GENEL Gİ

GİRİŞ
• Klasik LC’
LC’de numune ve hareketli faz kolonun
YÜKSEK PERFORMANS SIVI üzerinden ilave edilir.Hareketli fazıfazın kolondan
sürüklenmesiyle bileş
bileşenlerin bantlar halinde
KROMATOGRAFİ
KROMATOGRAFİSİ ayrı
ayrılmaları
lmaları sağ
sağlanı
lanır.Ayrı
r.Ayrılmayı
lmayı iyileş
iyileştirmek iç
için;
( HPLC ) daha uzun kolonlar (daha fazla sü süre)
kullanı
kullanılabilir veya dolgu maddesi
inceltilebilir.Araş
inceltilebilir.Araştırmalar sonucunda; kolonun
uygun bübüyüklüklükte dolgu maddesiyle
HAZIRLAYAN doldurulduğ
doldurulduğu ve kolonun üstü stünden yü yüksek
Ömer ERCAN bası
basınç uygulandığı
uygulandığı HPLC elde edilmiş
edilmiştir.

HPLC 4 bö
bölümde incelenir.
• Yüksek performanslı
performanslı sıvı
kromatografisinde, • 1)Dağı
1)Dağılma
lma kromatografisi (sı
(sıvı-sıvı krom.)
• Hareketli faz: Sı
Sıvı • 2)Adsorpsiyon kromatografisi (sı
(sıvı-katı
katı
• Durgun faz: Çok küçü
küçük
k katı
katı parç
parçacı
acıklardan krom.)
oluş
oluşur. • 3)İ
3)İyon değ
değiştirici kromatografi
• Uygun akış
akış hızları
zları elde edebilmek • 4)Jel kromatografisi (jel geç
geçirgenlik ve jel
için,sı
in,sıvıya birkaç
birkaç yüz psi’
psi’lik veya daha süzme kromatografisi)
yüksek bir bası
basınç uygulanması
uygulanması gerekir. • Bu sı
sıvı kromatografi teknikleri aslı
aslında
uygulamalarda birbirini tamamlayan
tekniklerdir. (Ş
(Şekil 1 )

HPLC’
HPLC’nin Önemi

• HPLC, bü
bütün analitik ayı
ayırma metotları
metotları
arası
arasında en çok kullanı
kullanılanı
lanılanı
lanıdır.Bunun
nedenleri:
• Hassas olması
olması
• Sıcaklığ
caklığa
a hassas olan maddelere bile
uygulanabilmesi
• Doğ
Doğruluk dereceleri ve kesinlikleri yüyüksek
sonuç
sonuçlar vermesi
• Şekil 1 Sı
Sıvı kromatografinin uygulamaları
uygulamaları

1
Metodun uygulanabildiğ
uygulanabildiği baş
başlıca HPLC’
HPLC’de Ekstra Bant Geniş
Genişlemesi
alanlar şunlardı
unlardır:
• HPLC’
HPLC’de bazen kolon dolgu maddesinin
• Nükleik asitler haricinde önemli bir bant geniş
genişlemesi
• Terpenoitler olur.Bant geniş
genişlemesi genel olarak;
• Pestisitler enjeksiyondan,dedektö
enjeksiyondan,dedektörden veya boru
• Antibiyotikler birleş
birleştirme kı
kısımları
mlarından kaynaklandığı
kaynaklandığı halde
• Steroitler ekstra bant geniş
genişlemesi, sısıvının kolon
duvarları
duvarlarına yakı
yakın bö
bölgelerindeki ve orta
• Proteinler
kısımlardaki akış
akış hızları
zlarının farklı
farklılığından
ığından
• Amino asitler kaynaklanı
kaynaklanır. GC’
GC’ de bu geniş
genişleme difüdifüzyonla
• Hidrokarbonlar bertaraf edilebilirken LC’
LC’de bu pek mü mümkü
mkün
• Karbonhidratlar değ
değildir.
• Organometalik bileş
bileşikler ve bazı
bazı inorganik
maddeler

HPLC CİCİHAZI
ve Baş
Başlıca Kı
Kısımları
mları

• Çöz
Çözücü Haznesi ve Çöz
Çözücü
• Yüksek Bası
Basınç Pompası
Pompası (Pompa Sistemleri)
• Akış
Akış Kontrolü
Kontrolü ve Programlama Sistemleri
• Numune Enjeksiyonu
• Kolonlar ve Kolon Termostatları
Termostatları
• Kolon Dolgu Maddesi Tipleri
• Dedektö
Dedektörler
• Şekil 2 HPLC cihazı
cihazının şematik gö
görünümü

Çöz
Çözücü Haznesi ve Çöz
Çözücü
• Her cihazda en az bir tane 500 mL’
mL’lik bir
çöz
çözücü haznesi bulunur.Çö
bulunur.Çözzücü sıvılarda
bulunabilecek tozları
tozları ve çöz
çözünmü
nmüş gazları
gazları
uzaklaş
uzaklaştırmak iç için önlemler alı
alınır.(pik
geniş
genişlemesi ve girişgirişime sebep olurlar)
• HPLC metodunda izokratik elü elüsyon, çöz
çözücü
bileş
bileşiminin sabit tutulduğ
tutulduğu bir tekniktir.
• HPLC’
HPLC’de gradiyent elü elüsyon çöz
çözücü
bileş
bileşiminin süsürekli veya basamaklı
basamaklı
değ
değiştirildiğ
tirildiği bir tekniktir.

2
 Pompa Sistemleri • İki tip mekanik pompa vardı
vardır:
• LC’
LC’de kullanı
kullanılan pompaları
pompaların özellikleri:
• 1)Vidalı
1)Vidalı şır
şırınga:Akış
nga:Akış hızı kolay kontrol
• 6000 psi’
psi’ye kadar bası
basınç oluş
oluşturabilmeli edilebilen,pulsuz akış
akış sağ
sağlar.Kapasiteleri
• Pulssuz sı
sıvı çıkışı bulunmalı
bulunmalı sınırlı
rlıdır.
• Akış
Akış hızı 0,1-
0,1-10 mL/dakikaya
ayarlanabilmeli • 2)Reciprocating pompa:Daha yaygı
yaygın
• Akış
Akış hızı tekrarlanabilirliğ
tekrarlanabilirliği >%5 olmalı
olmalı kullanı
kullanılır.İ
r.İç hacminin küçü
küçüklklü
üğü,yü
,yüksek
çıkış bası
basıncı
ncı,gradiyent elü
elüsyon tekniğ
tekniğine
• Çok sayı
sayıda çöz
çözücünün korozyon etkisine kolay uyarlanabilme ve sabit akışakış hızı
karşı
karşı dayanı
dayanıklı
klı olmalı
olmalı üstü
stünlü
nlükleri vardı
vardır.

Numune Enjeksiyon Sistemi

• Elastomerik bir septum iç
içerisinden şır
şırınga ile
enjeksiyon yaygı
yaygındı
ndır ama tekrarlanabilirliğ
tekrarlanabilirliği
düşüktü
ktür.

• Akış
Akış--durdurma enjeksiyon sistemlerinde çöz
çözücü
akışı
akışı ani olarak durdurulur,kolondaki bağ bağlantı
lantı
çıkarı
karılarak şır
şırınga ile dolgulu kolona enjekte
edilir.Bu numune uygulama lupları
lupları ile yapı
yapılır.5-
r.5-
500 µl enjeksiyona uygun luplar vardı
vardır.Bu sistem
enjeksiyonun tekrarlanabilir ve uygun bası basınçta
yapı
yapılması
lmasını sağ
sağlar.

• Şekil 3 HPLC’
HPLC’de kullanı
kullanılan reciprocating pompa

Kolon Sistemleri
• Kolon çapları
apları ve uzunlukları
uzunlukları yapı
yapılacak iş
işlere
bağ
bağlıdır.Kolonları
r.Kolonların uzunluğ
uzunluğu 130 cm ve iç iç çapı
apı 4-
10 mm civarı
civarındadı
ndadır.Dolgu parç
parçacı
acık boyutu 5-5-10
µm kadardı
kadardır.Bu kolonları
kolonların 1 metresinde 40.000-
40.000-
60.000 tabaka bulunur.Son yı yıllarda uzunluğ
uzunluğu 3-
3-
• Şekil 4 Numune 7,5 cm iç
iç çapı
apı 1-4,6 mm olan mikro kolonlarda
uygulama lupu. üretilmeye baş
başlamış
lamışttır.Tabaka sayı
sayısı 100.000’
100.000’e
kadar çıkmaktadı
kmaktadır.
• LC’
LC’de kullanı
kullanılan en yaygı
yaygın dolgu maddeleri
silisyum dioksittir.Parç
dioksittir.Parçacı
acıkları
kların yü
yüzeyi fiziksel
veya kimyasal bağbağlarla ince organik bir filmle
kaplanı
kaplanır.
• Alü
Alümina, polimerler ve iyon değ değiştirici reç
reçinelerde
dolgu maddesi olarak kullanı
kullanılmaktadı
lmaktadır.

3
 Dedektö
Dedektörler
• HPLC’
HPLC’de genel ve özel amaç
amaçlı olmak üzere • Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS)
iki tip dedektö
dedektör kullanı
kullanılır.Genel amaç
amaçlı • Photodiode Array detector (PDA)
dedektö
dedektörler, hareketli fazı
fazın kı
kırma indisini, • Fluorescence detector (RF)
dielektrik sabitini, yoğ
yoğunluğ
unluğunu ölçen • Conductivity detector (CDD)
dedektö
dedektörlerdir.Bu özellikler çözçözünenin • Refractive Index detector (RID)
konsantrasyonuna ve tü türüne bağ
bağlı olarak • Electrochemical detector (ECD)
değ
değişir. Buna karşı
karşıllık özel amaç
amaçlı • Mass detector (MS)
dedektö
dedektörler, bir maddenin UV • Evaporative Light Scattering detector (ELSD
(ELSD))
absorpsiyonunu, floresansı
floresansını, difü
difüzlenme
akı
akımını ölçer.

UV-
UV-VIS. Absorbans Dedektö
Dedektörleri
UV DEDEKTÖ
DEDEKTÖR
• En çok kullanı
kullanılan dedektö
dedektörlerdir.Piyasada
kolonlara takı
takılarak kullanı
kullanılabilecek şekilde • Absorbans ölçüm
çümü
özel tasarlanmış
tasarlanmış fotometre ve C : concentration
Cell
spektrofotometrelerde vardı vardır.Bir çok
organik madde UV bö bölgede absorpsiyon Ein Eout
gösteren fonksiyonlu gruplar
bulundurduğ
bulundurduğu iç için fotometrelerde 245 nm b Lambert-Beer yasası
ve 280 nm d.boyunda ışın ışın veren civa
lambaları
lambaları kullanı
kullanılır. AbC= - log (Eout / Ein)
(A : absorbance)

UV DEDEKTÖR
UV DEDEKTÖ
DEDEKTÖR
Çalışma prensibi

• UV dedektö
dedektörün olanakları
olanakları
– İki ayrı
ayrı dalga boyunda çalış
alışabilmek
abilmek
– Oran kromotogramı
kromotogramı alabilmek
– Dalga boyunu zamana karşı karşı
programlayabilmek
– Spektrum taraması
taraması yapabilmek
– D2 / W lamba seçseçeneğ
eneği
– Değ
Değişik çalış
alışma
ma tü
türleri iç
için hü
hücre
seç
seçenekleri
23

4
 Floresans Dedektö
Dedektörleri
FLORESANS DEDEKTÖ
DEDEKTÖR
• En basit floresans dedektö
dedektörlerinde,uyarı
rlerinde,uyarıcı kaynak • Floresans oluş
oluşumu
olarak civa lambası
lambası,ışınlar
ışınlarıı süzmek iç
için de
filtreler kullanı
kullanılır.Daha iyi cihazlarda uyarı
uyarıcı Excitation Wavelength
ksenon ark lambası
kullanı
lambası ve monokromator
kullanılır.Floresans metodunun avantajı
avantajı, her + hn1 *
hangi bir absorbans metodundan en az10 defa
daha hassas olması
* hn2+
olmasıdır.Bu avantaj LC’ LC’de daha da
iyidir, çünk
çünküü LC ile ayrı
ayrılan maddeler,farmasotik A* Emission Wavelength
hn2
maddeler, kriminal maddeler, klinik maddeler, hn1
petrol ürü nleridir ki bunları
bunların çoğu şiddetli
Fluorescence
floresandı
floresandır. A A

FLORESANS DEDEKTÖ
DEDEKTÖR Kırma İndisi Dedektö
Dedektörleri
• Çalış
alışma
ma prensibi

• Güvenilir cihazlardı
cihazlardır.Akış
r.Akış hızından
etkilenmezler ve her madde iç için
kullanı
kullanılabilirler.İ
labilirler.İndis ölçmeleri sı
sıcaklığ
caklığa
a çok
bağı
bağıml
mlııdır.Diğ
r.Diğer dedektö
dedektörler kadar hassas
değ
değildirler.(Duyarlı
ildirler.(Duyarlılığı düşüktü
ktür)

REFRACTİ Işın
şın Dağı
Dağıttıcı Dedektö
Dedektörler (ELSD)
REFRACTİVE INDEX DETECTOR
• ELSD, HPLC iç
için son zamanlarda geliş
geliştirilen
• Çalış
alışma
ma prensibi genel amaç
amaçlı dedektö
dedektörlerdendir.Bö
rlerdendir.Böylece
dedektö
dedektörlerde kolondan gelen çözelti,bir
çözelti,bir
nebü
nebülizö
lizöre aktarı
aktarılır.Çö
r.Çözelti
zelti orada azot veya hava
akı
akımıyla ince bir sis haline getirilir.Bu sis sı sıcaklığı
caklığı
kontrol edilen bir tütüpten geçgeçirilir.Burada çöz
çözücü
buharlaş
buharlaştırılır.Geriye analizi yapıyapılan maddenin
mikrokü
mikrokürecikleri kalı
kalır.Bu parç
parçacı
acıklar bir lazer
demetinden geç geçirilir.Etrafa yayı
yayılan ışınlardan
ışınlardan
parç
parçacı
acık akı
akımına dik olan yö yöndeki ışın
ışın demeti
Sıcaklık kontrolü fotodiyotla ölçül
çülür.Bunun avantajı
avantajı uçucu
olmayan bü bütün maddelere uygulanabilmesi ve
tekrarlanabilirliğ
tekrarlanabilirliğinin yüyüksek olması
olmasıdır.

5
Kütle Spektrometrisi Dedektö
Dedektörleri
MASS DETECTOR
HPLC-
HPLC-MS • Çalış
alışma
ma prensibi
• HPLC, bü
bütün analitik ayı
ayırma metotları
metotları arası
arasında Vacuum
en çok kullanı
kullanılanı
lanılanı
lanıdır.Bir çok bileş
bileşiği çok iyi
ayı
ayırabilmektedir.Fakat
rabilmektedir.Fakat bunları
bunları tanı
tanıyamaz.
• MS, pek çok bileş
bileşiğin tam olarak tanı
tanınması
nması gibi
+
detaylı
detaylı yapı
yapısal bilgi verebilir.Fakat
verebilir.Fakat bunları
bunları + + ++
+++ + ++
+
+ +
+ ++++
+ ++ ++ + + +

kolayca ayıayıramaz.
• Hem HPLC hem de MS yö yöntemleri kullanı
kullanım Mass analyser
alanları
alanlarını geniş
genişletmek ve aynıaynı zamanda daha
güçl
üçlü bir analitik teknik oluş
oluşturmak üzere Skimmer
birleş
birleştirilmektedir. lens
Rotary pump TMP1 TMP2

MASS DETECTOR Dağı

Dağılma
lma Kromatografi
• Diquat’
Diquat’ın mass spektrumu

• Bütün sı
sıvı kromatografi teknikleri iç
içinde en
fazla kullanı
kullanılanı
lanı dağı
dağılma
lma kromatografisidir.
Sıvı-sıvı kromatografi ve sıvı-bağ
bağlı faz
kromatografi olmak üzere iki alt sısınıfta
incelenir.

Normal-
Normal-Faz ve Ters-
Ters-Faz Dağı
Dağıllım

• Sıvı-sıvı dağı
dağılma
lma kromatografide durgun • Durgun faz ile hareketli fazı
fazın bağı
bağıll
faz, katı
katı dolgu parç
parçacı
acıkları
kları yü zeyine polaritelerine gö
göre iki tip dağı
dağılma
lma krom.
adsorpsiyonla tutturulmuş
tutturulmuş bir çözçözücüdür. vardı
vardır.
• Normal-
Normal-faz dağı
dağılma
lma kromatografide,
• Sıvı bağ
bağlı faz kromatografide durgun faz, durgun faz polar; hareketli faz ise
katı
katı dolgu parç
parçacı
acıkları
kları yüzeyine kimyasal apolardı
apolardır.
bağ
bağlarla tutturulmuş
tutturulmuş organik • Ters-
Ters-faz dağı
dağılma
lma kromatografide ise
maddelerdir.Daha sı sık kullanı
kullanılır. durgun faz apolar; hareketli faz polardı
polardır.

6
• Normal-
Normal-faz kromatografide polarlığı
polarlığı en az
Uygulamalar
olan bileş
bileşen kolondan en önce
çıkar,hareketli fazı
fazın polarlığı
polarlığı arttı
arttıkça
elü
elüsyon zamanı
zamanı azalı
azalır.
• Şekillerde ve tabloda bağ
bağlı-faz dağı
dağılma
lma
kromatografi ile yapı
yapılan tipik çalış
alışmalar
malar
• Ters-
Ters-faz tekniğ
tekniğinde ise, polarlığı
polarlığı en çok belirtilmiş
belirtilmiştir.
olan bileş
bileşen kolondan ilk önce çıkar ve
hareketli fazı
fazın polarlığı
polarlığı arttı
arttıkça elü
elüsyon
zamanı
zamanı artar.

• Bir organik fosfat

• Bir alkolsü
alkolsüz iç
içecek böcek ilacı
ilacının sı
sıvı
katkı
katkı maddesinin sı
sıvı bağ
bağlanmış
lanmış faz
bağ
bağlı faz kromatogramı
kromatogramı.
kromatogramı
kromatogramı.

Yüksek Performanslı
Performanslı Dağı
Dağılma
lma Adsorpsiyon Kromatografisi
Kromatografinin Uygulamaları
Uygulamaları
• Adsorpsiyon kromatografisinde analit,polar
bir dolgu maddesinin yü
yüzeyine adsorplanı
adsorplanır.

• Adsorpsiyon kromatografisinde, hareketli

faz genellikle bir organik çöz
çözücü veya org.
çöz
çözücülerin karışı
karışım
mıdır.Durgun faz ise, çok
ince bir şekilde öğütülmü
lmüş silis veya
alü
alümina tozudur.

7
 İyon kromatografisi
• Adsorpsiyon kromatografisi, daha çok mol
kütleleri 5000’
5000’den daha az,nispeten apolar • İyon kromatografisi, analitin sulu bir
ve suda çöz
çözünmeyen organik maddelerin hareketli faz iç
içerisinde iyonlaş
iyonlaşarak
ayrı
ayrılması
lmasında kullanı
kullanılır.Diğ
r.Diğer tekniklerde çöz
çözündü
ndüğü bir HPLC tekniğ
tekniğidir.Durgun faz
bulunmayan en önemli özelliğ zelliği, meta ve ise çok ince olarak öğütülmülmüş bir iyon
para süsübstitü
bstitüe benzen tü türevleri gibi değ
değiştirici reç
reçinedir.
izomerik karışı
karışımlar
mlarıı ayı
ayırabilmesidir.

Boyut Ayı
Ayırıcı Kromatografi
Kaynaklar
• Boyut ayı
ayırıcı iyon kromatografisinde
ayı
ayırma, molekü
molekül boyutları
boyutlarına dayanı
dayanır.
• Jel sü
süzme tekniğ
tekniği, polar tü
türlerin • İnstrü
nstrümental Analiz-
Analiz-Prof.Dr.Turgut Gü
Gündü
ndüz
ayrı
ayrılması
lmasında kullanı
kullanılan,dolgu maddelerinin
hidrofilik olduğ
olduğu bir çeşit boyut ayı
ayırıcı
kromatografidir. • Enstrü
Enstrümental Analiz İlkeleri-
lkeleri-Skoog,West
• Jel geç
geçirgenlik tekniğ
tekniği, apolar tü
türlerin
ayrı
ayrılması
lmasında kullanı
kullanılan, dolgu • Analitik Kimya Temelleri 2
maddelerinin hidrofobik olduğ
olduğu bir çeşit
boyut ayı
ayırıcı kromatografidir.

www.kimyauzerine.com