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Microbiologia 2006/2007
ANATOMIA BACTERIANA
3 de Outubro de 2006
Aula leccionada por Doutor Acácio Gonçalves Rodrigues
SUMÁRIO DA AULA T2
Susana Sá
Tânia Borges
Turma 13
FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Hoje é uma aula comprida e é uma aula em que eu vos vou chamar à atenção daquilo
que considero os aspectos essenciais de uma matéria bastante longa que tem a ver com a
citologia da bactéria na sua constituição, da sua anatomia, da sua fisiologia ou
metabolismo.
Vamos lá à anatomia da bactéria.
CONSTITUIÇÃO DA BACTÉRIA
⇒ Nucleóide.
⇒ Algumas inclusões.
⇒ Ribossomas. Ela tem que ser capaz de efectuar a síntese proteica. Estes ribossomas
são diferentes dos das células eucarióticas: subunidades e coeficiente de
sedimentação de 70s.
⇒ Plasmídeos. Vamos abordar isto mais tarde e com mais detalhe na próxima aula
sobre genética microbacteriana. Mas são fragmentos de material genético, de DNA,
que podem estar extra ou intracromossómicos, neste caso estão
extracromossómicos.
⇒ Membrana celular. É
o principal órgão
metabólico da bactéria,
é o sítio onde se dá a
respiração celular.
⇒ Parede celular. Aqui
chama muito à atenção,
o destaque deste
peptidoglicano.
⇒ Está aqui também
representado um
flagelo, que é um órgão
de locomoção.
MEMBRANA
Este é o modelo clássico de Singer Nicholson que também não é novo para vocês:
⇒ Uma bicamada de fosfolipídeos. Os fosfolípidos são polares, com uma extremidade
hidrofílica e uma extremidade hidrofóbica (voltada para o interior);
⇒ Proteínas (proteínas periféricas ou extrínsecas e proteínas integrais ou
intrínsecas-transmembranares).
Os fosfolípidos são parecidos com os das membranas celulares dos eucariotas, mas têm
alguma diferença em termos de constituição: têm mais fosfatidilglicerol e mais
fosfatidiletanolamina.
De um modo geral, as membranas celulares de uma bactéria, têm também um teor
proteico maior do que têm as membranas dos eucariotas, porque estas proteínas têm que
efectuar muitas funções metabólicas, por exemplo:
⇒ Produção de energia;
⇒ Respiração, que nos eucariotas, nas células mais evoluídas, já são feitas por
organelos especializados.
Portanto em peso seco comparativamente a um eucariota, uma bactéria tem mais
proteínas na sua membrana.
Funções
As funções são muitas:
⇒ Permeabilidade;
⇒ Transporte de iões e substâncias dos mais diversos tipos que a bactéria precisa;
⇒ Transporte de electrões e fosforilação oxidativa;
⇒ Excreção de exoenzimas e de outras proteínas;
⇒ Funções biossintéticas das mais variadas, inclusivamente vamos ver que parte da
síntese da parede celular é feita a um passo importante que só ocorre a nível
membranar;
⇒ Funções de quimiotaxia (despertando a resposta pelo organismo que está a ser
agredido).
Transporte
Ora bom, de uma forma muito simplificada, como é que se faz o transporte através
destas membranas? Ou se faz por difusão passiva ou se faz por transporte activo.
Um modelo muito recente sobre fisiologia da membrana, baseia-se também no
transporte através destas proteínas, mas segundo 3 modelos:
⇒ Modelo uniporte: passa uma única substância num só sentido;
⇒ Modelo simporte: passam 2 substâncias no mesmo sentido (uma digamos a
reboque);
⇒ Modelo antiporte: passam 2 substâncias mas em direcções opostas.
Segundo este modelo, a mesma proteína pode funcionar apenas de 1 destas 3 maneiras;
de 2 destas 3 maneiras; ou ainda das 3 maneiras em simultâneo (não é bem em
simultâneo, mas é pouco tempo após).
A membrana é o grande órgão metabólico da bactéria.
PAREDE
Temos aqui 2 tipos de parede.
Gram positivo
Aqui temos sobretudo uma
substância que é o peptidoglicano. E
cada uma destas “linhas” representa
uma camada e como vocês estão a
ver, estão aqui várias camadas. Esta
parede é essencialmente constituída
por peptidoglicano.
Peptidoglicano, mucopeptídeo,
mureína, são três termos que são
usados indistintamente nos vários
livros, para designar a mesma coisa. Aparecem aqui também representados estes ácidos
teicóicos. E estes ácidos basicamente são lipídeos, têm glicerol ou ribitol, e podem ser
classificados em dois tipos:
⇒ Ácidos teicóicos da Parede celular unidos por ligações covalentes ao
peptidoglicano;
⇒ Ácidos teicóicos da Membrana celular (ácido lipoteicóico) unidos por ligações
covalentes aos glicolípidos da membrana celular.
Mas o principal constituinte é o peptidoglicano.
Gram negativo
Aqui temos uma membrana citoplasmática
que é igual à das gram positivo, mas já
agora devo dizer-vos, que em ultra-
estrutura, em microscopia electónica (e
isto era uma coisa que classicamente era
considerado muito importante, mas
ninguém sabia dizer porquê), a membrana
citoplasmática da bactéria gram positiva
tem um perfil assimétrico (o folheto
externo é mais espesso), enquanto que a
membrana da gram negativo tem um perfil
simétrico. Isto hoje em dia tem muito
pouca relevância.
Constituição:
⇒ O peptidoglicano, resume-se a uma ou duas camadas. Não quer dizer que seja
exactamente uma ou duas, mas é muito pouco.
⇒ Temos aqui um espaço – espaço periplasmático – que não é virtual, mas é um
espaço laxo digamos assim, pouco denso, comparativamente a este e está
preenchido sobretudo por proteínas que vocês estão aqui a ver, tem aqui algum
fluido e existem aqui alguns nutrientes solúveis.
⇒ Depois existe aqui outra vez uma membrana, que se chama outer membrane
(tradução para português é membrana externa). Não é semelhante à membrana
citoplasmática, porque no folheto interno ela tem essencialmente fosfolípidos, mas
no folheto externo tem uma coisa que se chama lipopolissacáridos – tem lipídeos,
mas a esses lipídeos estão ligados carbohidratos.
⇒ Também não é sempre assim, podem haver zonas da membrana do gram negativo,
quer no folheto interno, quer no folheto externo onde existam fosfolípidos. Aliás, há
bactérias gram negativa que não têm, ou têm muito pouco, lipopolissacáridos e têm
no folheto externo sobretudo fosfolípidos. Mas este é um padrão clássico.
⇒ Também aqui nesta membana externa (outer membrane) existem proteínas longas
que formam poros, as chamadas porinas. Obviamente que são sistemas de
transporte através desta membrana externa.
PEPTIDOGLICANO
mucopeptídeo, a parede, que vai dar forma à bactéria, portanto ela para ficar redonda,
ou para ficar mais alongada, tem que ser degradada nalguns pontos.
O que é fabuloso em termos de aspectos genéricos da síntese desta parede, é que a
bactéria não acumula percursores, a bactéria não tem reservatórios por exemplo de
ácido N-acetil-murânico ou N-acetil-glicosamina. Ela começa a sintetizá-los logo que
precisa deles, mas a síntese acaba por ser contínua, porque também a parede está
continuamente a degradar-se, aliás como a membrana, porque está a ser constantemente
atacada. Quando o metabolismo energético da bactéria não lhe permite acudir a tantos
pontos de agressão e começa a ter problemas de recuperação da parede e sobretudo da
membrana, a bactéria acaba por morrer.
É o peptidoglicano que confere rigidez estrutural à bactéria gram positivo. É uma
substância que se torna insolúvel, quando são retirados aqueles resíduos de ácidos
aminados. Enquanto está na fase citoplasmática e na fase membranar é hidrossolúvel,
mas depois torna-se insolúvel na água.
Estes ácidos teicóicos, obviamente que são solúveis, são hidrossolúveis. Não conferem
propriamente rigidez, funcionam muitas vezes como antigénios, têm funções ainda
muito pouco esclarecidas.
Resumo da biossíntese do peptidoglicano:
⇒ Fase citoplasmática:
o Produção dos percursores peptídicos
⇒ Fase membranar
o Transporte daquelas substâncias através da membrana
citoplasmática
⇒ Fase parietal
o Interligações interpeptídicas
Vocês têm o hábito de dizer que a bactéria gram negativo tem uma parede menos
espessa que a bactéria gram positivo, e isso não é verdade!
Ela (gram negativo) tem menos mucopeptídeo, mas a espessura não tem só a ver com o
peptidoglicano ou mucopeptídeo. Ela tem muito pouco peptidoglicano, mas tem um
espaço periplasmático, que aliás o próprio peptidoglicano já está contido no espaço
periplasmático, como tem proteínas e depois tem uma membrana externa, constituída
por dois folhetos, e que sobretudo nas enterobacteriácea têm uma espessura grande,
porque têm lipopolissacáridos bastante longos.
Devo-vos dizer que estes lipopolissacáridos, este LPS, é um dos principais mecanismos
de patogenicidade das bactérias.
Constituição do lipopolissacárido:
Portanto, mas como estão a ver, esta parede celular (da gram negativa), é uma parede
celular bastante espessa. Não se esqueçam disto!
Queria chamar a atenção do seguinte: há pouco mostrei aquelas ligações β1,4, onde
actuava a lisozima. Isto tem interesse porquê?
A lisozima é uma enzima que existe nas lágrimas, na saliva, na clara do ovo, nas nossas
excreções, e essa enzima é capaz de quebrar essas ligações. Ora bom, quando a lisozima
actua sobre a parede celular de uma bactéria de gram positivo, dá-se a lise dessa parede
e forma-se um protoplasto. Mas esta lisozima, não é capaz de atingir esta camada de
peptidoglicano da bactéria de gram negativo, por causa desta membrana externa, por
causa daqueles fosfolípidos.
Então se eu fizer actuar lisozima, mas juntamente um agente quelante de iões, por
exemplo o EDTA, e um tampão Tris, estes vão favorecer a entrada através desta camada
acima de tudo lipídica. A lisozima atinge o peptidoglicano da parede da bactéria de
gram negativo, degrada e portanto a bactéria fica com uma forma esférica, mas passa a
chamar-se não protoblasto, mas esferoblasto. Isto porque a lisozima não faz
desaparecer a membrana externa, e portanto fica uma célula sem peptidoglicano, mas
rodeada de membrana externa, acima de tudo constituída por proteínas e lipídeos.
Excepções a isto?
Nem todas as bactérias são assim, e insisto mais uma vez, não estamos aqui a falar de
arqueobactérias, estamos a falar de eubactérias.
Mas há bactérias muito importantes em patologia humana, que eu destaco o
mycobacterium, mycobacterium Leprae, mycobacterium tuberculosis (agente da
tuberculose), que muito embora tendo ultra-estruturalmente, a parede semelhante a uma
parede de gram positiva (tem bastante peptidoglicano), tem no seu exterior uma camada
de lipídeos completamente diferentes daqueles que nós vimos na bactéria de gram
negativo. Ele tem no seu exterior, acima de tudo, lípidos de alto peso molecular, que
são estes ácidos micólicos; Ele tem como que “bolas de cera” no seu exterior e é isto
que o torna completamente insensível aos métodos de coloração, que são utilizados para
corar a maior parte das bactérias. Este tipo de bactéria não cora pelo método de gram,
porque os corantes não conseguem penetrar aqueles lipídeos, aquelas ceras. A síntese
destes lipídeos é bastante complexa, é bastante demorada, demora muitas horas. Eu
disse-vos que uma Escherichia Coli se dividia em 20 minutos e uma bactéria destas
divide-se em várias horas. Depois havemos de ver mais tarde, que a resposta
imunológica para estas bactérias é completamente distinta daquela que é genericamente
semelhante para a grande maioria das bactérias que nós vamos estudar. Pensa-se que
essa resposta imunológica, que tem a ver com este tipo de lipídeos, concretamente com
estes ácidos micólicos. Depois havemos de ver, mais adiante, com mais detalhe, o
mycobacterium, a corar muito fracamente com o método Ziehl-Neelsen. Como estão a
ver aqui nesta imagem o mycobacterium, apesar de serem bacilos, têm uma forma
irregular, que tem a ver com os ácidos micólicos que têm.
Pili ou Fímbrias:
⇒ São pequenas projecções proteicas (proteína classicamente chamada de pilina) que
não são visíveis em microscopia óptica, só em microscopia electrónica.
⇒ São muito importantes em termos de adesão. Não uma adesão inespecífica, mas
uma adesão a receptores. Primeiro conheceram-se os chamados F pili ou pili de
fertilidade, pili factores sexuais. Na próxima aula vamos falar sobre trocas de
material genético e vamos ver que as bactérias podem contactar entre elas e
transferir material genético, através desses pili. Tem a ver com a adesão das
bactérias, há um pili que funciona como um factor de fertilidade masculino e
portanto essa foi a primeira adesão que foi conhecida por estes pili. Mas eles são
muito importantes para aderir por exemplo a células do epitélio, que têm
determinados receptores, determinadas leptinas e isto por exemplo, está muito bem
caracterizado para algumas enterobacteriáceas, alguns bacilos de gram negativo, que
são agentes importantes de infecção urinária.
⇒ Quem tem o azar de ter uma infecção urinária baixa, uma cistite, por uma bactéria
que tem o mesmo tipo de adesinas e tem uma boa interacção específica com as
proteínas que existem à superfície do epitélio, tem o azar de facilmente ver essa
cistite, essa infecção urinária baixa, transformada numa pielonefrite. A bactéria
ascende pelo ureter e atinge o rim. Precisamente por isso, não é só porque ela se
multiplica rapidamente ou que seja móvel.
Uma bactéria para infectar a mesa tem primeiro que colonizar a mesa. Por aqui passam
fluidos, vento e, portanto, a bactéria terá que se “agarrar” à mesa.
Imaginem a árvore brônquica: a bactéria para chegar aos pulmões tem que se “agarrar”
aos brônquios caso contrário será facilmente eliminada.
A mesma coisa acontece num endotélio de um vaso. Tem que haver uma adesão que lhe
permita permanecer ali algum tempo para depois se replicar. É um processo muito
importante para garantir a capacidade de colonização e multiplicação da bactéria.
Os flagelos são:
A bactéria Gram – tem um flagelo obviamente muito mais complexo, porque estando só
ancorado na membrana (não tendo o suporte do peptidoglicano), o flagelo é facilmente
removido. Portanto, tem vários anéis que o fixam, quer no peptidoglicano (que é
pequeno relativamente à bactéria Gram +), quer na membrana.
ESTRUTURA EXTERNA
Cápsula [polissacarídica, polipeptídica (bacillus anthracis)]
Slime Layer
Glicocálice
S-layer
CÁPSULA
De modo geral a cápsula é de natureza polissacarídica (carboidratos) mas existem
algumas excepções, como a cápsula do bacillus anthracis (tem uma cápsula
polipeptídica de ácido glutâmico). A cápsula pode ser visualizada quer positivamente
(corando-a por um método que cora a cápsula), quer negativamente (corando tudo o que
está à volta ficando um halo) pelo método de tinta-da-china.
Para além de carboidratos têm, em alguns casos (as bactérias Gram + e Gram – não são
as únicas), polissacarídeos com especificidade antigénica. Assim servem como
antigénios, podendo ser utilizados para a produção de anticorpos que identificam e
detêm as bactérias. Evidentemente se tivermos um anticorpo contra um determinado
antigénio que é específico, por exemplo, do streptococcus pneumoniae, eu já nem
preciso de cultivar a bactéria e esperar longas horas e longos dias. Eu encontro
especificamente aquela bactéria com esta técnica e podemos até identificar vários tipos
de bactérias.
S-LAYER
A S-layer é visível e é de natureza proteica. Tem uma camada muito fininha periódica
que está onde não se devia encontrar. Não digam que é uma cápsula proteica mas sim
uma camada fininha de revestimento de natureza periódica que está à superfície de
determinadas bactérias.
ESPOROS
Na última aula falamos das diferenças entre uma bactéria, um fungo e uma célula
eucariótica. O fungo reproduz-se sempre por esporos e as bactérias reproduzem-se por
divisão binária. Mas há bactérias que produzem esporos. Contudo, as bactérias que
produzem esporos não os produzem para se reproduzir mas sim para assegurar a
sobrevivência da espécie. A bactéria divide-se sempre por divisão binária!
Quando esta célula encontrar condições para que possa esporolar/ germinar (a célula
tem sensores), isto é, voltar à forma vegetativa, ela quebra a parede do esporo e
desenvolve-se tal como ela era, tendo as mesmas características genéticas.
Esquema de um esporo
Constituição do esporo:
⇒ Core – protoblasto do esporo contendo DNA e os restantes elementos da
bactéria; zona central, “coração”;
⇒ Membrana interna
⇒ Parede do esporo – formada por peptidoglicano normal que irá originar a
futura parede celular da célula vegetativa; camada interna da bactéria;
⇒ Córtex – camada mais espessa constituída por um tipo especial de
peptidoglicano com menos peptídeos “crosslinks” (são ligações finais que vão
ser quebradas na célula vegetativa); é muito sensível à lisozima e às
autolisinas;
⇒ Membrana externa
⇒ Protein “coat” – formada por uma proteína “keratin-like”; impermeável e
confere aos esporos a sua relativa resistência aos agentes químicos;
⇒ Exosporo – membrana lipoproteica contendo também carboidrato.
Formação do Esporo
1. Duplicação do DNA;
2. Uma cópia do DNA e conteúdo
citoplasmático é envolvido pela
membrana citoplasmática, pelo
peptidoglicano e pela membrana do
septo;
3. As duas camadas estão envolvidas
pelo córtex, que é constituído pela
membrana interna do
peptidoglicano “crosslinker” e uma
camada externa de peptidoglicano;
4. O cortéx é envolvido por uma
camada externa formada por uma
proteína “keratin-like” (coat);
5. Libertação do esporo.
Porque é que a célula-mãe não resiste ao calor, não resiste ao frio, não resiste à
desidratação e o esporo é capaz de resistir?
A célula-mãe tem também uma parede celular! Contudo, no esporo, a parede sofre
transformações. O invólucro torna-se mais espesso, resultando da sobreposição de duas
membranas celulares e de duas paredes celulares, tendo muito peptidoglicano. Esta
parede é enriquecida com ácido dipicolínico e este ácido confere uma termo-resistência
e uma resistência mecânica às células.
No interior do esporo visualizam-se muitas inclusões de glicogénio que lhe vão
permitir, após a germinação, sobreviver nas primeiras horas.
Germinação do esporo
No interior da forma
vegetativa mas que
não deformam o corpo
da bactéria
Deformam o corpo
bacteriano
Para além desta resistência química, a resistência física/ rigidez deste esporo é tão
grande que é extremamente difícil obter um corte de um esporo para microscopia
electrónica. Tal como os tecidos, as bactérias têm que ser aglutinadas, têm que ser
incluídas em Epon e cortada com uma lâmina de diamante. Este esporo é tão rígido que
quando a lâmina de diamante toca na parede do esporo, muitas vezes ele salta e liberta-
se do Epon.
A bactéria precisa de O2, fonte de carbono, azoto, sais minerais (cobre, potássio,
magnésio, cálcio, ferro, sódio e cloro) e alguns micronutrientes.
Não vou estar a descrever ao pormenor as vias de catabolismo e anabolismo mas quero
que tenham presente o seguinte: as bactérias não se podem “dar ao luxo” de ter uma
função metabólica que não precisam. De um modo geral, a bactéria está preparada para
metabolizar em primeiro lugar carboidratos metaboliza primeiro a glicose porque é
muito mais difícil estar a degradar a frutose e a lactose pois são carboidratos mais
complexos. Contudo, ela é capaz de degradar muitos carboidratos diferentes.
A bactéria sofre um fenómeno a que se chama repressão metabólica, isto é, tem muitas
das suas vias metabólicas reprimidas porque não necessita delas.
A bactéria produz pouca energia para aquilo que precisa de fazer: sintetizar substâncias,
reparar a membrana, a parede celular, a cápsula e as suas proteínas.
Portanto, de um modo geral, a bactéria obtém energia e consegue converter tudo através
do ciclo de Krebs: quer a partir de proteínas, quer a partir de polissacáridos, quer a partir
de lípidos… Reparem na importância do piruvato e da acetil-CoA. Não vou falar destas
vias mas façam o favor de as ler e compreender (ver em anexo imagens sobre o tema).
É assim que a bactéria consegue sintetizar outros aminoácidos que são essenciais
(através do ciclo de Krebs) e que não os obtém a partir do meio.
Interpretação da curva:
Inicialmente temos a fase inicial de adaptação e fase de crescimento exponencial
(Tc=positiva).
Entretanto começam a escassear nutrientes (carboidratos) ou o O2 (que é essencial para
as bactérias aeróbias) – Por isso a cultura é mantida em agitação (facilita a dissolução
do oxigénio). Então, a bactéria entra numa fase de crescimento estacionário, ou seja, a
bactéria leva um bocado mais de tempo a dividir-se até parar por completo a sua divisão
(Tc=0).
Entretanto o meio não suporta mais o crescimento. Inicialmente, a Tc ainda não é
negativa, porque muitas bactérias, apesar de não terem nutrientes no exterior, podem ter
reservas metabólicas (carboidratos ou lipídeos) que assegurem a sua sobrevivência.
Contudo, esgotadas todas as reservas, a taxa de crescimento torna-se francamente
negativa porque o número de bactérias que nasce é significativamente inferior ao
número de bactérias que morrem. A taxa de crescimento diminui até que chega ao zero.
Esta curva é diferente para o mesmo meio de cultura, é diferente de bactéria para
bactéria, é diferente da salmonella para a escherichia coli. Para a mesma escherichia
coli é diferente de meio de cultura para meio de cultura.
quantas bactérias existe naquele meio de cultura. Eu consigo saber qual o tempo de
duplicação da bactéria que estou a estudar.
ANEXOS