CB 4maio2009

Catarina Brito
Laboratório de Tecnologia de Células Animais

ITQB-UNL/IBET
http://tca.itqb.unl.pt
Células Estaminais
Catarina Brito
anabrito@itqb.unl.pt
Biotecnologia Molecular
FCUL
4 de Maio de 2009
Células Estaminais
Características
As células estaminais são definidas por 3 características fundamentais:
célula
estaminal • Indiferenciação
células não-especializadas.
AUTO
RENOVAÇÃO
DIFERENCIAÇÃO
• Capacidade de auto-renovação ilimitada
capacidade de se dividir durante períodos
indefinidos, muitas vezes durante toda a vida do
organismo, originando células indiferenciadas.
• Potencial de diferenciação
célula
estaminais
Sob condições apropriadas e / ou na presença
dos sinais adequados podem dar origem a
diferentes tipos de células, com características e
célula funções especializadas.
especializadas
4 de Maio de 2009
04/05/2009 1
Catarina Brito
ITQB-UNL/IBET
Células Estaminais
Características
Auto-renovação vs Diferenciação
divisão celular simétrica vs assimétrica
Morrison & Kimble 2006, Nature 441, 1068-74
4 de Maio de 2009
Células Estaminais
Características
Regulação da auto-renovação
Intrínseca - Há segregação dos factores determinantes de renovação/diferenciação
Extrínseca - Apenas 1 das células-filha fique em contacto com o ambiente que confere a
identidade às células estaminais – o chamado nicho estaminal
Regulação Intrínseca Regulação Extrínseca
Knoblich 2008, Cell 132, 583–597
4 de Maio de 2009
04/05/2009 2
Catarina Brito
ITQB-UNL/IBET
Tipos Células Estaminais
CÉLULAS ESTAMINAIS CÉLULAS ESTAMINAIS

EMBRIONÁRIAS ADULTAS OU SOMÁTICAS
(ESCs) (ASCs)
Tracto gastrointestinal e Músculos Sistema nervoso central e

orgãos associados (fígado, tecidos conjuntivos periférico, pele, tecidos
pâncreas), (ossos, cartilagem), conjuntivos da cabeça,
glândula tiróide e paratiróide, sistema urogenital, olhos, ouvidos,
timo, sistema cardiovascular, glândula pituitária, medula
Laringe, traqueia, medula óssea (sangue) adrenal
pulmões, bexiga, uretra
Adaptado de O’Connor & Crystal 2006, Nature Reviews Genetics 7, 261-276
4 de Maio de 2009
Células estaminais presentes durante todo o tempo de vida de um organismo com:

- capacidade de auto-renovação ilimitada
- potencial de diferenciação
Diferentes tipos de células estaminais diferem na:
- origem
- extensão do potencial de diferenciação
Células Estaminais Musculares
Células Estaminais Adultas
Células Estaminais Embrionárias

Células Estaminais Pele
Células Estaminais Hematopoiétic
Células Estaminais
do Cordão Umbilical
Células Estaminais da Placenta
Células Estaminais Mesenquimais
4 de Maio de 2009
04/05/2009 3
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Potencial de Células Estaminais

diferenciação
Plasticity ?
Plasticity ?
Totipotência capacidade de formar todas as linhagens

do organismo, dando origem a um indivíduo
completo - zigoto e células resultantes das
Plasticidade ou trans-diferenciação primeiras divisões embrionárias.
propriedade de células estaminais Pluripotência capacidade formar todas as linhagens
somáticas cujo potencial de diferenciação presentes num organismo adulto – células
não se restringe à linhagem a que
estaminais embrionárias (ESCs)
pertencem. Aplicação do conceito a
mamíferos gera alguma controvérsia… Multipotencia capacidade de formar múltiplos tipos
celulares de uma linhagem – células estaminais
4 de Maio de 2009 ou somáticas (ASCs)
adultas
4 de Maio de 2009
04/05/2009 4
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NIH, 2008
4 de Maio de 2009
Derivação de Células Estaminais Embrioná

Embrionárias
linhas celulares Fertilização in vitro embriões
excedentários (massa celular
interna do blastocisto) (ESCs).
Clonagem terapêutica transferência
nuclear de células somáticas para
oócitos (massa celular interna do
blastocisto) (ESCs).
Indução de pluripotência células
somáticas “reprogramadas
geneticamente” por introdução de
genes-chave para pluripotência,
desdiferenciam e adquirem fenótipo
semelhante a células estaminais
embrionárias (iPS).
4 de Maio de 2009
04/05/2009 5
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Derivação de Células de Pluripotência Induzida

linhas celulares Limitações para possível
Métodos de produção de iPS aplicação clínica:
Método clássico - introdução de
componentes virais;
- possibilidade de
reactivação dos genes de
vectores retrovirais, com integração no genoma
reprogramação
(oncogénicos) e/ou
Novos Métodos activação de oncogenes por
integração no genoma
formação de tumores
vectores adenovirais - sem integração no genoma
- expressão residual dos
transgenes poderá ser
responsável por diferenças
vectores plasmídicos - sem integração no genoma
observadas no potencial de
diferenciação de células iPS
4 de Maio de 2009
Derivação de Células de Pluripotência Induzida

linhas celulares
Métodos de produção de iPS
- vectores lentivirais excisáveis por recombinase Cre;
- transfecção com vector não-viral único; transgenes removidos por transposão PiggyBac, que
não provoca alterações no genoma.
-proteínas recombinantes com caudas poliarginina … ainda pouco eficiente mas promissor
4 de Maio de 2009
04/05/2009 6
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Cultura Células Estaminais Embrioná

Embrionárias
Métodos de cultura ESCs têm potencial de proliferar indefinidamente… mas
requerem substratos e factores específicos:
-camada de células “feeder” humanas (fibroblastos embrionários ou
de prepúcio) ou de murganho (fibroblastos embrionários de
murganho -mEFs);
-componentes de matriz extracelular (matrigel, laminina,
fibronectina, etc) + meio condicionado de mEFs ou meios
quimicamente definidos já disponíveis comercialmente;
-Factores de crescimento envolvidos na activação das vias de
transcrição de pluripotência: factor de crescimento de fibroblastos-
2 (bFGF ou FGF2), activin, TGF-β1, etc.
[ESC de murganho mantêm-se indiferenciadas na presença de factor

de inibição de leucemia (LIF) e soro bovino]
4 de Maio de 2009

Embrionárias
Métodos de cultura
Métodos de passagem:
Dissecção manual
Laboriosos e difíceis
de adaptar a grande
escala
Digestão enzimática: colagenase, dispase, TrypleSelect

Aumentam probabilidade de instabilidade genética e epigenética
Limitações da cultura de ESC humanas

necessidade de
- sistemas de cultura reprodutíveis e menos laboriosos;
-meios de cultura composição definida, sem de componentes de origem animal
que permitam o crescimento eficiente das células a densidades clonais

minimizem acumulação de alterações genéticas e epigenéticas.
4 de Maio de 2009
04/05/2009 7
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Embrionárias
Caracterização das ESC em cultura
Grande dificuldade em caracterizar as linhas
estaminais embrionárias humanas
-grande número de linhas, estabelecidas de
maneira diferente;
-métodos de cultura variam entre laboratórios
International Stem Cell Initiative, 2007

Tentativa de fazer caracterização baseada em
parâmetros métricos uniformizados: 59 linhas
de 17 laboratórios
- Análise morfológica;
- Presença de marcadores moleculares característicos - de superfície e
factores de transcrição (SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, nanog,
Oct-4, etc);
- Avaliação da viabilidade após congelamento/descongelamento;
- Análise citogenética (cariotipo);
- Avaliação da pluripotência in vitro (corpos embrióides) e in vivo
(teratomas).
4 de Maio de 2009

Embrionárias
Análise morfológica
4 de Maio de 2009
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Embrionárias
Caracterização das ESC em cultura DAPI
Presença de marcadores moleculares característicos
-antigénios de superfície (SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81);
Oct4
- factores de transcrição (nanog, Oct-4, etc).
DAPI SSEA-3
DAPI TRA-1-81
DAPI SSEA-4
DAPI TRA-1-60
Análise por Microscopia de

Imunofluorescência, Citometria de Fluxo,
qRT-PCR .
4 de Maio de 2009

Embrionárias
- Avaliação da viabilidade após
congelamento/descongelamento;
- Análise citogenética (cariotipo);
- Avaliação da pluripotência in vitro (corpos
embrióides) e in vivo (teratomas).
corpos embrióides
-agregados esféricos de células estaminais
embrionárias
-assemelham-se a blastocisto – camada
externa de endoderme primitiva e presença
de células estaminais e ectoderme primitiva
no interior
-após alguns dias de cultura apresentam
células das 3 camadas germinativas
4 de Maio de 2009
04/05/2009 9
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Embrionárias
corpos embrióides
-depois de cultivados em suspensão são plaqueados e
avaliada a presença de células das 3 camadas
germinativas
βιιι-tubulin (Ect) hepatocyte nuclear factor 3-β α-smooth muscle actin

(HNF3β / FOXA2) (End) (ASMA) (Mes)
4 de Maio de 2009

Embrionárias
teratomas
- células estaminais embrionárias transplantadas para murganhos imunodeficientes;
- forma-se tumor (teratoma) que contém células ou tecidos derivados das 3 camadas
germinativas
- aprox. 8 semanas pós-implantação, animal é sacrificado para análise histológica do tumor.
Secretory epithelium with Cartilage and bone Neuroectoderm

goblet cells (Endoderm) (Mesoderm) (Ectoderm)
4 de Maio de 2009
04/05/2009 10
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Embrionárias
Diferenciação direccionada J.R. Masters, B.O. Palsson and J.A. Thomson (eds.): Human Cell Culture, Volume VI.
neurónios Embryonic Stem Cells. 2007.
cardiomiócitos
grande variedade de protocolos mas ainda longe de

métodos reprodutíveis, com rendimentos elevados
4 de Maio de 2009
Fontes Células Estaminais Adultas
Uma célula estaminal adulta é uma célula indiferenciada (não especializada) que se encontra
num tecido especializado (diferenciado)
medula óssea
sangue periférico
mucosa olfactiva
córnea e retina
polpa dentária
fígado
pele
tracto gastrointestinal
pâncreas
Normalmente, as células estaminais geram um

tipo celular intermédio antes de ser atingida a
diferenciação total (célula precursora ou
progenitora)
4 de Maio de 2009
04/05/2009 11
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Células Estaminais Adultas
4 de Maio de 2009
Terapia Celular
Definição
Consiste na prevenção ou tratamento de
doenças humanas através da administração de
células que foram seleccionadas, multiplicadas
e farmacologicamente tratadas ou alteradas
fora do organismo.
O objectivo da terapia celular é de

substituir, reparar ou melhorar a função de
tecidos ou órgãos danificados
As células a administrar podem ser

obtidas do próprio paciente (terapia
autóloga) ou de um dador (terapia
alogénica).
4 de Maio de 2009
04/05/2009 12
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Potenciais Terapia Celular

aplicações
4 de Maio de 2009
Aplicação clínica desde 1959 Células Estaminais Hematopoié

Hematopoiéticas
Até 1995, mais de 40 000 transplantes realizados em todo o mundo

Cancros hematopoiéticos – leucemias e linfomas
Cancro noutros orgãos, que exigam dose elevada de quimioterapia
Doenças da medula – genéticas e adquiridas: talassémias, doenças autoimunes, etc…
4 de Maio de 2009
04/05/2009 13
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Células Estaminais Hematopoié

Hematopoiéticas
Fontes
Medula óssea
É a fonte clássica de células estaminais hematopoiéticas
(HSCs)
Protocolo: anestesia do dador, punção de um osso, tipicamente
a crista ilíaca, e recolha das células com uma seringa.
Cerca de 1 em cada 15.000 células é uma célula estaminal
Sangue periférico
Fonte mais recente (últimos 10 anos), desde que se
descobriu que as células migram da medula óssea para a
corrente sanguínea depois de injectar o dador com uma
citocina.
Protocolo: O dador é injectado com G-CSF dias antes da recolha
de células. As células são recolhidas através de um tubo
intravenoso inserido na veia do dador e passam através de um
sistema de filtração que separa as células CD34+, sendo todas as
outras células devolvidas ao dador.
Cerca de 5-20% das células recolhidas são de facto células
estaminais
4 de Maio de 2009
Células Estaminais Hematopoié

Hematopoiéticas
Fontes
Sangue do cordão umbilical
Primeira recolha em 1992, centenas de milhar de recolhas a nível global.
Protocolo: o sangue é recolhido da veia do cordão umbilical após o nascimento do bebé.
Embora o sangue de cordão umbilical represente uma fonte valiosa de HSCs, não existem dados
conclusivos sobre diferenças qualitativas entre as células obtida desta fonte e as obtidas da medula
óssea ou sangue periférico
4 de Maio de 2009
04/05/2009 14
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Células Estaminais Mesenquimais

Células estaminais multipotentes
Isoladas pela primeira vez em 1997.
Características:
- suporte do crescimento e da expansão das células estaminais hematopoiéticas,
promovendo igualmente o seu enxerto quando aplicadas em conjunto.
- podem diferenciar-se em condrócitos (células da cartilagem), osteócitos (células de osso,

tendão ou ligamentos), adipócitos (células de gordura) e miócitos (células de músculo).
fontes: medula óssea

cordão umbilical – sangue e matriz
tecido adiposo, etc...
4 de Maio de 2009
Células estaminais
multipotentes
Células Estaminais Neuronais
Isoladas pela primeira vez em no

início dos anos 90.
Características:
- capacidade de diferenciar nos 3
tipos de células neuronais:
neurónios, astrócitos,
oligodendrócitos;
-variam consoante a região
-crescimento em neurosferas
Day 44
Astrócitos (GFAP)
Neurónios (NF-L)
Núcleos
50 µm
4 de Maio
Sa Santos et al (2007) Journal de 2009 Research, 85: 3386-97
Neuroscience
04/05/2009 15
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CÉLULAS ESTAMINAIS
@
Laboratório de Tecnologia de
Células Animais
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04/05/2009 16
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Animal Cell Technology UNIT

Virus-like particles (VLP’s) Adenovirus
Adenoviral-based vaccines Retrovirus & lentivirus
Marker Vaccines, others Baculovirus
GENE Monoclonal antibodies

Fusion Proteins, others
THERAPY
VACCINES
RECOMBINANT
IN VITRO PROTEINS
PRIMARY TOXICOLOGY CELL
CULTURES HANDLING/
Hepatocytes
Neurons and astrocytes (rat & human) THERAPY
(rat & mice) Embryonic & adult stem cells
(human & murine)
Stirred bioreactors for human

stem cell expansion and
neuronal differentiation
04/05/2009 17
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Human Embryonic Stem Cells (hESCs)

isolated from the inner cell mass of human blastocyst (day 5)
establishment of human embryonic stem cell (hESC) lines
9 High self-renewal ability;
9 Pluripotency: can give rise to cells from all three embryonic

germ layers
in vitro Toxicology
Drug Screening
Cellular Therapy
Tissue Engineering
hESCs CULTURE – BIOPROCESSING ISSUES
Quality Controlled Reproducible Culture Systems for

expansion and differentiation
EXPANSION
Significant amounts of cells
Robust
Affordable
W/O compromising Self-Renewal and Differentiation Capacity
DIFERENTIATION
AMOUNT and PURITY (e.g. eliminate undiferentiated cells to avoid teratomas
formation after transplantation)
04/05/2009 18
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Stirred suspension systems have been described as promising in vitro

systems for:
Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as
aggregates in suspension culture bioreactors
Cormier et al. (2006), Tissue Eng
d
stem cell expansion onic stem cell-derive
ent of human embry
Improved developm vessel cul tivation
stir red
embryoid bodies by technol Bioeng
6). Bio
embryoid body cultivation Cameron et al. (200
Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long
term expansion as aggregates in suspension bioreactors
zur Nieden et al (2007). J Biotechnol,
stem cell differentiation
Novel culture strategy
for human stem cell prolife
Serra et al. (2007) ration and neuronal diff
. J. Neurosc. Res ere ntiation
Challenges:
Development of culture strategies capable of integrating
both expansion and differentiation processes in
bioreactors
Scalability Automation
Scale-
Scale-up of differentiated cells to clinically relevant numbers
04/05/2009 19
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Stirred tank bioreactors

3 fully controlled;
3 culture homogeneity;
3 scalable;
3 easy sampling;
3 hydrodynamically well-characterized;
3 reproducible experimental conditions.
stirred-
stirred-tank bioreactors for
3D-
3D-culture of clinical relevant cells Å aggregates
Å capsules
agitation
Non invasive monitoring:
Controlled Cell expansion;
pH Environment pO2
Cell viability;
Metabolic performance;
temperature Cell function.
Human Embryonic Stem Cells (hESCs)
However...
8 Difficult & Expensive to handle

8 Feeder layer dependent
8 Time consuming
hESCs model systems are promising

candidates for elucidating the
mechanisms involved in self-renewal
and differentiation
04/05/2009 20
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Which hESCs model system?

Embryonal Carcinoma (EC) stem cells – “The Stem Cells of Tumours“
Derived from teratocarcinomas, tumours of primordial germ cells
-High self-renewal capacity

-Pluripotency
-Expression of pluripotent
stem cell markers;
-Can give rise to cells of the 3
germ layers.
Cell Model System Æ NTera-2/cl.D1- NT2 cells

Derived from a human testicular teratocarcinoma
3 Express hESC markers 3 Exposure to retinoic acid (RA) generates post-mitotic

neurons (NT2-N)
3 High self-renewal ability
3 Differentiation in vitro similar to in vivo neurogenesis
3 Pluripotent 3 The derived neurons have been successfully
used in transplantation studies
Valuable model for Robust model for human neuronal

hESCs differentiation in vitro
NT2 undifferentiated cells NT2 neurons
Retinoic Acid
Treatment
04/05/2009 21
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In vitro NT2 Neurons
Markers of mature CNS neurons

Neurofilaments
Tau protein
Synaptophysin
Microtubule associated Proteins (MAP) type 1 and 2
Transplantation
Specific culture conditions
SUCCESSFUL ENGRAFTMENT
ANIMAL MODELS:
FUNCTIONAL SYNAPSES • Stroke
Secretion of GABA, Dopamine, Catecholamine, • Huntington’s

Choline • Parkinson’s
EXPRESS AMYLOID PRECURSOR PROTEIN • Amyotrophic Lateral Sclerosis
HUMAN:
• Stroke (phase I clinical trial)
NT2 – Neuronal Differentiation Protocols
Static Culture (Pleasure et al,1992)

STEP 1 - NT2 Proliferation and Differentiation STEP 2 - Elimination of NT2- cells STEP 3 - Selecting NT2-N neurons
RA treatment MI treatment
Replate Replate
Day 1 Day 36 Day 37 Day 48 Day 53
Limitations...
8 Laborious 8 Difficult to control
8 Low differentiation efficciency (3.2%) 8 Scaleability
8 Time consuming (2 months) 8 Reproducibility
8 Monitoring
Improve culture systems for stem cell proliferation and differentiation
04/05/2009 22
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AIM
Improvement of a reproducible bioprocess for the up-scaling
expansion of human neurons
3 Develop culture strategies for undifferentiated NT2 cell

expansion as 3-D aggregates in stirred suspension systems
Æ Inoculum density
Æ Culture operation mode
3 Integrate NT2 expansion and neuronal differentiation steps

in a fully controlled bioreactor process
Effect of inoculum density in NT2 cell expansion

• Inoculum Density (cell/ml): 0.4x105 (SP- 0.4), 1x105(SP- 1) and 4x105 (SP- 4)
• Culture Operation Mode: Batch
SP- 0.4 SP- 1 SP- 4 10 SP-4

SP-1
Day 1 8
C ell C o n cen tratio n
(x 10 5 cell/m L )
2 SP- 0.4
Day 3 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (day)
SP-1 SP- 4
Growth rate- μ (day-1) 0.50 0.40

Day 6
Fold Increase- Xmax/X0 7.8 2.1
50 μm
Xmax (x 105 cell/mL) 7.8 8.6
04/05/2009 23
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Effect of inoculum density in NT2 cell expansion
Selected Inoculum Density: SP- 4

10 SP-4
Cells started to detach 8
Cell C o n cen tratio n

(x 10 5 cell/m L )
from the aggregates from
6
day 4 onwards
4
50 μm
Ô Cell Concentration 2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Next step: t (day)
● Prolong the exponential growth phase

● Improve cell expansion
Glucose Fed-batch
Æ Reduce lactate production
Glucose feeding was performed twice a day and maintaned at low levels (<1.4 mM) throughout culture time
Media Exchange (“perfusion”)

Æ Removal of toxic metabolites and addition of fresh nutrients
Partial media exchange (50%) was performed daily from the 3rd cultivation day onwards
Impact of operation mode in NT2 cell expansion

• Inoculum Density (cell/ml): 4x105
• Culture Operation Mode: Batch (SP-4), Fed-batch (SP-4FB) and Media Exchange (SP-4ME)
20
SP- 4 SP-4FB SP-4ME SP-4ME
Cell Concentration
16
(x 105 cell/mL)
Growth rate- μ (day-1) 0.40 0.48 0.37

Day 3 12
SP- 4FB
Fold Increase- Xmax/X0 2.1 4.1 4.5 8
Xmax (x 105 cell/mL) 8.6 16.3 18.1 4 SP-4
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
t (day)
SP- 4FB Exponential growth phase was extended until day 5
SP- 4ME 2-fold increase

50 μm 50 μm
in maximum cell concentration
04/05/2009 24
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Impact of operation mode in NT2 cell expansion

• Inoculum Density (cell/ml): 4x105
• Culture Operation Mode: Batch (SP-4), Fed-batch (SP-4FB) and Media Exchange (SP-4ME)
day 2 day 4 5
Ammonia
q GLC (nmol.10-6cell.day -1) qGLC day 3 day 5 4 SP-4
30
Am m onia (m M)
3 SP- 4FB
20
SP-4ME
2
10
1
0
0
SP-4 SP-4FB SP-4ME
0 1 2 3 4 5 6 7 8
2,5
t (day)
qLDH cum(U. 10-6 cell.day -1)

2
qLAC LDH/Viability SP-4
q LAC(nmol.10 -6cell.day -1)
30 SP- 4FB
1,5
qLDH cum
20 1
SP-4ME
10 0,5
0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
SP-4 SP-4FB SP-4ME
t (day)
SP- 4FB SP- 4ME
9 Lowest qGLC and qLAC values

9 Higher cell viability
Cells were not continuously subjected
2
Decrease in viability from day 5 onwards
to accumulation of toxic metabolites
Accumulation of toxic metabolites (Ammonia)
Possibly depletion of essential nutrients
Characterization of undifferentiated NT2 cells expanded in the Bioreactor

Bioreactor
• PLURIPOTENCY and UNDIFFERENTIATED phenotype

PLURIPOTENCY ___________ UNDIFFERENTIATED ____________
Oct-4 DAPI TRA-1-60 DAPI SSEA-4 DAPI Nestin DAPI
DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
100 μm
Oct-4, TRA-1-60, SSEA-4 and Nestin was maintained

throughout cell expansion (up to day 6)
04/05/2009 25
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Bioreactor
• PLURIPOTENCY and UNDIFFERENTIATED phenotype
Flow Cytometry PLURIPOTENCY UNDIFFERENTIATED

Oct-4 DAPI TRA-1-60 DAPI
DAY 0
Inoculum (Control)
94.8% 88.7%
positive cells positive cells
DAY 3
Exponential growth
97.2% 94.6%
positive cells positive cells
The high levels of Oct-4 and TRA-1-60 obtained for the cells of the
inoculum were maintained at day 3 of the bioreactor culture
NT2 cells maintained their pluripotency and undifferentiated

phenotype during expansion in the bioreactor

Bioreactor
• Neuronal Differentiation Potential Number of neurons
N Diff efficiency =
Number of total cells after RA
Static Protocol (Pleasure et al, 1992)
2.3 x106Cells were treated with Cultures

cell were Cells were cultured
transferredRA Tf75 5 weeks were split
toduring in MI conditions
Neurons
1:4.5
DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
+ 1day + 35 days + 12 days
NEURONAL DIFFERENTIATION – 48 days
Neuronal differentiation efficiency was similar for all cultures Æ 3 - 3.5%

At the end of neuronal differentiation protocol Æ Cultures composed by 99-100% neurons
04/05/2009 26
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Bioreactor
• Neuronal Differentiation Potential
Static Protocol (Pleasure et al, 1992)
MAP2 DAPI βIII-Tub DAPI
DAY 0
Inoculum (Control)
BIOREACTOR
CULTURE
DAY 3
Exponential growth
DAY 6
After expansion
The differentiated neurons were identified by MAP2 and βIII-Tub positive staining
NT2 cells maintained their neuronal differentiation potential during

expansion in the bioreactor
Combining expansion and neuronal differentiation of NT2 cells in the Bioreactor

1. Neuronal differentiation was induced by addition of
retinoic acid (10μM) when cells achieved the middle of
the exponential growth phase – day 3
The expansion of undifferentiated NT2
cells was successfully implemented in
the bioreactor without compromising 20
the stem cell potential 16

Cell Concentration
(x 105 cell/mL)
12
BR- 4ME
8
Next step: 4
0
● Integrate neuronal differentiation step in the 0 1 2 3 4 5 6 7 8
bioreactor system t (day)
04/05/2009 27
Catarina Brito
ITQB-UNL/IBET
Expansion
1. Neuronal differentiation was induced by addition of
retinoic acid (10μM) when cells achieved the middle of
DAY 3 the exponential growth phase – day 3
BIOREACTOR CULTURE
Differentiation
2. Neuronal differentiation period was prolonged for 3
weeks
DAY 9
1 week
DAY 16
2 weeks During neuronal differentiation:
y Aggregate size increase, reaching average

diameters of 150, 300 and 450μm after 1, 2 and 3
weeks, respectively;
DAY 23 50 μm
3 weeks y Aggregate geometry became uniform, forming
compact and spherical structures;
Nestin– precursor cells
βIII-Tub -neurons
y Neurospheres – composed of precursor cells and

differentiated neurons
Cryosection

Expansion
3. Neurospheres were harvested from the bioreactor and

cultured, on PDL-MG coated flasks, in mitosis inhibitory
DAY 3 conditions to allow cell migration and inhibit cell proliferation
BIOREACTOR CULTURE
Differentiation
Immunofluorescence
Microscopy
DAY 9 3 days
Nestin Æ precursor cells
1 week
βIII-Tub Æ neurons
3 days
DAY 16
2 weeks
3 days
DAY 23
3 weeks
3 days post-seeding
y Cultures derived from neurospheres harvested at day 23 were richer in neurons and
presented more developed neuritic networks than the neurosperes harvested at day 16
y On neurospheres harvested earlier, precursor cells predominated
04/05/2009 28
Catarina Brito
ITQB-UNL/IBET
Expansion
4. Neurons were harvested after 7 days of culture on coated flasks
by selective trypsinization
DAY 3
MI cultivation
BIOREACTOR CULTURE
Differentiation
BIOREACTOR STATIC
CULTURE CULTURE
DAY 9
1 week
7 days 0.1%
16 days
DAY 16
2 weeks
7 days 17,2%
23 days
DAY 23
3 weeks 7 days 37.4%
30 days
3.2%
48 days
Number of neurons
7 days post-seeding N Diff efficiency =
Number of total cells harvested from the bioreactor
y The fraction of neurons increased throughout bioreactor culture time
y The bioreactor culture improved the neuronal differentiation efficiency by up to 10-fold and reduced the time of
the differentiation process, when compared to static culture
y At the end of the process pure cultures of neurons (99-100%) were obtained
Conclusions
Large scale expansion of human neurons was successfully developed
using stirred bioreactors, by integrating human NT2 cell expansion and
differentiation in a two-step bioprocess
Successfully expansion of undifferentiated NT2 cells as 3-D aggregates

without compromising the stem cell potential
Neuronal differentiation efficiency of NT2 cells was improved by 10-fold,

compared to previous static protocols
This system allows the expansion of human differentiated neurons derived

from a continuous source of pluripotent stem cells
04/05/2009 29
Catarina Brito
ITQB-UNL/IBET
Bibliography
BOOKS
•Lanza et al (eds) “HandBook of Stem Cells” (2004)
•“Cell Culture Technology for Pharmaceutical and cell based therapies” S Ozturk and
Wei-Shou Hu (2006)
•J.R. Masters, B.O. Palsson and J.A. Thomson (eds.): Human Cell Culture, Volume
VI. Embryonic Stem Cells (2007).
•Santos SS, Leite SB, Sonnewald U, Carrondo MJ and Alves PM (2007). Stirred vessel cultures
of rat brain cells aggregates: characterization of major metabolic pathways and cell population
dynamics. J Neurosci Res 85, 3386-3397
•Serra M, Leite SB, Brito C, Costa J, Carrondo MJ and Alves PM (2007). Novel culture strategy
for human stem cell proliferation and neuronal differentiation. J Neurosci Res 85, 3557-3566.
•Serra M, Brito C, Leite SB, Gorjup E, von Briesen H, Carrondo MJ and Alves PM (2009). Stirred
bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann Anat 191, 104-115.
04/05/2009 30

CB 4maio2009

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Laboratório de Tecnologia de Células Animais

divisão celular simétrica vs assimétrica

Morrison & Kimble 2006, Nature 441, 1068-74

Intrínseca - Há segregação dos factores determinantes de renovação/diferenciação

Regulação Intrínseca Regulação Extrínseca

Knoblich 2008, Cell 132, 583–597

Tipos Células Estaminais

CÉLULAS ESTAMINAIS CÉLULAS ESTAMINAIS

Tracto gastrointestinal e Músculos Sistema nervoso central e

Adaptado de O’Connor & Crystal 2006, Nature Reviews Genetics 7, 261-276

Células estaminais presentes durante todo o tempo de vida de um organismo com:

Células Estaminais Adultas

Células Estaminais Embrionárias

Células Estaminais Hematopoiétic

Células Estaminais Mesenquimais

Potencial de Células Estaminais

Totipotência capacidade de formar todas as linhagens

Derivação de Células Estaminais Embrioná

Derivação de Células de Pluripotência Induzida

Derivação de Células de Pluripotência Induzida

Cultura Células Estaminais Embrioná

[ESC de murganho mantêm-se indiferenciadas na presença de factor

Cultura Células Estaminais Embrioná

Digestão enzimática: colagenase, dispase, TrypleSelect

Limitações da cultura de ESC humanas

que permitam o crescimento eficiente das células a densidades clonais

Cultura Células Estaminais Embrioná

International Stem Cell Initiative, 2007

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Análise por Microscopia de

Cultura Células Estaminais Embrioná

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βιιι-tubulin (Ect) hepatocyte nuclear factor 3-β α-smooth muscle actin

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Secretory epithelium with Cartilage and bone Neuroectoderm

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grande variedade de protocolos mas ainda longe de

Fontes Células Estaminais Adultas

Normalmente, as células estaminais geram um

Células Estaminais Adultas

O objectivo da terapia celular é de

As células a administrar podem ser

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Aplicação clínica desde 1959 Células Estaminais Hematopoié

Até 1995, mais de 40 000 transplantes realizados em todo o mundo

Células Estaminais Hematopoié

Células Estaminais Hematopoié

Células Estaminais Mesenquimais

Isoladas pela primeira vez em 1997.

- podem diferenciar-se em condrócitos (células da cartilagem), osteócitos (células de osso,

fontes: medula óssea

Isoladas pela primeira vez em no

-variam consoante a região

Animal Cell Technology UNIT

GENE Monoclonal antibodies

Stirred bioreactors for human

Human Embryonic Stem Cells (hESCs)

9 High self-renewal ability;

9 Pluripotency: can give rise to cells from all three embryonic

hESCs CULTURE – BIOPROCESSING ISSUES

Quality Controlled Reproducible Culture Systems for