Professional Documents
Culture Documents
Praktikum
Jerka Dumić
Sanja Dabelić
Olga Gornik
Gordana Maravić Vlahoviček
Ruđer Novak
Sandra Šupraha Goreta
Recenzenti
Prof. dr. sc. Karmela Barišić
Prof. dr. sc. Jasna Lovrić
J. Dumić i sur.,
Biološka kemija Praktikum;
ur. J. Dumić,
izdavač Sveučilište u Zagrebu,
Farmaceutsko-biokemijski fakultet,
Zagreb 2010.
ISBN 978-953-6256-61-7
CIP zapis dostupan u računalnom katalogu
Nacionalne i sveučilišne knjižnice u Zagrebu pod brojem 744598
Sadržaj
(sekvenciranje
Vježba 1.
R
+
H3N Cα COOH
1
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Tablica 1.1 Popis proteogenih aminokiselina (struktura, Mr, pKa vrijednosti funkcionalnih
skupina). Preuzeto i prilagođeno iz (1).
Ime, troslovni i pKaR
pKa1 pKa2
jednoslovni Strukturna formula a Mr bočni
α-COOH α-NH3+
simbol ogranak
Nepolarne aminokiseline
Glicin
Gly 75,1 2,34 9,78
G
Alanin
Ala 89,1 2,35 9,87
A
Valin
Val 117,2 2,29 2,74
V
Leucin
Leu 131,2 2,33 2,74
L
Izoleucin
Ile 131,2 2,32 2,76
I
Metionin
Met 149,2 2,13 9,28
M
Prolin
Pro 115,1 1,95 10,64
P
Fenilalanin
Phe 165,2 2,20 9,31
F
Triptofan
Trp 204,2 2,46 9,41
W
Polarne neutralne (nenabijene) aminokiseline
Serin
Ser 105,1 2,21 9,15
S
Treonin
Thr 119,1 2,09 9,10
T
Asparagin
Asn 132,1 2,02 8,8
N
Glutamin
Gln 146,1 2,17 9,13
Q
Cistein
Cis 121,2 1,71 10,78 8,33
C
Tirozin
Tyr 181,2 2,2 9,11 10,07
Y
2
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Zbog tog svojstva da istovremeno mogu primiti proton (kiseline), ali i otpustiti proton
(baze) aminokiseline smatramo amfoternim molekulama, odnosno amfolitima. Takav
oblik, u kojem molekula ima skupine suprotnih naboja nazivamo dipolarnim ionima ili
"zwitterionima“.
3
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
pH 14
12
pK3
10 pK2
pI
8
4
pK1
2
0
0 1,0 2,0 3,0
mol NaOH / mol AK
4
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
U tom se primjeru pKa (-log Ka) vrijednosti (2,18; 8,95 i 10,53) dovoljno razlikuju da
titracijska krivulja jasno pokazuje pojedinačne disocijacijske korake. S obzirom na to da
pKa odgovara onoj vrijednosti pH pri kojoj je količina disociranog i nedisociranog
oblika jednaka, očekujemo da će svaki disocijacijski korak stvoriti svoje pufersko
područje.
Nagib titracijske krivulje je minimalan pri dodatku 0,5, 1,5 odnosno 2,5 ekvivalenta
baze. Tada je [AK2+] = [AK+], odnosno [AK+] = [AK0], odnosno [AK0] = [AK-]. U tim
točkama dodatak baze izaziva najmanju promjenu pH.
Otopina koja se opire promjeni pH poznata je kao puferska otopina. Puferi su prema
definiciji smjese slabih kiselina ili baza i pripadajućih im soli. Djelovanje pufera sastoji
se, dakle, u sposobnosti A- iona da preuzmu dodane H+ ione i stvore HA te na taj način
ublaže promjenu pH. S druge pak strane, prilikom dodatka OH- iona dolazi do
preuzimanja protona od strane HA pri čemu nastaju H2O + A- ione, čime se puferska
otopina opire promjeni pH.
Puferski kapacitet definira se kao broj molova H+ ili OH- iona koji dodani sustavu
smanjuju ili povećavaju pH za jednu jedinicu. Puferski kapaciteti nekog pufera u
kiselom i u baznom smjeru mogu biti različiti, a jednaki su samo kada je pH = pKa i
tada on ima maksimalnu vrijednost (maksimalni puferski kapacitet). To slijedi izravno
iz definicije konstante disocijacije izražene u logaritamskom obliku koji je poznat pod
imenom Henderson-Hasselbalchova jednadžba.
5
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
+NH C H C O H +NH C H C O - + H+
3 2 2 3 2 2
+NH CH CO - -
NH2CH2CO2 + H+
3 2 2
+ -
U izoelektričnoj točki [ NH3CH2CO2H] = [NH2CH2CO2 ], pa je
Ka 1 × Ka 2 = [H + ]2
(pKa1 + pKa 2 )
pH = = pI
2
1.3 Zadaća
Titrirajte otopinu izoelektrične aminokiseline kiselinom, a potom i bazom. Na
temelju krivulje dobivene potenciometrijskom titracijom uzorka odredite o kojoj se
aminokiselini radi. Iz grafa očitajte pKa vrijednosti, pI vrijednost te ekvivalente dodane
kiseline, odnosno lužine na osnovi kojih ćete izračunati Mr nepoznate aminokiseline iz
uzorka.
6
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
1.4 Reagencije
• 0,2 M NaOH u dest. vodi
• 0,2 M HCl u dest. vodi
• otopina izoelektrične aminokiseline (3 g/L destilirane vode)
1.5 Pribor
• pH-metar
• kombinirana elektroda
• magnetska miješalica
• magnet
• bireta za HCl (25 mL)
• bireta za NaOH (25 mL)
• stalak za birete s nastavkom
• pipete
• čaša od 100 mL
• odmjerne tikvice
• staničevina
• milimetarski papir
1.7 Postupak
• U čašu od 100 mL dodajte 40 mL uzorka (otopina izoelektrične aminokiseline, 3
g/L) te u nju stavite magnet. Postavite čašu na magnetsku miješalicu tako da se
magnet lagano okreće.
• Kombiniranu elektrodu prethodno uključenog i baždarenog pH-metra izvadite iz
zasićene otopine KCl, isperite je destiliranom vodom, lagano obrišite
staničevinom i uronite u čašu s uzorkom. Pazite da elektrodu uronite dovoljno
duboko u otopinu, ali tako da je magnet ne može udariti. Napomena: poželjno je
elektrodu pH-metra čim prije uroniti u otopinu, odnosno čim kraće vrijeme
ostavljati na zraku.
• Napunite biretu od 25 mL 0,2 M otopinom NaOH te je postavite tako da možete
titrirati uzorak u koji je uronjena elektroda u čaši na miješalici.
• Titrirajte sadržaj u čaši 0,2 M otopinom NaOH iz birete. Lužinu dodajte u malim
obrocima (0,1-0,2 mL), kako bi grafički prikaz titracije sadržavao što više
eksperimentalnih točaka. Nakon svakog dodatka lužine pričekajte da se pH
ustali, očitajte ga i zabilježite.
• Po završetku titracije izvadite elektrodu i magnet iz čaše, a uzorak koji ste titrirali
bacite. Elektrodu isperite vodom i obrišite te je potom uronite u čistu čašu u koju
ste stavili novih 40 mL uzorka i magnet i postavili je na miješalicu.
• Na već opisani način titrirajte uzorak 0,2 M otopinom HCl.
7
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
1.8 Zadaci
1. Pri kojem je pH puferski kapacitet dva puta veći u lužnatom nego u kiselom
smjeru?
2. Glicin se često upotrebljava kao pufer. Komercijalno ga možemo nabaviti u
obliku glicin hidroklorida, izoelektričnog glicina ili natrijevog glicinata.
- - +
COOH COO COO Na
- + +
Cl H3 N C H H3 N C H H2 N C H
H H H
8
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
1.9 Literatura
1. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
2. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. (1999) Biochemistry. Canada: Brooks/Cole
Cengage Learning.
9
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Vježba 2.
Gel-filtracija hemoglobina
2.1 Gel-filtracija
Jedna od osnovnih zadaća preparativne i analitičke biokemije je odjeljivanje i
identifikacija bioloških molekula. Za odjeljivanje se često koriste kromatografske
metode kod kojih se smjesa tvari otopljena u pokretnoj fazi (koja može biti tekućina ili
plin) razdvaja na sastavnice propuštanjem kroz stacionarnu fazu (najčešće čvrsti
polimer). Tekućinska kromatografija u koloni podrazumijeva pokretnu fazu (otapalo) i
stacionarnu fazu u staklenoj, plastičnoj ili metalnoj koloni. Punjenje kolone, odnosno
zrnca kromatografskog materijala, mogu biti inertna ili mogu stupati u interakciju s
analitom. Kod kromatografije ionske izmjene, kromatografije obrnute faze i afinitetne
kromatografije pojedine komponente ostavaruju interakcije sa zrncima gela ovisno o
svom naboju, polarnosti ili afinitetu za ligand te se tako odjeljuju od ostalih komponenti
iz uzorka. Suprotno tome, kolona za gel-filtraciju sazdana je od inertnih zrnaca koja ne
stupaju u interakciju s analitom, odnosno ne vežu se, ne reagiraju s uzorkom, niti nose
električni naboj. Ovdje se razdvajanje temelji na različitoj brzini putovanja molekula
ovisno o njihovoj veličini.
U osnovnoj izvedbi, aparaturu za kromatografiju čini samo kolona punjena
kromatografskim materijalom. Uzorak se nanosi na kolonu koja se potom ispire
puferom, a sadržaj i koncentracija pojedine tvari u sakupljenim se frakcijama određuje
naknadno. Između zrnaca gela nalazi se intersticijska tekućina, a unutar njih prostor
ispunjen gel-tekućinom. Kod gel-filtracije velike molekule ne mogu prodrijeti kroz pore
i ući u zrnca gela pa brzo putuju intersticijskom tekućinom, dok male molekule prodiru
u zrnca usporavajući svoje putovanje (Slika 2.1).
male molekule
velike
molekule
10
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Ukupni volumen tekućine u koloni jednak je zbroju volumena pufera izvan i pufera
unutar zrnaca gela. Volumen dostupan pojedinoj molekuli obrnuto je razmjeran njenoj
veličini, odnosno vrlo velike molekule putuju kroz pufer izvan zrnaca gela i prve izlaze
iz kolone, a za njima kasnije izlaze manje molekule koje putuju i kroz pufer izvan
zrnaca gela i kroz pufer unutar zrnaca. Količina pufera potrebna da neka molekula
izađe iz kolone naziva se volumen ispiranja. Raspon masa molekula koje je moguće
odijeliti određenim kromatografskim materijalom za gel-filtraciju određen je veličinom
njegovih pora. No pored veličine pora, njegovo je važno svojstvo i veličina zrnaca gela
(krupna, srednja, sitna i vrlo sitna); što su zrnca krupnija pakiranje kromatografskog
materijala je rjeđe pa je brzina protoka veća, a time je separacija uzorka slabija. Stoga se
krupna zrnca primjenjuju za velike preparacije kod kojih je brzina važnija od
razlučivanja, sitna zrnca za većinu preparativnih postupaka, a vrlo sitna zrnca koriste se
u analitičke svrhe kada je potrebno maksimalno razlučivanje.
Zrnca za gel-filtraciju su umreženi polimeri, a razlikujemo tri osnovna tipa:
dekstran, agarozu i poliakrilamid. Dekstran je polisaharid sastavljen od monomera
glukoze. Sama zrnca kao i pore u njima mogu biti različite veličine. Agaroza je linearni
polimer D-galaktoze i 3,6-anhidro-L-galaktoze umrežen vodikovim vezama. Pore na
zrncima su mnogo veće nego kod dekstrana, što je korisno za odjeljivanje velikih
proteina ili dugih linearnih molekula (DNA, RNA). Poliakrilamidne gelove čine
umreženi akrilamid i N,N-metilenbisakrilamid. Po svojstvima pri odjeljivanju slični su
dekstranu, no dostupni su u širem rasponu veličine pora.
11
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
smeđe boje. Ovaj oblik ima veliki afinitet vezanja negativnih iona, ali i neutralnih
molekula s izraženim dipolnim momentom, pa umjesto kisika veže vodu.
A) B) C)
2.3 Zadaća
Priredite otopinu methemoglobina dodatkom kalijevog fericijanida u otopinu
hemoglobina. Gel-filtracijom razdvojite smjesu feri/ferocijanida i methemoglobina.
Protein će daljnjim prolazom kroz gel reagirati s prethodno unijetim Fe(II) reagensom
uslijed čega će se reducirati u deoksihemoglobin, a zatim oksigenirati otopljenim
12
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
2.4 Reagencije
• 0,02 M natrijev fosfatni pufer, pH 7
• 80 mM FeSO4 u 0,2 M natrijevom fosfatnom puferu, pH 7
• 80 mM EDTA u 0,2 M natrijevom fosfatnom puferu, pH 7
• uzorak (otopina deoksihemoglobina) u dest. vodi
• kalijev fericijanid
• Sephadex G-25
2.5 Pribor
• staklena kolona, 10 cm, φ=1 cm
• gumeni nastavak za kolonu sa stezaljkom
• parafilm
• stalak sa stezaljkom
• staklena čaša od 100 mL
• staklena boca
• Pasteurova pipeta
• plastične epruvete od 1,5 mL
• plastične epruvete od 15 mL
• stalak za epruvete
• špatula
• automatske pipete
• nastavci za automatske pipete
• boce štrcalice
2.7 Postupak
• Stezaljkom podesite protok pufera kroz staklenu kromatografsku kolonu u
staklenu čašu na 30 kapi u minuti. Prekinite istjecanje kada se razina pufera spusti
do površine zrnaca gela.
• Uzorak (otopinu deoksihemoglobina) razrijedite u epruveti puferom u volumnom
omjeru 1+4 (70 μL krvi + 280 μL pufera). Dodajte sasvim mali kristal fericijanida i
protresite epruvetu.
• U drugoj epruveti pomiješajte 0,1 mL otopine FeSO4 i 0,1 mL otopine EDTA.
• Kako biste dobili oštre vrpce slojeva u koloni nužno je pažljivo raditi i prilikom
nanošenja uzoraka na kolonu ne uzmutiti površinski sloj gela. Na kolonu prvo
nanesite 0,2 mL svježe priređene smjese FeSO4/EDTA u fosfatnom puferu,
13
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
2.8 Zadaci
1. Usporedite gel filtraciju i dijalizu. Navedite prednosti i mane pojedine tehnike
odjeljivanja molekula.
2. Obilježili ste velik segment DNA radioaktivnim nukleotidima. Koji ćete
kromatografski materijal upotrijebiti za razdvajanje molekula DNA od slobodnih
nukleotida?
3. Ima li razlike između oksidacije i oksigenacije hemoglobina? Objasnite!
4. Zašto se kisik labilno veže za prostetičku skupinu hemoglobina?
2.9 Literatura
1. Wood, E.J. (1989) Practical Biochemistry for Colleges. Pergamon Press.
2. Dixon, H.B.F. and McIntosh, R. (1967) Reduction of Methaemoglobin in
Haemoglobin Samples using Gel Filtration for Continuous Removal of Reaction
Products. Nature 213: 399-400.
3. Voet, D. and Voet, J.g. (1995) Biochemistry. John Wiley & Sonc Inc.
4. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. (1999) Biochemistry. Brooks Cole.
5. http://www.aw-bc.com/mathews/ch07/heme.htm
14
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Vježba 3.
varijabilni
prostorno bliskih cisteinskih ostataka. Na
dio
molekuli funkcionalno razlikujemo
konstantni i varijabilni dio (Slika 3.1).
Varijabilni dio specifično prepoznaje i laki
konstantni
veže antigen, dok konstantni dio lanac
posreduje u aktivaciji stanica imunosnog
dio
sustava. Kombiniranjem različitih amino- teški
kiselina u varijabilnom dijelu, imunosni lanac
sustav posredstvom protutijela može
prepoznati milijune različitih stranih
molekula u organizmu. Slika 3.1 Shematski prikaz molekule. Ig.
15
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
molekule poprimaju uređenu strukturu. Premda točan mehanizam nije poznat, smatra
se da povećanjem koncentracije amonijevog sulfata u otopini dolazi do kompeticije
između amonijevih i sulfatnih iona i proteina za slobodne molekule vode što dovodi do
agregacije i precipitacije proteina.
Možemo reći da amonijev sulfat oduzima vodu otopljenim proteinima te oni stoga
stvaraju nakupine i talože se. Za odvajanje je ključna empirijski utvrđena činjenica da se
određeni protein taloži u uskom rasponu koncentracija amonijevog sulfata. Na slici 3.2
prikazana su dva proteina s različitim
omjerom hidrofilnih i hidrofobnih skupina na
površini molekule. Jasno je da će se protein s
lijeve strane slike taložiti pri manjoj
koncentraciji amonijevog sulfata (jer ima
manje vodi izloženih hidrofilnih skupina,
odnosno okružen je s manje molekula vode).
Istaložene proteine moguće je centri- Slika 3.2 Dva proteina s različitim
fugiranjem razdvojiti od proteina zaostalih u omjerom hidrofilnih (crno) i
hidrofobnih (bijelo) skupina.
otopini.
A) B)
veže za proteine u uzorku, maskira njihov površinski naboj i oni postaju negativno
nabijeni. Količina negativno nabijenog detergenta koja će se vezati na protein razmjerna
je njegovoj veličini (1,4 g SDS/g proteina) pa putovanje proteina u električnom polju u
ovoj vrsti elektroforeze ovisi isključivo o njegovoj molekulskoj masi (s obzirom na to da
je omjer naboja i mase konstantan).
Proteine razdvajamo diskontinuiranom elektroforezom uz uporabu sabijajućeg i
razdvajajućeg gela koji se međusobno razlikuju u pH i gustoći (Slika 3.4). Proteini se
prolaskom kroz sabijajući gel (3-5%) pri pH 6,8 koncentriraju u usku vrpcu te svi
zajedno ulaze u razdvajajući gel (10-15%) u kojem je pH 8,8. Brzina putovanja u
razdvajajućem gelu uvjetovana je učinkom molekulskog prosijavanja, odnosno manji
proteini putuju brže, a veći sporije.
Uzorke pripremamo dodatkom pufera za nanošenje uzoraka koji sadrži SDS, β-
merkaptoetanol, glicerol i boju bromfenol
plavo u puferu pH 6,8. β-merkaptoetanol
kida disulfidne mostove, SDS denaturira
proteine uz kuhanje pri 95°C, glicerol
povećava gustoću uzorka te se oni tako
lakše nanose u jažice, a boja bromfenol
plavo služi za praćenje tijeka
elektroforeze, ali ne boja proteine.
Nakon provedene elektroforeze,
proteine vizualiziramo bojanjem gela
bojom koja specifično boja proteine,
Coomassie blue® R-250, otopljenoj u
metanolu i octenoj kiselini. Višak boje s
gela uklanjamo ispiranjem u otopini Slika 3.4 Ureñaj za diskontinuiranu SDS-
octene kiseline. PAGE. Slika preuzeta i modificirana iz (6).
17
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
3.5 Zadaća
Iz uzorka humanog seruma izolirajte imunoglobulin G. Provjerite čistoću
pročišćenog proteina SDS-poliakrilamidnom gel elektroforezom te odredite
koncentraciju izoliranog proteina.
3.6 Reagencije
• 3,5 M amonijev sulfat u dest. vodi
• 10 mM natrijev fosfatni pufer, pH 6,8
• 2 M NaCl u dest. vodi
• pufer za nanošenje uzoraka: 187,5 mM Tris/HCl pH 6,8; 6% SDS, 20% glicerol, 5%
β-merkaptoetanol, 0,1% bromfenol plavo u dest. vodi
• 1% agaroza u dest. vodi
• gel za sabijanje: 30% akrilamid/0,8% bisakrilamid, 1,0 M Tris HCl, pH 6,8, 10%
SDS, 10% amonijev persulfat u dest. vodi
• TEMED
• gel za razdvajanje: 30% akrilamid/0,8% bisakrilamid, 1,5 M Tris HCl, pH 8,8, 10%
SDS, 10% amonijev persulfat u dest. vodi
• pufer za elektroforezu: 192 mM glicin, 3,5 mM SDS, 25 mM Tris HCl, pH 8,3, u
dest. vodi
• otopina za bojanje gela (0,1% Coomassie blue® R-250, 45% metanol, 10% ledena
octena kiselina u dest. vodi)
• otopina za odbojavanje gela: (10% octena kiselina u dest. vodi)
• komercijalno pribavljena smjesa proteina poznatih molekulskih masa
• komercijalno pribavljen imunoglobulin G
3.7 Pribor
• automatske pipete
• nastavci za automatske pipete
• plastične epruvete od 1,5 i 2 mL
• stalak za epruvete
• stalak sa stezaljkom
• staklene boce
• flomaster za označavanje
• stolna centrifuga
• plastične kolone, 10 cm, φ = 1 cm
• gel Sephadex G-25
• Fractogel® TMAE-650 (anionski izmjenjivač trimetilaminoetan)
• plastične kapaljke
• peristaltička pumpa
• plastične cijevi s odgovarajućim priključcima
• čaše od 100 mL
• termostatirana tresilica
• mješač Vortex
• digestor
18
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
3.9 Postupak
3.9.1 Isoljavanje amonijevim sulfatom
• U 200 μL humanog seruma dodajte 400 μL 3,5 M otopine amonijevog sulfata, tako
da njegova konačna koncentracija bude 2,3 M. Začepite epruvetu i promiješajte
uzorak.
• Uzorak centrifugirajte 5 minuta pri 5400g te potom supernatant pipetom odbacite
u čašu za otpad.
• Preostali talog resuspendirajte u početnom volumenu (200 μL) 10 mM fosfatnog
pufera pH 6,8.
19
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
• Nakon što sakupite prvih 1 mL tekućine koja istječe iz kolone, tu frakciju bacite, a
sljedeća 2 mL koja istječu iz kolone nastavite sakupljati u epruvetu od 2 mL. Taj
uzorak sačuvajte za sljedeći korak pročišćavanja (anionsku izmjenu).
• Kako bi kolonu za gel-filtraciju isprali od amonijevog sulfata, propustite kroz nju
30 mL pufera koji po izlasku s kolone sakupljajte u čašu za otpad i potom bacite.
20
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
21
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
• Kada boja iz uzorka (bromfenol plavo) dosegne donji rub razdvajajućeg gela
prekinite tok električne struje.
• Razdvojite stakla, uronite gel u otopinu za bojanje te sve zajedno zagrijavajte 45
sekundi pri maksimalnoj jakosti u mikrovalnoj pećnici. Potom ostavite gel u
otopini za bojanje na zibaljci tijekom sljedećih 15 minuta.
• Izlijte otopinu za bojanje iz kadice u kojoj se nalazi gel te kadicu s gelom kratko
isperite destiliranom vodom. Potom u nju dodajte otopinu za odbojavanje koju
zatim zagrijte tijekom 45 sekundi u mikrovalnoj pećnici pri najvećoj jakosti.
Nastavite odbojavanje gela tijekom sljedećih 15 minuta na zibaljci.
• Utvrdite u kojim se frakcijama nalazi IgG i je li pročišćen od ostalih proteina
seruma.
3.8 Zadaci
1. Koja je razlika između krvnog seruma i krvne plazme?
2. Koja je funkcija varijabilnog dijela, a koja konstantnog dijela imunoglobulina G?
3. Koji dio proteinske strukture apsorbira svjetlost valne duljine 280 nm?
4. SDS-poliakrilamidnom elektroforezom analizirali ste smjesu proteina i nakon
bojanja gela bojom Coomassie na gelu vidite tri vrpce. Možete li na osnovu toga sa
22
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
3.9 Literatura
1. Gornik, I., Maravić, G., Dumić, J., Flögel, M. and Lauc, G. (1999) Fucosylation of
IgG Heavy Chains is Increased in Rheumatoid Arthritis. Clinical Biochemistry. 32:
605-608.
2. Aurer, I., Lauc, G., Dumić, J., Rendić, D., Matišić, D., Miloš, M., Heffer-Lauc, M.,
Flögel, M. and Labar, B. (2007) Aberrant Glycosylation of Igg Heavy Chain in
Multiple Myeloma. Coll Antropol. 1: 247-251.
3. http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/amso4.htm
4. Deyl Z. ed. (1983). Electrophoresis: A survey of techniques and applications.
Elsevier Scientific, Amsterdam/New York.
5. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.
6. Alberts, B. et al. (2002) Molecular Biology of the Cell. Garland Science
7. Shapiro AL, Viñuela E, Maizel JV Jr. (September 1967). Molecular weight
estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.
Biochem Biophys Res Commun. 28 (5): 815–820.
8. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
23
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Vježba 4.
Enzimska kinetika
(sekvenciranje
4.1. Klasifikacija enzima
Nazivlje enzima najčešće potječe od imena supstrata ili vrste kemijske reakcije koju
kataliziraju, uz nastavak – aza. Tako je primjerice katekol supstrat enzima katekolaze, a
proteaze su enzimi koji kataliziraju razgradnju proteina. Prema IUBMB nomenklaturi
(nomenklaturi Međunarodnog udruženja za biokemiju i molekularnu biologiju, engl.
International Union of Biochemistry and Molecular Biology, IUBMB) enzimi se
označavaju brojevima EC. Svaki je enzim opisan slijedom četiri broja, pri čemu prvi broj
klasificira enzime u jednu od 6 osnovnih skupina koje su formirane ovisno o
mehanizmu reakcije koju kataliziraju (Tablica 4.1).
Tablica 4.1 Klasifikacija enzima.
4.2. Katekolaza
U oksidoreduktaze ubrajamo i katekolazu (drugim imenom katekol-oksidazu;
tirozinazu odnosno 1,2-dihidroksibenzen: kisik oksidoreduktazu, EC 1.10.3.1), enzim
široko rasprostranjen u biljkama. Katekolaza katalizira reakciju katekola i kisika u kojoj
se katekol oksidira u benzokinon (Slika 4.1). U stanicama se nalazi u vezikulama i
dolazi u doticaj s katekolom i kisikom nakon oštećenja stanice. Smeđa boja koja nastaje
kada se, primjerice, voće razreže i stoji na zraku potječe od nastalog benzokinona.
Benzokinon inhibira rast mikroorganizama te tako štiti oštećenu biljku od truljenja.
katekolaza
2 + O2 2 + 2 H2O
katekol benzokinon
(1,2 – dihidroksibenzen) (crven)
24
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
4.4. Zadaća
Priredite reakcijske smjese s istim koncentracijama enzima i različitim
koncentracijama supstrata i odredite apsorbancije tako priređenih smjesa u
tridesetosekundnim intervalima tijekom prve tri minute enzimske reakcije. Zaključite
kada je enzimska reakcija u ustaljenom, a kada u post-ustaljenom stanju. Izračunajte
vrijednosti početne brzine enzimske reakcije pri različitim koncentracijama supstrata.
25
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
4.5. Reagencije
• 10% ekstrakt krumpira u fosfatnom puferu, pH 7,0 (držati na ledu u tamnom)
• 20 mM katekol u dest. vodi
• 50 mM natrijev fosfatni pufer, pH 7,0
4.6. Pribor
• staklene epruvete
• plastične epruvete od 15 mL
• stalak za epruvete
• staklene čaše
• aluminijska folija
• automatske pipete
• nastavci za automatske pipete
• staklena kiveta
• staničevina
• staklene boce
• boce štrcaljke
• štoperica
• VIS spektrofotometar
26
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
4.8. Postupak
4.8.1. Tijek enzimske reakcije i učinak koncentracije supstrata na početnu brzinu
enzimske reakcije
• Označite epruvete i u njih precizno ispipetirajte odgovorajuće volumene pufera,
vode i katekola (navedene u tablici 4.2).
Tablica 4.2 Sastav reakcijskih smjesa.
• Prva epruveta (označena S) ne sadrži katekol te služi kao slijepa proba. Dodajte u
prvu epruvetu 0,5 mL ekstrakta krumpira, začepite epruvetu i promućkajte je te
sadržaj epruvete prelijte u kivetu. Stavite kivetu u spektrofotometar te
apsorbanciju pri 540 nm namjestite na vrijednost 0.
• Ispraznite kivetu, isperite je destiliranom vodom i protresite kako biste iz nje
uklonili svu tekućinu.
• Dodajte u sljedeću epruvetu (1) 0,5 mL katekola i istovremeno uključite
štopericu. Začepite epruvetu i promućkajte je, potom njezin sadržaj prelijte u
kivetu koju umetnite u spektrofotometar te očitavajte apsorbancije svakih 30
sekundi tijekom 3 minute. Rezultate upisujte u tablicu 4.3.
• Na isti gore opisani način izmjerite apsorbancije ostalih uzoraka. Napomena: nije
potrebno ponovno koristiti slijepu probu.
Tablica 4.3 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije uz konstantnu koncentraciju
enzima katekolaze.
27
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Tablica 4.5 Vrijednosti apsorbancije tijekom enzimske reakcije pri koncentraciji katekola
8,0 mM.
28
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
4.9. Zadaci
1. Možete li metodom opisanom u ovoj vježbi pratiti što se događa s
koncentracijom produkta tijekom predustaljenog stanja? Zašto?
2. Zašto ekstrakt krumpira tijekom ove vježbe držite na ledu?
3. Koje su osnovne osobine ustaljenog stanja enzimske reakcije koja prati Michaelis-
Menteničinu kinetiku?
4. Kako biste podesili reakcijske uvjete ako ste u pokusu A izmjerili određenu
maksimalnu brzinu studirane enzimske reakcije, a u pokusu B želite da
izmjerena maksimalna brzina bude 2 puta veća od brzine u pokusu A?
4.10. Literatura
1. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
2. Wood, E.J. (1989) Practical Biochemistry for Colleges. Oxford: Pergamon Press.
3. Price, N.C., Dwex, R.A., Ratcliffe, R.G. and Wormald, M.R. (2005) Principles and
Problems in Physical Chemistry for Biochemists. Oxford: Oxford University
Press.
29
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Dodatak:
Enzimska kinetika
(sekvenciranje
Svaku kemijsku reakciju pokreće negativna razlika Gibbsove energije između
produkata reakcije i reaktanata. Tijekom reakcije ta se energetska razlika smanjuje.
Sustav ulazi u ravnotežu kad je razlika Gibbsovih energija jednaka nuli. Pozitivna
energetska razlika pokreće povratnu reakciju. Oslobađanje energije bitno je za
spontanost reakcije. Međutim, ne teku sve energetski povoljne reakcije spontano i brzo.
Postoje vrlo spore reakcije usprkos velikom energetskom potencijalu. Njih koči
energetska prepreka koju treba prijeći na putu do produkta reakcije: treba aktivirati
reaktante. U kemiji se potrebna energija aktivacije najčešće namakne povišenjem
temperature. U organizmu, koji može živjeti u vrlo ograničenom temperaturnom
rasponu, spore se reakcije ubrzavaju pomoću enzima, vrlo specifičnih i moćnih
bioloških katalizatora. Enzimska je reakcija složenijeg mehanizma od nekatalizirane
reakcije, ali teče brže, uz smanjenu energiju aktivacije (Slika 1). Katalitička moć enzima
je vrlo različita, a najveća brzina enzimske reakcije ograničena je difuzijom (k = 10-9Ms-1).
→S#)
ΔG0#(S→
S
→ P# )
ΔG0#(ES→
Kompleks ES zatim može dati produkt i slobodni enzim ili može u povratnoj reakciji
disocirati na reaktante. Enzim ne mijenja položaj ravnoteže S P, on samo ubrzava
reakciju pretvorbe supstrata u produkt do uspostavljanja ravnoteže.
Brzina nastajanja produkta ovisi o katalitičkim svojstvima i koncentraciji enzima te
koncentraciji supstrata. Zbog načina vezanja supstrata, prirode katalitičke reakcije i
dinamičnosti proteinske strukture, tijek i brzina reakcije vrlo su osjetljivi na reakcijske
30
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
uvjete, kao što su temperatura, pH i ionska jakost te drugi sastojci u reakcijskom mediju
(proteini, aktivatori, inhibitori i dr.).
d[ES]/dt > 0
vrijeme
Slika 2. Tijek enzimski katalizirane reakcije. Nakon miješanja enzima i supstrata dolazi do
stvaranja kompleksa ES. Koncentracija ES raste dok se ne ustali, odnosno dok reakcijski sustav ne uđe u
ustaljeno stanje. Ustaljeno se stanje uspostavi vrlo brzo (ms < t < 1s), a kratki period koji mu prethodi
nazivamo predustaljeno stanje.
U ustaljenom stanju produkt (P) nastaje stalnom brzinom, koju nazivamo početnom
brzinom, a označava se vo. Michaelis-Menteničina kinetika odnosi se na brzine
enzimskih reakcija u ustaljenom stanju.
Kad se potrošio osjetni dio supstrata, prestaje ustaljeno stanje i započinje
postustaljeno stanje, tijekom kojeg dolazi do postupnog smanjenja koncentracije ES,
intenziviranja povratne reakcije, stoga i do postupnog smanjenja brzine nastanka
produkta. Koncentracija produkta P raste sve do uspostavljanja ravnoteže, u kojoj su
brzina nastajanja produkta i brzina njegove razgradnje izjednačene.
31
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
vo= k2 [ES]
gdje je k2 prava katalitička konstanta (I reda, kcat), pa je brzina nastajanja produkta iz
kompleksa ES izravno proporcionalna koncentraciji kompleksa ES
k1 [E][S] = (k-1 + k2) [ES]
Budući da se početna (ukupna) koncentracija enzima ET raspodjeljuje na slobodni enzim
E i kompleks ES
[E ]= [ET] - [ES]
Na osnovi gornjih jednadžbi možemo izraziti koncentraciju ES kao
[ET] [S]
[ES] = gdje je Km = (k-1 + k2)/k1.
Km + [S]
Konstantu Km nazivamo Michaelisovom konstantom.
Slijedi da je početna brzina enzimske reakcije određena izrazom
k2[ET] [S]
v o=
Km + [S]
Mjerimo li početne brzine enzimske reakcije uz različite početne koncentracije supstrata,
opazit ćemo da početna brzina raste s porastom supstrata sve dok ne dosegne neku
maksimalnu brzinu, Vm. Maksimalna brzina se postigne kad je sav enzim zasićen
supstratom, tako da je koncentracija kompleksa ES jednaka početnoj koncentraciji
enzima.
vo = Vm = k2 [ET]
Prema tome početnu brzinu možemo izraziti kao
Vm [S]]
vo =
Km + [S]]
Kad je [S] << Km (< 0,01 Km) početna brzina linearno ovisi o početnoj koncentraciji
supstrata.
Vm [S] Vm
vo = gdje je =k
Km Km
32
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
d[S]
v= = k[S]
dt
gdje je k konstanta brzine I reda.
Znajući konstantu brzine možemo izračunati količinu nastalog produkta u određenom
vremenu iz integriranog oblika v.
Kad je [S] >> Km (> 100 Km) reakcija je 0-tog reda. Količina nastalog produkta ne ovisi o S,
pa je količina produkta jednaka
[P] = Vm × t
Enzimska kinetika u dijagnostičke svrhe mjeri se upravo u takvim uvjetima.
Znamo da je Vm = k2 [ET] pa količina nastalog produkta izravno ovisi o koncentraciji
aktivnog enzima.
[P] = k2 [ET] t
[S]=Km
33
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
1 / vo
1 / V max
-1/K m 1/[S]
34
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
E+S ES E+P
E+I EI
VmI = Vm
Primjer je kompetitivne inhibicije djelovanje benzojeve kiseline (homologa pravog
supstrata - katekola) na katekolazu.
Do nekompetitivne inhibicije dolazi kad reverzibilna inhibicija ovisi isključivo o
koncentraciji inhibitora, a ne možemo na nju utjecati promjenom koncentracije
supstrata. Nekompetitivni inhibitor ne veže se u samom aktivnom središtu, već
njegovo vezanje na enzim izaziva konformacijsku promjenu koja enzim učini
neaktivnim, što smanjuje ukupnu koncentraciju aktivnog enzima. Smanjuje se
maksimalna brzina, jer je time jedan dio enzima uklonjen iz katalitičkog tijeka, a aktivni
udio enzima zadržava početni afinitet za supstrat, tj. Km se u nekompetitivnoj inhibiciji
ne mijenja.
Akompetitivna inhibicija nastaje kad se inhibitor ne veže na slobodni enzim nego na
neki enzimski oblik koji sam više ne može vezati supstrat, na primjer na kompleks ES.
E+S ES E+P
ES + I ESI
35
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Vm
vi =
[I]
1+
Ki
Km
K mi =
[I]
1+
Ki
1 / Vo B
D
C
1 / Vmax
1/[S]
-1/Km
36
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
60°C
apsorbancija produkta
100 –
40°C
70°C
50 –
80°C
20 40 60 80
t (°C) vrijeme (minute)
37
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
V. Literatura
1. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
2. Price, N. C., Dwek, R. A., Ratcliffe, R. G., Wormald, M. R. (2001) Principles and
Problems in Physical Chemistry for Biochemists. Oxford: Oxford University
Press
38
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Vježba 5.
Ugljikohidrati
(sekvenciranje
5.1 Ugljikohidrati
Jedna od četiri osnovne skupine bioloških makromolekula su ugljikohidrati -
polihidroksialdehidi ili polihidroksiketoni opće formule (CnH2n0n)x, pri čemu je n≥3 (te
ovisno o tome razlikujemo trioze, tetroze, pentoze, heksoze itd.) dočim x može biti 1
(kod monosaharida), 2 (kod disaharida), 3-10 (kod oligosaharida) te >10 (kod
polisaharida). Monosaharidi mogu biti različiti metabolički intermedijari, a gradivne su
jedinice već spomenutih di-, oligo- i polisaharida kao i nukleinskih kiselina i
glikokonjugata. Reakcijom karbonilne skupine monosaharida i jedne od njegovih
hidroksilnih skupina nastaju poluacetali ili poluketali, pri čemu se rastvoreni oblik
ugljikohidrata (koji nacrtan u linearnom obliku nazivamo Fischerovim prikazom)
zatvara u ciklički oblik (koji prikazujemo Haworthovom projekcijom). Na taj se način
stvaraju peteročlani prsteni (furanoze) ili šesteročlani prsteni (piranoze) koji osim
ugljika sadrže i jedan atom kisika. Pri tome karbonilni C-atom postaje asimetričan
(anomeran), a ovisno o položaju novonastale hidroksilne skupine na anomernom C-
atomu razlikujemo α i β anomere. Aldoheksoze većinom stvaraju piranoze (reakcijom
aldehidne skupine i hidroksilne skupine na petom C-atomu), a aldotetroze, aldopentoze
i ketoheksoze stvaraju furanoze. Na slici 5.1 prikazana je aldoheksoza glukoza, koja se
još naziva i grožđani šećer, jedini monosaharid koji se u stanicama nalazi samostalno, a
nalazimo je i u krvi i ostalim tjelesnim tekućinama, dok je na slici 5.2 prikazana
ketoheksoza fruktoza, koja se naziva i voćni šećer.
otvoreni
A) B) oblik (<1%)
stvaranje poluacetala
Slika 5.1 D-glukoza. A) Linearan oblik – Fischerov prikaz B) Ciklički oblik – Haworthov prikaz.
39
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
D-fruktoza D-fruktofuranoza
(linearni oblik) (Haworthov prikaz)
Slika 5.2 D-fruktoza. Linearan oblik – Fischerov prikaz i ciklički oblik – Haworthov prikaz.
saharoza laktoza
40
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Slika 5.4 Benedictova reakcija. Benedictov reagens sadrži bakrov (II) sulfat u alkalnoj vodenoj
otopini natrijevog citrata i natrijevog karbonata. U prisutnosti reduktivnog šećera taloži se svijetlo crveni
bakrov (I) oksid i nastaje aldonska kiselina.
41
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
A)
5-hidroksimetil-furfural
B)
obojani furfuril-difenilmetan
5.2 Zadaća
Razgradite laktozu u mlijeku djelovanjem enzima laktaze te odredite prisutnost i
koncentraciju na taj način nastale glukoze u mlijeku. U različitim uzorcima provjerite
prisutnost: škroba (Lugolovom reakcijom), proteina (Bradfordovom reakcijom),
ugljikohidrata (Molischovom reakcijom) i reduktivnih ugljikohidrata (Benedictovom
reakcijom).
5.3 Reagencije
• laktaza (β-galaktozidaza, 0,1 U/μL) u fiziološkoj otopini
• kravlje mlijeko (koje sadrži laktozu) nerazrijeđeno i razrijeđeno 1:10 destiliranom
vodom
• 1% otopina škroba u dest. vodi
• zasićena otopina saharoze u dest. vodi
• zasićena otopina glukoze u dest. vodi
• zasićena otopina fruktoze u dest. vodi
• otopina goveđeg serumskog albumina (BSA, 1 mg/mL) u dest. vodi
• humani serum
• 10% ekstrakt krumpira u 40 mM fosfatnom puferu pH 7,0
42
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
• otopina DNA iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 (15 mM NaCl, 1,5 mM natrijev
citrat, pH 7,0 - 7,1) približne koncentracije 15 μg/mL
• suncokretovo ulje
• Lugolova otopina (2% I2/ 10% KI u dest. vodi)
• Bradfordov reagens (0,05 g/L Coomassie Blue G250 u 5% metanol/8,5% H3PO4 u
dest. vodi)
• Benedictov reagens (0,95 M natrijev karbonat, 0,67 M natrijev citrat i 70 mM
bakrov (II) sulfat pentahidrat u dest. vodi)
• 5% α-naftol u 96% etanolu
• koncentrirana H2SO4
5.4 Pribor
• plastične epruvete od 1,5 mL
• stalak za epruvete od 1,5 mL
• automatske pipete
• nastavci za automatske pipete
• testne trake za semikvantitativno određivanje glukoze (primjerice Keto-Diastix,
Bayer)
• staničevina
• staklene epruvete
• stalak za staklene epruvete
• kapaljke
• vodena kupelj ili čaša i grijač
• staklene boce
• drvene hvataljke za epruvete
43
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
5.6 Postupak
5.6.1 Priprema uzorka mlijeka koje ne sadrži laktozu
• Po 1 mL nerazrijeđenog kravljeg mlijeka otpipetirajte u 2 plastične obilježene
epruvete od 1,5 mL.
• U jednu epruvetu dodajte 50 μL otopine laktaze.
• Obje epruvete inkubirajte 15 minuta pri sobnoj temperaturi.
• U pojedinu epruvetu uronite po jednu testnu traku za određivanje razine
glukoze, odmah je izvadite van i s trake uklonite višak mlijeka pomoću
staničevine.
• Nakon 30 sekundi usporedite testno polje za glukozu sa skalom boja na
pakiranju testnih traka te zaključite kolika je koncentracija glukoze u uzorcima.
44
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
5.7 Zadaci
1. Koji će od navedenih uzoraka pokazivati pozitivnu reakciju s I) Lugolovom
otopinom, II) Bradfordovim reagensom, III) Molischovim reagensom i IV)
Benedictovim reagensom i zašto:
a. D-glukozamin
b. D-glukarna kiselina
c. N-acetil-D-galaktozamin
d. albumin
e. imunoglobulin G
f. maltoza
2. Pretpostavite i objasnite rezultate pokusa u kojem a) škrob, b) celulozu i c)
glikogen izlažete djelovanju α-amilaze iz sline uz prisutnost Lugolove otopine.
3. Je li u reakcijama na reduktivne ugljikohidrate moguće razlikovati D-
gliceraldehid od dihidroksiacetona? Obrazložite!
5.8 Literatura
1. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
2. Koolman, J. and Roehm, K.H. (2005) Color Atlas of Biochemistry. Stuttgart:
Thieme Verlag.
3. http://www.biochemweb.org/carbohydrates.shtml
45
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
Vježba 6.
Lipidi
6.1 Lipidi
Lipidi su biološke makromolekule raznolikih struktura koje, za razliku od proteina,
nukleinskih kiselina i polisaharida nisu polimeri. Jedna od njihovih najvažnijih osobina
je netopljivost ili vrlo slaba topljivost u vodi. Velika većina lipida su esteri u kojima je
kiselinska komponenta dugolančana masna kiselina (jedna ili više), a alkoholni dio
može biti trovalentni alkohol glicerol (masti i ulja), dvovalentni dugolančani
aminoalkohol sfingozin (sfingolipidi), jednovalentni dugolančani alkohol (voskovi) ili
jednovalentni sterolni alkohol (esteri kolesterola). Neki su lipidi izoprenoidnog
porijekla: alkani karakterizirani dugim lancima s višestruko konjugiranim dvostrukim
vezama (β-karoten) ili izoprenoidi višestruko ciklizirani u steroidne strukture
(kolesterol i steroidni hormoni). Neki lipidi sadrže fosfatnu kiselinu (fosfolipidi) ili
šećerne strukture (glikolipidi).
Masne su kiseline nerazgranate karboksilne kiseline koje sadrže 4-24 (najčešće 16 do
18) ugljikova atoma. One koje ne sadrže dvostruke veze među ugljikovim atomima
nazivaju se zasićenim masnim kiselinama, dočim se one kod kojih postoje takve veze
nazivaju nezasićenima (Slika 6.1.). U organizmima se rijetko nalaze u slobodnom
obliku; većinom su esterificirane te su kao takve sastavnica membrana stanica i
organela, a u velikim se količinama nalaze u tkivima koja služe za pohranu energije.
Slika 6.1 α-linolenska kiselina. Nezasićena masna kiselina koju nalazimo u lanenim sjemenkama.
Naziva se još i ω-3 masnom kiselinom jer se prva dvostruka veza nalazi na trećem ugljikovom atomu od
kraja (hidrofobni rep). Slika preuzeta s (2).
46
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
6.2 Saponifikacija
Sapuni i detergenti su amfifilne molekule koje u vodenom okružju stvaraju micele –
hidrofilni dijelovi molekula okreću se prema vodi, a hidrofobni jedan prema drugome
stvarajući unutrašnjost micele. Smanjujući površinsku napetost vode i emulgirajući
lipide omogućavaju njihovo otapanje u vodi. Hidrofilni dio detergenta čine anionske,
kationske ili neionske polarne skupine, a hidrofilni dio sapuna karboksilna skupina.
Hidrofobni dio detergenta može biti raznolike strukture (primjerice linearan ili
razgranati ugljikovodični lanac ili sterolni prsten deoksikolata), a kod sapuna je
hidrofobni dio zapravo lanac masne kiseline (Slika 6.2).
A) C)
B)
Slika 6.2 Sapuni i detergenti stvaraju micele. A) sapun (natrijev stearat) i B) detergent (natrijev-p-
dodecilbenzensulfonat). Na slici A) i B) sivo su osjenčani hidrofobni dijelovi, a plavo zaokruženi i
osjenčani hidrofilni dijelovi molekula. C) micela – hidrofobni dijelovi čine unutrašnjost, a hidrofilni
vanjsku stranu micele koja je okrenuta prema vodi.
Sapuni su, dakle, soli (većinom natrijeve i kalijeve) masnih kiselina. Nastaju reakcijom
saponifikacije koja uključuje hidrolizu triacilglicerola i neutralizaciju masnih kiselina
jakom lužinom (Slika 6.3). U pripremi sapuna najčešće se koriste trigliceridi
životinjskog porijekla, iako se mogu koristiti i biljne masti, kao što su kokosovo,
palmino ili drugo biljno ulje.
A)
lužina sapun lužina sapun lužina sapun
triacilglicerol + + +
diacilglicerol monoacilglicerol glicerol
B) O
CH2O C C17H33 CH2OH
O
CHO C C15H31 + 3 NaOH CHOH + 2 C17H33COO-Na+ + C15H31COO-Na+
O
CH2O C C17H33 CH2OH
Slika 6.3 Saponifikacija. A) Slijed reakcija kojima iz triacilglicerola (estera glicerola i tri masne
kiseline) uz dodatak lužine nastaje sapun (sol masnih kiselina) i u konačnici alkohol (glicerol). B)
Kemijski prikaz ukupne reakcije saponifikacije kojom iz 1,3-distearil-2-palmitil-glicerata nastaju glicerol,
natrijev palmitat i dvije molekule natrijevog stearata, odnosno tri molekule sapuna.
47
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
6.3 Zadaća
Ekstrahirajte lipide iz uzorka čokolade i lanenih sjemenki acetonom te odredite
stupanj nezasićenosti ekstrahiranih lipida oksidacijom pomoću KMnO4.
Napravite sapun miješanjem jake lužine i jestivog ulja te ispitajte učinkovitost
otapanja ulja tako priređenog sapuna i komercijalno pribavljenog detergenta.
6.4 Reagencije
• 20% otopina NaOH u dest. vodi
• biljno ulje
• 5 M NaCl u dest. vodi
• dest. voda ohlađena na 4°C
• detergent
• aceton
• 2% otopina KMnO4 u dest. vodi
• mliječna čokolada
• lanene sjemenke
6.5 Pribor
• staklene čaše (10 mL i 400 mL)
• magnetska miješalica s grijačem
• magnet za miješanje
• stakleni štapić
• stakleni lijevak
• filter papir
• Erlenmayerova tikvica
• staklene epruvete
• vaga
• kapaljka
6.7 Postupak
6.7.2 Saponifikacija
• Pomiješajte 15 mL 20% otopine NaOH i 10 mL suncokretovog ulja u staklenoj
čaši od 400 mL.
• Dodajte magnet za miješanje i zagrijavajte na magnetskoj miješalici uz
konstantno miješanje. Poželjno je da smjesa lagano kipi, a u slučaju prejakog
kipljenja, smanjite zagrijavanje. Zagrijavajte dok ne nastane gusta smjesa
(približno 30 minuta).
• Smjesu maknite s grijača i u nju odmah ulijte 150 mL 5 M otopine NaCl.
• Miješajte staklenim štapićem nekoliko minuta dok se sapun ne odvoji od stijenki
čaše.
• Filtrirajte kroz obični filter papir u Erlenmayerovu tikvicu uz dva dodatna
ispiranja s po 100 mL vode koju ste prethodno ohladili u frižideru.
6.8 Zadaci
1. Usporedite temperaturu taljenja zasićenih i nezasićenih masnih kiselina.
2. Usporedite maslinovo ulje i maslac obzirom na udio zasićenih i nezasićenih
masnih kiselina.
3. U mrkvi se, između ostalog, nalazi i β-karoten, za koji je karakteristična
izoprenska struktura. Ukoliko naribanu mrkvu stavite u navedena otapala, u
kojima će β-karoten biti topljiv i po čemu to možete zaključiti:
a. destilirana voda
b. fiziološka otopina
c. 50% etanol u destiliranoj vodi
d. 96% etanol
e. petroleter
49
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
f. suncokretovo ulje
4. Podrobno objasnite mehanizam djelovanja sapuna i detergenta, odnosno princip
na kojem se temelji primjena sapuna i detergenata kao sredstava za čišćenje.
6.9 Literatura
1. Voet, D. and Voet J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
2. http://biology.nicerweb.com/med/Alpha-linolenic_acid.gif
3. http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/lipids.htm
4. http://chemistry.about.com/od/cleanerchemistry/a/how-soap-cleans.htm
50
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
Vježba 7.
51
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
A) B)
Hiperkromni pomak se pri određenoj valnoj duljini (najčešće 260 nm) odvija unutar
uskog temperaturnog područja. To znači da je denaturacija DNA kooperativni proces
pri čemu razaranje dijela strukture destabilizira ostatak i potiče daljnju denaturaciju.
Krivulja mekšanja je prikaz ovisnosti apsorbancije otopine DNA o temperaturi (Slika 7.2
B). Iz nje se može očitati temperatura pri kojoj je postignuto 50% denaturacije i koju
nazivamo temperaturom mekšanja, Tm.
Stabilnost dvostruke uzvojnice DNA, a time i njezin Tm, ovisi o nekoliko čimbenika
kao što su sastav baza DNA, ionska jakost i pH otopine te prisutnost drugih molekula
koje se vežu na DNA. Veličina Tm linearno je razmjerna molarnom udjelu baznih parova
GC. Tri vodikove veze koje povezuju gvanin i citozin stabilnije su od dviju vodikovih
veza između adenina i timina. Tm se povećava za oko 0,4°C ako se udio GC baznih
parova poveća 1%. Kada se DNA nalazi u otopini pri približno fiziološkim uvjetima,
52
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
vrijednost Tm je obično unutar područja 85-95°C (DNA koja sadrži 40% GC parova, što
je vrijednost svojstvena genomu sisavaca, pri fiziološkim uvjetima ima Tm oko 87°C,
dok DNA koja sadrži 60% GC parova, pod istim uvjetima ima Tm oko 95°C.) Stoga je
bez intervencije staničnog sustava dvolančana DNA stabilna unutar stanice.
Homogene DNA (primjerice virusne ili plazmidne) koje se sastoje od identičnih
kratkih dijelova, denaturiraju se u uskom rasponu promjene temperature. Za razliku od
homogenih, heterogene DNA sadrže mnoštvo različitih fragmenata nastalih
nasumičnim kidanjem kromosoma. Kako se Tm tih fragmenata razlikuju, temperaturni
raspon pri kojem se takva DNA denaturira je širi.
Na temperaturu mekšanja utječu i ionska jakost i vrijednost pH. Međusobno
odbijanje negativnih naboja, koje pri fiziološkim uvjetima imaju fosfatne skupine,
destabilizira uzvojnicu DNA. Kako je elektrostatsko odbijanje istoimenih naboja ovisno
o dielektričnoj konstanti otopine, povećanjem ionske jakosti povećava se dielektrična
konstanta te se smanjuje međusobno odbijanje fosfatnih skupina. Uzvojnica DNA se
stabilizira, krivulja denaturacije se sužava i Tm raste. Promjena pH koja uzrokuje
protoniranje ili deprotoniranje baza narušava vodikove veze među njima te dovodi do
denaturacije DNA. Zapravo, bilo koja molekula koja može stvoriti vodikove veze s
funkcionalnim skupinama baza u DNA ili omesti slaganje baza jedne iznad druge može
pridonijeti denaturaciji uzvojnice. Takve su molekule, primjerice, urea i formamid, ali i
proteini koji se vežu na jednolančanu DNA.
Denaturacija DNA je reverzibilan proces. Ukoliko se promijenjeni parametri sustava
koji su uzrokovali denaturaciju DNA (primjerice temperatura) vrate na početne
vrijednosti, DNA se renaturira. Ako se otopina denaturirane DNA naglo ohladi na
temperaturu znatno nižu od Tm, nastala DNA bit će samo djelomično dvolančana
poradi toga što komplementarni lanci neće imati dovoljno vremena da se u u otopini
susretnu i pravilno spare prije nego što se tako djelomično dvolančana struktura
"smrzne" u otopini. Ako se, pak, otopina denaturirane DNA polagano hladi do
temperature 20-25°C manje od Tm, bit će dovoljno toplinske energije da se kratkim,
pogrešno sparenim dijelovima DNA omogući razdvajanje i ispravno sparivanje te na taj
način stvaranje duljih komplementarnih sljedova. Oni se na toj temperaturi više ne
mogu razdvojiti te se DNA postupno u cijelosti renaturira, odnosno zauzima nativnu
konformaciju. Slično tome, komplementarni lanci RNA i DNA u procesu hibridizacije
tvore dvolančane RNA-DNA hibride. Dvostruka uzvojnica odgovarajuće DNA samo je
neznatno stabilnija od tako nastalih hibrida.
Denaturacija i renaturacija DNA bitne su za biološku ulogu ove molekule pri
procesima replikacije i transkripcije. Tm kao mjera denaturacije DNA važan je čimbenik
za mnoge eksperimentalne metode koje uključuju hibridizacije nukleinskih kiselina
(primjerice, lančana reakcija polimeraze, eng. polymerase chain reaction - PCR).
7.3 Zadaća
Postupno zagrijavajte uzorak DNA do temperature 92°C i pratite denaturaciju
mjerenjem apsorbancije pri valnoj duljini 260 nm. Odredite Tm iz krivulje mekšanja.
53
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM ___
7.4 Reagencije
• pufer SSC/10 (15 mM natrijev klorid, 1,5 mM natrijev citrat, u dest. vodi , pH 7,0 -
7,1) – standardni pufer za eksperimente denaturacije
• otopina DNA izolirana iz kravljeg timusa u puferu SSC/10 – uzorak
7.5 Pribor
• plastične epruvetice od 1,5 mL
• stalak za epruvete
• automatske pipete
• nastavci za automatske pipete
• vodena kupelj
• posuda sa smjesom leda i vode
• UV spektrofotometar
• kvarcna kiveta
7.7 Postupak
• Po 1 mL otopine DNA otpipetirajte u 10 plastičnih obilježenih epruveta.
• Epruvete stavite u stalak i uronite u vodenu kupelj.
• Kupelj postupno zagrijavajte do 92°C. Kada se dostigne željena temperatura, po
jednu epruvetu izvadite i odmah ohladite u smjesi leda i vode. Predlažu se
sljedeće temperature (°C):
25 40 55 65 70 75 80 84 88 92
• U prikladnu tablicu upisujte stvarnu temperaturu pri kojoj je uzorak izvađen.
• Nakon što je prikupljen i dobro ohlađen i posljednji uzorak, uzorcima redom
izmjerite A260, na milimetarskom papiru nacrtajte graf ovisnosti apsorbancije o
temperaturi te odredite temperaturu mekšanja (budući da se ona razlikuje od
vrijednosti koju biste dobili mjerenjem kod stvarnih temperatura, označite je kao
Tm0).
54
BIOLOŠKA KEMIJA — PRAKTIKUM
7.8 Zadaci
1. Koje sile združuju dva lanca molekule DNA?
2. U 0,2 M otopini natrijevog klorida Tm DNA je 75°C. U drugoj otopini ista DNA
ima Tm od 100°C. Kakva svojstva ima nepoznata otopina u odnosu na 0,2 M
otopinu natrijevog klorida?
7.9 Literatura
1. Voet, D. and Voet, J. (1995) Biochemistry. New York: John Wiley & Sons Inc.
55