FACULDADE ESTÁCIO DE SÁ

DE CAMPO GRANDE-MS

BIOQUÍMICA – PRÁTICA

PROFESSOR Dr. JOAQUIM CORSINO

APOIO TÉCNICO – Kátia Danielle Ferreira Martins
Carlos Alexandre F. da Silva
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Campo Grande – MS 2006

INTRODUÇÃO

A – Objetivos Gerais das Aulas Práticas de Bioquímica

As aulas práticas de Bioquímica tem como objetivo criar condições para que os estudantes
sejam capazes, ao final do curso, de:
1. Manipular os equipamentos freqüentemente utilizados em laboratório de
bioquímica.
2. Conhecer por meio de reações efetuadas no laboratório, as propriedades
químicas das substâncias que compõem os organismos vivos.
3. Interpretar resultados experimentais.
B – Normas do Laboratório de Bioquímica
1. Espectrofotômetro, centrifuga, banho-maria ou quaisquer outros aparelhos,
somente deverão ser manuseados pelos alunos após instruções, a fim de se evitar
danos irreparáveis.
2. Em dias e hora pré-determinados, os alunos terão à sua disposição professores e
técnicos encarregados de orienta-los na execução e interpretação dos referidos
trabalhos.
3. Após o uso de um bico de gás, ou de água, não deixa-los aberto, tomando o
cuidado de fechar as torneiras completamente.
4. Não lançar nas pias quaisquer materiais, com exceção de água, para evitar a
corrosão dos encanamentos.
C – Prevenção de Acidentes
1. Trabalhar sempre protegido por avental.
2. Não fumar dentro do laboratório.
3. Ao acender o bico de gás, ter o cuidado de não abrir a torneira de gás, antes que
tenha a mão o palito de fósforo acesso.
4. Não operar com substâncias inflamáveis (álcool, éter) nas proximidades de uma
chama. Usar banho de água ou areia.
5. Os reagentes tóxicos ou corrosivos, álcali ou ácidos fortes (quando
concentrados), não deverão ser pipetados com a boca.
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TRABALHO PRÁTICO

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
No final desse trabalho prático, o estudante deverá saber:

1. Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento de

aminoácidos.
2. O significado de seguintes reações particulares.
• Reação xantoprotéica
• Reação de Sakaguchi
• Reação de aminoácidos que contém enxofre.

1. Reações Gerais dos Aminoácidos

a.Formação de sais com ácidos e bases devido à natureza de íon dipolar dos aminoácidos

O conhecimento das propriedades ácido-básicas dos aminoácidos, é extremamente

importante para o entendimento de muitas propriedades das proteínas. Além disso, separar,
identificar e quantificar os diferentes aminoácidos, que são passos necessários para a
determinação da composição e seqüência aminoácidos das proteínas, é baseada no
comportamento característicos de cada um destes monômeros.
Os aminoácidos são cristalizados a partir de soluções aquosas neutras em sua forma
totalmente ionizada como íons dipolares ou zwitterions. Embora tais íons dipolares sejam
eletricamente neutros e não se movam em um campo elétrico, eles possuem cargas opostas nos
seus dois pólos. Quando um aminoácido neutro é dissolvido em água, ele pode se comportar como
um ácido (doador de prótons) ou como uma base (aceptor de prótons).

OH- OH-
+ + -
R-CH( NH3)-COOH R-CH( NH3) COO R-CH(NH2)-COO-
+ +
H H

[ A-]
Sabendo-se que: pH = pK1 + log -------- onde HA é um ácido qualquer
[ HA]

Podemos, por uma curva de titulação, calcular os diferentes pK, s de um determinado

aminoácido bem como o seu ponto isoelétrico, a partir da relação:

PK, 1 + pK,2
pI = ----------------------
2

Dessa maneira, podemos, a partir dos valores de pK e pI identificar qualquer dos 20

aminoácidos protéicos.
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Procedimento experimental

• Suspender uma pitada de tirosina em 1 mL de água

• Acrescentar uma gota de indicador de cor (vermelho cresol), observar que a tirosina não se
dissolve.
• Adicionar, gota a gota, NaOH 2N e acompanhar a dissolução da tirosina precipitada.
• Adicionar, gota a gota, HCl 10% e notar a formação de precipitado. Prosseguir a adição de HCl
até dissolução da tirosina.
• Escrever as reações envolvidas nos diversos passos da experiência, usando a estrutura da
tirosina e explicar cada etapa do processo.
+
NH3
-
HO CH2 C COO
H

TIROSINA

OBSERVAÇÃO: O vermelho de cresol apresenta os seguintes pontos de viragem:

pH 0,0 – 2,5 – rosa; pH 2,5 – 6,5 – amarelo; pH acima de 7,0 - roxo

pK, s da tirosina: pK1 = 2,20; pK2 = 9,11; pK3 = 10,07

Responda:

• Qual é o pI da tirosina?
• Se em lugar da tirosina tivesse sido empregada a glicina, os mesmos resultados seriam
observados? Por que?

b. Reação com Ninhidrina

A ninhidrina (hidrato de triceto-hidrindeno) é um composto heterocíclico que forma um

derivado corado, após reagir com aminas, com os amingrupos dos aminoácidos livres ou de
terminações de proteínas e peptídeos. A ninhidrina oxida o aminoácido, produzindo CO 2 , NH3 , e
um derivado aldeídico com um átomo de carbono a menos e, conseqüentemente, reduzindo.
Posteriormente, a ninhidrina oxidada e reduzida reage com a amônia liberada formando um
complexo violeta ou púrpura. Exceto o derivado da prolina, que é amarelo.

As reações podem ser equacionadas da seguinte maneira:

H
CO2 + R C
O O O
OH H
OH
+ R C COOH
OH H Ninidrina reduzida
NH2
O NH3 O
O
Ninidrina oxidada HO

HO
O
O O

+
H + 3 H2O + N

-
O O
Complexo
Como a intensidade da coloração do complexo colorido
formado é proporcional à concentração de
aminoácidos ou peptídeos pequenos, esta reação é freqüentemente utilizada para determinação
quantitativa de aminoácidos em solução.
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Procedimento experimental
Tubo Amostra/Concentração Volume - mL Ninhidrina 0,1% - (gotas)
1 Água 1,0 5
2 Glicina 0,5 mM 1,0 5
3 Prolina 0,5 mM 1,0 5
4 Leucina 0,5 mM 1,0 5
5 Aspartame 0,19%* 1,0 5
6 Solução protéica 1,0 5

* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éste ), adoçante 200 vezes mais potente do que o açúcar.
Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.

Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C por 3 minutos. Compare

os resultados com o branco (tubo 1). Anote os resultados e explique-os.

2. Reações específicas de identificação de aminoácidos

a. Aminoácidos com grupos guanidina: Reação de Sakaguchi

H2N C NH R
Os aminoácidos com grupo guanidina [ NH2 ] desenvolvem em meio alcalino
Um complexo verde com o α – naftol ( OH ) que, em presença de

hipoclorito de sódio (NaClO) passa a avermelhado. Identifique o (s) aminoácidos (s) contendo o
grupo guanidina.

Procedimento experimental
Tubos Amostra/Concentração Volume NaOH 2,5 N α – Naftol NaClO - 0,5% mL
mL gotas gotas
1 Água 1,0 3 3 1
2 Arginina 0,5 mM 1,0 3 3 1
3 Glicina 0,5 mM 1,0 3 3 1
4 Triptofano 0,5 mM 1,0 3 3 1
5 Solução Protéica 1,0 3 3 1
Misturar e observar a cor, que desaparece após alguns minutos, usando o tubo 1 como
controle. Anote os resultados e explique-os.

b. Reação xantoprotéica

Específica para aminoácidos que apresentam anel aromático. O precipitado branco que se
forma é devido à ação do HNO3 (ácido mineral forte), e o desenvolvimento da cor amarela ocorre
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por formação de nitrocompostos (anel aromático + NO2 ). Relacione os aminoácidos aromáticos e

suas respectivas estruturas.

Procedimento experimental
*** OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança, os experimentos a seguir deverão ser
efetuados na capela.

Tubos Amostra/Concentração Volume - mL HNO3 - mL

1 Água 2 1
2 Glicina 0,5 mM 2 1
3 Triptofano 0,5 mM 2 1
4 Tirosina 0,5 mM 2 1
5 Solução Protéica 2 1

Anote os resultados e explique-os.

c. Reação para aminoácidos contendo enxofre

Aminoácidos que contém enxofre, em meio alcalino e, à quente, liberam o enxofre que
aparece na forma de sulfeto de sódio (Na2S). Este reage com acetato de chumbo (CH3COO)2 Pb,
formando o PbS, que escurece a reação:
H H
R S R C NH2 + NaOH Na2S + R C NH2
COOH Sulfeto de sódio COOH
Aminoácido com enxofre Aminoácido sem enxofre

Na2S + (CH2COO)2Pb PbS + CH3COONa

Sulfeto de sódio Acetado de sódio
Acetado de chumbo Sufeto de chumbo

Cite os aminoácidos que contém enxofre, com suas respectivas fórmulas estruturais.

Procedimento experimental
Tubos Amostras Volume - mL NaOH 2 N 100º C (CH3COO)2Pb mL
mL
1 Água 2 1 0,5
2 Cisteína 2 1 0,5
3 Glicina 2 1 0,5
4 Solução Protéica 2 1 0,5

Anote os resultados obtidos e explique-os.

CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
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I – INTRODUÇÃO
As proteínas, que são macromoléculas de peso molecular definido, são eletrólitos cujo
comportamento se ajusta aos mesmos princípios físicos de eletrólitos de massa molecular menor.
A natureza química dos radicais R (cadeias laterais) dos aminoácidos que compõe a estrutura
primária das proteínas determina a sua estrutura secundária e/ou terciária.
O comportamento físico-químico das proteínas está relacionado a vários fatores. A
solubilidade por exemplo, depende pH, força iônica do meio, constante dielétrica do solvente e
temperatura. Em geral as proteínas são menos solúveis no ponto isoelétrico. Neste pH as
proteínas não apresentam carga efetiva (as cargas positivas são iguais às negativas) e portanto
não atuam como forças eletrostáticas entre as outras moléculas presentes no meio. De ambos os
lados do pH isoelétrico todas as moléculas terão carga efetiva positiva ou negativa. Nestes
casos,pelo fato das moléculas de proteínas se repelirem, haverá menor tendência para agregação
e precipitação.

II – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

No final deste trabalho prático o aluno estará familiarizado com as propriedades físico-
químicas das proteínas, bem como as técnicas e reações de identificação das mesmas.

III – REAÇÃO DO BIURETO

NH
3.1 – Fundamento
A reação do biureto ocorre com substâncias que contenham grupos C O e grupos
nitrogenados. Sendo assim, essa reação é positiva para todas as proteínas e peptídeos graças
às suas ligações peptídicas. Estas moléculas, quando tratadas com uma solução diluída de sulfato
de cobre, em meio alcalino, dão coloração púrpura característica, devido à formação do complexo
de coordenação entre o átomo de cobre e 4 átomos de nitrogênio.

HN NH
R CH HC R
Cu
O C C O
HN NH

Biureto - (complexo de coordenação entre peptídeos e cobre II, de cor púrpura)

3.2 – Procedimento

Montar uma bateria com:

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Tubos Amostra CuSO4 a 0,5% mL NaOH a 10% mL

1 Água, 2 mL 0,5 0,5
2 Clara de ovo(a), 2 mL 0,5 0,5
3 Gema de ovo(b), 2 mL 0,5 0,5
4 Leite(c), 2 mL 0,5 0,5
5 Extrato de Soja(d), 2 mL 0,5 0,5
• Soluções preparadas por: a) homogeneização de 1 clara de ovo com 50 mL de água;
• b) homogeneização de 1 gema de ovo com 50 mL de água;
• c) homogeneização de 50 g (5 colheres médias) de leite em pó com 100 mL de água;
• d) homogeneização de 10 g de farinha de soja de semente de soja em 100 mL de água
destilada.

Observar que em alguns tubos haverá formação de uma coloração violeta, característica de reação
positiva, enquanto que no tubo contendo apenas água e os reagentes verificar-se-á uma cor azul
escura característica do cobre em meio alcalino (formação de Cu (OH)2 e de óxidos de Cu).

IV – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

4.1 – Reações de Precipitação de Proteínas com Desnaturação

4.1.1 – Termocoagulação – Coagulação pelo calor

As proteínas são termolábeis, quando submetidas à ação do calor desnaturam

irreversivelmente.

Procedimento
• Colocar em tubos de ensaio soluções contendo proteínas (ovo, soro, etc);
• Aquecer, e observar a coagulação.

4.1.2 – Coagulação com ácidos minerais – Reação de Heller

Fundamento
Os ácidos minerais fortes desnaturam as proteínas, transformando-as em metaproteínas,
insolúveis. A reação de Heller (reação de proteínas com HNO 3 concentrado) é freqüentemente
utilizada para a pesquisa de albumina na urina e permite a dosagem semi-quantitativa. Esta
reação é sensível a concentração da ordem 1:30.000.

Procedimento Experimental
***OBSERVAÇÃO: Para que se garanta a segurança, o experimento a seguir deverá ser efetuado
na capela, pelo professor, de maneira demonstrativa.

Colocar um tubo de ensaio:

• 2 mL de solução protéica
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• Juntar cuidadosamente e vagarosamente, pelas paredes do tubo, 2 mL de HNO3 concentrado,

sem misturar. Observar no limite de separação das duas camadas um anel branco (proteína e
meta-proteína).

4.1.3 – Precipitação com Sais de Metais Pesados

Alguns sais de metais pesados precipitam as proteínas, por exemplo: HgCl2, AgNO3
CuSO4, FeCl3, (CH2COO)2Pb (acetato de chumbo), etc. Outros somente precipitam proteínas em
meio ácidos. Por exemplo: Na2WO4 (tungstato de sódio).

Procedimento A
Tubo Solução Protéica - mL CuSO4 0,5% FeCl3 1% (CH2COO)2 Pb 1%
1 2
2 2 *gotas
3 2 *gotas
4 2 *gotas
* Adicionar gotas das soluções de metais pesados à solução protéica, até observar a formação de
precipitado.

Procedimento B
Colocar em um tubo de ensaio:
• 2 mL de solução protéica;
• 1 mL de solução de Na2WO4 10%
• Agitar. Notar que não ocorre precipitação;
•
Então Juntar:
• 0,5 mL de H2SO4 10%. Forma-se imediatamente um precipitado.

Esta reação é utilizada em análises clínicas para desproteinização de sangue (método de

Follin – Wu), quando os métodos de dosagens de Glicose, Uréia, Creatinina, assim o exigem.
Interprete os resultados observados.

4.1.4 – Precipitação com Solventes Orgânicos

Colocar em tubo de ensaio:

• 2 mL de solução protéica;
• 1 mL de etanol.

Notar a formação de um anel branco na separação das camadas.

4.1.5 – Precipitação por reagentes alcalóides

Os reagentes alcalóides (ácido pícrico, cítrico, tânico, etc...), agem pelo seu âniom e
reagem com as proteínas formando sais (proteinados) insolúveis. Esta reação só é possível se a
proteína apresentar carga positiva, portanto, no lado ácido do seu pI. Quando adicionamos base,
re-dissolve o precipitado formado.

Reação de Esbach
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Procedimento Experimental
Colocar em tubo de ensaio:
• 2 mL de solução protéica;
• 1 mL do reativo de esbach (ácido pícrico – 1,0g / ácido cítrico – 2,0g em 100 mL de H 2O).
Forma-se um precipitado amarelo.
• Juntar:
• 1 mL de NaOH 10%. Observar a dissolução do precipitado. Explicar.

ENZIMAS I
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Objetivos Específicos
Ao final deste trabalho prático o estudante deverá saber:
• Manipular experimentalmente soluções de enzimas;
• Identificar experimentalmente as propriedades de termolabilidade e especificidade;
• Manipular reações catalisadas por enzimas com a finalidade de determinar
semiquantitativamente a influência da concentração de enzima, temperatura e do pH na
atividade enzimática.

Procedimento Experimental

1. Atividade da Catalase

Enzima presente em quase todas as células animais.

a. Em um tubo de ensaio colocar:

• 10 gotas de sangue
• 5 mL de água destilada – homogeneizar
• 1 mL de H2O2 3% (10 volumes) – agitar

b. Note a formação de espuma abundante. Procure uma explicação para o fato. Esquematize a
reação ocorrida.

2. Atividade da Peroxidase

A peroxidase é uma enzima encontrada em todas as plantas superiores, sendo rara em

tecidos animais. As exceções são leucócitos, hemácias, fígado e rins.

a. Colocar em dois tubos de ensaio:

Tubos Reativo Kastle-Meyer Água - mL Sangue diluído - mL H2O2 3% gotas

1 1,0 - 5,0 3
2 1,0 5,0 - 3

b. Note o aparecimento imediato de cor rosa, que se intensifica, lentamente, no tubo que
contém sangue.
OBS.: O reativo de Kastle-Meuer é uma solução alcalina de fenolftaleína reduza (AH 2), que oxida
diidroxifenóis na presença de H2O2, formando a quinona correspondente. Não sendo oxidada pelo
peróxido de hidrogênio (H2O2), nem pelo oxigênio molecular (O2). O sangue contém peroxidase,
que transfere dois átomos de hidrogênio do substrato (AH2) para H2O2, que é convertido em H2O,
oxidando assim a fenolftaleína, que adquire coloração rósea, em meio alcalino.

AH2 + H2O2 → 2H2O + A+

Fenolftaleína reduzida Fenolftaleína oxidada

IDENTIFICAÇÃO DE CARBOIDRATOS
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Introdução
Os carboidratos podem ser identificados por meio de várias reações. Algumas dessas
reações envolvem a formação de complexos corados, e a especificidade da identificação depende
da estrutura dos carboidratos. Assim, há reações gerais e outras para estruturas mais específicas,
como aquelas, para aldoses, cetoses, mono e dissacarídeos redutores, etc.

Objetivos Específicos

No final deste trabalho prático, o estudante deverá saber:

• Executar testes qualitativos para reconhecimento de carboidratos

• Significado dos seguintes testes: Molisch, Barfoed, Seliwanoff e Benedict.

1. Reação de Molich

Os carboidratos e algumas substâncias, que se transformam em furfural ou seus derivados

na presença de H2SO4, reagem com alta naftol, formando compostos de condensação, de cor
violeta, e de estrutura incerta. Abaixo estão representadas as reações de formação de furfural e de
hidroximetilfurfural, respectivamente a partir de uma pentose e de uma hexose.

O
O C
H α -naftol
C5H10O 5 + H2SO 4 Composto violeta
furfural

O
HOH2C O C
H α -naftol
C6H12O 6 + H2SO 4
Composto violeta
hidroximetilfurfural

Procedimento experimental
Preparar os seguintes 8 tubos de reação:

Tubos Amostra Volume mL Alfa-naftol 5% em etanol gotas

1 Água 1,0 3
2 Glicose 0,1 M 1,0 3
3 Frutose 0,1 M 1,0 3
4 Sacarose 0,1 M 1,0 3
5 Amido 0,1% 1,0 3
6 Maltose 0,1% 1,0 3
7 Aspartame 0,2%” (*) 1,0 3
8 Ciclamato/sacarina 1,0 3

Pela parede do tubo inclinado, adicionar lentamente, sem agitar, 2 mL de h2SO4

concentrado (CUIDADO CORROSIVO!!!). Anotar os resultados, usando o tubo 1 (branco, controle)
como referência.
( *) Aspartame = L – aspartil-L –fenilalanina – metil – éster.

O teste de Molisch serve para identificar carboidratos. Estes, pela ação desidratante do
ácido sulfúrico, transformam-se em furfural no caso de pentoses, ou hidroximetilfurfural no caso de
hexose. Estes, por sua vez, reagem com os fenóis (timol, natol), dando origem a um composto de
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cor roxa. A coloração verde que às vezes se forma, deve ser desprezada. Para o bom êxito desta
reação é necessário que o tubo esteja seco, e que haja a menor agitação possível.

2. Reação de Barfoed

Através desta reação se distingue um mono de um dissacarídeo, pela velocidade com que
se forma Cu2O, a partir da reação entre acetato cúprico e o carboidrato. Oreativo de Barfoed oxida
os monossacarídeos ( a mono-ácidos ) mais rapidamente que os dissacarídeos permitindo,
portanto, a diferenciação entre ambos ( mon e dissacarídeos ).

Cu+2 (aq) + CH3COO- (aq) + carboidrato → Cu2O (prec.) + CH3COO- (aq) + carboidrato oxidado

3. Reação de Seliwanoff

Na presença de HCl, as cetoses, mais rapidamente do que as aldoses, formam derivados

de furfural que se condensam com o reagente de Seliwanoff, que contém resorcinol (1,3 –
bezenodiol), produzindo compostos avermelhados. A reação exige aquecimento em banho
fervente, e é positiva também para sacarose que, nas condições do teste, é hidrolisada em glicose
e frutose. Mesmo a glicose pode dar reação positiva, se o aquecimento for prolongado, porque na
presença de HCl, ocorre a sua transformação em frutose. A concentração do HCl na reação não
deve ultrapassar 12 % (aproximadamente 4 N).
A reação que ocorre é a seguinte:

O
Aquecimento O C
Cetose + HCl H resorcinol
Composto violeta
furfural

Procedimento experimental
Preparar 5 tubos de ensaio:

Tubos Amostra Volume mL Seliwanoff (Resorcinol 0,05 % em HCl 2 N)

1 Água
2 Frutose 0,1 M
3 Glicose 0,1 M
4 Sacarose 0,1 M
5 Pentose 0,1 M
1 1,5
1 1,5
1 1,5
1 1,5
1 1,5

Após misturar o conteúdo dos tubos, colocar em banho de água fervente, e acompanhar o
desenvolvimento da cor a cada 2 ou 3 minutos, até no máximo 15 minutos.
Quando notar o aparecimento da cor vermelha acompanhada ou não de precipitado de cor
marrom avermelhado, retirar o tubo do banho. Para dissolver o precipitado eventualmente formado,
acrescente algumas gotas de etanol absoluto, agitando o tubo. Anotar os resultados obtidos,
lembrando-se sempre de usar o tubo 1 (controle) como referência.

4. Reação de Benedict

Utilizada para identificação de carboidratos redutores. Íons de metais como, cobre, prata,
ferro, mercúrio, etc, são reduzidos por grupos aldeídos ou cetônicos livres de vários carboidratos.
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Colocando-se hidróxido de cobre II, Cu (OH)2, de cor azul, em meio alcalino, forma-se uma
suspensão que, sob aquecimento, se precipita como óxido de cobre II, CuO de cor preta. Mas se
compostos redutores forem acrescentados à suspensão, o Cu (OH)2 é reduzido a Cu2O, que se
precipita e cuja cor se situa entre o amarelo e o vermelho. As reações abaixo mostram o que
ocorre o Cu (OH)2 na presença e na ausência de agentes redutores, em meio alcalino e a quente.

Ausência de composto redutor:

Meio alcalino
Cu(OH)2 CuO + H2O
(azul) Aquecimento (preto)

Presença de composto redutor:

Meio Alcalino
Cu (OH)2 Cu2O + H2O
(azul) Aquecimento (amarelo/vermelho)

Como não é prático utilizar uma suspensão de Cu2+, e também para evitar que o CuO
(preto) mascare o resultado da reação, acrescenta-se ao meio da reação um composto orgânico
solubilizador que, em meio alcalino adequado, reage com os íons metálicos, formando um
complexo iônico solúvel. Este complexo se dissocia em grau suficiente para que haja, nomeio da
reação, íons metálicos disponíveis para se reduzirem. No caso do reagente de Felihling, emprega-
se CuSO4 à 2%, solubilizado por tartarato de Na + e de K+ 10%, dissolvido em NaOH 2 M; no caso
de reagente de Benedict (qualitativo), emprega-se CuSO4 2% solubilizado por citrato de Na+ 20%,
dissolvidos em Na2CO3 2 M.
Os testes de carboidratos redutores são positivos para compostos com grupamento – OH
glicosídico livre, mas negativos para polímeros de cadeias longas. Assim, amido não dá reação
positiva, a não ser após a sua hidrólise, e a reação é tanto mais positiva quanto maior a extensão
da hidrólise.
Até alguns anos atrás, o teste de substâncias redutoras, sobretudo na urina, era
empregado no diagnóstico de pacientes diabéticos, ou suspeito de sê-lo, de modo rotineiro.
Atualmente, há testes mais sensíveis para dosagem rápida de glicose, baseadas em ensaio
enzimático (glicofita/glicose-oxidase) e que são muitos mais práticos, por não exigirem a
disponibilidade dos reagentes mencionados.

Procedimento experimental

Identificação de substâncias redutores com reagentes de Benedict (qualitativo)

Preparar 9 tubos de ensaio:
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´Tubo Amostra Volume mL Reagente de Benedict Resultado

1 Água 1,0 1,0
2 Glicose 0,1 M 1,0 1,0
3 Frutose 0,1 M 1,0 1,0
4 Sacarose 0,1 M 1,0 1,0
5 Amido 0,1% 1,0 1,0
6 Maltose 0,1 M 1,0 1,0
7 Aspartame 0,2% 1,0 1,0
8 Ciclamato/Sacarina 1,0 1,0
9 Urina humana 1,0 1,0

Aquecer todos os tubos em banho de água fervente , durante 5 minutos. Anotar os

resultados obtidos (se positivo, numa escala de 1 a 4 cruzes, + a ++++), comparando com o tubo 1
(controle). Explique os resultados.

IDENTIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS
Objetivos Específicos
No final deste trabalho prático o estudante deverá saber:
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1. Extrair grãos de amido de batata

2. Preparar soluções de amido
3. Reconhecer a presença de amido pelo teste de iodo – Lugol
4. Realizar a hidrólise química do amido
5. Determinar a progressão de hidrólise pelos testes de iodo e Benedict
6. Reconhecer os produtos de hidrólise parcial e total de amido
7. Extrair e caracterizar o glicogênio hepático
8. significado das reações e operações realizadas

I. Extração e identificação do amido

O amido não pode ser detectado pelos testes de redução, porque dispõe de um número
muito reduzido de resíduos de glicose livre, para determinação da atividade redutora. Na estrutura
do amido, a cadeia linear é constituída por resíduos de glicose ligados entre si por ligações α
(1,4), enquanto na cadeia ramificada ocorrem ligações α (1,4) e α (1,6). A cadeia linear (amilose)
é solúvel e a cadeia ramificada (amilopectina), insolúvel. O amido da batata é constituído por 98%
de amilose e 2% de amilopectina.
Na presença de iodo, o amido forma um complexo de cor azulada, de composição incerta.
Esse complexo se desfaz sob aquecimento, perdendo a cor azul, mas é refeito quando é resfriado.
A celulose, também um polímero de glicose, mas constituído de ligações β (1,4) não reage com
iodo, enquanto o glicogênio, à semelhança do amido, reage formando um complexo de cor
avermelhada. Também, à semelhanç do amido, o glicogênio é formado por ligações de tipo α (1,4)
e α (1,6).

Procedimento experimental
A. Extração do amido
1. Raspar integralmente uma batata, com uma lâmina de vidro, transferindo as raspas para um
béquer de 250 mL
2. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro
3. Filtrar em gaze, recolhendo o filtrado em um béquer de 500 mL. Espremer a gaze
4. Extrair novamente o amido da raspa com 50 mL de água, filtrando em gaze e recolhendo o
filtrado no béquer de 500 mL
5. Deixar o amido se depositar no béquer aproximadamente 20 minutos
6. Descartar, cuidadosamente, o líquido sobrenadante.

B. Preparação da solução de amido

1. Colocar aproximadamente 25 mL de (amido) completo para 50 mL (água quente)
2. Adicionar aproximadamente 50 mL de água destilada fria ao deposito de amido, obtido em A.6
3. Adicionar esta última suspensão à água em ebulição, lentamente, sob constante agitação
4. Continuar o aquecimento até que se forme uma solução opalescente em banho-maria, fervente
5. Utilizar esta solução para as experiências subsequentes

C. Detecção do amido – reação com Lugol

Tubos Amostras Quantidades mL Lugol (iodo 5% em KI 10%) gotas Resultado
1 Água 1,0 2
2 Amido obtido em B 1,0 2
3 Maltose 0,1% 1,0 2
4 Celulose 1,0 2
5 Glicose 0,1 M 1,0 2
 17

6 Sacarose 0,1 M 1,0 2

Aquecer em banho de água fervente, durante 1 a 2 minutos, os tubos que

dissolveram cor com Lugol. Observar. Resfriar. Observar novamente. Anotar os resultados,
usando sempre o tubo 1 (controle) como referência.

D. Hidrolise ácida do amido

A estrutura polimérica do amido pode ser desfeita por hidrólise das suas
ligações glicosídicas. Fisiologicamente, o amido é hidrolisado enzimaticamente
pela amilase salivar e pela amilase pancreática. Quimicamente, obtém-se
resultado semelhante empregando-se HCl concentrado, à quente.
Durante a hidrólise do amido são formados compostos intermediários, de
cadeias de glicose de tamanhos variáveis, e no final do processo obtém-se uma
mistura de glicose e maltose.

Procedimento experimental:
Transferir 25 mL de amido para um elenmyer e adicionar 1 mL de HCl
concentrado, aquecer em banho maria fervente por 30 minutos.
Sendo que deve retirar, logo que adiciona o HCl, 1 mL da solução e
transferir 0,5 mL para um tubo e 0,5 mL para outro tubo de ensaio. Adicionar em
um dos tubos 3 gotas de lugol, observar a coloração, e no outro adicionar 1 mL do
reativo de Benedict e aquecer em banho maria fervente, observar a coloração.
Repetir o processo em intervalos de 5 a 5 minutos.

Amido amido solúvel + maltose

Eritrodextrina + maltose

Acrodextrina + maltose

Maltose

Glicose

EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPÍDEOS

I. Extração de lipídeos de semente se soja

Procedimento experimental
a. Extração
• Em copo de 100 mL pesar 10 g de soja moída e seca
 18

• Adicionar 25 mL de álcool
• Agitar por 5 minutos
• Filtrar através de papel de filtro, para um béquer
• Lavar o resíduo com 10 mL de álcool por duas vezes
• Evaporar o filtrado em banho de areia, com agitação constante até diminuição total do álcool
• Observar o resíduo amarelo e oleoso. Esse óleo será utilizado como material para as provas
seguintes.

b. Caracterização
1. Solubilidade
Em uma bateria de 9 tubos de ensaio numerados, colocar 3 gotas de óleo
vegetal em cada um e adicionar 3 mL de:
1º- Água
2º- HCl a 4%
3º- Na2CO3 a 2%
4º- NaOH a 10%
5º- Etanol
6º- Éter Sulfúrico
7º- Clorofórmio
8º- Benzeno
9º- Acetona

Agitar vigorosamente e verificar:

a) Insolubilidade no 1º e 2º tubos
b) Emulsão estável nº 3 e 4
c) Solubilidade parcial no tubo nº 5 que se torna total pelo aquecimento
d) Solubilidade total no demais tubos.

Juntar mais 20 gotas de óleo nos tubos contendo:

• Éter
• Clorofórmio
• Benzeno
• Acetona
Observar a grande solubilidade do óleo nesses solventes.

I – DOSAGEM DE GLICOSE
Vários métodos foram propostos para a determinação de glicose. No início, era utilizado o
seu poder redutor, várias técnicas neste sentido foram desenvolvidas. Os oxidantes mais
empregados foram os íons cobre e os íons ferricianeto; ambos, em meio alcalino. Naturalmente,
estes métodos sofrem interferências de outros agentes redutores, presentes na amostra, o que
determina a falta de especificidade para a análise em questão.
Outros métodos, aonde a glicose reage diretamente com certas substâncias orgânicas,
foram desenvolvidos. Destas substâncias, a ortotoluidina é a mais utilizada.
 19

Posteriormente, os métodos enzimáticos foram surgindo e colocados em prática. Como

exemplo, podemos citar o método de glicose-oxidase e o método da hexoquinase.

1 – MÉTODO DA ORTOTOLUIDINA

A glicose reage especificamente com a ortotoluidina, a quente e em presença de ácido

acético glacial, produzindo uma mistura, em equilíbrio, uma glicosilamina e a correspondente base
de Schiff. A intensidade da cor é medida, fotometricamente.

AMOSTRA
Soro, plasma, urina, líquor e outras. O soro deve ser colhido em jejum e livre de hemólise.

REATIVOS
A – Reativo cromogênico
Num frasco de 2.000 mL, colocar 1 g de tiouréia, acrescentar 940 mL de ácido acético
glacial e 60 mL de ortotoluidina. Misturar até completa dissolução e guardar em frasco escuro. A
temperatura ambiente, é estável por 12 meses e, em geladeira, por 24 meses.

B – Solução padrão de glicose

Pesar, exatamente, 1 g de glicose e dissolver em 800 mL de água destilada. Adicionar 1 g
de ácido benzóico e diluir com água destilada até completar 1.000 mL. Estável por um ano, quando
conservada em geladeira.

Procedimento
a. Tomar 3 tubos, e proceder como a seguir:
Branco Amostra Padrão
Água destilada 0,05mL - -
Soro - 0,05 mL -
Padrão - - 0,05 mL
Reativo cromogênico 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL
Misturar e colocar os tubos, em banho fervente, durante 10 minutos. Esfriar em água
corrente por 2 a 3 minutos e ler as absorvâncias, em 630 nm.

CÁLCULO
Glicose (mg/dL) + Absorvância da amostra / Absorvância do padrão x 100

NOTAS
a. A urina e o líquor podem seguir a metodologia direta para o soro ou plasma.
b. A hemoglobina até 350 mg/dl e a bilirrubina até 20 mg/dl não interferem no método sem
desproteinização. Quantidades maiores dão erros positivos.
c. A lactose e a galactose, presentes em casos de gravidez e durante a lactação ou em casos raros
de galactosemia infantil, podem reagir com a ortotoluidina, manose também.
d. É importante o uso de ortotoluidina, a mais incolor possível. A adição de tiouréia como
antioxidante confere ao reativo uma cor ligeiramente amarelada. A absorbância desta solução
frente a um branco de ácido acético não deve ser superior a 0,015
e. É recomendaável não desproteinizar com ácido perclórico. O resfriamento, em água muita fria,
pode provocar turvação.
f. A reação segue a lei de Beer até 1.500 mg/dl. Quando os valores forem maiores que 300 mg/dl,
diluir a solução final com reativo de cor, efetuar novamente as leituras e calcular, multiplicando o
resultado final pelo fator de diluição, até 1.500 mg/dl.
 20

g. Somente os métodos do ortotoluidina e da hexoquinase fornecem resultados exatos para a

glicose urinária, em concentrações inferiores a 0,2 g/dl.

VALORES DE REFERÊNCIA
Soro e plasma – 70 a 110 mg/dL
Sangue total – 60 a 100 mg/dL
Líquor – 40 a 70 mg/dL
Urina – até 30 mg/dL ou até 0,25 g/24 horas.

2 – GLICOSE ENZIMÁTICA

Finalidade
Sistema enzimático para a determinação de Glicose no sangue, líquor e líquidos ascíticos,
pleural e senovial em método cinético. Somente para uso diagnóstico in vitro.
 21

Princípio
A glicose oxidase catalisa a oxidação da Glicose de acordo com a seguinte reação:

GOD
Glicose + O2 + H2O Ácido Glucônico + H2O2

H2O2 formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da peroxidase,
através de uma reação oxidativa formando um antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de
cor é proporcional à concentração da glicose na amostra.

POD
2H2O2 + 4 – Aminoantipirina + fenol Antipirilquinonimina + 4H2O

REAGENTES
Enzimas – conservar entre 2 – 8 ºC
Tampão – Conservar entre 2 – 8 ºC. Tampão fosfato – pH 7,4
Padrão – 100 mg/dl – Estável entre 15 – 25 ºC. Após o manuseio armazenar, bem vedado, entre 2
– 8 ºC, para evitar evaporação.

INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Ácido ascórbico em concentrações acima de 100 mg/L interferem na reação diminuindo os
resultados.
Nas 24 horas que sucedem à ingestão aguda de álcool, ocorre significativa redução na
glicemia. As reduções podem também ser significativas nos indivíduos submetidos a jejum
prolongado ou em obesos tratados com dieta com baixo valor calórico.

AMOSTRA
A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo 8 horas ou de acordo com
recomendação médica.
Usar plasma ou soro tomando as precauções a seguir. Realizar a colheita do sangue
utilizando um anticoagulante contendo um inibidor da glicólise. As amostras de sangue não
contendo um antiglicolítico, devem ser centrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ou
soro, separados das células ou coágulo. O mesmo procedimento deve ser realizado na colheita de
líquor e líquidos ascítico, pleural e senovial.
Nas amostras com antiglicolítico, a concentração da glicose permanece estável por até 24
horas. No plasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicose permanece estável por 3
dias entre 2 – 8 ºC, quando não ocorre contaminação bacteriana.

INTERFERÊNCIAS
Bilirrubina até 16 mg/dL, Hemoglobina até 160 mg/dL e Triglicérides até 750 mg/dL não
produzem interferências significativas.

PROCEDIMENTO
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Branco Teste Padrão

Amostra - 0,02 mL -
 22

Padrão - - 0,02 mL
Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL

Misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 ºC durante 15 minutos. Determinar

as absorvâncias do teste e padrão em 505 nm. A cor é estável por 60 minutos.

CÁLCULOS

Glicose (mg/dL) = Absorvância do teste x 100 / Absorvância do padrão

LINEARIDADE
A reação é linear até 400 mg/dl. Diluir a amostra com NaCl mol/L (0,85%), dosar
novamente e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.

VALORES DE REFERÊNCIA
Plasma: 70 a 110 mg/dL
Líquor: 2/3 da glicemia – em amostras colhidas simultaneamente.

SIGNIFICADO CLÍNICO
Valores elevados ocorrem nos vários tipos de diabetes primárias, nos estados de
intolerância à glicose e nas diabetes secundárias a várias doenças (hipertiroidismo,
hiperpituitarismo, hipoadrenocorticismo, etc).
Valores diminuídos ocorrem nas hipoglicemias que podem ser devidas a várias causas.
Quando a ocorrência de sintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duas formas de
hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia do jejum e pós-prandial.
Causas mais comuns de hipoglicemia do jejum: hiperinsulinismo, tumores
extrapancreáticos, síndrome auto-imune (formação espontânea de anticorpos para receptores da
insulina), insuficiência supra-renal e/ou hipofisária, doença hepática grave e alcoolismo.
A hipoglicemia pós-prandial é classificada em hipoglicemia alimentar, hipoglicemia do
diabético tipo II e do paciente com intolerância à glicose.
A redução da concentração de glicose nos líquidos corporais encontra-se relacionada a
processos inflamatórios ou infecciosos. A concentração de glicose no líquor representa um dos
parâmetros para a distinção entre meningite bacteriana e virótica.

OBSERVAÇÕES

• A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatores fundamentais para a

estabilidade dos reagentes e obtenção de resultados corretos
• A água utilizada na limpeza do material deve ser de boa qualidade
• A urina contém numerosas substâncias, principalmente o ácido úrico, que
interferem nos métodos utilizando a reação GOD-POD levando a resultados
falsamente diminuídos.

COLESTEROL

Principio
O colesterol no soro é quantificado através das seguintes reações
enzimáticas:
 23

1. ésteres de colesterol col. esterase colesterol livres mais ácidos graxos

2. colesterol livre + O2 col. esterase colesterona + H2O2

3. 2 H2O2 + 4 aminoantipirina + p-hidroxibenzoato peroxidase 4 -

antipirilquinonimina + 4 H2O

Amostra
Soro ou plasma isentos de hemólise (anticoagulante - heparina).
Jejum de 12 a 16 h. Amostra quando refrigerada de 2 a 8ºC se conserva por 7
dias, se mantida a 10ºC conserva-se por 3 meses.O uso de anticoagulantes como:
citrato, EDTA e Oxalato, provocam resultados ligeiramente diminuídos.

Procedimento
Identificar três tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao)
B T P
Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Solução padrão - - 20 µ L
Amostra - 20 µ L -

Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC.

retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em
espectrofotômetro em 510 nm zerando o aparelho com o branco.

Calculo
absorvancia do teste
Colesterol (mg/dL) = ---------------------------- x 200
absorvancia do padrao

Valores de referencia

Em termos estatísticos, na população brasileira, em ambos os sexos, os

níveis de colesterol situam-se na faixa de 150 – 240 mg/dL.
 24

Colesterol (mg/dL)
Desejável < 200
Risco moderado 200 – 239
Alto risco (DCI) > 240

TRIGLICERIDES

Principio
Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintes reações:
 25

Triglicéride lípase da lipoproteína glicerol + acido graxo

Glicerol + ATP glicerolquinase Mg+2 glicerol - 3 - fosfato + ADP

Glicerol - 3 - fosfato + O2 glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2

oxidase
2 H2O2 + 4 aminoantipirina + ESPAS peroxidase quinoneimina + 4 H2O

Amostra
A amostra deve ser obtida após jejum de 12 a 14 h. Soro. O analito e
estável por 2 - 8ºC. O armazenamento prolongado da amostra não e
recomendado porque varias substancias podem ser hidrolisadas liberando glicerol,
levando a obtenção de resultados falsamente elevados.

Procedimento
Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir
Branco Teste Padrão
Amostra - 0,01 mL -
Padrão - - 0,01 mL
Reagente de cor 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. O nível da água

do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar
as leituras das absorvancias do padrão e do teste em espectrofotômetro em 540
nm.

Calculo
absorvancia do teste
Triglicérides (mg/dL) = ---------------------------- x 200
absorvancia do padrao

Valores de referencia

Triglicérides
Desejável < 200
Limiar alto 200 – 400
Elevado 400 – 1000
 26

Muito elevado > 1000

LDL - COLESTEROL

Fundamento

As lipoproteínas de baixa densidade (LDL ou β -lipoproteínas) separam do

soro, pecipitando-as seletivamente pela adição de polímeros de alto peso
 27

molecular. Após centrifugar, no sobrenadante fica o resto de lipoproteínas (HDL e

VDL); o colesterol ligado às mesmas determina-se utilizando o sistema enzimático
Colesterol oxidase/peroxidase com colorimetria segundo Trinder (Fenol/4-AF).
Pela diferença obtida entre o colesterol total e o determinado no
sobrenadante, obtém se o colesterol ligado as LDL.

Amostra
Soro
a) Coleta: o paciente deve estar em jejum (de 12 a 16 h)
b) Aditivos: não são necessários
c) Substâncias interferentes conhecidas: os soros hipertrigliceridemicos (com
quilomicrons) produzem sobrenadantes turvos; a bilirrubina interfere nos
níveis maiores de 50 mg/L

Procedimento

Em um tubo de Kahn, colocar:

Amostra 200 µ L
Reagente precipitante 100 µ L
Homogeneizar agitando (sem inverter) durante 20 segundos e deixar 15 minutos no
banho Maria a 20-25ºC. Centrifugar 15 minutos a 3000 rpm. Separar rapidamente o
sobrenadante. Vide limitações do procedimento. Utilizar o sobrenadante como
amostra para o ensaio colorimetrico.
Em três tubos de fotocolorimetros marcados B (branco), P (padrão) e D
(desconhecido), colocar:
B P D
Sobrenadante - - 100 µ L
Padrão - 20 µ L -
Reagente de 2 mL 2 mL 2 mL
trabalho
Misturar e incubar 5 minutos a 37ºC quando seja utilizado o reagente de trabalho
de Colestat enzimático AA/liquida ou 15 minutos a 37ºC quando seja utilizado
aquele de Colestat enzimático. Tirar do banho Maria e esfriar. Ler em
espectofotometro a 505 nm.

Calculo do resultado

LDL colesterol (g/l) = colesterol total (*) – (D x f)

f = 0,624
P
(*) valor obtido com Colestat enzimático ou Colestat enzimático AA liquida.
 28

Valores esperados

Risco baixo ou nenhum (pessoas normais): menores de 140 mg/dL

Risco moderado (pessoas com probabilidade de contrair ECC): entre 140 e
190 mg/dL
Risco elevado (pessoas suspeitas de ter ECC): acima de 190 mg/dL

HDL COLESTEROL

Principio
Lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e muita baixa densidade (VLDL),
são precipitadas seletivamente por polietilenoglicol tamponado. No sobrenadante,
resta apenas a fração de alta densidade HDL. O teor de colesterol da fração HDL
 29

e determinado pelo sistema enzimático colesterol 250 Dolis/colesterol enzimático

liquido Dolis.

Amostra
Soro. Estável por 4 dias, sob refrigeração de 2-8ºC. Após a precipitação, o
sobrenadante, permanece estável por 15 dias se mantido a - 20ºC. o paciente
deve estar em jejum obrigatório de 12 h.

Procedimento
Identificar três tubos com B (branco), T (teste) e P (padrao)
B T P
Reagente de cor 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Solução padrão - - 50 µ L
Sobrenadante - 50 µ L -

Misturar por agitação e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC.

retirar do banho Maria e efetuar as leituras das absorvancias de P e T em
espectrofotômetro em 510 nm, zerando o aparelho com o branco.

Calculo
Absorvancia do teste
Colesterol HDL (mg/dL) = ---------------------------- x 50 x 2
Absorvancia do padrao

Valores de referencia
desejável risco moderado Alto risco
Col. LDL(mg/dl) < 130 130 - 159 > 160
Col. HDL fem (mg/dl) > 65 45 - 65 < 45
Col. HDL masc (mg/dl) > 55 35 – 55 < 35

ÁCIDO ÚRICO

Principio

O ácido úrico e determinado de acordo com as seguintes reacões:

 30

Ácido úrico + O2 + H2O uricase alantoina + CO2 +H2O2

2 H2O2 + DHBS + 4 – aminoantipirina peroxidase antipirilquinonimina + 4 H2O

Amostra
Usar soro, úrina e líquidos (aminiotico e sinovial). O analto e estável por 3
dias entre 2 – 8ºC e por 6 meses a –10ºC.

Procedimento
Tomar três tubos de ensaio e proceder como a seguir :
Branco Teste Padrão
Amostra - 0,02 mL -
Padrão - - 0,02 mL
Reagente de trabalho 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Misturar e incubar por 10 minutos em banho Maria a 37ºC. O nível da água

do banho deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio. Efetuar
as leituras das absorvancias de padrão e do teste em espectrofotômetro em 520
nm.

Calculo
absorvancia do teste
Ácido úrico (mg/dL) = ---------------------------- x 6
absorvancia do padrao

Valores de referencia

Acido úrico (mg/dl)

Soro: homens 2,5 a 7,0
Soro: mulheres 1,5 a 6,0
Urina 250 a 750 por 24 h

PROTEINAS TOTAIS - PP

Fundamento
As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos
em meio alcalino (reagente do biureto), formando um complexo de coloração
violeta, cuja absorbância medida em 545 nm e diretamente proporcional a
concentração de proteína na amostra.
 31

Amostra
Soro ou plasma (heparinizados). O analito e estável por 8 dias entre 2-8ºC.

Procedimento
Pipetar em tubos de ensaio identificados:
Tubos Branco Teste Padrão
Água destilada 20 µ L - -
Amostra - 20 µ L -
Padrão - - 20 µ L
Biureto 1000 µ L 1000 µ L 1000 µ L

Agitar bem e deixar os tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Ler absorbância do padrão e do teste, zerando o aparelho com o branco em
545 nm.

Calculo

O calculo pode ser efetuado através do Fator de Calibração.

Cp
Fc = -------
Ap

Ct = Fc x At, onde:

Cp = concentração do padrão
Ct = concentração do teste
Ap = absorbância do padrão
At = absorbância do teste

Valores de referencia

Proteínas totais
Soro 6,0 a 8,0 g/dL
Plasma 6,8 a 8,3 g/dL