DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS

POR EL METODO DE LA NINHIDRINA

REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS.

Los aminoácidos participan en muchas reacciones en las cuales

intervienen las funciones - amino, carboxilo y los diversos grupos R.
La revisión de todos estos tipos se encuentran fuera de los objetivos
de un curso de unas cuantas reacciones importantes:

DETECCION Y MEDICIÓN CUANTITATIVA.

La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo común para

visualizar las bandas de separación de aminoácidos por
cromatografía o electroforesis, también es utilizada con fines
cuantitativos para la determinación de aminoácidos. Reacciona con
todos los aminoácidos alfa cuyo pH se encuantra entre 4 y 8, dando
una coloración que varía de azul a violeta intenso. Este producto
colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por
resonancia, la coloración producida por la ninhidrina es
independiente de la coloración original del aminoácido.

La reacción con la ninhidrina produce colores que sirven como

base para la cuantificación de todos los aminoácidos primarios se
evalúa midiendo la absorción de la luz con la longitud de onda de
540 nm.

Aminoácidos secundarios como la prolina forman productos

ligeramente distintos; estos son amarillos t tienen su máxima
absorción a 440 nm. El cálculo de la concentración se basa en la
relación de Beer-Lambert.
 El orto-ftaldehído (OPA, del ingles orto-ptaldehyde, también
llamado fluoraldehído) es un nuevo reactivo de revelado, más
sensible, con el cual puede detectarse concentraciones de
aminoácidos de orden de picomoles (10E-12) a femtomoles (10E-
15). Esta enorme diferencia en sensibilidad se debe a la productos
intensamente fluorescentes. Después de la reacción, la exposición a
una radiación de 360 provoca una emisión fluorescente a 445 nm,
cuya intensidad se relaciona con la concentración del aminoácido.
Esta reacción ocurre con rapidez si se trata de aminoácidos
primarios, pero no cuando son secundarios. No obstante, la prolina
puede detectarse oxidándola primero a una amina primaria.

Los derivados de la feniltiohidatoina que absorbe la luz

ultravioleta, los derivados fluorescentes del densilo y los derivados
amarillos del dinitrofenilo son útiles no son solo para la detección
cuantitativa de aminoácidos, sino también para su identificación.

METODOS PARA DETERMINAR CUANTITATIVAMENTE A LOS

AMINOACIDOS.

Hay diferentes métodos para determinar cuantitativamnete a los

aminoácidos como lo son, las cromatografias, electroforesis y otros
métodos en el que participan tanto las cromatografias como
reacciones con dinitrofluorobenceno y fenilisotiocianato.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

El cambio ionico sucede cuando los constituyentes ionicos de la

manera se retienen selectivamente por intercambio con sus iones
sustituibles del empaque. Este fenomeno de iones puede definir
como que posee grupos ionicos fijos y grupos ionicos móviles. Estos
últimos pueden ser sustituidos por otros, bajo condiciones
especificas.

La cromatográfia de intercambio ionico consiste en intercambiar

iones de la fase estacionaria, la cual es un polímero con iones lábiles
(cationes o aniones) de estructura porosa, insolubles, pero capaz de
aumentar su volumen al ser humedecidos.

CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA DE CAPA FINA

Existen varios métodos para medir la cantidad de un componente

individual en una mancha. Un método general es raspar el
absorbente que rodea a cada mancha con una navaja o puede
limpiarse con agua, proceder a analizar el constituyente de la
muestra por algún método espectrofométrico o colorimétrico.
También es posible usar un método microanalítico, como una
microtitulación.
El segundo método consiste en analizar directamente el
compuesto sobre la placa. Suele utilizarse un aparato llamado
densitómetro. Si el compuesto es fluorescente, puede utilizarse un
tipo de fluorómetro para medir la cantidad de fluorescencia que
emite la mancha.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

Esta técnica se basa en el principio de que un compuesto se

reparte o distribuye entre dos fases líquidas. En un ambiente que
contiene vapor de agua, el papel de cromatografía absorbe una
cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del
papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y
constituye la fase estacionaria. Si se permite que un que un
disolvente no acuoso ( la fase móvil) se traslade por el papel
impulsada por la acción capilar, tan pronto como el disolvente
alcance a cualesquiera moléculas de soluto en el papel, están se
distribuirán entre las dos fases en una proporción característica de
sus coeficientes de reparto. Cuanto más soluble sea un soluto en la
fase movil, tanto más se trasladara el compuesto por el papel en la
dirección del flujo del disolvente y viceversa
Podemos citar como ejemplo del procedimiento de cromatografía
en papel la separación de aminoácidos en fracciones por
cromatografía descendente en papel Whatman No. 1, empleando
la elución fenol saturado con agua. Los aminoácido aparecen como
manchas coloridas después de revelar el cromatograma rociándolo
con reactivo de ninhidrina.
Se desconoce con certera el mecanismo de la cromotagrafía en
papel. Es probable que los constituyentes de la muestra
probablemente sean retenidos por el papel a causa de su
solubilidad en el agua que el papel absorbe, o por absorción de los
propios constituyentes de la muestra o por una combinación de
ambos.
 REACCION CON DINITROFLUOROBENCENO.
Es una reacción que se usa para la medición y detección
cuantitativa de los aminoácidos, la principal aplicación sé encuantra
en la determinación del residuo N-terminal de cadenas peptidicas.
El complejo formado es el dinitrofenil derivado (DNP) de color
amarillo; cromatografía en papel o en capa fina de un DNP-
aminoácido desconocido contra estándares conocidos de DNP
aminoácidos proporciona la base para identificar al conocido.

REACCION CON FENILISOTIOCIANATO.

Se le conoce también como reacción de Edman; se utiliza para la
identificación de aminoácidos con la aplicación principal de
determinar la secuencia de cadenas peptídicas desde el extremo N-
terminal.

REACCION CON FLUORESCAMINA.

Este es un reactivo aún más sensible para la determinación
cuantitativa de aminoácidos, ya que puede detectar nanogramos de
aminoácido, al igual que la ninhidrina, la fluorescamina forma un
complejo con aminas de otros compuestos además de aminoácidos.

METODOLOGIA DE LA PRACTICA.

Para preparar el reactivo de ninhidrina se disuelven 400 mg de

cloruro estanoso en 250 ml de amortiguador de citrato de 0.2 M ph
de 5 (4.3 gr de ácido cítrico más 8.7 gr de citrato trisodico en 250
ml, se ajusta a pH 5 con NaOH o HCl). Se añade esta solución a 250
ml de metilén celosolve ( etilen glicol monometil éter), en los que
se ha disuelto previamente 10 gr de ninhidrina.

Después de añadir ninhidrina, se agita y se coloca en un baño de

agua hirviendo durante de 20 minutos. Terminado el calentamiento,
se enfría en otro baño de agua y se añade 8 ml de n-propanol al 50
%. Se vuelven a aguitar los tubos, y se deja en reposo durante 10
minutos para que aparezca el color y después se lee a 570 nm.
CALCULOS.