PRÁCTICA # 5

“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE

MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y
ESTUDIO DE BACTERIAS”
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos
métodos que permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es
posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo
de microorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de
microbiología consiste en transferir una muestra microbiológica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener
cultivos microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario
considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para
impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra
parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las
condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de
cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la
incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la
luminosidad.
La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la
obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio,
caracterización, aplicación y control de los mismos. La forma de
sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósito
específico del estudio.
OBJETIVOS:
ξAplicar la técnica adecuada para preparar el área de
trabajo y evitar contaminaciones.
ξOrganizar el material para su fácil manejo e
identificación.
ξManipular adecuadamente los cultivos puros.
ξSeleccionar y aplicar las técnicas de siembra
adecuadas para alcanzar propósitos específicos.
ξIdentificar y describir correctamente las
características culturales y microscópicas de algunas
bacterias.
ξOrganizar e interpretar los resultados del estudio
macroscópico y microscópico de bacterias.
MARCO TEÓRICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el
desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio
controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio
se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de
microorganismo, se denomina cultivo puro oaxénico, cuando contiene
más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un
cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es
conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente
de una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza.
En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo
humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y
diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene
artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se
han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están
por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y
recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no
deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que
éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico
es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio
sólido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un
solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones
favorables. Unclon está constituido por una población de células
descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo
suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un
medio sólido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el
mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de
otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta
transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o
carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que
el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por
microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que
eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el
lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de
cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una
zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al
conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la
contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y
detallado de la misma evita accidentes tales como:
o

La contaminación y pérdida del cultivo en estudio

o

La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la

contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto
es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patógenos.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del
principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario.
Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene
varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad
pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente
para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras
microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiológico son
terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con
filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle
o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja,
asa, espátula y/o gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los
diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo:
los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con
tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser
transferido mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta
pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este
tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que
se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las
ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de
agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra
parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas
y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del
inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar
contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de
siembra (asa recta) o pipeta pasteur; en este último caso es necesario
calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una
temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se
homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la
movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de
microorganismos con diferentes requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la
cantidad o de las necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan
o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la
superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los
microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles
a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que
presentan características que varían con el tipo de microorganismo
cultivado y el medio de cultivo empleado.
En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya
que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH
neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al
proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del
microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo
propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones
adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de
los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las
veces están relacionadas con la de su hábitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren
temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para
alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora
microbiológica o un baño de agua a temperatura constante, en tanto que
para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a
temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del
laboratorio, a temperatura ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en
cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos.
La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco,
lo que determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el
crecimiento de cualquier cultivo
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experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de

nueve días. Con relación a las necesidades gaseosas, no todos los
microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólo
crecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo
crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados o
estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce
como facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias
que requieren oxígeno, pero sólo lo utilizan cuando éste existe en
concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El
desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de
los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean
sustancias reductoras o equipos especiales.
Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o
en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en
forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos,
comensales o mutualistas. Fisiológicamente este grupo presenta
características muy variables, hay bacterias móviles e inmóviles
fotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en
un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se
emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma
de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas,
movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales
en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo
en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra:
El método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos.
Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población
mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio
sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les
denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio
menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la
región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra
con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún.
Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales.
A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo
que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones
para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente
representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo.
Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado
una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos
obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de
una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se
desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos
axénicos.
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se
diluyenantes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la
muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede
realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones
de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una
suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan
diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero
a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade
1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina,
igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el
proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede
proceder de dos maneras diferentes.
En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con
agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas
en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se
extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en
placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de
la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de
cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células
microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban
hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por
estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las
placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el
método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el
proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de
que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el
método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de
seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos.
Para obtener un cultivo axénico mediante este método:
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composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente
de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto
de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros
organismos, denominadosexigentes, requieren medios químicamente
muy complejos. Por ejemplo, la bacteria
Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que
requiere un medio con muchos ingredientes. Los
medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos,
pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se
requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las
bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los
requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre
pueden utilizarse.
Medios complejos
Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos
medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales
como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un
medio líquido complejo se denominacaldo. La caseína u otras proteínas
que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o
en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de
utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en
péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las
proteínas parcialmente hidrolizadas se les denominapeptonas. Entre las
peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la
triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de
caseína.
Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos
deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se
comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios
es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se
utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar
nutritivo. Generalmente se prefiere la utilización de los medios complejos,
ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los
microorganismos.
Medios selectivos
Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos,
mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan
para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por
ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi,
agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos
de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque
contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o
el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos
pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene
sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium
botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio
SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras
especies de
Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor
extremo de pH o una fuente de carbono poco
común.
Medios diferenciales
Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un
determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus
pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar
sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria
muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen
hemólisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias
relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH
porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del
indicador y por tanto de sus colonias.
Medios selectivos-diferenciales
Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar
MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para
detectar cepas deSalmonella yShigella, bacterias entéricas (del
intestino) que causan disenterías. Cualquier muestra de heces enviada al
laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies.
El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz
grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las
sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
positivas(Salmonella yShigella son Gram negativas). A partir de aquí, el
componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser
importante.Salmonella yShigella no fermentan la lactosa, pero la mayor
parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas
dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo serán.
Medios de enriquecimiento
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anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más

difícil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los
microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos
líquidos con más de uno o dos centímetros de profundidad deben
oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a
través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi
todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son
plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces
convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de
rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El
suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se
utilizan para producir antibióticos, es un desafió para la ingeniería. Estos
cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores,
mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de
aire.
La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea
problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden
cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un
compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato ,

que
reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de
oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petri, si
estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya
eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte
como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación
química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas
mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua;
el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la
reacción consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo
para disminuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir
anhídrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos)
es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la
vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba
para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido
láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente
cuando el dióxido de carbono les favorece.
Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una
breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal
herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para
añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para
sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas.
Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno ,

en las cuales
se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos
laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos
trabajan con máscaras de oxígeno.
Conservación de los cultivos axénicos
Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el
laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos.
Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco,
mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede
mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los
cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como
referencia se les denomina cultivos de colección .
 Muchos laboratorios poseen una
colección de cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de
las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones
que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un
servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de
los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación
(eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura.
Los cultivos generalmente se desecan porliofili zación (congelación y
desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte
en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para
proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo
seco y se expone al vació para su sublimación (eliminación del agua
congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen
congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras
aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a
temperatura ambiente.
Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con
sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el
dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan
por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en unultracongelador,
capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.
Observación de las bacterias:
a) Observación macroscópica: El tamaño de las bacterias impide
verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias
que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A
nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño,
aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de
brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen
modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver
esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa
si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona
superficial, si producen pigmentos, etc.
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b) Observación microscópica: Puesto que la inmensa mayoría de las
bacterias son incoloras, la única forma de
observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su
contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con
colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste,
generalmente de fases, en el microscopio.
Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su
fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o
dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en
sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave
utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar
repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación
por calor se procede a la tinción.
CUADRO DE CARÁCTERÍSTICAS DE BACTERIAS PATÓGENAS:
GÉNERO Y
ESPECIE
MACROSCÓPICAS
MICROSCÓPICAS
TINTORIALES
Micrococcus
luteus
Aerobio
estricto,
coagulasa negativa, forma colonias amarillo brillantes
en agar nutritivo
cocos
Gram +
Escherichia Coli
Móviles, aerobias, anaerobias facultativas, mesòfilas, pH 6-8, indol, lactosa
y glucosa positivo
Bacilos,
capsula
o
microcápsula,
flagelos
perìtricos
Gram -
Pseudomona
aeruginosa
Móviles, colonias gris con brillo metálico, aroma semejante a uva
fermentada
Bacilos, un flagelo polar o un mechón de 2 a 3 flagelos, pillis
Gram -
Staphylococcus
aureus
Inmóviles, colonias pequeñas,
circulares,
borde
continuo, cremosas, anaerobios facultativos,
fermentadores de maltosa, lactosa, glucosa, manitol, producción de ácido
láctico, catalasa
Cocos, racimos o cadenas
cortas, 0.7 a 1.2 micras
Gram +
Streptococcus spInmóviles, colonias elevadas, lisas,
circulares, aerobio y anaerobio
facultativo
Cocos
en
racimos,
capsuladas
Gram +
Bacillus anthracisMóviles o inmóviles, esporulados,
aerobios
bacilos
Gram+
Bacillus cereus
Aerobio o anaerobio facultativo, móvil, hidroliza la lecitina de huevo y no
fermenta el manitol
Bacilos esporulado
Gram +
Bacillus subtilis
Catalasa +, aerobio
Bacilos que esporulan
Gram +
Yersinia pestis
inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, fermentadores, ureasa y
catalasa+, en ocasiones prod gas
Bacilos con extremos
redondeados,
 flagelos perìtricos o anfitricos, pillis, cápsula de poco
espesor
Gram -
Mycobacterium
leprae
No se puede cultivar in Vitro,
inmóvil
Bacilo delgado recto, en
empalizada o haces
Ácido alcohol resistente
Gram.+
Kleibsella
pneumoniae
Inmóviles, aerobios, anaerobios
facultativos,
fermentadores
y
catalasa+, prod. gas
Bacilos capsulados
Gram -
Clostridium tetaniMóviles,
colonias
brillantes, traslucidas, gris amarillas borde irregular
rizoide,
anaerobios estrictos, pH 7.2-7.6 T 37ºC, prod gas y olor
desagradable
Bacilos solos en cadena o pares, flagelos perìtricos, prod esporas
redondas terminales
Gram +
Clostridium
botullinum
Colonias pequeñas, traslucidas, borde filamentoso, centro opaco, blanco
grisáceo,
anaerobios
estrictos
Bacilos
aislados
en parejas o cadenas cortas, flagelos perìtricos
Gram +
Mycobacterium
Forman un pigmento amarillo en bacilo delgado, extremos Acido-
alcohol resistente,
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tuberculosis
incubación, aerobios estrictos
redondeados
Gram.+
Nocardia
Microaerofìlicos,
anaerobios,
fermentadores +
Bacilos y cocobacilos
Gram +; débilmente
acido-alcohol resistentes
Salmonella TyphiMóviles, colonias grandes de 2 a
4mm rugosas o lisas, aerobios, anaerobios facultativos, mesòfilos,
fermentadores, prod. H2SO4
Bacilos, flagelos perìtricos
no esporulados
Gram -
Shigella
dysenteriae
Inmóvil, colonias redondas 2mm, convexas, transparentes, aerobios,
anaerobios facultativos, glucosa + indol+ o -
bacilos
Gram -
Chlamydia
trachomatis
Inmóviles, filtrables
cocoides
Gram - ; tinción con giemsa, castañeda o machiavello
Brucella sp
Inmóviles,
aerobio,
catalasa,
oxidasa y ureasa positivos
Bacilos
cortos;
cocobacilos
Gram -
Neisseria
gonnorrhoeae
Inmóviles, aerobios, anaerobios facultativos, pH de 6 a 8, oxidasa y
glucosa positiva
Cocos
en
pares, capsulados de 0.6 a 1micra
Gram -
Streptococcus
pyogenes
Inmóviles, colonias en forma de disco, mucosas, mate, lisas o rugosas con
hemólisis alrededor, anaerobios facultativos, producen ácido láctico
Cocos en cadena, 0.5 a
2mm
Gram+
Rickettsia
pallidum
Inmóviles, intracelulares obligados
Bacilos o cocobacilos, pared formada por 3 capas a manera de cápsula,
cubierta
mucilaginosa
Gram - ; tinción con Giemsa, Machiavello o Jiménez
Vibrio Cholerae
Móvil,
aerobio,
anaerobio facultativo, sensible a la acidez, catalasa,
indol, oxidasa, rojo de metilo, sacarosa y fermentador +
Bacilo curvo, un flagelo
polar
Gram -
Corynebacterium
diphtheriae
Aerobio
y
microaerofìlico,
inmóviles,
catalasa
+
fermentadores + T 35ºC pH 7.6
Bacilo en forma de basto con uno de sus extremos más angosto,
agrupación en empalizadas.
Gram +; la tinción no es uniforme debido a los gránulos que contiene en su
citoplasma, que se tiñen más intensamente
MATERIAL:
Pipeta
pasteur
estéril
4 tubos con
caldo
4 tubos con medio SIM
2 mecheros
Asa y portasa
Etiquetas o marcador
∗Cultivos de las siguientes bacterias:
ξEscherichia coli
ξBacillus Subtillis
ξStaphylococcus Aureus
ξStreptococcus
Faecallis
ξPseudomona
Aureginosa
ξStaphylococcus
Epidermis
MÉTODOLOGÍA:
o

Limpiar y esterilizar el área de trabajo

o

Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que esta presente

un cono azul bien marcado.
o

Identificar y organizar el material dentro del área de trabajo.

o

Marcar los tubos con iniciales de la cepa a sembrar y fecha.

a) Siembra en medio líquido:
Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una
pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo
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que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril.
Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra.
Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la
temperatura óptima de crecimiento.
b) Siembra en medio semisólido: La siembra en este tipo de medio,
que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y que
se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado,
con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el
hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por
la misma trayectoria utilizada al realizar
Técnicas de estriado:
a)estriado simple: estriado continuo: Esteriliza el filamento del asa
de siembra y toma la parte de la caja
de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cercas del mechero
espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja
a su tapadera, ahora, toma una placa con agar estéril (donde se vaya a
sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un
extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza
las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de
una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de
la muñeca.
b)estriado en cuadrantes: la mayor parte del inóculo e descarga en
los cuadrantes 1y 2, lo que permite
obtener colonias separadas en 3 y 4; Con un asa de siembra, previamente
esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se
extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con medio, en
forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el
medio. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada
previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo
nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y
enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva
la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición
invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de
una muestra que contenga un elevado número de bacterias.
Guía de observación:
o
Observe las características culturales de las colonias formadas
para cada sembrado en los diferentes medios
de cultivo.
o

Describa las observaciones en la tabla correspondiente.

o

De cada microorganismo hacer un frote y teñir mediante la

técnica de gram.
o

Observe al microscopio describir las características de las

diferentes bacterias en estudio en la tabla
correspondiente.
o

Compare el desarrollo de las bacterias inoculadas en los

diferentes medios para anaerobios.
o

Con base en los resultados obtenidos, indicar cuál bacteria es

aerobia, anaerobia, anaerobia facultativa o
microaerofílica.
Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas
aisladas sobre medio sólido:
10
RESULTADOS:
Tabla de las características de cultivos bacterianos:
CULTURALES
Bacteria
E.
Faecallis
Staphylococc
us Aureus
Bacillus
Subtillis
Staphylococcu
s Epidermis
Escherichia coli
Pseudomon
a
Aureginosa
1) En medio líquido:
Crecimient
osuperficial
Anaerobi
o
facultativ
o
Anaerobio
facultativo
aerobio
anaerobio
-
-
Opacidad
mediana
nula
mediana
nula
-
-
Sedimentogrumoso
compacto
Compacto
viscoso
-
-
2) En medio semi-sólido
Forma de
la línea de
la
picadura
Papilar
móvil
-
-
-
Papilar móvil
Vellosa
móvil
3) Colonias en placa
Medio
Mc
Conkey
-
Sal Manitol
-
Mc Conkey
EMB
EMB
Forma
Fusiforme
-
fusiforme
-
Circular
Circular
Circular
Elevación
Plana
-
convexa
-
Convexa
Convexa
Convexa
Bordes
Filamentos
o
-
Ondulado
-
Ondulado
Ondulado
Ondulada
Textura
Plana
-
Membranos
o
-
Membranos
o
membranos
o
Butirosa
Color
rosado
-
morado
-
rojizo
morado
Metalico
MICROSCÓPICAS
Forma
Cocos
Cocos
Bacilos
Cocos
Bacilos
bacilos
Agrupació
n
Cadenas
Racimos
En pares y
en cadena
Racimos
Cadenas
Cadenas
Gram
Gram +
Gram +
Gram +
Gram +
Gram -
Gram -
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
 Se realizaron 3 técnicas para sembrado de cultivo: en medio
líquido (con caldo nutritivo), en medio semi-
sólido (medio SIM) y en placa (con estriado simple y en
cuadrantes), con 6 diferentes bacterias para
después dejar incubar las bacterias.
 Una vez incubadas las bacterias se observaron sus
características macroscópicas o culturales y sus
características microscópicas; Los resultados de estas observaciones
realizadas se pueden ver en la tabla anterior, en la que se puede observar
que cada una de ellas varía de a cuerdo a sus características específicas
de crecimiento en los diferentes medios.
CONCLUSIONES:
Por medio de esta práctica se logró utilizar las técnicas aprendidas durante
el transcurso del curso. Se logró aprender a realizar algunos de los
métodos que existen para cultivar bacterias y de esta manera observar sus
características tanto macroscópicas como microscópicas e interpretación
de las mismas, con lo que se observó
11
que para cada bacteria existen características diferentes que son las que
las identifican y diferencian de otras bacterias, por lo que de esta manera
se le puede llegar a identificar con su correcta siembra y observación para
análisis posteriores o simplemente para la identificación de una bacteria en
algún medio u organismo.
BIBLIOGRAFÍA:
ξ Romero Cabello, R. Microbiología y Parasitologìa Humana: Bases
etiológicas de las enfermedades infecciosas.
Editorial Panamericana, México 2001. 2ºed. Pp.257-429
ξ http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jolope/GUIONPRACTICA
S0506.doc
ξhttp://es.wikipedia.org/wiki/
ξ http://www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.pdf
12

5.- Tecnicas Basicas Para El Cultivo de

Microorganismos
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Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.

Organizar el material para su fácil manejo e identificación... (More) Aplicar la técnica adecuada
para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.
Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.
Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas
bacterias.
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.
(Less)
tecnicas de siembra
medios de cultivo
condiciones ambientales para medios de cultivo
conservacion de medios de cultivo
(mas etiquetas)
tecnicas de siembra
medios de cultivo
condiciones ambientales para medios de cultivo
conservacion de medios de cultivo
caracteristicas macroscopicas y microscopicas de microorganismos
mircroorganismos
bacteriano medio
aislamiento transferencia
microscopicos
coli forma
microbiologia sistemas
mismo microorganismo
morfologica
hisopo
tecnicas aislamiento
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Gracias mano, me sirve mucho!
02 / 28 / 2011

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¡Este documento ha logrado llegar a la lista de crecimiento!
06 / 21 / 2010

Francisca Parraguez Figueroadejó un comentario

me sirve...
05 / 23 / 2010

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Dan Chate Velasque.dejó un comentario
great job
10 / 05 / 2009

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