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24-08-2009

Conceptos básicos
 Definición de enzimas
 Fuentes de enzimas
 Campos de aplicación enzimas
 Clasificación de las enzimas
 Cinética enzimática
 Sitio activo y actividad enzimática
 Parámetros cinéticos
 Inhibición enzimática

Enzimas

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Qué son la enzimas


 Las enzimas son proteínas que catalizan las reacciones
bioquímicas.
 Estructura 3aria o 4aria Función biológica
 Las enzimas son CATALIZADORES ORGANICOS
 Intervienen en una gran cantidad de reacciones del
metabolismo de células, tejidos y órganos
 Catalizan reacciones químicas necesarias para la
sobrevivencia celular: metabolismo de los hidratos de
carbono, proteínas, aa, lípidos, ácidos nucleicos, etc.
 Las enzimas pueden actuar dentro de la célula, fuera de
ésta y en el tubo de ensayo

Las enzimas catalizan la reacción bajando la energía


requerida para pasar de sustrato a producto

REACCION NO CATALIZADA
El agua no es capaz de pasar
sobre la montaña

ENERGIA DE
ACTIVACIÓN

REACCION CATALIZADA: Las olas


pasan sobre la montaña

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Sin enzima
Con enzima

E+S • La Ea de la hidrólisis de la urea


baja de 30 a 11 kcal/mol con la
acción de las enzimas,
acelerando la reacción 1014 x
• El aumento de temperatura
E+P necesario para producir la
reacción no catalizada seria de
Tiempo de la reacción 529ºC

Algunos aumentos de actividad producidos


por el uso de enzimas

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Enzima vs Catalizador
 Tanto la enzima como el catalizador aceleran la
velocidad de una reacción química.

 Una enzima puede transformar 1000 moléculas de


sustrato/ segundo

 Las enzimas tienen 3 propiedades que los


catalizadores NO tienen:
 Especificidad por el sustrato

 Se inactivan por desnaturación

 Pueden ser reguladas

FUENTES DE ENZIMAS
 Las enzimas pueden ser de origen vegetal, animal y
microbiana.
 Entre las enzimas de tipo vegetal, se encuentran las proteasas,
carbohidrasas ( las cuales descomponen residuos de azúcares
de carbohidratos superiores, amilasas y -amilasa
 Entre las enzimas de tipo animal están las esterasa ( Lipasa se
produce en la mucosa gástrica, el páncreas, fosfotasas: Se
obtiene de tejidos animales óseo, muscular, tripsina y
quimotripsina se produce en el páncreas )
 Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias,
arqueas y de hongos.

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Uso industrial de las enzimas


 Química fina y farmacéutica
 Química de alimentos
 Química analítica
 Descontaminación
 Nuevas fuentes de energía

Enzimas en la industria de alimentos


 modificación química, selectiva, especifica
 hidrólisis de almidón ---- jarabe de fructosa
 hidrólisis de lactosa en leche
 producción de quesos (hidrólisis de k-caseína )
 hidrólisis de glicosil derivados ( aromas en vinos )
 modificación de grasa y aceites ( interesterificacion )
 mejora de procesos de extracción ( aceites )
 aprovechamiento de residuos agrícolas
 producción de aditivos alimentarios
 liberación de productos de alto valor añadido ( glicosidasas )
 análisis de alimentos - biosensores ( electrodos enzimáticos)

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Clasificación de las enzimas

 Comisión de Enzimas (EC) de la IUPAC


 Se basa en el tipo de reacción que
catalizan
 Comprende cuatro dígitos y un nombre
complejo

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Nombre sistemático: Grupo transferido

ATP: hexosa fosfotransferasa


Donador Aceptor Tipo de reacción catalizada

Número EC

Enzyme EC 2.7.1.1
Comission Subgrupo
Grupo

Nombre común (sustrato+”asa”): Hexokinasa

Clasificación de enzimas por Grupos

EC 1.x Oxidorreductasas
EC 2.x Transferasas
EC 3.x Hidrolasas
EC 4.x Liasas
EC 5.x Isomerasas
EC 6.x Ligasas

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Grupo 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreducción, en que
átomos de oxigeno ó hidrogeno son trasladados entre
moléculas:
Ared + Box Aox + Bred

AH2 + B A + BH2
En las reacciones redox, siempre tienen que estar presentes a
la vez el aceptor y el dador electrónico.

Grupo 2: Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de átomos ó grupo de
átomos entre moléculas:

A-X + B A + B-X

Dador: Aceptor Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1


Nombre común: hexokinasa

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Grupo 3: Hidrolasas
Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son
las más comunes en el dominio de la tecnología enzimática:

A-B + H2O A-OH + H-B

No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las hidrolasas.


Muchas de ellas conservan el nombre Primitivo. Ejemplo:
Quimosina EC 3.4.23.4.

Grupo 4: Liasas
Catalizan reacciones reversibles de remoción de grupo de
átomos del sustrato (este grupo no incluye las hidrolasas):

A-B A+ B

Ejemplo
Nombre sistemático:
Histidina amonio-liasa (EC 4.3.1.3)

Nombre común:
Histidasa

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Grupo 5: Isomerasas
Catalizan reacciones de isomerización moleculares

A B
Ejemplo:
Glucosa isomerasa (EC 5.3.1.5)

Grupo 6: Ligasas
Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas
de la hidrólisis de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.).

A + B + ATP A-B + ADP + Pi

Ejemplo: Glutationa sintasa (EC 6.2.2.3)

Nombre sistémico:
G-L-glutamilo-L-cisteina:glicina ligase

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Cinética de las reacciones


enzimáticas

Cinética Enzimática
 Es el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los
factores que intervienen en la actividad enzimática, que se
evalúa a través de la velocidad de la reacción catalizada.
 Las variables más importantes son:
• Concentración de enzima, sustratos y productos
(incluyendo inhibidores y/o activadores)
• pH
• Temperatura

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 Las enzimas se unen a los


reactivos (sustratos)

 Cada enzima tiene una forma


única con un sitio o centro activo
en el que se une al sustrato

 Después de la reacción, enzimas


y productos se separan.

 Las moléculas enzimáticas no


han cambiado después de
participar en la reacción

La unión del sustrato es muy


específica:

 Complementariedad
geométrica
 Complementariedad de
cargas, uniones iónicas

Modelos:
 Llave – cerradura.

 Encaje inducido

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Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,


de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Substrato Enzima

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración


en su estructura por el hecho físico de la unión.

Substrato Enzima

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Enzima + sustratos
Una enzima puede
unir más de un
sustrato en su sitio
activo

ADP + PEP
COMPLEJO
ENZIMA-SUSTRATO ATP + PIRUVATO

Enzima + productos

Baja
concentración
de sustrato

ALTA
concentración
de sustrato
SATURACION

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Medición de la velocidad de reacción enzimática

Enzima
Sustrato(s) Producto(p)

dp ds
v
dt dt

d[P]
[ ] v = dt , t 0
p

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Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima


para fijar substrato; una vez que están ocupados
todos, por mucho que aumente la concentración
de substrato, la velocidad permanecerá constante
tendiendo a un valor asintótico

Michaelis-Menten y Estado estacionario

Vmax
Velocidad de la reacción (v)

Vmax/2

Km Concentración de Sustrato [S]

Vmax * s
v=
Km + s

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Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES
(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato


(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace


igual a la mitad de la máxima (s0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentración

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de


enzima (hoy se prefiere caracterizar a la enzima por
k+2)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

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Vmax
Velocidad de la reacción (v)

Vmax/2

Km Concentración de Sustrato [S]

A mayor Km, menor es la afinidad de la enzima por el sustrato


A menor Km mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato

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Representación directa

v
100
Vmax
80

60
Vmx s
v
40 Km s

20

s
0
0 20 40 60 80 100

Km

Representación recíproca doble


(Lineweaver - Burk)

0.04

1/v
0.03

1/Vmax
0.02

1 Km 1 1
-1/Km
0.01 v Vmx s Vmx

0.00
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/s

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Métodos de linealización para determinación


parámetros cinéticos

Método Eje Y Eje X Intercepto Intercepto Pendiente


Eje Y Eje x
Lineweaver- 1/v 1/s 1/V -1/K K/V
Burke

Hanes s/v s K/V -K 1/V

Eadie- v v/s V V/K -K


Hofstee

Actividad Enzimática

dp ds
a vt 0
dt t 0 dt t 0

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 Así esta actividad corresponde al máximo potencial catalítico


que las enzimas poseen para un determinado conjunto de
condiciones ambientales.
 Existen situaciones (sustratos heterogéneos) donde la
velocidad inicial de reacción no es representativa del real
potencial catalítico de la enzima.
 Se asume que la velocidad inicial de reacción es
proporcional a la concentración de proteína enzimática.

 Actividad enzimática: Es el número de moles


de sustrato que reaccionan para formar
producto, por mol de enzima y por unidad de
tiempo. Esto supone que la enzima está
plenamente saturada con sustrato y por tanto la
reacción se efectúa con su máxima rapidez

 Índice de recambio: muestra la eficiencia de


la catálisis enzimática

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Efecto del pH

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:


- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del sustrato

2. Sobre la transformación catalítica del sustrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH óptimo para su actividad


El pH afecta las interacciones iónicas

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Efecto de la temperatura

1. Aceleración de la reacción según la ecuación


de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

Efecto de la temperatura en la ENZIMA


Aumento de la Desnaturación
velocidad por calor

15º 40º 75º

Temperatura

Cada enzima tiene una temperatura óptima.

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Coenzimas-Cofactores
 Las coenzimas son pequeñas moléculas
orgánicas, que se unen a la enzima.
 Las coenzimas colaboran en la reacción
enzimática recibiendo transitoriamente
algún grupo químico: H+ , OH, CH3 .
 La enzima sin la coenzima recibe el
nombre de APOENZIMA

El NAD es una coenzima aceptora de H

Sustrato
oxidado

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Algunas enzimas requieren metales


para mejorar su actividad

Isoenzimas o Isozimas
Son formas moleculares diferentes de una
misma enzima
 Catalizan lamisma reacción
 Ejemplo: Lactato deshidrogenasa
 Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH
 Se diferencian por su movilidad electroforética
 Usadas en clínica: sueros normales y sueros con
alguna patología

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Inhibición enzimática

Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de
interacciones con el centro activo u otros centros específicos
(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a


la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la


molécula, causando un cambio conformacional con
repercusión negativa en la actividad enzimática.

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Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,


con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E+I EI

ES + I ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:


E+I E’

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,


impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo


haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción
catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato


una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo
se conoce como Inhibición Anticompetitiva

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Inhibidores Competitivos
 Compiten con el sustrato por el sitio activo
de la enzima
 Se une solo a la enzima libre
 V máx no se altera y K M cambia

S
E ES E+P
I
Inhibición
Competitiva

EI

Las fijaciones de substrato e inhibidor son


mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

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Inhibición Competitiva
S
E ES E+P [E] [I]
Ki =
I [EI]
Se define una constante de
equilibrio de disociación del
EI inhibidor:

Vmx s
v
i
Km 1 s
Ki

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Inhibidor competitivo
 Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el inhibidor
competitivo es desplazado y se forma producto

Inhibidor competitivo
su estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

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Características:
• Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente
exclusivas
• A muy altas concentraciones de substrato desaparece la
inhibición
• Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo
químico del substrato.
• El inhibidor es tan específico como el substrato

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la


Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy


altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia


del inhibidor competitivo.

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Inhibidor competitivo
Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo
aumenta la Km

Km Km
Sin con
inhibidor inhibidor

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble


0.07
1/v
0.06

0.05

0.04
1/Vmax
0.03

0.02
-1/Km
0.01

1/s
0.00
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-1/(Km(1 + i/Ki))

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Inhibidor No Competitivo
 Se une a un lugar diferente del sitio activo
la enzima
 Se une a la enzima libre y también al
complejo enzima-sustrato
 Por acción del inhibidor disminuye la Vmáx
pero el valor de KM no se altera

S
E ES E+P
I I
Inhibición
S No Competitiva

EI ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E


y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos

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Inhibidor NO competitivo
El inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un
sitio diferente del sitio activo

Inhibidor Incompetitivo
 Se une a un lugar diferente del sitio activo
de la enzima
 Se une sólo al complejo enzima-sustrato
 Los efectos que tiene: disminuye el valor
de KM y también el de Vmáx

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S
E ES E+P
I
Inhibición
Anticompetitiva
ESI

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;


el complejo ESI no es productivo

Inhibidores Irreversibles
 Producen inactivación permanente de la
actividad enzimática
 Se interfiere con el normal desarrollo de
una reacción o vía metabólica
 Ejemplos: p-cloromercuribenzoato,
yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

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Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,


sino por una constante de velocidad ki:

E+I E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los
inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación
del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente


tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

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Enzimas Alostéricas
 Son enzimas cuya estructura proteica está
formada de varias subunidades
 No se rigen por la cinética de M - M
 Además del sitio o centro activo tienen sitios
alostéricos o de regulación
 Sitio activo/sustratos;
 Sitio alostérico/moduladores o reguladores
 La relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de sustrato sigue cinética
sigmoídea

Enzimas alostéricas
 Las enzimas alostéricas
presentan estructura
cuaternaria.
 Tienen diferentes sitios
activos, unen mas de una
molécula de sustrato
 La unión del sustrato es
cooperativa
 la curva de velocidad
presenta una forma
sigmoidal

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RESUMEN
 Las enzimas son proteínas que catalizan
las reacciones biológicas
 Presentan especificidad por su sustrato
 Cada enzima presenta dos parámetros
importantes Vmax (saturación de la
enzima) y la Km (medida de la afinidad
por el sustrato)

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 La actividad enzimática puede ser


inhibida, por inhibidores competitivos
(similares al sustrato) o por inhibidores no
competitivos.
 La temperatura y el pH afectan a la
enzima en su actividad catalítica.
 Algunas enzimas requieren de coenzimas
y/o cofactores para su actividad.

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