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Bioquímica/Bioquímica I

Guia de trabalhos práticos

2007-2008

Docente: Prof. Ana Seca


Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Calendarização

Data Sumário

7-13 Fev. Inscrição nos turnos práticos.


Informações sobre o funcionamento da componente prática.
14 Fev. Organização em grupos. A internet para a pesquisa em Bioquímica.
Utilização do Excel
19 e 21 Fev. Preparação e eficácia de soluções tampão

26 e 28 Fev Extracção de moléculas biológicas: DNA e proteínas

4 e 6 Março Reacções dos hidratos de carbono

Extracção e quantificação espectrofotométrica do licopeno do


11 e 13 Março
tomate

1 e 3 Abril Quantificação de proteínas: método do biureto

5 Abril Teste Teórico

8 e 10 Abril Extracção de lípidos e quantificação do colesterol

15 e 17 Abril Introdução à cromatografia e à electroforese

22 e 24 Abril Separação de lípidos por cromatografia em camada fina

6 e 8 Maio Isolamento da mioglobina do hamburger

13 e 15 Maio Electroforese de proteínas

27 e 29 Maio Avaliação e discussão dos trabalhos

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Critérios de avaliação da componente prática da disciplina

Avaliação
Componente prática 30 %
A avaliar:
Preparação do trabalho prático
Execução prática
Relatório

A nota da componente prática resulta da avaliação de quatro trabalhos práticos de entre os


realizados ao longo do semestre e da apresentação na forma de poster de um dos trabalhos executados
em laboratório.
O trabalho nas aulas práticas é em grupo pelo que devem entregar por grupo o respectivo relatório
até 24 h depois de terminada a aula.
A não entrega do relatório implica a nota zero no respectivo trabalho prático.
É necessária a frequência de 75 % das aulas práticas para ter aproveitamento na disciplina.

Material imprescindível na aula prática


Bata (nenhum aluno poderá executar o trabalho prático sem bata)
Guia dos trabalhos práticos.

REGRAS GERAIS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO

Conduta geral
Não deve correr nem brincar, no laboratório. No caso de ocorrer qualquer acidente é fundamental
que mantenha a calma e saiba qual a primeira atitude a tomar. Uma vez tomadas as primeiras
medidas de segurança (descritas ao longo deste texto), informe imediatamente o docente do ocorrido.

Higiene laboratorial
Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório. Deve lavar as mãos frequentemente sempre
que trabalhe com produtos químicos e, em particular, se derramar sobre a pele algum produto.

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Protecção corporal
É aconselhável o uso de bata e óculos de segurança (ou outros), no laboratório. Deve usar luvas de
protecção e utilizar o nicho sempre que manipular substâncias de alguma forma perigosas.1

Prevenção contra incêndios


i) Tenha particular atenção ao manuseamento de substâncias inflamáveis. Nunca aqueça solventes
inflamáveis em placas de aquecimento, use sempre banho de água.2
ii) Conheça a localização e modo de funcionamento do extintor do laboratório. Não se esqueça que,
em caso de incêndio, deve dirigir o jacto do extintor para a base das chamas.
iii) Conheça, também, a localização da manta de amianto que serve para extinguir incêndios no
vestuário.
iv) Certifique-se que conhece o ponto mais próximo do seu laboratório em que pode accionar
manualmente o alarme contra incêndio.

Comportamento em caso de alarme de incêndio


O sistema de detecção e alarme contra incêndios é accionado automaticamente através dos sensores
distribuídos pelo edifício, ou manualmente. Quando o alarme for accionado proceda do seguinte
modo:
i) Desligue todos os aparelhos eléctricos que estiver a utilizar e coloque em segurança todo e
qualquer material. Estas tarefas devem ser efectuadas o mais rapidamente possível mas sem
pânico, de modo a não causar mais acidentes.
ii) Dirija-se rapidamente, mas sem atropelos nem pânico, para a porta de saída do Edifício, e aguarde
no exterior. Não deve abandonar este local sem que para tal seja autorizado.

Tratamento em caso de acidente


Cortes: deve lavar imediatamente com água e desinfectar o ferimento. Tenha cuidado para que
nenhum pedaço de vidro ou qualquer corpo estranho fique no ferimento.
Queimaduras (calor, ácidos ou bases): lave abundantemente a área atingida com água e notifique o
docente.

1 Consulte sempre os rótulos dos frascos em caso de dúvida e, em último caso, coloque a questão ao docente.
2 Trata-se apenas de uma regra geral, no entanto, há que ter em atenção que determinados reagentes inflamam (ou explodem) em
contacto com a água, outros reagentes específicos ou mesmo com o ar, pelo que é fundamental a leitura atenta do rótulo de um produto
desconhecido.
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Conservação do laboratório e do material
i) Deve manter limpas e livres de qualquer obstáculo as zonas de circulação do seu laboratório
ii) Deve manter limpa a bancada
iii) O material de vidro que utilizar deve ser convenientemente lavado e arrumado no fim do
trabalho.
iv) Os frascos de reagentes e solventes, uma vez usados, devem ser tapados e repostos no seu lugar.
v) Os aparelhos devem ser utilizados e protegidos respeitando as instruções de operação.
vi) Sempre que danificar algum tipo de material informe imediatamente o docente, para que o
mesmo possa ser substituído ou reparado.

BIBLIOGRAFIA

Guia do Laboratório de Química e Bioquímica


José A. Martinho Simões, et al., Lidel, 2000
ISBN 972-757-146-8

Guia de Segurança
Pedro Domingues, Mário Simões, Departamento de Química, Universidade de Aveiro, 2002
ISBN 972-789-069-5

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Preparação de soluções tampão

A relação entre o pH de uma solução tampão e as concentrações do par ácido/base que a


compõe é dada pela equação de Henderson-Hasselbach. [A− ]
pH = pK a + log
[HA]
Pode-se preparar uma solução tampão de duas formas: (1) pesar separadamente os dois
componentes de maneira a obter-se a razão desejada entre eles e dissolvê-los num volume adequado de
água, ou (2) obter ambos os componentes da mistura a partir de uma dada quantidade de um dos
componentes da mistura, sendo o segundo formado pela adição de uma quantidade especificada de um
ácido ou base forte. Nesta aula vamos utilizar o método indicado em (1).

A. Prepare a seguinte solução tampão


25 mL de tampão fosfato 0,25 mol/dm3, pH 7,5.

Utilize os dados da Tabela 1 para escolher as substâncias a partir das quais preparará a solução
pretendida. Siga os passos sugeridos abaixo.

(a) A partir da equação de Henderson-Hasselbach, calcule a massa ou volume de cada um dos


seus componentes (ácido e base conjugado) tendo em conta que a concentração indicada refere-se à
soma das moles dos dois componentes da solução por litro.
(b) pese/meça os reagentes escolhidos e dissolva-os usando as técnicas e material adequados.
(c) confirme o pH da solução tampão utilizando o papel indicador.

B. Verifique a eficácia do tampão que preparou

Pretende avaliar a variação de pH sofrida pela solução tampão preparada, em comparação com
outras soluções fornecidas (água destilada, solução de sacarose e solução de um aminoácido) depois da
adição de diferentes quantidades de HCl 1 moldm-3 a cada uma delas.
Avalie ainda as alterações de pH que as soluções sofrem quando lhes adiciona NaOH 1moldm-3
(sugestão: use volumes pequenos de cada uma das soluções e quantidade de HCl e NaOH que se
possa medir às gotas)

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Questionário:
1. A solução que preparou tinha o pH pretendido? No caso da resposta ser negativa, pense em
explicações para esse facto.
2. Qual (ou quais) das soluções que testou apresentava poder tampão? No caso das que apresentavam,
explique porque possuem esse poder tampão.
3. Sabendo que a eficácia de um tampão (capacidade tampão) é máxima sempre que a relação entre a
concentração das espécies envolvidas é inferior ou igual a um factor de 10 vezes, estará o tampão
preparado em situação de capacidade máxima?

Bibliografia e endereços da internet:


"Phosfate Buffer calculation": (Preparação de soluções tampão online)
http://www.columbia.edu/~scb2001/tools/phosphate/phosphate.html
(consultado a 30/1/2008)
“Preparing a Buffer solution”
http://www.csudh.edu/oliver/chemdata/buffers.htm
(consultado a 30/1/2008)

ANEXO

Tabela 1. Valores de pKa para alguns pares ácido-base conjugados (adaptado de Bohinski, 1979).
Ácido Base pKa

-
Ácido fosfórico (H3PO4) ião dihidrogenofosfato (H2PO4 ) 2,12
Ácido acético (CH3COOH) ião acetato (CH3COO-) 4,74
Ácido carbónico (H2CO3) ião bicarbonato (HCO3- ) 6,35
Ião dihidrogenofosfato (H2PO4-) ião hidrogenofosfato (HPO42-) 7,2
Tris ((HOCH2)3CNH3+) Tris ((HOCH2)3CNH2) 8,3
Ião hidrogenofosfato (HPO42- ) 3-
ião fosfato (PO4 ) 12,3

Nota: Tris = tri(hidroximetil)-aminometano

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Modelo de relatório

Relatório de__________________________________
Trabalho nº __: ________________________________________________________

Turno:____________________________ Nomes:________________________________
Grupo: __________________________ ________________________________
________________________________

1- Registo de resultados experimentais (em Tabela sempre que aplicável)


Exemplos para trabalho nº1:
Massa ou volume Volume total (mL)
Componente ácido
_________________
Componente básico
_________________

pH após a adição de n gotas de HCl 1moldm-3

Solução n=0 n=?? n=??? n=???? n=???? n=???

Água destilada

Tampão fosfato

Solução de sacarose

Solução de
aminoácido
(n=0 gotas, ou seja, o pH antes de qualquer adição)

2- Cálculos:
Cálculos a efectuar envolvendo os resultados experimentais e sempre que possível em tabela também
(não se aplica quando o trabalho é puramente qualitativo)

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3- Conclusões e comentários
Pretende-se objectividade e espírito crítico com sugestões pertinentes tendo em conta os objectivos do
trabalho. As questões levantadas no questionário são apenas pistas de pontos a discutir e a salientar
neste item. Não se pretende a criação de um item “resposta ao questionário”.

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Extracção de moléculas biológicas: DNA e proteínas

Os seres vivos têm em comum diversos constituintes moleculares. Entre estes contam-se os
ácidos nucleicos, responsáveis pela informação genética, e as proteínas, com importantes papéis
metabólicos e estruturais. Para extrair estas moléculas dos tecidos onde se encontram, há uma série de
estratégias comuns a seguir. É necessário romper as paredes e membranas celulares, desagregar as
estruturas onde estão inseridas, de modo a libertá-las para o meio, e extraí-las selectivamente, usando
propriedades químicas ou físicas que as diferenciem. Por outro lado, é preciso que a sua estrutura não
seja destruída, como no caso das proteínas, que são bastante sensíveis a factores como o pH do meio e
a temperatura.

Neste trabalho vamos extrair DNA de diferentes frutos (Kiwi e um fruto trazido pelos alunos), e
ainda proteínas de origem animal e vegetal (filete de peixe, soja, feijão demolhado e feijão enlatado).

A. Extracção do DNA

1. Descasque o fruto e obtenha um "gomo" com cerca de 10 g. Pese-o e registe o peso:


2. Coloque-o num copo de 250 mL. Adicione 20 mL de tampão de extracção de DNA (já preparado:
7,5 g de NaCl, 25 g de NaHCO3, 1 mL de detergente, água destilada num volume total de 600 mL)
3. Homogeneíze com a "varinha mágica" até desfazer o fruto (não mais de 20 s).
4. Filtre com um coador para um copo mais pequeno. Pese os resíduos que ficaram no coador.
5. Transfira 5 mL do filtrado para um tubo de ensaio de 15 mL.
6. Com uma pipeta de Pasteur de plástico deixe escorrer cuidadosamente um pouco de álcool 96%
gelado (vindo do congelador) pelas paredes do tubo, de modo a formar duas
fases (i.e., não misturar com o líquido que está na fase inferior).
7. Esteja com atenção à interface e procure detectar alterações. O DNA
forma filamentos (ver Fig. 1) - enrole-os com cuidado, utilizando uma vareta
de vidro.
Fig. 1. Filamentos de DNA na interface tampão de extracção/álcool
(http://gslc.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/)

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B. Extracção de proteínas e doseamento semi-quantitativo

NOTA: para minimizar a desnaturação das proteínas, o processo de extracção é sempre feito a
temperaturas baixas. Vamos utilizar um banho de gelo com sal para manter a temperatura abaixo de
0ºC.

1. Pese cerca de 1 g de músculo (filete de peixe) e de fonte de proteína vegetal (soja ou feijão).
2. Coloque ambas as fontes de proteína em copos de 25 mL, no banho com gelo. Adicione a cada um
10 mL de tampão de extracção de proteínas frio já preparado (Tris-HCl 0,1 moldm-3 a pH 8,0). Não se
esqueça de identificar sempre cada um dos extractos proteicos!
3. Homogenize no almofariz arrefecido (colocado sobre o gelo), até desfazer completamente. Transfira
cada homogenato para um tubo de centrífuga.
(Nota: se o seu grupo tiver apenas um almofariz, lave cuidadosamente o almofariz e pistão entre as
duas homogenizações, para não haver mistura entre as duas proteínas).
4. Centrifugue durante 5 minutos, à velocidade máxima, na centrífuga refrigerada. Registe a velocidade
utilizada: __________ r.p.m. (equivalente a (__________ x g), e a temperatura (____ºC).
5. Com cuidado para não levantar o resíduo da centrifugação, recolha o sobrenadante de cada tubo
para um tubo graduado, devidamente identificado. Registe o volume de cada extracto proteico:
6. Congele 1,5 mL de cada extracto num eppendorf. Este extracto será utilizado mais tarde, noutra aula.
Não se esqueça de identificar: o extracto, o seu grupo e o turno prático.

Com o restante volume, vamos avaliar de modo semi-quantitativo a concentração de proteína presente
em cada extracto. Vamos usar um corante, o azul de Coomassie, presente no Reagente de Bradford já
preparado (85 mg de Coomassie Brilliant Blue G, 50 mL etanol 96% (v/v), 100 mL de ácido fosfórico
85%, H2O destilada por cada litro), que tem a seguinte característica: em presença de proteínas, forma
um complexo por adsorção à ligação peptídica, mudando a cor do castanho para o azul.

8. Na tampa duma microplaca, identifique os poços que vai utilizar: pelo menos um para o controlo ou
"branco", um para a solução de BSA (albumina de soro bovino 1 mg/mL de Tris-HCl pH 8,0), e dois
para os extractos proteicos.
9. Em cada um desses poços, deite 3 gotas de cada amostra (não esquecendo o "branco").
10. Agora, adicione a cada poço 2 gotas de reagente de Bradford. Observe os resultados ao fim de 5-10
min.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H

Elabore o relatório de acordo com o modelo proposto no trabalho anterior com as necessárias
adaptações.

Questões:
- Extracção de DNA
1. Como foi conseguida a ruptura de membranas?
2. Se as membranas são lipídicas e os lípidos são substâncias insolúveis em água, deveriam ter-se
observado partículas gordurosas?
3. Qual a função do hidrogenocarbonato de sódio no tampão de extracção de DNA?
4. Com este método, terá extraído exclusivamente DNA?
- Extracção de proteínas:
1. Por que razão se homogenizou o músculo (ou feijão, ou pedaço de soja), para além de o fazer
contactar com o tampão de extracção?
2. Depois da centrifugação dos extractos proteicos, o que calcula que se encontrava no resíduo? E no
sobrenadante?
3. Compare a concentração de proteína das diferentes amostras.
- Análise global
1. Existirá a mesma quantidade de DNA em todas as células e tecidos? E de proteína?

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2. Por que razão a extracção de DNA foi feita à temperatura ambiente, e a das proteínas a baixa
temperatura?
(mais difícil...)
3. Compare os dois métodos de extracção, quanto às semelhanças e diferenças.

Bibliografia e endereços da internet:

- DNA from the beginning” - http://www.dnaftb.org/dnaftb/: DNA, história, animações, questões, etc
- "Genetics Science Learning Center", versão em espanhol
http://gslc.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/
- Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the determination of protein concentrations
using the Coomassie dye-binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
- " Bradford Protein Assay: Protein Concentration Determination by the Bradford Assay”
http://www.molecularstation.com/protein/bradford-protein-assay/

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Reacções dos hidratos de carbono

Recorrendo à utilização de uma série de ensaios qualitativos, procurar-se-á Solução Soluto


identificar o conteúdo numa amostra desconhecida. Irá ainda dispor de um A Glucose
conjunto de soluções conhecidas que poderá usar como teste positivo ou B Frutose
negativo indicadas na tabela ao lado (soluções a 1%). C Arabinose
D Sacarose
Neste trabalho mais que em qualquer outro, é necessário um bom plano E Lactose
de trabalho. Sugere-se a seguinte estratégia: F Amilopectina
1. Uma vez que pretende identificar uma solução problema, sugere-se G Amido
que comece por estudar as características estruturais das moléculas da
tabela acima.
2. Elabore um diagrama com uma sequência possível de ensaios a realizar e que lhe permita
chegar a uma conclusão (veja abaixo quais são os testes disponíveis e que características dos
hidratos de carbono permitem detectar).
3. Seleccione os controlos (positivo e negativo) a incluir em cada ensaio.

TESTE DE MOLISCH À PRESENÇA DE HIDRATOS DE CARBONO


1. Adicionar 2 gotas de reagente de Molisch já preparado (α-naftol, 50g/L etanol 96%) a 2 mL de
cada uma das soluções a ensaiar.
2. Escorrer cuidadosamente, na hotte, cerca de 2 mL de ácido sulfúrico concentrado pela parede do
tubo de ensaio, de forma a permitir a formação de duas fases.
3. Observar o desenvolvimento de cor arroxeada na junção das duas fases.

TESTE DE BENEDICT À CAPACIDADE REDUTORA DE HIDRATOS DE CARBONO


1. A 2 mL de reagente de Benedict já preparado (1,73 g CuSO4 5H2O, 10,0 g Na2CO3 anidro, 17,3 g
citrato de sódio dihidratado para 100 mL água destilada) são adicionadas 5 gotas de cada amostra.
2. Os tubos são incubados em água em ebulição durante 3-5 minutos.

TESTE DO IODO À PRESENÇA DE POLISSACÁRIDOS COM ESTRUTURA helicoidal


1. 2 Gotas do reagente já preparado (0,25 g de I2, 1,99 g KI por 100 mL água) são adicionadas a 10
gotas de cada amostra.

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2. Observe a cor formada

TESTE DE BARFOED À PRESENÇA DE MONOSSACÁRIDOS


1. Adicionar 2 mL de reagente de Barfoed já preparado (6,6 g Cu(CH3COO)2 e 1,8 mL de
CH3COOH glacial por 100 mL de reagente) a 1 mL de amostra.
2. Imergir os tubos em água em ebulição durante exactamente 2 minutos (períodos mais longos
podem resultar na hidrólise de dissacáridos, falseando os resultados).

TESTE DE BIAL PARA DISTINÇÃO DE HEXOSES E PENTOSES


1. Na hotte, adicionar 2,5 mL de reagente de Bial já preparado (3 g orcinol pa, 0,5 g FeCl3 em 100
mL de HCl concentrado) aos tubos de ensaio - ATENÇÃO: EXTREMAMENTE TÓXICO E
CORROSIVO.
2. Adicionar 1 mL de amostra e aquecer até à ebulição (prolongar a ebulição pode levar à reacção
com hexoses, falseando os resultados).

TESTE DE SELIWANOFF À PRESENÇA DE CETOSES


1. Adicionar 2 gotas de amostra a 2 mL de reagente de Seliwnnoff já preparado (0,1 g resorcinol e
30 mL de HCl concentrado para 100 mL de reagente)
2. Aquecer num banho de água em ebulição durante 3 minutos (prolongar a ebulição pode levar à
reacção com aldoses, falseando os resultados).

Elabore o relatório de acordo com o modelo estabelecido, com as observações apresentadas em tabela
(não esqueça de indicar os resultados observados para o controlo positivo e negativo em cada teste).
Quais as suas conclusões quanto à constituição da amostra desconhecida?

Bibliografia
Artigo original: Benedict, S. R. (1908). "A Reagent For the Detection of Reducing Sugars". J. Biol.
Chem. 5: 485–487. http://www.jbc.org/cgi/reprint/5/6/485
http://www.answers.com/topic/benedict-s-reagent (consultado 30-01-2008)
Carbohydrate Characterization:
http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH150/experiments/carbohydrates.htm (consultado 30-01-2008)

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Colorimetric identification of unknown sugars:
http://www.science.smith.edu/departments/Biochem/Biochem_353/CARBO.html (consultado 30-01-
2008)

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Extracção, identificação e quantificação espectrofotométrica do Licopeno

1. Procedimento experimental
Solução de extracção
• Mistura de hexano/acetona/etanol
(2:1:1 v/v/v)

Nota: a inalação do n-hexano pode ser prejudicial à saúde; por esta razão todo o procedimento de
extracção deverá ser efectuado na hotte.

Cada grupo irá trabalhar com uma amostra diferente. O docente irá distribuir por cada grupo o tomate
ou subproduto do tomate que irá ser utilizado para a realização deste trabalho.

1- Retire a casca e as sementes do tomate fresco e homogenize num almofariz. (este passo não é
realizado no caso de usar subproduto do tomate)
2 - Pese cerca de 2,5g de amostra homogenizada e coloque num frasco Schott embrulhado em papel de
alumínio para excluir a luz. Registe o peso.
3 - Na hotte, adicione 25 mL de mistura de hexano/acetona/etanol (2:1:1 v/v/v), e coloque uma barra de
agitação magnética no frasco. Tape com a rolha deixe na hotte, sob agitação, durante 30 minutos.
4 - Ao fim desse tempo pare a agitação e adicione 5 mL de água destilada. Deixe separar as fases
durante cerca de 5 a 10 minutos. Com uma pipeta de Pasteur, retire o pigmento, que fica localizado na
fase orgânica, para um tubo com rolha preta, envolto em papel de alumínio.
5 – Trace o espectro de absorção no espectrofotómetro entre 400 e 600 nm, depois de fazer a linha de
base com n-hexano. Se estiver muito concentrado (absorvância máxima superior a 1), dilua com n-
hexano.
6 – Leia a absorvância da solução ao máximo de absorção

Atenção: os resíduos devem ser colocados no frasco marcado “resíduos n-hexano”.

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2. Tratamento dos resultados

1 - Compare o espectro obtido com os espectros de absorção de alguns


pigmentos indicados ao lado
2 - Qual dos espectros se assemelha mais ao que obteve na sua
experiência? Identifique o pigmento extraído com base nesta
característica.
3 – Se tiver extraído essencialmente licopeno puro, quantifique-o
utilizando o coeficiente de extinção molar ε470nm= 1,85x105. Apresente
os resultados como mglicopeno/g tomate ou mglicopeno/g amostra usada).
4 - Compare os valores obtidos pelo seu grupo com os dos outros
grupos. Qual a fonte que será a maior fonte de licopeno?
5- Muitas pessoas preferem preparar saladas utilizando tomate pouco maduro. Que lhe parece este
hábito, depois de ver os resultados das experiências do seu turno prático?

Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.

Bibliografia

Spectrofotometry: http://www.chm.davidson.edu/ChemistryApplets/spectrophotometry/index.html
(consultado 7-2-2008)
Lycopene: http://www.3dchem.com/molecules.asp?ID=103 (consultado 30-01-2008)
Stahl, W. and Sies, H. Lycopene: A Biologically Important Carotenoid for Humans? Archives of
Biochemistry and Biophysics, Volume 336, Issue 1, 1 December 1996, Pages 1-9.

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QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS: MÉTODO DO BIURETO

Em condições alcalinas, substâncias que contenham uma ou mais ligações peptídicas formam
um complexo de cor violeta com os sais de cobre do reagente de biureto. Deste modo, quanto mais
proteína houver na solução, mais forte será a intensidade da cor violeta (o que pode ser quantificado
medindo a absorvância da solução resultante a 520 nm. Neste trabalho irá quantificar o teor de proteína
no extracto proteico que obteve numa aula anterior e guardou no congelador.

1. Preparação das soluções padrão para a recta de calibração


1.1. Prepare a solução padrão-mãe de BSA (albumina de soro bovino, "Bovine Serum Albumine"), com
uma concentração de 5 mg/mL.
1.2. Prepare 5 soluções padrão por diluição da solução padrão-mãe numa gama de concentrações de 0,5
a 5 mg/mL de BSA. Homogenize bem as soluções. (não utilize volume final inferior a 10 mL).

2. Reacção com o reagente de biureto


2.1. Faça reagir em diferentes tubos de ensaio 1 mL de cada uma das soluções padrão que preparou
com 1 mL de reagente de biureto já preparado (2 g NaOH, 0,5 g sulfato de cobre (CuSO4,5H2O), 2,25 g
tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O), 0,75 g sulfato de sódio pentahidratado (NaSO4
5H2O) e 1,25 g de iodeto de potássio para cada 250 mL de solução). Homogeneíze bem a solução.
2.2. Repita o procedimento anterior usando 1 mL de extracto proteico obtido pelo seu grupo numa aula
anterior. Não se esqueça de preparar um "branco".
2.3. Decorridos 15 min, leia no espectrofotómetro a absorvância a 520 nm, depois de acertar o zero do
aparelho. Determine o valor de proteína por massa de amostra inicial.

Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.

Bibliografia:
Colorimetric Assays: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html (consultado 7-
02-2008)
Biuret Protein Assay: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/biuret.html (consultado 7-02-
2008)

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Extracção de lípidos e determinação de colesterol

NOTA: o procedimento para as sementes (A) e para a gema de ovo (B) tem algumas diferenças, mas a
maioria dos passos pode ser executada em simultâneo. Leia o protocolo e planeie a maneira de
aproveitar os passos comuns de modo mais eficiente.

A. Extracção de lípidos de sementes oleaginosas (noz)

1. Pese cerca de 1g de sementes.


2. Transfira para um almofariz, adicione 5 mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1 (v/v) e
homogenize cuidadosamente.
3. Transfira o extracto para um tubo de vidro graduado, lavando o conteúdo do almofariz com mais 5
mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1 (v/v).
4. Coloque o tubo (tapado) num banho termostatizado a 50ºC durante 10 min. Arrefeça em água fria.
5. Filtre para um tubo graduado previamente pesado o extracto anterior.
6. Adicione ao tubo um volume de solução de CaCl2 0,02% (p/v) correspondente a 0,2 vezes o volume
de filtrado. Homogenize no vórtex.
7. Adicione o mesmo volume medido no ponto 6 de uma solução clorofórmio:metanol:água (2:50:50,
v/v/v). Misture, deixe no gelo até separação das duas fases e aspire a fase aquosa com uma pipeta de
Pasteur, eliminando-a.
8. Meça o volume total da fase orgânica e registe.
9. Retire 1 mL para um tubo de ensaio normal para determinação do teor de colesterol (parte C do
protocolo).
10. Coloque o tubo graduado num banho a 80ºC na hotte e deixe evaporar o solvente até à secura.
11. Pese o extracto seco e, a partir do valor obtido, determine a quantidade de "lípidos totais" por
grama de tecido fresco. Identifique e guarde o extracto lípido para a próxima aula prática.

B. Extracção de lípidos de gema de ovo


1. Tal como anteriormente, pese cerca de 1g de gema de ovo, directamente para um tubo graduado.
2. Adicione 10 mL de mistura clorofórmio:metanol 2:1 e homogenize bem no vórtex.
3. Filtre para um tubo graduado com rolha, previamente pesado, o extracto anterior.

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Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
4. Adicione ao tubo um volume de solução de CaCl2 0,02% (p/v) correspondente a 0,2 vezes o volume
de filtrado. Homogenize no vórtex.
5. Adicione o mesmo volume medido em 4 de uma solução clorofórmio:metanol:água (2:50:50, v/v/v).
Misture no vórtex, deixe no gelo até separação das duas fases e aspire a fase aquosa com uma pipeta de
Pasteur, eliminando-a.
6. Meça o volume total da fase orgânica. Retire 1 mL para um tubo de ensaio normal, para
determinação do teor de colesterol (parte C do protocolo).
7. Coloque o tubo graduado num banho a 80ºC na hotte e deixe evaporar o solvente até à secura.
8. Pese o extracto seco e determine a quantidade de "lípidos totais" por grama de tecido fresco.
Identifique e guarde o extracto lípido para a próxima aula prática.

C. Quantificação do colesterol total


1. Coloque em tubos de ensaio diferentes 1 mL de cada extracto lípidico.
2. Execute o procedimento indicado em 1 para uma solução referência (solução de colesterol 10 mM) e
outro para o controlo negativo.
2. Adicione a cada tubo 5 mL de reagente de Liebermann-Buchard já preparado (60 mL de anidrido
acético, 10 mL de H2SO4 concentrado, 30 mL de CH3COOH glacial e 0,6 g Na2SO4 anidro), na hotte.
CUIDADO, O REAGENTE É CORROSIVO!!!
3. Tape os tubos e coloque-os em banho-maria a 35ºC durante 10 min.
4. Observe a cor dos tubos ao fim desse tempo e quantifique o teor de colesterol numa escala de 1 (não
tem colesterol) a 5 (tem colesterol numa concentração de1,7 mM).

Elabore o respectivo relatório seguindo o modelo estabelecido com as adequadas adaptações. Não
esqueça os comentários e conclusões.

Questionário:
1. Segundo os resultados obtidos, qual dos tecidos continha mais colesterol?
2. De que forma poderíamos quantificar o colesterol com maior precisão?

Bibliografia:
Barreto, M. Carmo "Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol." J. Chem.
Educ. 2005, 82, 103-104.

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Guia dos trabalhos práticos de Bioquímica/Bioquímica I (2007/2008)
Cholesterol Analysis: http://employees.oneonta.edu/helsertl/CholesterolLab.html (consultado em 30-
01-2008).
Extracção e quantificação do colesterol: www.dqb.fc.ul.pt/cup/44302_44329/FundQuimB-
Trab_4_0708.pdf (consultado em 30-01-2008).
A. P. Kenny, The determination of cholesterol by the Liebermann-Burchard reaction, Biochem J. 1952
52(4): 611–619. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1198067 (consultado em
30-01-2008).

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