzima se
satura con sustrato :
[ sustrato]
Sin embargo la determinación de Km y Vmáx desde este gráfico no es muy adecuada, ya
que se requiere de gran cantidad de puntos para construir la zona curva. En cambio si se
tratará de una línea recta, esta queda determinada con tres puntos y es más fácil,
extrapolar o interpolar, o calcular una pendiente o una intersección. Es así como
Lineweaver y Burk, linealizaron el comportamiento de Michaelis-Menten obteniendo una
recta que queda representada en el siguiente gráfico:
1/v
1/Vm
-1/Km 1/[S]
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Objetivos
* Cuantificar la velocidad de una reacción enzimática

* Aplicar los conceptos teóricos adquiridos en la caracterización de una enzima.
* Encontrar el pH y la temperatura optima de la fosfatasa ácida de aorta de bovino
* Determinar Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino
* Cuantificar la velocidad de la reacción enzimática en presencia de un inhibidor
Materiales por Grupo Reactivos

30 tubos de ensayos solución tampón citrato pH: 3; 4,5;
5,6; 7,5; 9.
3 gradillas solución p-nitrofenilfosfato 30 mM
1 juego de micropipetas P1000, P200,P20 Solución MgCl2 50 mM
puntas azules y amarillas solución de TCA al 30%
3 cubetas solución de NaOH 0,1 M
pipeta vidrio 5 mL+propipeta
cronometro
Material General
espectrofotómetros
4 baños termorregulados ( a 20ºC, 37ºC, 60ºC, 80ºC)
4 placas calefactoras con vaso pp de 250 mL
Hielo
Parafilm
Procedimiento Experimental
A: Preparación de un extracto crudo de la enzima:
La enzima se extrae de aorta de bovino. Esta arteria se encuentra rodeada de una capa
de grasa fácilmente extraíble.
En el laboratorio se procede a retirar la capa de grasa, con la ayuda de una tijera se
extrae la capa externa y se deja solo la capa interna la cual se corta en trozos pequeños
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que se dejan en hielo. Los trozos fríos se homogeneizan junto con una cantidad
adecuada de agua destilada a 0ºC. Se homogeneiza no más de un minuto (evitando el
calentamiento), se enfría si es necesario. La mezcla se filtra usando gasa, el filtrado debe
permanecer frío, este corresponde a la enzima cruda o extracto crudo.
B: Efecto de pH
Para determinar el efecto del pH en la actividad Enzimática se realizarán reacciones en
distintos soluciones tampón citrato de pHs: 3,0; 4,5; 5,6; 7,5 y 9,0
Prepare una serie de tubos según indica la tabla 1. La enzima debe agregarse en último
lugar.
Tabla Nº1
Volumen (mL) B C 1 2 3 4 5
p-nitrofenilfosfato - 1,0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2,5 mL buffer pH 0 0 3.0 4.5 5.6 7.5 9.0
H2O 4.5 4.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Enzima 1.0 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
B: Blanco: No contiene sustrato
C: Control: No contiene enzima y mide la hidrólisis espontánea del sustrato
MgCl2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad.
Cada tubo debe mezclarse por inversión suavemente e incubar a 37ºC por 30 min.
Terminada la incubación, realice los siguientes pasos para cada tubo:
1. Agregar 1 mL de solución de TCA al 30%, mezclar por inversión y dejar en hielo. El

ácido tricloro acético (TCA) detiene la acción enzimática por desnaturalización ácida de la
enzima.
2. Transferir una alícuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A pH

básico el producto p-Nitrofenol tiene un máximo de absorción a 410 nm.
19
3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco.
Anote los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la absorbancia
de cada tubo experimental debe restarle la absorbancia del tubo C.
4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus pH. Se
deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá al pH óptimo.
Resultados Actividad Efecto pH

Tabla resultados Nº1
Nº tubo a pH Absorbancia Concentración Velocidad de la
a pH Producto mM reacción
3.0
4.5
5.6
7.5
9.0
C: Efecto de la temperatura en la reacción enzimática

Se estudiará la reacción a las temperaturas 0ºC, 20ºC; 37ºC; 60ºC; 80ºC y 100ºC.
Prepare los siguientes tubos según la tabla 2
Tabla Nº 2
Volumen (mL) B C T
p-nitrofenilfosfato O 1.0 1.0
MgCl2 0.5 0.5 0.5
buffer pH 5,6 2.5 2.5 2.5
H2O 2.0 2.0 2.0
Enzima 1.0 0 1.0
1. Prepare seis veces el tubo C (C1, C2,…C6) y seis veces el tubo T (T1, T2…T6).
Mezcle cada tubo por inversión suavemente e incube 30 min. a las temperaturas
indicadas. Es decir un tubo C y tubo T para cada temperatura ( Ej. C1 y T1 a 0ºC)
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2. Una vez terminada la incubación se procede para cada tubo en forma idéntica a la
descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir:

enzima.
3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco. Anote
los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la absorbancia de cada tubo
(discuta con sus profesores la factibilidad de usar el tubo C como blanco). Una vez
realizados los cálculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con el
correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TºC. Determine la temperatura optima
para la enzima
4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus
temperatura. Se deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá a
la temperatura óptima.
Resultados Actividad Efecto Temperatura
Tabla resultados Nº2
Nº tubo a T ºC Absorbancia Concentración Velocidad de la
a Tº Producto mM reacción
0
20
37
60
80
100
Una vez realizados los cálculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con
el correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TºC. Determine la temperatura optima
para la enzima.
21
D: Efecto de la concentración de sustrato.
Determinación de Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino.

Prepare los siguientes tubos, según la tabla 3:
Tabla Nº3
Volumen (mL) Blanco 1 2 3 4
p-nitrofenilfosfato - 0,5 1,0 1,5 2,0
MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
buffer pH 5,6 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
agua 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
Enzima 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Para cada tubo mezcle por inversión suavemente e incube a 37ºC, por 30 Minutos (este
será el ∆t y debe ser medido con precisión).
1. Una vez terminada la incubación se procede para cada tubo en forma idéntica a la
descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir:

enzima.

4. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco.
Anote los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la absorbancia
de cada tubo.
5. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus temperatura.
Se deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá a la temperatura
óptima.
22
6. Con los valores de absorbancia calcule la [p-nitrofenol]. Con este valor y el tiempo de
incubación calcule la velocidad de la reacción.
7. Conociendo la concentración inicial de sustrato, calcule la concentración de este en
cada tubo. Grafique según Lineweaver- Burk. Determine el valor de Km y Vmáx.
8. Para calcular la concentración de sustrato recuerde que V1 x C1 = V2 x C2
Resultados Curva de Saturación

Tabla Nº3
Concentración Absorbancia Concentración Velocidad de
Sustrato A 410nm Producto mM reacción 1/[S] 1/v
E: Efecto de un inhibidor en la cinética de una reacción enzimática.

Se utilizará H2PO4- ( producto de la reacción) como inhibidor de la reacción catalizada por
la fosfatasa ácida. Para ello se repite la experiencia anterior “Efecto de la concentración
de sustrato” en presencia del inhibidor.
Volumen (mL) Blanco 1 2 3 4

p-nitrofenilfosfato - 0,5 1,0 1,5 2,0
MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
buffer pH 5,6 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Agua destilada 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
NaH2PO4 10 mM 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Enzima 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
1. Selle los tubos con parafilm, incube a 37 ºC por 30 minutos. Proceda de la misma
forma anterior para detener la reacción enzimática y medir la formación de
producto.
23
Resultados Cinética de Inhibición

Tabla Nº3
Velocidad de
Concentración Absorbancia Concentración Reacción en 1/[S] 1/v
Sustrato A 410nm Producto mM presencia de
NaH2PO4
1. En gráfico velocidad versus concentración trace los resultados de velocidad en

presencia del inhibidor
2. En gráfico de Lineweaver- Burk trace los resultados de velocidad en presencia del
inhibidor
3. Determine el tipo de inhibición.
Resultados
1. Construir la gráfica del efecto del pH.

2. Construir la gráfica del efecto de la temperatura
3. Construir la gráfica de según Lineweaver- Burk. Determine el valor de Km y Vmáx.
4. Determine el tipo de inhibición.
24
25
LABORATORIO Nº5
GLICEMIA Y COLESTEROL
A. GLICEMIA
INTRODUCCIÓN
La glucosa es la principal fuente de energía en el ser humano. Sin embargo,

dependiendo de los requerimientos energéticos del individuo el metabolismo de la glucosa
puede resultar en: a) producción de energía, al catabolizarse hasta CO2 y H2O a través de
la glicólisis, b) almacenamiento de energía, generando glicógeno en el hígado o
triglicéridos en el tejido adiposo, c) utilización de la glucosa, convirtiéndola en amino
ácidos o conjugándola con proteínas.
A pesar de las considerables fluctuaciones en la ingesta de carbohidratos

(principal fuente de glucosa) y en su demanda, la concentración de glucosa en la
sangre (glicemia) de los individuos sanos se mantiene en un rango estrecho (70 – 105
mg/dl en el adulto en ayuno). La estricta regulación de la concentración sanguínea de
glucosa depende de la acción de varias hormonas. La insulina estimula la captación de
glucosa y promueve su conversión a glicógeno (glicogénesis) o triglicéridos, y además
inhibe la producción de glucosa endógena. Por otra parte hormonas contrarreguladoras
como glucagón, epinefrina, cortisol y hormona de crecimiento, aumentan la liberación y
producción endógena de glucosa (glicogenolisis, gluconeogénesis).
Por lo tanto, alteraciones en la producción, secreción, y/o actividad biológica de

estas hormonas resultan en cambios de los niveles sanguíneos de glucosa. Por esto la
determinación de la concentración de glucosa en la sangre es fundamental en el
diagnóstico y monitoreo de desórdenes del metabolismo de carbohidratos como por
ejemplo diabetes mellitus, diabetes gestacional, hipoglicemia neonatal, hipoglicemia
idiopática, carcinoma de islotes pancreáticos, etc.
Existen numerosos procedimientos analíticos para cuantificar la concentración de

la glucosa en la sangre, siendo rutinariamente utilizados los métodos enzimáticos, dada
su alta especificidad y sensibilidad. En este trabajo práctico se utilizará el método de la
glucosa oxidasa (GOD), acoplado a una reacción colorimétrica catalizada por la enzima
peroxidasa (POD).
26
Las reacciones involucradas en el ensayo enzimático son las siguientes:
Glucosa (muestra) + O2 + H2O
GOD
gluconolactona + H2O2
2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol
POD
4 H2O + 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona
El último producto generado en esta serie de reacciones es coloreado, por lo tanto

puede absorber la luz visible y en consecuencia puede cuantificarse
espectrofotométricamente (ver anexo de espectrofotometría). Dado que la producción
de 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona es directamente proporcional a la
concentración de glucosa, se puede construir una curva de calibración generada a partir
de soluciones de concentración conocida (estándar) de glucosa y las mediciones de
absorbancia del producto final del ensayo enzimático. Para conocer la concentración de
glucosa de una muestra desconocida, realizamos el ensayo y medimos la absorbancia del
producto. Este valor de absorbancia puede ser interpolado en la curva de calibración para
conocer la concentración de glucosa.
OBJETIVOS
- Cuantificar la concentración de glucosa de una muestra problema
- Evaluar las diferentes concentraciones de glucosa sobre el efecto que puede
implicar en el organismo.
TAREAS PREVIAS
- Cálculos para preparar estándares de glucosa mediante dilución seriada de la solución

stock.
27
PARTE EXPERIMENTAL
Materiales
1 micropipeta p20
1 micropipeta p1000
puntas para p20
puntas para p1000
15 tubos eppendorfs
1 microplaca
lector de microplaca
rotulador
1,5 ml suero fisiológico
1 ml glucosa 400 mg/dl (solución stock)
3 ml reactivo R1
0,1 ml plasma A (muestra)
0,1 ml plasma B (muestra)
Procedimiento experimental
1. Preparación de estándares de glucosa
- rotular 5 tubos eppendorfs para preparar las soluciones estándares de glucosa

- preparar 500 µl de los estándares de glucosa (400, 200, 100, 50 y 25 mg/dl), haciendo
diluciones seriadas en suero fisiológico a partir de la solución stock de glucosa.
2. Obtención de plasma sanguíneo (ya fue hecho, Ud. recibirá el plasma)
- rotular 1 tubo eppendorf para colectar el plasma sanguíneo

- centrifugar 2 min a 800 x g (1500 rpm) la muestra de sangre heparinizada para
separar el plasma de los elementos figurados
- aspirar con la micropipeta el plasma, sin distorsionar el pellet celular
- recuperar el plasma en tubo eppendorf limpio rotulado
3. Ensayo enzimático y medición de absorbancia
- rotular 8 tubos eppendorfs para preparar las mezclas de reacción

- preparar las mezclas de reacción, agregando a cada tubo los volúmenes de reactivos
indicados en la siguiente tabla 1. Es recomendable, para sincronizar lo más que se
pueda las reacciones, agregar el reactivo R1 a todos los tubos y luego comenzar a
agregar los 3 µl de muestra a los tubos correspondientes. Luego de haber agregado la
última muestra agitar todos los tubos simultáneamente.
28
- incubar 30 min. a temperatura ambiente

- transferir 150 µl de cada reacción a un pozo de la microplaca, registrando la
localización de cada muestra
- medir la absorbancia a 505 nm (A505) en lector de microplaca
Tabla 1
Tubo Reactivo R1 Muestra
0 (blanco) 300 µl 3 µl suero fisiológico
25 300 µl 3 µl glucosa 25 mg/dl
Muestra A 300 µl 3 µl plasma A
Muestra B 300 µl 3 µl plasma B
ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA
La cantidad de luz monocrómática absorbida por las moléculas de una solución se

relaciona directamente con: la distancia que debe recorrer el haz de luz para atravesar la
solución, la estructura de las moléculas en solución capaces de absorber energía a la
longitud de onda determinada (λ) y la concentración de la/s molécula/s absorbente/s.
Estas variables se integran en la ley de Beer-Lambert, que puede ser expresada de la
siguiente manera, si consideramos sólo una especie molecular en la solución capaz de
absorber energía a esa longitud de onda:
 Io 
A = log  = ε × c × l
 I 
Donde:
A : absorbancia
Ιo: intensidad de la luz incidente
Ι: intensidad de la luz transmitida
ε: coeficiente de extinción molar (L mol-1 cm-1)
c: concentración de la molécula absorbente (mol L-1)
I: largo de la celda por la que pasa de luz (cm)
La absorbancia es un valor empírico, determinado en un espectrofotómetro y es

además un valor adimensional (sin unidades).
El coeficiente de extinción molar es específico de cada molécula, y depende de la

naturaleza química de la molécula estudiada, el solvente en el que se encuentra, la
29
longitud de onda de la luz incidente, del pH y de sí la especie absorbente se encuentra en

equilibrio con otras especies, por ejemplo cambiando el estado de protonación.
El largo de la celda depende del diseño de la celda y del espectrofotómetro

utilizado.
De esta forma si medimos la absorbancia de soluciones con diferentes
concentraciones de la molécula absorbente, en las mismas condiciones experimentales (ε
y l constantes), la absorbancia sólo dependerá de la concentración de esta molécula. Por
lo tanto la relación entre absorbancia y concentración puede ser representada por la
siguiente ecuación:
A = K ×c
en donde los términos ε y l han sido reunidos en una única constante K. Esta ecuación
puede ser representada por una recta en un plano de ejes cartesianos, donde A es la
variable dependiente (y), c la variable independiente (x) y K la pendiente.
30
B. LIPIDOS: Determinación de colesterol
INTRODUCCION.
El colesterol y los ésteres del colesterol son liberados desde las lipoproteínas por
detergentes. La enzima colesterol esterasa hidroliza los esteres de colesterol formándose
H2O2 en la siguiente reacción enzimática de oxidación de colesterol por la colesterol
oxidasa según la siguiente ecuación:
Colesterol esterasa
Ester de colesterol + H2O colesterol + ácidos. Grasos
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 colesterol-4-en-ona+H2O2
Peroxidasa
H2O2 + 4AP+ fenol quinonimina + H2O
La cantidad de quinonimina de color rojo formada es proporcional a la concentración de

colesterol
Reactivos :
- Kit de Determinación de colesterol

- Muestra se suero
Procedimiento
BLANCO ESTANDAR MUESTRA
Standard - 20 µl -
Muestra - - 20 µl
Reactivo de 2ml 2ml 2ml

trabajo
1. Mezclar e incubar a 37ºC por 5 minutos o 10 minutos entre 15º y 25ºC

2. Medir la Absorbancia del estándar y la muestra , ajuntando el espectofotrometro
con el blanco del reactivo a 505 nm. El color es estable por 30 minutos.
31
Cálculos:
Concentración de colesterol = Abs. de la muestra * concentración del estandar

Abs. del estándar
mg/dlx 0.0258= mmol/l

Concentración del estándar : 200mg/dl
Linealidad del método:
El método es lineal hasta una concentración de 600mg/dl (15.4 mmol/l). Si la

concentración de colesterol es mayor de 600mg/dl en el suero o plasma, diluir la muestra
en solución salina y repetir la determinación, multiplicando el resultado por el factor de
dilución.
Valores de referencia
Los siguientes limites son recomendados para el reconocimeinto de una

hipercolesterolemia
Sospechoso: 220mg/dl (5.7 mmo/l)

De riesgo: 260 mg/dl (6.7 mmol/l)
Objetivos:
- Conocer el método de cuantificación de colesterol

- Relacionar los conocimientos teóricos con la aplicación práctica y clínica
32
LABORATORIO 6
EXTRACCIÓN DE DNA
Lic. Patricia Arias
Introducción
El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado ADN, constituye el

principal componente del material genético de la inmensa mayoría de los organismos,
junto con el ARN, siendo el componente químico primario de los cromosomas y el material
con el que los genes están codificados.
Se trata de una molécula de gran peso molecular (macromolécula) que está

constituida por tres sustancias distintas: ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del
tipo pentosa (la desoxirribosa), y una base nitrogenada cíclica que puede ser púrica
(adenina o guanina) o pirimidínica (timina, citosina o uracilo). La unión de la base
nitrogenada (citosina, adenina, guanina o timina) con la pentosa (desoxirribosa) forma un
nucleósido; éste, uniéndose al ácido fosfórico, nos da un nucleótido; la unión de los
nucleótidos entre sí en enlace diester nos da el polinucleótido, en este caso el ácido
desoxirribonucleico.
Fig. Nº1: Estructura Bases Nitrogenadas.
La función principal del ADN es mantener a través de un sistema de claves (código

genético) la información necesaria para que las células hijas sean idénticas a las
progenitoras (información genética). Este proceso se almacena en la secuencia de las
33
bases (aparentemente aleatoria), que tiene una disposición que es copiada al ARNm
(traducción) para que en el ribosoma sintetice determinada proteína. Este proceso es
también denominado "dogma central de la biología molecular". Por medio de los
mecanismos de recombinación y mutaciones se obtienen las variaciones necesarias para
adaptaciones y evoluciones.
El núcleo dirige las actividades de la célula y en él tienen lugar procesos tan

importantes como la autoduplicación del ADN o replicación, antes de comenzar la división
celular, y la trascripción o producción de los distintos tipos de ARN, que servirán para la
síntesis de proteínas. Las cadenas de polipeptídicas codificadas por el ADN pueden ser
estructurales como las proteínas de los músculos, cartílagos, pelo, etc., bien funcionales
como las de la hemoglobina o las innumerables enzimas del organismo. La función
principal de la herencia es la especificación de las proteínas, siendo el ADN una especie
de plano o receta para nuestras proteínas.
El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y

lisar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario
contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar (romper) los núcleos y liberar el
DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe
también cualquier actividad nucleasa en la preparación.
El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes,

como RNA y proteínas.
OBJETIVOS
- Conocer los procedimientos básicos de purificación y extracción de DNA

- Conocer las diferentes funciones que tienen cada reactivo para realizar la extracción
- Lograr la visualización de DNA
Materiales
Hojas de acelga
Sal
Agua fría
Detergente líquido
Licuadora
Jugo de lechosa (papaya) o piña (ananá)
Vasos precipitados limpios
Colador o filtros
Alcohol frío
Palillos
Cuchara
Parte Experimental
34
En este práctico cada grupo contara con medio vaso de hojas de acelga al que se debe
agregar una punta de espátula de sal y 250 ml de agua destilada fría, licuar a alta
velocidad por 15 minutos. Las cuchillas de la licuadora separar las células de los tejidos
que forman parte de la hoja.
- Cuele el contenido del vaso de la licuadora a un vaso limpio. Añada 2 cucharadas

soperas de detergente líquido (solubiliza membranas). Mezcle todo y deje reposar 10
minutos.
- Vierta esta mezcla en pequeños recipientes de vidrio limpios.
- Añada a cada recipiente unas gotas de jugo de lechosa (enzima) y mezcla muy
suavemente para no formar espuma. Deje reposar 2 minutos.
- Incline cada recipiente y añade lentamente desde su borde el alcohol frío hasta que veas
una capa sobre el contenido.
El DNA se elevará desde la mezcla hasta la capa de alcohol.
Con un palillo puedes manipular el DNA.
Información para la realización del informe
Para el informe deberá averiguar lo siguiente:
1) Que función cumple el detergente

2) Que función cumple el alcohol
3) Que función cumple el jugo de lechosa
Esta información debe ser incluida en la parte de discusión.
35
ANEXOS
Formato de Entrega de Informes:
• Papel tamaño carta.

• Letra Arial 10.
• Márgenes 2 cm por cada lado.
• Los títulos y subtítulos deben ir en negrita.
• Escritura a espacio simple.
• El número total de hojas no debe sobrepasar las 15, incluyendo portada e
índice.
El informe debe incluir:
1) Tapa:
- Titulo. (nombre de la guía)
- Integrantes. (Nombre y apellidos)
- Nombre docente:
- Fecha de realización del práctico
2) Índice.
- Especificar la página en la que se encuentra cada uno de los
capítulos del informe.
3) Introducción:
- Indicar el marco teórico del estudio realizado.

- Especificar los objetivos generales y específicos del trabajo
realizado.
4) Materiales y Métodos:
- Presentar las actividades realizadas y los medios empleados en

su desarrollo incluyendo fotos, gráficos, esquemas, láminas,
etc. Citar la bibliografía consultada en el caso de ser
necesario.
5) Resultados y Discusiones:
- En esta parte se mostrar en forma de tablas todos los

resultados de las mediciones realizadas.
- Posteriormente realizar una discusión de los diferentes
resultados que se obtengan, comparándolos con fundamento
teórico de lo observado en el laboratorio.
- Ej. Si entre dos muestras problemas observó un cambio de
color cual es el principio químico que lo hizo cambiar y mostrar
ese tipo de reacción para lo cual debe utilizar bibliografía.
6) Conclusiones y recomendaciones:
- Presentar las conclusiones obtenidas y posibles

recomendaciones que el alumno pueda aportar.
36
7) Bibliografía:
Al final de cada informe se deberá detallar la bibliografía consultada en base

al siguiente modelo.
• Libros.
APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLIDO E INICIAL DEL

NOMBRE AUTOR 2; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC.
Año de publicación. Título de la publicación. Editorial. Cuidad y país
de publicación. __ Pág. (páginas del texto).
Ej: Matissek, R., Schnepel, F. N. y Steiner, G. 1998. Análisis de
los alimentos. Ed. Acribia. Zaragoza, España.: pp. 1 y 229-232.
• Revistas u otra publicación periódica:
APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLIDO E INICIAL DEL

NOMBRE AUTOR 2; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC.
Año de publicación. Título de la publicación. EN REVISTA: Editorial.
pp.: __ - __ (páginas citadas).
Ej: Mazziatelli, M., and A. Shubert. 1990. Effect of several VAM

endophytes and artificial sustrate on vitropropagated Vitis
berlandisi x rupestri 1103. En revista: Agric. Ecosyst. Environ.
29:279-283.
• Webibliografía:
APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR. Disponible en: Página
web.
SORIA A., Elia M., REYES E., Carlos, OCCEGUERA A., Zenaida et al.
MICORRIZACIÓN DE PLANTAS MICROPROPAGADAS DE CAÑA DE
AZÚCAR (Sacharum officinarum). Agric. Téc. [online]. oct. 2001, vol.61,
no.4 [citado 02 Septiembre 2007], p.436-443. Disponible en la Web:
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-
28072001000400005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0365-2807.
NOTA:
No se aceptaran como bibliografía o fuente de información.
www.rincondelvago.com
www.wikipedia.com
www.yahoo.com
www.altavista.com
Ni otro tipo de web de dudosa fuente
Si se sorprenden informes en donde la información escrita es copiados y pegados textual

desde las páginas web sin haber analizado u ordenado las ideas este informe será
evaluado con nota 1.0
37

Guia de Lab Oratorio de Bioquimica 2011 Salud)

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GUÍAS DE LABORATORIO DE

PARA CARRERAS DEL ÁREA DE LA SALUD

Coordinadora: Mg. ©Karin Figueroa S.

Lípidos (Colesterol) y Glicemia

REGLAMENTO INTERNO LABORATORIOS

1. La Asistencia a Laboratorio es de un 100%.

7. NO se aceptará recuperar laboratorios.

8. El uso de la Guía de Laboratorio es OBLIGATORIO, los estudiantes que no tengan su guía

9.1 En TODOS los laboratorios se realizará un control de entrada, que comprenderá

9.3 Al final del semestre se realizará un EXAMEN DE LABORATORIO

9.4 Las ponderaciones de Laboratorio son:

9.5 A LOS ALUMNOS QUE SEAN SORPRENDIDOS COPIANDO EN LOS CONTROLES,

9.7 NO SE ELIMINAN NOTAS.

Los hidratos de carbono pertenecen los compuestos poli-funcionales que

Por lo tanto, ellos poseen simultáneamente propiedades de aldehídos o cetonas y

Los monosacáridos, según el numero de átomos de carbono en la molécula, se

Los oligosacáridos y polisacáridos son hidratos de carbono complejos y al ser

Los hidratos de carbono están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el

CLASIFICACION DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

a) Monosacáridos: Son generalmente sólidos bien cristalizados, solubles en agua, de

b) Disacáridos: Formados por dos unidades de azúcares simples siendo lo más

1. - Disacáridos reductores ej: Maltosa, lactosa.

c) Polisacáridos: Son grandes moléculas formados por condensación de unidades de

Una de las propiedades de los carbohidratos que se emplean en su determinación

El poder reductor de los carbohidratos está condicionado a la presencia de un

En polisacáridos donde los grupos aldehídos o cetónicos libres se encuentran

Numerosos agentes oxidantes como Cu2+, Ag+ y ferricianuro de potasio pueden

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

Usando las diferencias de las propiedades químicas es posible identificar algunos

El complejo ión cúprico-tartrato (reactivo de Fehling) es reducido en ambiente alcalino

Test de Seliwanoff para Cetosas

Este test está basado en las reacciones de deshidratación (eliminación de H2O),

Test de Iodo para Almidón

- Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo a su reactividad en

1.- Test de Fehling

2.- Test de Seliwanoff (Resorcinol: 3-hidroxi fenol)

3.- Hidrólisis Acida

4.- Test de Iodo para Almidón

Tabla de resultado Test

GLUCIDO Fehling Seliwanoff Test de iodo

TITULACIÓN DE AMINOACIDOS: Determinación de pK1, pK2, PI

Mg. ©Karin Figueroa S.

Fig. Nº1: Estructura básica de un aminoácido

Fig. Nº2: Ejemplos de estructuras de aminoácidos.

Fig. Nº3: Estructura zwitterión.

• Determinar el pKa1, pKa2 de un aminoácido sin carga

Materiales por grupo Reactivos

1 vaso pp 250 mL Solución de Gli 0,025 Molar pH=2,00

1. Tome una alícuota de 25 mL de solución de glicina 0,025 Molar y viértala en un vaso pp

PROTEINAS: Extracción y cuantificación de la caseína de la leche

Mg. ©Karin Figueroa S.

La purificación de proteínas es una actividad usual en el trabajo en Bioquímica. La

La sal inorgánica más comúnmente utilizada es el Sulfato de Amonio que en solución se

El pH también ha sido utilizado efectivamente en la precipitación selectiva de proteínas.

La Caseína puede ser separada por precipitación isoeléctrica a pH 4,6. La

Cuantificación de Proteínas en Solución

Se debe preparar una curva de calibración usando soluciones estándar de proteína.

- Realizar de manera experimental la extracción de la proteína (caseína)

Cada grupo toma 5 ml de leche descremada y la diluyen a 25 ml con H2O destilada. Se

El sólido centrifugado se redisuelve en 5 ml de NaOH 0,01 M. Si queda sólido en

b) Determinación de proteínas por el método de Biuret

Preparar una solución estándar de proteína de concentración 10 mg/ml usando una

TUBO Nº ml de soluc. Estándar ml de agua