Professional Documents
Culture Documents
2007-2008
Data Sumário
2
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Avaliação
Componente prática 30 %
A avaliar:
Preparação do trabalho prático
Execução prática
Relatório
Conduta geral
Não deve correr nem brincar, no laboratório. No caso de ocorrer qualquer acidente é fundamental
que mantenha a calma e saiba qual a primeira atitude a tomar. Uma vez tomadas as primeiras
medidas de segurança (descritas ao longo deste texto), informe imediatamente o docente do ocorrido.
Higiene laboratorial
Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório. Deve lavar as mãos frequentemente sempre
que trabalhe com produtos químicos e, em particular, se derramar sobre a pele algum produto.
3
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Protecção corporal
É aconselhável o uso de bata e óculos de segurança (ou outros), no laboratório. Deve usar luvas de
protecção e utilizar o nicho sempre que manipular substâncias de alguma forma perigosas.1
1 Consulte sempre os rótulos dos frascos em caso de dúvida e, em último caso, coloque a questão ao docente.
2 Trata-se apenas de uma regra geral, no entanto, há que ter em atenção que determinados reagentes inflamam (ou explodem) em
contacto com a água, outros reagentes específicos ou mesmo com o ar, pelo que é fundamental a leitura atenta do rótulo de um produto
desconhecido.
4
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Conservação do laboratório e do material
i) Deve manter limpas e livres de qualquer obstáculo as zonas de circulação do seu laboratório
ii) Deve manter limpa a bancada
iii) O material de vidro que utilizar deve ser convenientemente lavado e arrumado no fim do
trabalho.
iv) Os frascos de reagentes e solventes, uma vez usados, devem ser tapados e repostos no seu lugar.
v) Os aparelhos devem ser utilizados e protegidos respeitando as instruções de operação.
vi) Sempre que danificar algum tipo de material informe imediatamente o docente, para que o
mesmo possa ser substituído ou reparado.
BIBLIOGRAFIA
Guia de Segurança
Pedro Domingues, Mário Simões, Departamento de Química, Universidade de Aveiro, 2002
ISBN 972-789-069-5
5
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Utilize os dados da Tabela 1 para escolher as substâncias a partir das quais preparará a solução
pretendida. Siga os passos sugeridos abaixo.
Pretende avaliar a variação de pH sofrida pela solução tampão preparada, em comparação com
outras soluções fornecidas (água destilada, solução de sacarose e solução de um aminoácido) depois da
adição de diferentes quantidades de HCl 1 moldm-3 a cada uma delas.
Avalie ainda as alterações de pH que as soluções sofrem quando lhes adiciona NaOH 1moldm-3
(sugestão: use volumes pequenos de cada uma das soluções e quantidade de HCl e NaOH que se
possa medir às gotas)
6
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Questionário:
1. A solução que preparou tinha o pH pretendido? No caso da resposta ser negativa, pense em
explicações para esse facto.
2. Qual (ou quais) das soluções que testou apresentava poder tampão? No caso das que apresentavam,
explique porque possuem esse poder tampão.
3. Sabendo que a eficácia de um tampão (capacidade tampão) é máxima sempre que a relação entre a
concentração das espécies envolvidas é inferior ou igual a um factor de 10 vezes, estará o tampão
preparado em situação de capacidade máxima?
ANEXO
Tabela 1. Valores de pKa para alguns pares ácido-base conjugados (adaptado de Bohinski, 1979).
Ácido Base pKa
-
Ácido fosfórico (H3PO4) ião dihidrogenofosfato (H2PO4 ) 2,12
Ácido acético (CH3COOH) ião acetato (CH3COO-) 4,74
Ácido carbónico (H2CO3) ião bicarbonato (HCO3- ) 6,35
Ião dihidrogenofosfato (H2PO4-) ião hidrogenofosfato (HPO42-) 7,2
Tris ((HOCH2)3CNH3+) Tris ((HOCH2)3CNH2) 8,3
Ião hidrogenofosfato (HPO42- ) 3-
ião fosfato (PO4 ) 12,3
7
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Modelo de relatório
Relatório de__________________________________
Trabalho nº __: ________________________________________________________
Turno:____________________________ Nomes:________________________________
Grupo: __________________________ ________________________________
________________________________
Água destilada
Tampão fosfato
Solução de sacarose
Solução de
aminoácido
(n=0 gotas, ou seja, o pH antes de qualquer adição)
2- Cálculos:
Cálculos a efectuar envolvendo os resultados experimentais e sempre que possível em tabela também
(não se aplica quando o trabalho é puramente qualitativo)
8
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
3- Conclusões e comentários
Pretende-se objectividade e espírito crítico com sugestões pertinentes tendo em conta os objectivos do
trabalho. As questões levantadas no questionário são apenas pistas de pontos a discutir e a salientar
neste item. Não se pretende a criação de um item “resposta ao questionário”.
9
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Os seres vivos têm em comum diversos constituintes moleculares. Entre estes contam-se os
ácidos nucleicos, responsáveis pela informação genética, e as proteínas, com importantes papéis
metabólicos e estruturais. Para extrair estas moléculas dos tecidos onde se encontram, há uma série de
estratégias comuns a seguir. É necessário romper as paredes e membranas celulares, desagregar as
estruturas onde estão inseridas, de modo a libertá-las para o meio, e extraí-las selectivamente, usando
propriedades químicas ou físicas que as diferenciem. Por outro lado, é preciso que a sua estrutura não
seja destruída, como no caso das proteínas, que são bastante sensíveis a factores como o pH do meio e
a temperatura.
Neste trabalho vamos extrair DNA de diferentes frutos (Kiwi e um fruto trazido pelos alunos), e
ainda proteínas de origem animal e vegetal (filete de peixe, soja, feijão demolhado e feijão enlatado).
A. Extracção do DNA
10
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
B. Extracção de proteínas e doseamento semi-quantitativo
NOTA: para minimizar a desnaturação das proteínas, o processo de extracção é sempre feito a
temperaturas baixas. Vamos utilizar um banho de gelo com sal para manter a temperatura abaixo de
0ºC.
1. Pese cerca de 1 g de músculo (filete de peixe) e de fonte de proteína vegetal (soja ou feijão).
2. Coloque ambas as fontes de proteína em copos de 25 mL, no banho com gelo. Adicione a cada um
10 mL de tampão de extracção de proteínas frio já preparado (Tris-HCl 0,1 moldm-3 a pH 8,0). Não se
esqueça de identificar sempre cada um dos extractos proteicos!
3. Homogenize no almofariz arrefecido (colocado sobre o gelo), até desfazer completamente. Transfira
cada homogenato para um tubo de centrífuga.
(Nota: se o seu grupo tiver apenas um almofariz, lave cuidadosamente o almofariz e pistão entre as
duas homogenizações, para não haver mistura entre as duas proteínas).
4. Centrifugue durante 5 minutos, à velocidade máxima, na centrífuga refrigerada. Registe a velocidade
utilizada: __________ r.p.m. (equivalente a (__________ x g), e a temperatura (____ºC).
5. Com cuidado para não levantar o resíduo da centrifugação, recolha o sobrenadante de cada tubo
para um tubo graduado, devidamente identificado. Registe o volume de cada extracto proteico:
6. Congele 1,5 mL de cada extracto num eppendorf. Este extracto será utilizado mais tarde, noutra aula.
Não se esqueça de identificar: o extracto, o seu grupo e o turno prático.
Com o restante volume, vamos avaliar de modo semi-quantitativo a concentração de proteína presente
em cada extracto. Vamos usar um corante, o azul de Coomassie, presente no Reagente de Bradford já
preparado (85 mg de Coomassie Brilliant Blue G, 50 mL etanol 96% (v/v), 100 mL de ácido fosfórico
85%, H2O destilada por cada litro), que tem a seguinte característica: em presença de proteínas, forma
um complexo por adsorção à ligação peptídica, mudando a cor do castanho para o azul.
8. Na tampa duma microplaca, identifique os poços que vai utilizar: pelo menos um para o controlo ou
"branco", um para a solução de BSA (albumina de soro bovino 1 mg/mL de Tris-HCl pH 8,0), e dois
para os extractos proteicos.
9. Em cada um desses poços, deite 3 gotas de cada amostra (não esquecendo o "branco").
10. Agora, adicione a cada poço 2 gotas de reagente de Bradford. Observe os resultados ao fim de 5-10
min.
11
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Elabore o relatório de acordo com o modelo proposto no trabalho anterior com as necessárias
adaptações.
Questões:
- Extracção de DNA
1. Como foi conseguida a ruptura de membranas?
2. Se as membranas são lipídicas e os lípidos são substâncias insolúveis em água, deveriam ter-se
observado partículas gordurosas?
3. Qual a função do hidrogenocarbonato de sódio no tampão de extracção de DNA?
4. Com este método, terá extraído exclusivamente DNA?
- Extracção de proteínas:
1. Por que razão se homogenizou o músculo (ou feijão, ou pedaço de soja), para além de o fazer
contactar com o tampão de extracção?
2. Depois da centrifugação dos extractos proteicos, o que calcula que se encontrava no resíduo? E no
sobrenadante?
3. Compare a concentração de proteína das diferentes amostras.
- Análise global
1. Existirá a mesma quantidade de DNA em todas as células e tecidos? E de proteína?
12
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
2. Por que razão a extracção de DNA foi feita à temperatura ambiente, e a das proteínas a baixa
temperatura?
(mais difícil...)
3. Compare os dois métodos de extracção, quanto às semelhanças e diferenças.
- DNA from the beginning” - http://www.dnaftb.org/dnaftb/: DNA, história, animações, questões, etc
- "Genetics Science Learning Center", versão em espanhol
http://gslc.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/
- Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the determination of protein concentrations
using the Coomassie dye-binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
- " Bradford Protein Assay: Protein Concentration Determination by the Bradford Assay”
http://www.molecularstation.com/protein/bradford-protein-assay/
13
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
14
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
2. Observe a cor formada
Elabore o relatório de acordo com o modelo estabelecido, com as observações apresentadas em tabela
(não esqueça de indicar os resultados observados para o controlo positivo e negativo em cada teste).
Quais as suas conclusões quanto à constituição da amostra desconhecida?
Bibliografia
Artigo original: Benedict, S. R. (1908). "A Reagent For the Detection of Reducing Sugars". J. Biol.
Chem. 5: 485–487. http://www.jbc.org/cgi/reprint/5/6/485
http://www.answers.com/topic/benedict-s-reagent (consultado 30-01-2008)
Carbohydrate Characterization:
http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH150/experiments/carbohydrates.htm (consultado 30-01-2008)
15
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Colorimetric identification of unknown sugars:
http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/CARBO.html (consultado 30-01-
2008)
16
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
1. Procedimento experimental
Solução de extracção
• Mistura de hexano/acetona/etanol
(2:1:1 v/v/v)
Nota: a inalação do n-hexano pode ser prejudicial à saúde; por esta razão todo o procedimento de
extracção deverá ser efectuado na hotte.
Cada grupo irá trabalhar com uma amostra diferente. O docente irá distribuir por cada grupo o tomate
ou subproduto do tomate que irá ser utilizado para a realização deste trabalho.
1- Retire a casca e as sementes do tomate fresco e homogenize num almofariz. (este passo não é
realizado no caso de usar subproduto do tomate)
2 - Pese cerca de 2,5g de amostra homogenizada e coloque num frasco Schott embrulhado em papel de
alumínio para excluir a luz. Registe o peso.
3 - Na hotte, adicione 25 mL de mistura de hexano/acetona/etanol (2:1:1 v/v/v), e coloque uma barra de
agitação magnética no frasco. Tape com a rolha deixe na hotte, sob agitação, durante 30 minutos.
4 - Ao fim desse tempo pare a agitação e adicione 5 mL de água destilada. Deixe separar as fases
durante cerca de 5 a 10 minutos. Com uma pipeta de Pasteur, retire o pigmento, que fica localizado na
fase orgânica, para um tubo com rolha preta, envolto em papel de alumínio.
5 – Trace o espectro de absorção no espectrofotómetro entre 400 e 600 nm, depois de fazer a linha de
base com n-hexano. Se estiver muito concentrado (absorvância máxima superior a 1), dilua com n-
hexano.
6 – Leia a absorvância da solução ao máximo de absorção
17
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.
Bibliografia
Spectrofotometry: http://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.html
(consultado 7-2-2008)
Lycopene: http://www.3dchem.com/molecules.asp?ID=103 (consultado 30-01-2008)
Stahl, W. and Sies, H. Lycopene: A Biologically Important Carotenoid for Humans? Archives of
Biochemistry and Biophysics, Volume 336, Issue 1, 1 December 1996, Pages 1-9.
18
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Em condições alcalinas, substâncias que contenham uma ou mais ligações peptídicas formam
um complexo de cor violeta com os sais de cobre do reagente de biureto. Deste modo, quanto mais
proteína houver na solução, mais forte será a intensidade da cor violeta (o que pode ser quantificado
medindo a absorvância da solução resultante a 520 nm. Neste trabalho irá quantificar o teor de proteína
no extracto proteico que obteve numa aula anterior e guardou no congelador.
Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.
Bibliografia:
Colorimetric Assays: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html (consultado 7-
02-2008)
Biuret Protein Assay: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/biuret.html (consultado 7-02-
2008)
19
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
NOTA: o procedimento para as sementes (A) e para a gema de ovo (B) tem algumas diferenças, mas a
maioria dos passos pode ser executada em simultâneo. Leia o protocolo e planeie a maneira de
aproveitar os passos comuns de modo mais eficiente.
20
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
4. Adicione ao tubo um volume de solução de CaCl2 0,02% (p/v) correspondente a 0,2 vezes o volume
de filtrado. Homogenize no vórtex.
5. Adicione o mesmo volume medido em 4 de uma solução clorofórmio:metanol:água (2:50:50, v/v/v).
Misture no vórtex, deixe no gelo até separação das duas fases e aspire a fase aquosa com uma pipeta de
Pasteur, eliminando-a.
6. Meça o volume total da fase orgânica. Retire 1 mL para um tubo de ensaio normal, para
determinação do teor de colesterol (parte C do protocolo).
7. Coloque o tubo graduado num banho a 80ºC na hotte e deixe evaporar o solvente até à secura.
8. Pese o extracto seco e determine a quantidade de "lípidos totais" por grama de tecido fresco.
Identifique e guarde o extracto lípido para a próxima aula prática.
Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.
Questionário:
1. Segundo os resultados obtidos, qual dos tecidos continha mais colesterol?
2. De que forma poderíamos quantificar o colesterol com maior precisão?
Bibliografia:
Barreto, M. Carmo "Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol." J. Chem.
Educ. 2005, 82, 103-104.
21
Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Cholesterol Analysis: http://employees.oneonta.edu/helsertl/CholesterolLab.html (consultado em 30-
01-2008).
Extracção e quantificação do colesterol: www.dqb.fc.ul.pt/cup/44302_44329/FundQuimB-
Trab_4_0708.pdf (consultado em 30-01-2008).
A. P. Kenny, The determination of cholesterol by the Liebermann-Burchard reaction, Biochem J. 1952
52(4): 611–619. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1198067 (consultado em
30-01-2008).
22