DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS

MUÑOZ, James; PAZ Claudia; VIDAL, Iván F.

Universidad del Cauca, Departamento de Química, Laboratorio de Bioquímica
Popayán, Colombia

OBJETIVOS METODOLOGIA

Determinar la concentración de proteína Se prepararon 7 soluciones diluidas de

(albúmina bovina) mediante el método de
Lowry.
Determinar la concentración de 3 muestras
problema a partir la construcción de una
curva de calibración.
concentración 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ppm a
partir de 100 mL de una solución de 30
ppm. Seguidamente se realizó el método de
Lowry (ver Figura 1).

Figura 1. Diagrama de flujo.

RESULTADOS

Cuadro 1. Registro del valor de absorbancia para las muestras de trabajo.

Valor de la absorbancia
Concentración (ppm)
observada (750 nm)
Blanco 0.26
2 0.38
4 0.56
6 0.4
8 0.41
10 0.52
12 0.41
14 0.56
MP1 0.7
MP2 0.66
MP3 0.7
Datos en rojo: datos descartados.
Figura 2. Curva calibración Proteína para 5 datos. Absorbancia-Concentración (ppm).

Tabla1. Datos obtenidos curva de calibración Proteína.

x y r b a sb sa
-5
8. 0.19 0.916 0.016 0.06 1.725x10 1.38x10-3
0 4 7 5 2

Significancia de la correlación. Limites de confianza de la pendiente

Ho: r =0 (b) y la ordenada (a).
Para t(n-2) grados de libertad, y un nivel
r n −2 0.9167 5 −2 de confianza del 95%.
t= t= = 3.97
1−r2 1 − 0.9167 2
b ± t ( n −2 ) s b
t(calculado)>t(tabulado); 0.0165 ±(3.18 )(1.725 x10 −5 )
3.97>3.18 para un contraste t de dos colas, = 0.0165 ±5.4855 x10 −5
t(n-2) grados de libertad, y un nivel de
confianza del 95%. Se rechaza Ho. Existe a ± t ( n −2 ) s a
correlación significativa. 0.062 ±(3.18 )(1.38 x10 −3 )
= 0.062 ±4.3884 x10 −3

Cuadro 2. Concentración calculada para las muestras problema.

Concentración
Muestra Absorbancia
calculada (ppm)
Muestra problema 1 0.44 22.9
Muestra problema 2 0.4 20.48
Muestra problema 3 0.44 22.9
Error aleatorio de las concentraciones debido a que el posterior cálculo de las
calculadas (Sxo). concentraciones de las soluciones
∑( y i − yˆi ) 2 = 0,02088468 problema presenta un error aleatorio muy
alto lo que a su vez genera un límite de
confianza muy amplio (88.5% para MP1 y
Sy =
∑ (y i − yˆ ) 2 MP3, 98.97% para MP2) por encima y por
x n−2 debajo de la concentración obtenida,
generando que estas concentraciones
0,02088468 obtenidas no sean confiables.
Sy = = 0.0834335 La tendencia no lineal de la curva es
x 5−2 debida a la precipitación de la proteína, la
cual fue diferente en cada muestra,
∑( x i − x ) 2 = 400 causando lecturas variables de la
absorbancia.
Sy
1 ( y − y) 2
Sx o = x
1+ + 2 o Análisis método de Lowry. El fundamento
b n b ∑ ( xi − x ) 2 del método de Lowry para cuantificación
de proteínas esta basado en la interacción
Sx o = 6,3756439 de las proteínas con el reactivo de Folin
(tungstato, molibdato y fosfato) en medio
alcalino (pH 10-10.5) y con Cu 2+. Es una
Límite de confianza de las valoración colorimétrica cuantitativa de las
concentraciones calculadas (xo). proteínas, siendo la intensidad de color
Para t(n-2) grados de libertad, y un nivel de proporcional a la concentración de
confianza del 95%. proteínas. Este método consta de dos
etapas:
x o ± t ( n −2 ) Sx o En la primera los iones Cu2+, en medio
alcalino, se unen a las proteínas formando
22 .9 ± (3.18 )6,375 = 22 .9 ± 20 .27
complejos con los átomos de nitrógeno de
20 .48 ± (3.18 )6.375 = 20 .48 ± 20 .27
los enlaces peptídicos. Estos complejos
22 .9 ± (3.18 )6,375 = 22 .9 ± 20 .27
Cu2+-proteína tienen un color azul claro.
Además, provocan el desdoblamiento de la
estructura tridimensional de la proteína,
ANALISIS DE RESULTADOS exponiéndose los residuos fenólicos de
tirosina que van a participar en la segunda
Análisis curva de calibración Proteína. Al etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene
observar la tendencia de los puntos sobre la en solución alcalina en forma de su
curva de calibración fácilmente se puede complejo con tartrato.
concluir que no existe una tendencia lineal. En la segunda parte se da la reducción,
Sin embargo al aplicar la estadística del también en medio básico, del reactivo de
caso se tiene que: el coeficiente de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos
correlación para los todos los datos es muy de los residuos de tirosina, presentes en la
inferior (r=0.3465) al aceptado (>0.95), mayoría de las proteínas, actuando el cobre
por lo que se excluyen 2 datos (los más como catalizador. El principal
alejados del intervalo según prueba Q), constituyente del reactivo de Folin-
para obtener un r=0.9167 el cual sigue Ciocalteau es el ácido
estando muy alejado del aceptado, pero fosfomolibdotúngstico, de color amarillo,
que sin embargo presenta correlación que al ser reducido por los grupos
significativa. Aunque el número de datos fenólicos da lugar a un complejo de color
escogido (n=5) presente significacia azul intenso.
correlativa, no es una significancia ideal
Cuando el reactivo de Folin es adicionado
a la proteína tratada con Cu2+ el máximo
color se da si la reducción ocurre alrededor
de un pH 10. En este punto el reactivo,
solo esta reactivo por un corto periodo de
tiempo.
Posibles explicaciones de la precipitación
de la proteína para nuestro caso pueden ser
que no se dio la reacción previa de la
proteína en medio alcalino con iones Cu2+,
en presencia de tartrato, lo que permite la
precipitación de la misma. Entre otras se
pudo presentar un rearreglo en la reducción
primaria del producto por lo que el
espectro de absorción cambia de forma
entre 3-30 minutos. Además durante el
primer minuto o más después de la adición
del reactivo de Folin, éste libera ácido
extra, lo cual podría ser resultado de la
disociación del fosfomolibdato, generando
que el buffer no pueda cumplir su función
y se sobrepase el punto isoelectrico de la
proteína lo que a su vez la precipita.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
Determine las concentraciones de las
muestras problema en función de la
curva de calibración.
Cuadro 3. Concentración calculada.
Concentración
Muestra calculada
(ppm)
Muestra problema 1 22.9
Muestra problema 2 20.48
Muestra problema 3 22.9
¿Para qué se emplea el meso-1,4-
dimercapto-2,3-butanodiol? Explicar el
fundamento químico
El meso-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol o
ditiotreitol (DTT) es un compuestos capaz
de reducir los enlaces disulfuro de las
proteínas (-S-S-) a grupos sulfhidrilo (-
SH). Permite desplegar completamente una
proteína y separar las subunidades de una
proteína multimérica; ambos efectos son
necesarios para que la movilidad de la
proteína en una electroforesis SDS-PAGE
sea acorde con su masa molecular.
La eficiencia del DTT como reductor de
puentes disulfuro que se ubican
generalmente en el interior de la proteína,
se debe a su estructura química que le
permite formar un anillo de seis átomos al
oxidarse.
CONCLUSIONES
No fue posible demostrar la efectividad del
método de Lowry para la cuantificación de
proteína de albúmina bobina, debido a que
al adicionar el reactivo de Folin a los pocos
minutos la proteína se precipitó, muy
posiblemente a que el buffer no pudo
amortiguar un exceso de ácido generado en
la disociación del fosfomolibdato.
Las concentraciones obtenidas para las
muestras problema presentan poca
confiabilidad ya que su rango de límite de
confianza en muy amplio.
BIBLIOGRAFIA
BOHINSKI, Robert. BIOQUIMICA. 5 ed.
Mexico: Pearson. 1991. p. 80-96
MILLER, J. N.; MILLER, J. C. Estadística
y Quimiometría para Química Analítica. 4
ed. España: Prentice Hall, 2002.p. 113-124
LEHNINGER, A. Principles of
Biochemistry. 4 ed. New York: Worth
Publishers. 2006. p.38-41
LOWRY, O.; ROSEBROUGH, N; FARR,
A.; and RANDALL, R. (1951) PROTEIN
MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL
REAGENT. The Journal of the Biological.
Chemistry. 193: 265-275