Manual de Practicas Instrument Ales y As

Manual de prácticas
de química analítica II
José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes • Frida Malpica Sánchez
Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Ramón Verde Calvo es egresado

de la Facultad de Química de la
UNAM, en donde obtuvo su título
de químico farmacéutico biólogo,
tecnólogo en alimentos. Poste-
riormente realizó sus estudios de
maestría en la Facultad de Ciencias
de la UNAM. Actualmente trabaja
en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Ali-
mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga-
ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du-
rante el añejamiento.
María de Lourdes Escamilla Hur-

tado realizó sus estudios de licen-
ciatura en la Facultad de Química
de la UNAM, obteniendo el título
de química farmacéutica bióloga,
orientación en Tecnología de Ali-
mentos. Posteriormente obtuvo su
grado de maestría en la Universi-
dad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología de
Fermentaciones. Posteriormente se ha desarrollado
profesionalmente como profesora-investigadora en la
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapa-
lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen-
taciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales,
producción de aromas por fermentación y enología, de
los cuales surgieron diversas publicaciones nacionales
e internacionales. También ha ejercido la docencia, tanto
en la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Química
de la UNAM, formando recursos humanos en los cam-
pos de microbiología y biotecnología alimentaria.
Manual de prácticas de
química analítica II
Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
Dr. José Luis Gázquez Mateos

Rector General
Lic. Edmundo Jacobo Molina

Secretario General
UNIDAD IZTAPALAPA
Dr. Luis Mier y Terán Casanueva
Rector
Dr. Eduardo Carrillo Hoyo

Secretario
Dr. José Luis Arredondo Figueroa

Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Dr. Gerardo Saucedo

Jefe del Departamento de Biotecnología
Ma. del Rosario Hoyos Alea

Jefa de la Sección de Producción Editorial
Manual de prácticas de
química analítica II
José Ramón Verde Calvo
Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes
Frida Malpica Sánchez
guc i
Cuidado de la edición y corrección de estilo:

Ma. Guadalupe Olvera Arellano
Primera impresión: 1999
© UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA
Av. Michoacán y La Purísima
Iztapalapa, 09340, México, D.F.
ISBN: 970-654-363-5
Impreso y hecho en México / Printed in México
índice
Presentación 9
Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11
Práctica 1. Análisis cualitativo de cromatografía
de gases (dos columnas) 33
Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37
Bibliografía 40
Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

ALTA RESOLUCIÓN 43
Práctica 3. Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
(método del patrón interno) 63
Práctica 4. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas

(método del patrón externo) 69
Bibliografía 74
Capítulo 3. ESPECTROFOTOMETRÍ A 75
I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77
Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85
Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la

concentración de cobalto y níquel en una mezcla 91
II. TURBIDIMETRÍA 95
Práctica 7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97
Bibliografía 101
Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103
Práctica 8. Determinación potenciométnca de constantes
de ionización 113
Práctica 9, Titulación potenciométnca del ferrocianuro con ceno 117
Bibliografía 125
Presentación
El presente manual tiene como meta apoyar de la manera más amplia el curso
teórico-práctico de Química Analítica II, materia que se imparte en el sexto
trimestre de las carreras de ingeniería en alimentos e ingeniería bioquímica in-
dustrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de la
Universidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cual-
quier curso de química analítica impartido en otra escuela pueda utilizar este
material.
En el manual se abordan temas como: cromatografía de gases y de líquidos
de alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo está
estructurado con una introducción (los fundamentos teóricos necesarios para
comprender los temas incluidos en la parte práctica), y presenta la descripción
de los aparatos a utilizar, así como la forma correcta de operarlos.
El texto se compone de nueve prácticas, estructuradas con objetivos, intro-
ducción, material y reactivos, normas y reglas de seguridad, técnicas, tratamiento
de datos experimentales, cuestionario y bibliografía. Esta última se presenta al
final de cada capítulo e incluye textos de autores reconocidos, así como revistas
con artículos actualizados de apoyo a los experimentos.
Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar am-
pliamente los conceptos teóricos con las actividades experimentales.
Los autores
Capítulo 1
CROMATOGRAFÍA DE GASES
Introducción
Este capítulo tiene como objetivo mostrar al alumno los fundamentos prácticos
de la cromatografía de gases: cómo funciona un cromatógrafo con detector de
conductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, in-
cluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras a partir
de compuestos puros.
La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodos
instrumentales de separación, ya que identifica de manera sencilla y rápida el
número de componentes de una mezcla. El único requisito para su imple-
mentación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ne-
cesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979).
Clasificación de la cromatografía
Por sus características analíticas la cromatografía puede ser:
a) Cromatografía cualitativa, que consiste solamente en la separación

de los componentes de una mezcla.
b) Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar y
cuantificar cada uno de los componentes de la mezcla.
De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de

gases se divide en dos:
a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma-

tografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con un
material sólido como el sílice granular, la alúmina o el carbón. El soluto
se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas. Las separaciones se
llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrio
entre el adsorbente y las moléculas de la fase móvil. Si las moléculas de
un componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia
Manual de prácticas de química analítica II
no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las

moléculas tienen una baja atracción por el adsorbente, tenderán a moverse
con rapidez junto con la fase móvil (figura 1.1).
Soluto absorbido en la
superficie de la fase
estacionaria
Figura 1.1 Cromatografía de adsorción.
La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comer-

ciales, utilizadas en cromatografía gas sólido, mencionando su aplicación
y la temperatura máxima de trabajo.
Tabla 1.1 Columnas capilares comerciales.
Temperatura
Columna Aplicación
Máxima
HPSoM 200 °C Hidrocarburos, gas natural
Poraplot Q 250 °C Alcoholes volátiles en

agua,gases
Poraplot U 190°C Compuestos volátiles polares,

aldehidos
HP Hewlett Packard
Columnas capilares, soporte; A12O3
14
Cromatografía de gases
b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en

donde la fase estacionaria es una capa delgada de un líquido no volátil,
colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2).
La fase estacionaria forma una película delgada en la superficie de un
soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y
una fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de partición
presenta grandes ventajas, comparada con la cromatografía de adsorción:
es mucho más reproducible y, gracias a que el coeficiente de partición
se hace constante en un margen más amplio de concentraciones, permite
que las bandas sean más definidas y mucho más simétricas.
Soluto disuelto en la fase

líquida que recubre la
superficie del soporte
sólido
Figura 1.2 Cromatografía de reparto.
El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso

cromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la fase
líquida. El soporte más común es la tierra de diatomeas, también conocida
como kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupos
oxidrilo libres en su superficie.
15
Componentes importantes de un cromatógrafo de gases
Uno de los puntos más importantes a considerar en la cromatografía de gases,

es el grado de separación que puede lograrse entre diferentes componentes en
una columna dada. Son varios los factores que pueden influir en la separación
deseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad de flujo del gas
acarreador, volumen de la muestra y caída de presión en la columna.
Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares.
En las primeras el soporte se encuentra empacado en tubos de acero inoxidable
o vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6 mm y de uno a cinco
metros de longitud. Las columnas con mayor diámetro son utilizadas en trabajos
de preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados.
En las columnas capilares la longitud es mucho mayor, pudiendo llegar hasta
100 metros con un diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estas últimas se caracterizan por
tener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución,
menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad de
muestra por correr debe ser menor (Harris, 1992).
Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas esta-
cionarias. La elección depende básicamente de la naturaleza de los compuestos
que se desean separar (tabla 1.2). La literatura informa acerca de gran cantidad
de soportes sólidos que han resultado satisfactorios, y de un número aun mayor
de líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debe producir un
reparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo, y
poseer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor.
Por supuesto, el líquido estacionario no ha de ser volátil a las temperaturas de
trabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si se
tiene interés por profundizar en este tema, se pueden consultar los trabajos de
Bens (1961), donde describe algunas propiedades y características de los
soportes ordinarios. Rohrschneider (1971) reportó una clasificación de las fases
líquidas en función de su polaridad, y propuso una escala de 0 a 100 en la que
el escualeno es tomado como cero y el oxidipropionitrilo como cien.
La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla está
determinada por dos factores: el grado de separación que se considere suficiente
y el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es la tem-
peratura mayor es la separación de los componentes, y mayor también el tiempo
16
de retención de estos últimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Desty

(1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de la
temperatura en la cromatografía de gases.
La velocidad de flujo del gas portador varía con cada análisis y puede cambiar
para diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en la
cuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para las
columnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a
100 ml/min, que deberán regularse con una precisión mayor de 1 ml/min.
Los gases portadores que se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno,
helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos en parte, en
el factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detector
empleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuados
son: nitrógeno, hidrógeno, argón y helio. El hidrógeno presenta altos valores de
conductividad térmica, factor muy importante en la detección de compuestos,
pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El helio
también tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso no
renovable y de costo elevado. En cambio, el nitrógeno se utiliza ampliamente
por ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividad
térmica.
17
Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en

cromatografía de gases.
Nombre Temperatura
Descripción Polaridad*
Comercial Iíquido/°C
Escualeno Escualeno I 20/100
Apienzon L Apienzon L I 50/300
SE-30 100% goma de silicona I 50/300
OV-1 100% goma de silicona I 50/300
UCW-982 goma del 99% metil, 1% vinil II 0/300
DC-200 100% de metil silicona líquida II 0/250
OV-101 100% de metil silicona líquida II 0/350
SP-2100 100% de metil silicona líquida II 0/350
SE-52 0 SE-54 fenilo al 5% II 50/300
Dexsii 300 Metil carbonato de silicona II 50/450
OV-17 Metil fenil silicona al 50% II 0/375
OV-25 Metil fenil silicona al 75% III 0/350
OV-210 3,3,3-trifluoropropilo al 50% III 0/275
Carbowax20M polietilen glicol IV 60/225
Carbowax20M polietilen glicol modificado

TPA con ácido tereftálico IV 60/250
Carbowax1500 polietilen glicol IV 40/200
SilariOC Cianopropil silicona al 100% IV 0/250
* I a IV de menor a mayor polaridad.
18
La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con una

jeringa a través de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra y el
gas acarreador lo lleva a lo largo de la columna. Las columnas analíticas requieren
de 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajo
preparativo llegan a utilizar de 20 a 1000 jil. Las muestras gaseosas requieren
de jeringas con cierre hermético o válvulas de muestreo de gases. Para el trabajo
analítico se utilizan volúmenes de 0.5 a 10 mi de gas, y para el análisis preparativo
los volúmenes pueden aumentar hasta un litro (Harris, 1992).
Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de un

gas está basada en la facilidad que tiene para transferir el calor que absorbe,
cualidad representada por su valor de conductividad térmica. Entre más grande
sea el valor, la capacidad para transmitir el calor será mejor. Por lo tanto, si se
suministra una cantidad constante de energía eléctrica al filamento del detector,
su temperatura estará en función de la conductividad térmica del gas acarreador.
Con un gas puro, la temperatura del filamento es constante, pero al presentarse
cambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica la
resistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a los
cambios de temperatura y a la corrosión química. Para su fabricación se emplea
generalmente platino, tungsteno y níquel.
Los factores que afectan la sensibilidad de los filamentos son: su geometría,

la corriente que pasa a través de los mismos, su resistencia y el valor de la con-
ductividad térmica del gas. La tabla 1.3 muestra la conductividad térmica de
los gases y de algunos compuestos utilizados en cromatografía.
19
Tabla 1.3 Conductividad térmica.
sustancia ct*
Nitrógeno 5.81
Helio 34.80
Argón 3.98
co2 13.52
Hidrógeno 41.60
Oxígeno 5.89
CO 5.63
Metano 7.21
Propano 3.58
n-Butano 3.22
Étanol 3.50
Acetona 2.37
Cloroformo 1.58
* unidades de la conductividad térmica cal cnrr2 seg^2/°C crrr1
Cálculos en cromatografía
Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculos

sencillos para conocer parámetros como la eficiencia de la columna, además,
si aplicamos técnicas de estándares se puede conocer también la concentración
de muestras problema. A continuación se desarrollan los cálculos más comunes
y útiles en cromatografía.
20
Número de platos teóricos en una columna (n)
Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribución

de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número de
platos teóricos, la separación en la columna es mejor.
w= 16
n - número de platos teóricos

t^ = tiempo que transcurre desde la inyección hasta el centro del pico del
componente
Aw=ancho del pico del componente
tj^ y Aw se expresan en las mismas unidades (tiempo, volumen, distancia, etc.)
Altura equivalente de un plato teórico (AEPT)
Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria para

establecer un equilibrio de distribución entre la fase estacionaria del soluto y la
fase móvil.
AEPT = ^
AEPT = altura equivalente de un plato teórico

L = longitud de la columna
n = número de platos teóricos
21
Cálculo del área de un pico con forma de triángulo
Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una forma

gaussiana. Un método sencillo para calcular el área bajo la curva es transformarla
en un triángulo, extrapolando la tangente en los puntos de inflexión hacia la
línea de referencia, como lo indica la figura 1.3.
tr o vr
Respuesta
del. Punto de inflexión
detector (parte más j
inclinada de la /
curva) /
t =0 tiempo o volumen
inyección
Figura 1.3 Cromatograma ideal
Fórmula para calcular el área de un triángulo:
A b*h
A
A = área
h = altura
b = longitud de la base
22
Cálculo de la resolución
Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica la manera de medir

los parámetros:
ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN
Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos.
V
V
-V
V
2 \
R
1/2 (Wx + W2)
Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1

V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2
FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2
23
Análisis cuantitativo
Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones en un sistema

cromatográfico. Los hay sencillos, pero poco confiables, pues no utilizan ninguna
sustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado de
confiabilidad. Estos métodos son:
1. Normalización
2. Calibración absoluta
3. Estándar interno
4. Estándar externo
Normalización o porcentaje por áreas
Con base en el cromatograma de una mezcla separada, es posible determinar

la concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva.
Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, con
base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje es
proporcional a la concentración del componente en la mezcla, siempre y cuando
la conductividad térmica de los componentes sea la misma, o muy parecida, y
que la respuesta del detector de conductividad térmica también sea igual para
todos los componentes. Como esto no es posible en la mayoría de los casos,
se requiere utilizar otros métodos más exactos.
Calibración absoluta
Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia pura

para medir el área del pico resultante. Enseguida, bajo las mismas condiciones
de corrimiento cromatográfico, se mide el área del pico que resulte de la sustancia
en la mezcla desconocida.
Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la con-
centración de la sustancia desconocida.
24
Estándar interno
Este método se puede utilizar de dos formas, para calcular un factor de respuesta
o elaborando una curva estándar para encontrar la concentración de una muestra
problema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyecta
junto con la o las muestras problema en un cromatógrafo. Las condiciones que
esta sustancia debe cumplir son (León, 1982):
• No debe formar parte de la muestra que se desea analizar.

• Tener similitud con los componentes del problema.
• Proporcionar por sí sola y junto con la muestra problema, picos bien resueltos
y de buena forma.
• Eluir en un tiempo cercano al de los componentes del problema.
• No debe reaccionar con los componentes de la muestra.
a) Factor de respuesta El método se basa en calcular el factor de respuesta

para cada sustancia analizada, ya que los detectores no responden de la
misma manera a todos los solutos. La técnica no es muy complicada y
consiste en medir el área bajo los picos de cada compuesto, en relación
con el área de los picos de un patrón interno. El factor de respuesta está
definido por la relación:
[P] \Ap
[S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen)

[P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen)
As = Área del soluto
Ap = Área del patrón
Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método de

normalización como con el del patrón interno.
b) Estándar interno con elaboración de curva estándar. En este caso

también se requiere de la adición de un compuesto de concentración
conocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto o
analito (S) para construir una curva patrón, como en la figura 1.5. Si una
25
cantidad conocida de patrón se agrega a una muestra problema, la curva

de calibración puede utilizarse para hallar la concentración del soluto.
Cuando se use un estándar interno es recomendable que la curva de
calibración se elabore cuando menos con tres puntos. Las unidades de
concentración pueden ser moles/litro, g/1, mg/1, porcentuales, etc.
hs
~hp
[S] = concentración del soluto hs = altura del soluto

[P] = concentración del patrón hp = altura del patrón
Figura 1.5 Curva para estándares internos.
Estándar externo
Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere de

mayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas de
calibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concen-
traciones. Es importante cuidar que los volúmenes de inyección sean los mismos
que para los compuestos de interés. Se construye una gráfica de área o altura,
en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad de
masa/volumen, ya sea molaridad, % p/v, o también puede utilizarse el % p/p.
La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, con
base en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6).
Área
o
altura
Concentración
Figura 1.6 Curva para estándares externos.
26
Operación del cromatógrafo

Gow-Mac modelo 69-350
Descripción
Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en la

parte frontal del aparato (figura 1.7).
11
Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac.
27
1. Puerto de inyección para la columna "A"

2. Control de ajuste del flujo de la columna "A"
3. Control de temperatura del puerto de inyección
4. Control de temperatura del detector
5. Control de temperatura de la columna
6. Sistema analógico de medición
7. Selector de medición
8. Control de encendido del cromatógrafo
9. Control de cambio de polaridad
10. Control de encendido del detector
11. Control de ajuste del cero
12. Control de atenuación
13. Control de la corriente del detector
14. Control de ajuste de flujo de la columna "B"
15. Puerto de inyección para la columna "B"
16. Tapa del horno del cromatógrafo
Uso del cromatógrafo
1. Verifique que todos los controles estén apagados y siga las instrucciones,
en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas de
cromatografía de gases.
2. Abra la llave del tanque que contiene el gas acarreador y verifique que la
presión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2, en caso de ser menor a
500 lb/in2, repórtelo al profesor.
3. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2.
Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando un
flujómetro de burbuja que tenga una disolución de jabón al 3 %.
28
Marcas de
calibración Burbuja
Flujo del gas del
cromatógrafo
_ Disolución
jabonosa
u PERA
Figura 1.8 Medidor de flujo.
La metodología es la siguiente: conecte la manguera del flujómetro a la

salida de la columna donde se quiere ajustar el flujo. Presione ligeramente
el bulbo lleno de disolución jabonosa, para formar las burbujas que serán
arrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marca
cero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguiente
ecuación:
600
Flujo = tseg
Con base en el resultado y utilizando el control correspondiente (columna

"A" o "B") ajuste el flujo requerido.
4. Ajuste los controles de temperatura y de inyección (tanto de la columna
como del detector). Fije la corriente de este último.
5. Verifique que el registrador tenga papel y tinta para un buen funciona-
miento, enciéndalo y seleccione la velocidad de corrimiento.
Para su buen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximada-
mente de 2 horas para que se estabilice la línea base. Durante este tiempo
se puede preparar la muestra, limpiar la jeringa y ajustar el cero.
6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito
(número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador,
coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la
29
atenuación del cromatógrafo en la posición 1. Coloque el atenuador en

la posición 256 y el cero con el control del cromatógrafo.
7. Inyección de la muestra. Se debe tener cuidado al introducir la j eringa,
si ésta es de una capacidad de 5 o 10 |il, tanto el émbolo como la aguja
son muy delgadas y se doblan fácilmente. Debe colocarse la jeringa en
posición perpendicular con respecto al cromatógrafo e introducirla en el
puerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza,
para asegurar que la muestra entre en la columna.
Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringa
cuando menos cinco veces con el disolvente adecuado. Debe limpiarse
inmediatamente después de usarla, para prevenir que la muestra se seque
y queden residuos en la jeringa o el émbolo.
8. Si los picos de la muestra se salen de escala, incremente la atenuación y
corra nuevamente su sistema.
9. Una vez terminado el trabajo cromatografía) disminuyalas temperaturas
de la columna, inyector y detector, y apague la corriente de este último.
Cuide que el flujo del gas continúe hasta que la temperatura de la columna
descienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador y
limpie lajeringa.
Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica
a) Para evitar que se queme el filamento del detector, verifique que el gas
acarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender el
detector.
b) Apagar la corriente del filamento, antes de abrir el sistema, para evitar
que éste se oxide.
c) La velocidad de flujo del gas portador debe permanecer constante.
30
Metodología para las prácticas de química analítica II
1. Los alumnos deben cubrir totalmente las nueve prácticas de este manual.
2. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar
todas las observaciones de la práctica en cuestión, realizará las siguientes
actividades:
• Dibuj ar un diagrama de bloques de la práctica que se va a realizar.
• Anotar las propiedades físicas, químicas y tóxicas de cada uno de los
reactivos mencionados en el protocolo de la práctica (investigados
previamente en la biblioteca).
• Realizar los cálculos necesarios para la preparación de las disoluciones
mencionadas en la práctica, tomando como base 100 mi de disolución.
Prevención de accidentes en el trabajo

con sustancias químicas*
1. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipo
personal de protección.
2. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos o tóxicos,
debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente
prohibido usar las pipetas succionando con la boca.
3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o al
calentar líquidos en tubos de ensayo o frascos, la cara deberá apartarse
para que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usar
anteojos protectores o careta de plástico.
4. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado.
5. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la
campana de extracción.
6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química.
7. Las sustancias susceptibles de generar peróxidos (THF, éter, etc.) deberán
ser verificadas periódicamente.
* Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobre
elfuncionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalaciones
de los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en su
sesión 133.
31
Práctica 1
Análisis cualitativo de cromatografía de gases

(dos columnas)
Introducción
Conocer y utilizar la cromatografía de gases es hoy en día un aspecto primor-

dial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración de
productos alimenticios o farmacéuticos necesita de un buen control de calidad,
y muchas de las técnicas utilizadas para esto requieren de la precisión del análisis
cromatográfico.
Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la fase
estacionaria o tipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de fases
líquidas disponibles para la cromatografía de reparto gas-líquido. Para resolver
este problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá más
fuertemente un soluto polar y que, por lo tanto, las sustancias menos polares
saldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retención
más cortos.
En esta práctica se corrobora tal criterio, ya que son separados compuestos
de diferente polaridad corriéndolos en una columna polar como la Carbowax
20 M. Posteriormente se efectúa la misma separación, pero utilizando la columna
DC-200 no polar.
Objetivo
El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo
69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia de
separar una misma muestra en dos columnas de diferente polaridad.
33
Manual de prácticas de química analítica Ií
Materiales y reactivos
• Cromatógrafo de gases
• Medidor de fluj o de burbuj a
• Cronómetro
• Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi
• 5 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita
• 5 vasos de precipitados de 50 mi
5 pipetas volumétricas de 1 mi
Propipeta
• n-pentano
Tetrahidrofurano
• 2-butanona
• n-propanol
En la parte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones de ope-

ración del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p. 27).
Normas de seguridad
Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilice

propipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecheros
prendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando con
disolventes.
Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentre
presente el profesor del laboratorio, quien le ayudará y brindará asesoría
sobre el buen manejo del equipo.
Procedimiento
1. Mezcle un mililitro de cada uno de los siguientes disolventes: n-heptano,

tetrahidrofurano, 2-butanona y n-propanol. Guarde la mezcla en un re-
cipiente cerrado.
34
Análisis cualitativo de cromatografía de gases
2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes:
Temperatura de la columna 130°C
Flujo del gas 80 ml/min.
Corriente del detector 200 mA (si el gas es helio)

100 mA (si el gas es nitrógeno)
3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca-

lentamiento previo, con el fin de estabilizar la temperatura de la columna,
el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todo
esto se refleje en una línea base estable.
4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor de
burbuja como se indica en la figura 1.8.
5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4 y
ponga a funcionar el graficador a una velocidad de 2.5 cm/min.
6. Con una jeringa de 50 fil, mida 3 \ú de n-heptano y adicione otros 10 |Lil
de aire. Inyéctelos en la columna y enjuague la jeringa.
7. Marque el punto de inyección en la carta, así como la información
relacionada con la muestra inyectada.
8. El primer pico que debe eluir es el pico de aire, seguido por el pico del
n-heptano.
9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último,
inyecte la mezcla de los disolventes.
10. Baj o las mismas condiciones de trabaj o, repita todo el proceso utilizando
la columna DC-200. Cambie la polaridad del sistema para que los picos
salgan en el mismo sentido que con la columna polar.
Tratamiento de datos experimentales
• Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las

corridas.
• Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras,
identifique los componentes de la mezcla en los cromatogramas de las
dos columnas.
35
Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna,

utilizando los datos del n-heptano.
Calcule el porcentaje de cada componente de las mezclas, utilizando el
método de normalización (por áreas).
Cuestionario
i. ¿En qué se basa la cromatografía de gases?
2. ¿Cómo puede medirse la eficiencia de una columna?
3. ¿Qué se entiende por cromatografía líquido-líquido y cromatografía gas-

líquido?
¿Qué ventajas tiene la programación de temperatura en la cromatografía

de gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo de
gases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta.
Explique cuáles son las ventajas y desventajas de las columnas capilares

y las columnas empacadas.
Con base en los siguientes datos, obtenidos con el empleo de una columna
de ftalato de dodecilo, realice los ejercicios que se piden.
Compuesto Vr(ml)
Acetona 21.5
Butanona 58.0
3-pentanona 145.0
Acetilcetona 400.0
a) Calcular el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada compuesto.

b) Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de
normalización.
36
Práctica 2
Factor de respuesta en cromatografía de gases
Introducción
El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. La

sensibilidad de los detectores de conductividad térmica difiere de un compuesto
a otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menor
conductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada de
compuesto. Por lo tanto, debe medirse unfactor de respuesta empírico para
cada sustancia que se somete a un análisis cuantitativo. El factor de respuesta
F está definido por la relación:
[P] \ApJ
Objetivo
El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer el
factor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno al
n-pentano.
• Cromatógrafo de gases
• Medidor de fluj o de burbuj a
37
Cronómetro
Jeringa para cromatografía de gases de 50 mi
2 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapón de baquelita
2 vasos de precipitados de 50 mi
Propipeta
n-pentano
n-butano
Normas de seguridad
Los compuestos a trabajar son muy volátiles y flamables, trabaje en un
área ventilada y lejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas de
seguridad de la práctica 1.
Procedimiento
1. Prepare en tubo de ensayo una disolución estándar, mezclando un mililitro
de n-heptano con otro de n-pentano.
2. Ajuste las condiciones del cromatógrafo con base en los siguientes datos:
Columna DC-200
Gas acarreador Helio
Flujo del gas 60 ml/min.
Temperatura 90 °C
Atenuación 4
Corriente del detector 200 mA
Velocidad de la carta 2.5 cm/min.
3. Verifique que la línea base se encuentre estable.

4. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repita por triplicado.
5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 \ú9 repita por
triplicado.
38
Factor de respuesta en cromatografía de gases
Mida y tabule todos los tiempos y volúmenes de retención de todas las

corridas.
Con base en las áreas y concentraciones de la disolución patrón, calcular
el factor de respuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano como
estándar interno.
Calcular la concentración del n-heptano en la muestra problema, utilizando
el factor de respuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas.
Cuestionario
1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta.
2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otros
detectores como el de ionización de flama o el de captura de electrones?
3. ¿Cómo se seleccionan las temperaturas para el inyector, la columna y el

detector?
4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial del

antimicrobiano metil parabeno, se utilizó la técnica del factor de respuesta
usando el propil parabeno como estándar interno. Se corrieron las mues-
tras en un cromatógrafo con detector de ionización de flama, columna
capilar BP5 con película de 0.5 |Lim, temperatura inicial de 160 °C y un
gradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para el
cálculo del factor se utilizaron 0.98 mmol de metil parabeno y 0.75 mmol
de propil parabeno. Se obtuvieron las siguientes alturas respectivas: 180
y 165 mm.
Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar la
muestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propil
parabeno. Las alturas resultantes fueron 150 mm para el metil y 160 mm
para el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabeno
en la muestra comercial.
39
Bibliografía
Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Approach.

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Bens, E. 1961. "Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid Chromato-

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Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa,

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Ewing, G. W. 1979. Métodos instrumentales de análisis químicos. Ed. Me

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Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965. Advances in Chromatography.

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Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1971. Advances in Chromatography.

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Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial

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Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973. Problemas y experimentos en análisis

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Miller, J. M. y R. L. Harmon. 1978. Elementary Theory ofGas Croma-

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Pecsok, R. L. 1981. Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa,

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40
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putacional Method." Anal. Chem., 33:510-515, Nueva Jersey.
Storch de García y Asensio, J. M. 1975. Fundamentos de la cromatografía

de gases. Alhambra, España.
41
Capítulo 2
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
Introducción
La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha

incrementado su importancia en muchas de las áreas del análisis, tanto a nivel
investigación como a nivel industrial. Muchas de las técnicas de control de ca-
lidad de fármacos, alimentos, aditivos y contaminantes ya se están efectuando
conHPLC.
Hace más de 80 años que se conoce la cromatografía de líquidos, pero sólo
a partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un proceso
cromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ninguna
manera sustituye a la cromatografía de gases, sólo es un complemento para el
análisis de componentes que no toleran una fase móvil gaseosa o temperaturas
muy elevadas. De hecho, presenta las siguientes ventajas frente a la cromatografía
de gases:
• Tiene una difusión mínima en la fase móvil, debido a la rapidez del análisis.
• No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza a
temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas a
temperaturas menores de 100 °C.
• La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso
posterior.
La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza una

fase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interés
biológico y de compuestos iónicos, ya que no depende de la volatilidad o es-
tabilidad térmica de los componentes. Se puede utilizar para separar proteínas,
aminoácidos, lípidos, ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales son el
análisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua,
contaminantes, sabores, colorantes, etc. La cromatografía de líquidos se basa
en la solubilidad de los compuestos: hay que escoger el disolvente o la mezcla
de disolventes apropiados para llevar a la muestra a través del sistema, también
hay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor
medida en la fase estacionaria y que gracias a las altas presiones con las que se
mueve la fase móvil, se puede obtener una rápida separación de los componentes
de una mezcla.
La cromatografía de líquidos se puede clasificar en cuatro tipos, dependiendo
de su uso:
Cromatografía de líquido-sólido
En este caso, la separación depende de la afinidad de la muestra hacia la fase

sólida o líquida. Si la muestra es muy afín a la fase estacionaria (compuesta por
partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente
utilizado se conoce como eluyente y también influye de manera importante en
la separación: si la muestra es más afín a la fase líquida, los tiempos de retención
serán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según su
capacidad para eluir solutos.
La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las
muestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgánica o acuosa. Existen
muchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las más
importantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver la
muestra, ser de baja viscosidad y, una vez terminada la separación, debe permitir
la recuperación del soluto de manera simple (Watty, 1989).
En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están en
función de su conformación: la fase normal y la fase inversa.
Para l^fase normal se requiere de una fase estacionaria polar, por lo tanto,
la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que se pueden utilizar en fase
normal son diol, sílica y amino, entre otros.
En \difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil po-
lar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18), octyl,
dimetil, etc.
Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce como fase ligada
(bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestos
que aumenten su carácter no polar (C2, C6, C8, Clg). En función del tamaño de
la cadena de hidrocarburos que se haya unido, los tiempos de retención de los
solutos que eluyan en estas columnas, tenderán a aumentar, pues se retendrán
más fuertemente.
46
Cromatografía líquida de alta resolución
Tabla 2.1 Lista de disolventes.
Disolvente índice de Longitud de Solubilidad en

polaridad onda de corte nm agua % p/p
Ácido acético 0.62 230 100

Acetona 5.10 330 100
Acetonitrilo 5.80 190 100
Benceno 2.70 280 0.18
N-butanol 3.90 215 7.81
Tetracloruro de carbono 1.60 263 0.08
Cloroformo 4.10 245 0.815
Ciclohexano 0.20 200 0.01
1,2-dicloroetano 3.50 225 0.81
Cloruro de metileno 3.10 235 1.6
Dimetil sulfóxido 7.20 268 100
Dioxano 4.80 215 100
Acetato de etilo 4.40 260 8.7
Etanol 6.20 210 100
Dietiléter 2.80 220 6.89
Heptano 0.00 200 0.0003
Hexano 0.00 200 0.001
Metanol 5.10 205 100
Pentano 0.00 200 0.004
N-propanol 4.00 210 100
Iso-propanol 3.90 210 100
Tetrahidrofurano 4.00 215 100
Tolueno 2.40 285 0.051
Tricloroetileno 1.00 273 0.11
Agua 9.00 200 100
Xileno 2.50 290 0.018
47
Cromatografía de intercambio iónico
Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuen-

tran disueltos en la fase móvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes
[N-(CH3*)3+] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones de
soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzas
electrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuar
cromatografía de intercambio iónico no solamente en HPLC, sino también en
capa fina, en columna y en papel impregnado de resina. En este método la se-
paración depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de la
columna y del pH durante el proceso de separación. El procedimiento deriva
de la cromatografía de líquido-sólido, y se utiliza en la separación de aminoáci-
dos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación de
complejos, etc.
Las resinas utilizadas en las columnas pueden estar o no polimerizadas. En el
mercado existen resinas intercambiadoras catiónicas, tipo ácido fuerte o débil,
e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles de
intercambio iónico, que se utilizan para separar moléculas pequeñas con pesos
moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas de
intercambio iónico comerciales, mencionando el tipo de iones que puede retener,
el pH de trabajo y la presión máxima a la que pueden ser utilizadas.
Aniones móviles
mantenidos cerca de
los cationes unidos
covalentemente a la
fase estacionaria
Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambio

aniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella).
48
Tabla 2.2 Columnas para HPLC de intercambio iónico.
Columna Soporte pH Presión máx.
Syn Chropac SAX Sílica 2a8 5 000 psi

Fuertemente aniónica
Syn Chropac WAX Sílica 2a8 5 000 psi

Débilmente aniónica
Syn Chropac SCX Sílica 2a8 5 000 psi

Fuertemente catiónica
TSKcatiónica Resina 2a12 200 psi
Cromatografía de exclusión molecular
Con este método las moléculas se separan por su tamaño y conformación: si el

peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula es
globular, la retención será mayor, comparada con una molécula de peso supe-
rior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular
(figura 2.2). Las aplicaciones de esta técnica son amplias, ya que permite separar
muestras con pesos moleculares entre 700 y más de 150 millones, particular-
mente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para la
separación de polímeros (tabla 2.3). Los soportes utilizados pueden ser de gel
de sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como las
columnas Biosep-SEC-S; o pueden ser polímeros como los de la serie Polysep-
GFC-P (poliestireno, polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.). En
el mercado de la cromatografía de exclusión molecular existe un gran número
de columnas que permiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que se
requiera (Phenomenex, 1994).
49
Manual de prácticas de química analítica
Moléculas grandes
son excluidas
Moléculas
pequeñas
penetran el gel
Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular.
Tabla 2.3 Columnas comerciales para la exclusión molecular.
Columna Rango PM Aplicaciones

Styagel HR 0.5 0 a 1 000 Aditivos, fenoles, epóxidos, urea
Styagel HT 4 5 000 a 600 000 PM intermedio
8
Styagel HMW7 500 000 a 1x10 PM alto
Cromatografía de afinidad
Se basa en la interacción específica que existe entre un soluto de una mezcla y

un sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Las
interacciones están relacionadas más con las características estructurales que
con la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan en
otros tipos de cromatografía. Ejemplos de aplicaciones son la relación sustrato
enzima y la relación antígeno anticuerpo (Day y Underwood, 1989).
Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos se
puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992; Pecsok, 1981.
50
Operación del cromatógrafo de

alta resolución (HPLC)
El HPLC consta de cuatro partes: el sistema de bombas encargado de mantener

constante el flujo de la fase móvil; el sistema de inyección que permite introducir
la muestra a trabaj ar; la columna que tiene la función de separar los componentes
de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual manda
una señal al sistema de registro.
Sistema de bombas
Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, el

cual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de
6 000 psi. La presión es necesaria para mover las partículas del soluto entre la
fase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidos
debe tener un flujo continuo y libre de pulsaciones.
Existen dos tipos de sistemas de elución: uno donde el disolvente no cambia
de composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución
¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación de
los componentes en una mezcla (elución por gradiente).
Las bombas con pistones sincronizados son las más empleadas en los sistemas
de HPLC. Un pistón siempre bombea disolvente, mientras el otro se llena. Es-
te arreglo proporciona un flujo relativamente libre de pulsos o pulsaciones.
Pueden evitarse muchos problemas con las bombas si se cuidan los solventes
utilizados: no deben tener un pH muy bajo ni formar precipitados con facilidad.
En columnas convencionales de 5 mm de diámetro interno y con flujos entre
1 y 2 ml/min, pueden resultar presiones de 400 bar, dependiendo de la longitud
de la columna, el tamaño de partícula y el disolvente.
El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si se
quiere tener reproducibilidad en las corridas cromatográficas.
51
Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC
Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC
52
Operación del sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):
Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha (número

8 de la figura 2.4). La parte frontal consta de (figura 2.3):
1. Pantalla digital para conocer la presión del sistema, la cual está dada en
libras por pulgada cuadrada (psi). El número que aparece en la pantalla
debe multiplicarse por 10, a fin de obtener la presión verdadera.
2. Botones que fij an la presión mínima y máxima de trabaj o durante el
proceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja en
cero psi y la máxima en 3 500 psi. El valor máximo depende del tipo de
columna a utilizar y de la viscosidad del disolvente o mezcla de ellos. Si
durante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estos
valores, el sistema de bombas se apaga automáticamente.
3. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema eléctrico siga
funcionando.
4. Reset. Botón que reenciende las bombas y restablece elflujo y la presión
del sistema.
5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo del
sistema tiende a cero.
6. Control de fluj o. Consta de tres diales rotatorios individuales y permite
preseleccionar el flujo del sistema en ml/min. El flujo debe incrementarse
poco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070
indica un flujo de 0.70 ml/min.
7. Válvula de purga. Permite la purga hidráulica del sistema.
8. Botón de encendido o apagado.
Sistema de detección de solutos eluidos
Existen diferentes tipos de detectores utilizados en la cromatografía de líquidos,

los hay defluorescencia,índice de refracción, conductividad eléctrica, de UV-
visible, arreglo de diodos, etc.
El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector en
HPLC, la mayoría de los compuestos tienen cuando menos alguna absorbancia
en las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas
53
Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos.
Figura 2.6 Detector UV-visible.
54
determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, la cual relaciona la

absorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1) y la longitud del
paso del haz de luz (b): A = 8be.
Los detectores de los equipos actuales tienen una mayorflexibilidadque los
espectros comunes, ya que pueden reportar valores menores de 0.001 unidades
de absorbancia.
Operación del sistema de detección
Se enciende el aparato con el botón rojo de la parte inferior derecha. La parte

frontal (figuras 2.5 y 2.6) consta de:
1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas de unidades de absorbancia.

2. Botón de polaridad. Sirve para cambiar la señal de salida del sistema de
registro.
3. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales
positiva y negativa nulificando la señal del integrador o registrador. Este
efecto es lo mismo que si se mandara una señal de cero volts al registrador,
permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho en el
registrador o integrador.
4. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utiliza
generalmente para indicar el momento de la inyección de la muestra.
5. Auto cero. Este botón permite definir la línea base y tiene un intervalo de
± 0.7 UA (unidades de absorbancia). Cuando la lámpara parpadea indica
que la señal de salida de la línea base excede el intervalo de trabajo del
auto cero.
6. Pantalla indicadora de la longitud de onda seleccionada.
7. Control de selección de longitud de onda. Ajusta la longitud de onda de
trabajo entre 190 y 700 nm con incrementos de 0.2 nm.
8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS, Absorbance Units Full
Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan la
sensibilidad de las unidades de absorbancia.
9. Botón de control. Consta de seis posiciones que se pueden seleccionar
y observar en la pantalla:
55
SE {Sample Energy). La pantalla reporta la energía UV de la celda

de la muestra problema.
RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda de
referencia.
AU (Absorbance Units). Se observan la unidades de absorbancia
presentes en la muestra problema.
Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato toma
como cero.
• DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámpara
de deuterio.
DLC {Deuterium Lamp Current). Reporta la corriente del filamento
de la lámpara en miliamperios, una lectura de 300 es ideal y de 285
a 315 es aceptable.
10. Tiempo de respuesta. Son cinco posiciones que seleccionan los diferentes
tiempos de respuesta:
• 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y mucho

ruido en la línea base.
• 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que la
anterior.
• 0.50 sea, más rápida que la respuesta normal y con ruido ligeramente
mayor de lo normal.
• 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidad
pequeña de ruido.
• 5.00 sea, respuesta lenta para una supresión máxima del ruido.
Operación del integrador SP4400
Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el croma-

tograma, sino también un reporte completo con los tiempos de retención, las
áreas y sus porcentajes. Si se requiere, también proporciona información sobre
las condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programas
para hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7).
56
Figura 2.7 Integrador
Figura 2.8 Vista parcial del teclado del integrador.
57
Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran los

métodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, como
los siguientes:
a) Método numérico cero: MN = 0. Es un método de porciento de área

usado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Este
método no utiliza factores de respuesta del detector y de esta manera no
requiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, se
selecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos del
cromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de los
componentes no son generalmente utilizados.
b) Método numérico uno: MN = 1. Es el más utilizado en cromatografía
de gases, en particular cuando todos los componentes de la muestra son
conocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que las
áreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta,
calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de con-
centración conocida.
c) Método numérico dos: MN = 2. Requiere la utilización de estándares
internos para cuantificar de manera exacta los componentes de una mezcla.
Es de uso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivos ali-
mentarios, etc. La concentración del estándar interno debe ser ligeramente
mayor, pero no pasar de un factor de 10, con respecto a los componentes
de interés en una mezcla.
Descripción del teclado (figura 2.8)
Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás.

LCD status: Presenta un cuadro en pantalla donde indica el canal (C/z),
archivo (FI\ número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidad
de la carta (Cs), atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime),
nivel (Level) y capacidad de memoria.
Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar la
inyección en la columna "A".
Shift inj/endA: Detiene el desarrollo del cromatograma sin dar el reporte
del mismo.
58
A ítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento del

proceso cromato gráfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla
los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece
el valor que se está utilizando.
Chart speed: Se utiliza para verificar la velocidad de la carta en cualquier
momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen
en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre
paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usar
velocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 para
cromatogramas ricos en picos.
PTeval: No debe utilizarse durante la corrida. Normalmente se ob-
serva su valor antes de inyectar nuevamente la muestra, ya que un valor
menor a 250 indica que ya no hay residuos de soluto del análisis anterior
pasando por el detector.
Metodología para el manejo del HPLC
1. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben ser

filtrados en membranas de 0.4 |um, para evitar que las impurezas entren
y contaminen la columna. El disolvente debe ser grado HPLC.
2. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes estén
sumergidos en sus respectivos recipientes.
3. Encender el sistema de bombas (número 8 de la figura 2.4).
4. Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la
figura 2.3) del sistema de bombas.
5. Seleccione la longitud de onda con base en el sistema a separar, moviendo
el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que el
cromatógrafo de gases, el HPLC requiere de un tiempo (20 a 30 minutos)
para que se estabilicen las condiciones de trabajo.
6. Encender el integrador y ajustar la velocidad de la carta y la atenuación,
presionando primero la tecla Chart speed del teclado del integrador y
posteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre una
serie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementos
geométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos
59
rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación al

valor próximo, de manera que los picos reduzcan a la mitad su tamaño
(siempre y cuando se utilicen las mismas condiciones de separación).
7. Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de 250.
8. Inyecte la muestra con una jeringa de 50 jal con aguja sin punta, mida
la cantidad establecida en el manual de prácticas de la muestra a correr
e introduzca la jeringa en la válvula de inyección. El mecanismo de
inyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga y
descarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a la tubería de
acceso (loop). Mueva la palanca a la posición de descarga para que la
muestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loop será
desplazado hacia la columna. El movimiento debe ser rápido para evitar
una caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas.
Posteriormente oprima la tecla inj/endA del integrador.
Terminado el tiempo de corrimiento vuelva a presionar la tecla inj/end
A, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado.
60
Flujo Flujo
Jeringuilla I
Hacia la
columna
Unión
Exceso
Alojamiento de de inyección
muestras
CARGAR INYECTAR
Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de alta

resolución.
61
Práctica 3
Cuantificación de una muestra problema de

anisaldehído (método del patrón interno)
Introducción
El funcionamiento de un comatógrafo de alta resolución empieza con el sistema

de bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo el
sistema. La muestra es inyectada por medio de una microj eringa, el volumen es
de unos cuantos microlitros para que la resolución de los picos sea buena y la
separación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacción
soporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentes
de la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de
"Z", a través de la cual fluye la disolución; es excelente para que los compuestos
no se mezclen y el flujo sea rápido. Por último, en el integrador, la absorban-
cia es convertida en señal eléctrica y así es reproducida como cromatograma.
En la cromatografía de líquidos de partición existen dos grupos de trabajo,
el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella la
fase estacionaria tiene un carácter no polar y se eluye con un disolvente polar.
El segundo grupo es la cromatografía de fase normal que utiliza un soporte
polar y un disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático o por
gradiente y el detector más común es el uv-visible, aunque también es utilizado
el de índice de refracción.
La cuantificación de una muestra problema por medio de un estándar interno
se puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe ser
hecha mínimo con tres puntos. En el laboratorio se debe tener especial cuidado
63
sobre las condiciones de separación, en cuanto a volumen inyectado, flujo y

composición de la fase móvil. La curva se desarrollará en función de la relación
de alturas o áreas de los picos del compuesto entre las del estándar (ver capítulo
1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de la
concentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. La
concentración de la muestra problema se interpola de la curva patrón.
Objetivo
El alumno aprenderá a utilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resolución

para cuantificar una muestra problema de anisaldehído, utilizando el método
del patrón interno.
Cromatógrafo de líquidos de alta resolución
Columna Spherisorb ODS C]810 mm
Filtros de teflón de 0.4 mm
Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC
5 frascos viales de 5 mi con tapa
Anisaldehído
Acetonitrilo
Tolueno
Muestra problema con anisaldehído
Normas de seguridad
Al preparar la mezcla acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno debe hacerlo
en la campana de extracción.
Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso y fla-
mable, que debe evitar respirar sus vapores y que puede causar irritación
en la piel.
64
Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
Procedimiento
1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser las si-

guientes:
Columna Spherisorb 10ODS10jim

Dimensiones 250 x 4.6 mm
Presión máxima 3 500 psi
Fase móvil acetonitrilo/agua (50:50)
Flujo 0.8 ml/min
2. Prenda y acondicione el cromatógrafo dejando que el sistema se estabilice.

3. Prepare las siguientes mezclas de anisaldehído y tolueno:
Compuesto Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3

Anisaldehído 0.07 M 0.05 M 0.03 M
Tolueno 0.05 M 0.05 M 0.05 M
4. Filtre por membranas de 0.4 jom: a) La mezcla de acetonitrilo agua, b)

cada una de las mezclas patrón y c) la muestra problema.
5. Solicite al profesor la muestra problema que contiene 0.05 M de tolueno
como estándar interno, mida 2 |il e inyéctelos.
6. Repita por triplicado la determinación.

Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo,
elabore una curva patrón como la que se muestra en la figura 2.10.
65
ALTURA S
ALTURA P
[SOLUTO S]
[SOLUTO P]
Figura 2.10 Curva patrón.
La concentración de la muestra problema se calcula a partir de sustituir

el valor de la altura del anisaldehído (altura S) en la mezcla problema en
la relación:
ALTURAS
ALTURA P
La altura "P" es la altura del tolueno, el valor de esta relación se interpola

en la curva patrón y el valor de la gráfica es sustituido en la siguiente
relación, para obtener la concentración del soluto de la muestra problema:
SOLUTO S
SOLUTO P
Cuestionario
1. Mencione tres diferencias, en cuanto a su aplicación, entre la cromatografía

degasesyelHPLC.
2. Describa los cuidados experimentales que se deben tener para: a) los

disolventes a utilizar como fase móvil, b) la muestra problema a separar
o cuantificar.
66
Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído
Indique usted qué fase estacionaria, qué fase móvil y qué detector serían
los indicados para efectuar una buena separación de las siguientes mezclas:
a) de carbohidratos, b) de aminoácidos y c) de proteínas.
Para conocer el contenido de anfetamina en un preparado farmacéutico

comercial, se utiliza como estándar interno la metanfetamina y se efectúan
tres corridas cromato gráficas. Con base en estos datos construya una
curva patrón y calcule la concentración de una muestra problema de
anfetamina que dio una altura de 123 mm.
Corrida 1 2 3
Fármaco Conc. Altura Conc. Altura Conc. Altura
Anfetamina 0.6 30 1.2 60 1.8 98

Metanfetamina 0.6 38 0.6 38 0.6 38
Conc.= concentración en mM.
67
Práctica 4
Separación y cuantificación de una muestra de

antocianinas (método del patrón externo)
Introducción
La cromatografía de líquidos de alta resolución ha tenido un gran auge en los

últimos 20 años, se ha utilizado como técnica para separar, identificar y preparar
sustancias en muchas áreas. Actualmente estos equipos se combinan con el
banco de memoria de una computadora, lo que ofrece una mayor facilidad en
la identificación de compuestos.
Una aplicación actualizada es la separación e identificación de antocianinas,
tanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos años de
historia, aún no se conoce qué ocurre con sus compuestos durante el
añejamiento. El color es uno de los atributos más importantes del vino y es
determinante en la evaluación sensorial. En las uvas tintas está dado por el
contenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Existen
en las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en ma-
yor proporción: malvidina, petunidina, cianidina, peonidinay delfidina (Reyes
etal., 1992).
Las antocianinas son pigmentos de color rojo, azul y violeta. En condiciones
acidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO~3 )
reaccionan y se decoloran, esta reacción es reversible. El color de los vinos
tintos se debe principalmente a las antocianinas libres (estos compuestos tienden
a polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), y a
pigmentos polímeros formados durante el tiempo de afiejamiento del vino, por
condensación de antocianinas con otros compuestos flavonoides y proba-
69
blemente aldehidos. El color de los vinos tintos depende del pH, el contenido
de SO2? de los pigmentos poliméricos y los taninos.
El uso de equipos como el HPLC permite la separación de las antocianinas
en vinos tintos y éstas aparecen como picos discretos.
Objetivo
El alumno utilizará el cromatógrafo de líquidos de alta resolución para separar

y cuantificar una muestra de antocianinas, utilizando el método del patrón extemo.
Cromatógrafo de líquidos de alta resolución

Columna Spherisorb ODS Clg 10 mm
Filtros de teflón de 0.4 mm
Papel filtro WhatmanNo. 1
Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC
4 tubos de ensayo con tapa de rosca
Mortero con pistilo
Pipeta graduada de 10 mi
Clorhidrato de malvidinamonoglucósido
Ácido fórmico
Acetonitrilo
Metanol
HC1 (concentrado)
Normas de seguridad
Cuide que al preparar las mezclas acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno
se haga en la campana de extracción.
70
Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas
Recuerde que el acetonitrilo es venenoso,flamabley que causa irritación

en la piel. Se debe evitar respirar sus vapores.
Maneje con cuidado el ácido fórmico y evite el contacto con la piel, ya
que es corrosivo.
Procedimiento
1. Extracto a partir del hollejo de la uva: lavar y quitar el hollej o a 10 uvas

tintas, colocando éste en un mortero limpio. Adicionar 10 mi de metanol
y presionar suavemente con el pistilo contra el hollejo para obtener una
disolución muy colorida. El extracto es prefiltrado con papel Whatman
No. 1, antes de filtrar con membranas Millipore de 0.45 |Ltm. El extracto
se guarda en un tubo de ensayo limpio y con tapón de rosca. Se protege
de la luz y debe utilizarse a la brevedad.
2. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser:
Columna Spherisorb 10 ODS 10 |jm

Dimensiones 250 x 4.6 mm
Presión máxima 3 500 psi
Fase móvil. Se utiliza un gradiente de elución con dos disolventes:
Disolvente A, ácido fórmico al 40%
Disolvente B, acetonitrilo
Gradiente inicial: 25 % solvente A
6 minutos después incremente el disolvente B a 23 %.
Flujo 0.7 ml/min
NOTA: verifique que tanto las muestras como los disolventes de la fase
móvil se filtren en membranas Millipore de 0.45 |jm.
3. Prenda y acondicione el cromatógrafo, permitiendo que se estabilice el

flujo y la columna.
4. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Repítalo por triplicado.
71
5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3-

monoglucósido, se preparan cuatro diferentes concentraciones 25,50,
100 y 150 mg/1 en metanol con 1 ml/1 de HC1 concentrado. Se inyectan
en la columna por separado, los volúmenes de inyección deben ser de
214,1. Ajuste la atenuación para que los picos no rebasen la escala del
integrador.
Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo,
elabore una curva patrón como la de la figura 1.6. Calcule el coeficiente
de correlación.
Con la altura de los picos del extracto de uva en el cromatograma interpole
los datos en la curva patrón.
Con el valor verdadero (dato proporcionado por el profesor) calcule la
precisión y exactitud y discuta sus resultados.
Cuestionario
1. ¿Qué influencia pueden tener los siguientes cambios sobre el croma-

tograma obtenido en esta práctica?
a) Utilizar una columna C-8 en lugar de una C-18.

b) Disminuir el flujo de la fase móvil.
c) Hacer una elución isocrática (en lugar de una por gradiente) en condi-
ciones de disminución del flujo de la fase móvil.
2. ¿Qué puede suceder si, por descuido, no se filtra el extracto de materia

colorante y se inyecta en el cromatógrafo?
72
Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas
3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante una

corrida que presentó fuertes variaciones en la presión de las bombas?
¿Qué puede ocasionar este comportamiento?
4. ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los croma-

tógrafos de alta resolución?
5. Mencione brevemente tres aplicaciones directas de la cromatografía

líquida de alta resolución, mencionando además tipo de columna, fase
móvil que se podría utilizar y el detector adecuado.
73
Bibliografía

México.
Dallas, C. y O. Laureano. 1994. "Effects of pH, Sulphur Dioxide, Alcohol

Content, Temperature and Storage Time on Colour Composition of a
YoungPortugueseRedTable Wine". J.Scl Food Agrie. 65:477-485.

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Meites, L. (editor). 1963. HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA.
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tector. Thermo Separation Products, USA.
Operator'sManual. 1993. ConstaMetric 3200 Fluid Metering Pump. Thermo

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Pecsok, R. L. y L. D. Shields. 1987. Métodos modernos de análisis químico.

Ed. Limusa, México.
Reyes-Dorantes, A., M. L. Escamilla-Hurtado y J. R. Verde-Calvo. 1992.

Enología Vol I. Elaboración de vinos de mesa. Universidad Autónoma
Metropolitana Iztapalapa, México.
Watty, M. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra Mexicana, México.
74
Capítulo 3
ESPECTROFOTOMETRIA
I. VISIBLE ULTRAVIOLETA
Introducción
Los usos analíticos de la espectrofotometría en la zona del visible ultravioleta

son muchos y muy variados. El objeto de este capítulo es hacer mención de
algunas de estas aplicaciones, y que el alumno ponga en práctica los co-
nocimientos adquiridos en la teoría sobre la ley de Lambert y Beer.
Cuando un compuesto o ion capaz de absorber luz es colocado en una cel-
da en un espectrofotómetro, cierta cantidad de luz monocromática será
absorbida por dicho compuesto y el resto saldrá de la celda para ir a incidir so-
bre el fototubo que la detectará. Este comportamiento es aprovechado para
conocer la concentración de los compuestos.
La transmitancia, T, de una disolución se define como la fracción de la in-
tensidad o de la fuerza de la luz incidente, Po, que se transmite verdaderamente
a través de la disolución. En donde P es la intensidad de la luz que sale de la
muestra.
T = — o T = 100
Po \Po)
La absorbancia, A, de una disolución es la luz que absorbe, no la que se

transmite, y se define como:
A = - logT = log —
La ley de Beer (también conocida como la ley de Bouguer-Beer o de Lam-

bert y Beer) establece que: a una longitud de onda dada, la absorbencia es
proporcional a la concentración de la especie absorbente en una disolución,
como lo indica la siguiente ecuación.
A = zbc
En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración

(moles/1) y la constante de proporcionalidad es la absortividad molar, e. Su
valor numérico depende de las unidades que se usen para expresar b y c. Si b
está dada en cm y c en moles por litro, se le denomina coeficiente de extinción
molar o absortividad molar y recibe el símbolo de e. Si la concentración se da
en g/1, solamente se llama coeficiente de extinción o absortividad y su símbolo
es "a" (para obtener mayor información sobre esta ley se pueden leer los trabajos
de Hughes, 1952,Liebhafsky, 1953,yLykos, 1992).
Desviaciones de la ley de Beer
Una gran cantidad de compuestos absorbentes siguen bastante bien la ley de

Beer en soluciones diluidas, pero en algunas sustancias las absorbancias varían
en forma no lineal respecto de la concentración. Este comportamiento se conoce
como "desviación de la ley de Beer". Para trabajar estos sistemas se requiere
una curva de calibración, trazada con valores de muestras de concentración
conocida, de este modo se puede conocer el intervalo de concentraciones en
el cual la relación es lineal. Se debe tomar en cuenta que las desviaciones con
respecto a esta ley pueden tener causas diversas: por muestras muy concentradas
o muy diluidas, por variación del equilibrio químico de la sustancia que absorbe
y por limitaciones del instrumento utilizado.
Para tener el mínimo de problemas con las desviaciones, se recomienda
trabajar en el intervalo de concentraciones de 10'2 M a 10'6 M. Si se utiliza una
técnica poco reconocida, hay que cuidar el equilibrio químico poniendo espe-
cial atención en la fuerza iónica y en el pH del sistema, ya que hay muchos
compuestos cromóforos o quelatos que presentan equilibrios parciales, en estos
casos hay que agregar un exceso de ligando para desplazar el equilibrio hasta
la formación del complejo con mayor número de coordinación.
También existen problemas causados por los equipos, como las radiaciones
reflejadas dentro del aparato que llegan al detector, los cambios de sensibilidad
del detector y lasfluctuacionesen la corriente eléctrica que provocan cambios
en la intensidad de la radiación y por ende modificaciones en la lectura registrada.
Un dato muy importante es que las mediciones espectrofotométricas sólo
son confiables con valores intermedios de absorbancia, aproximadamente entre
0.187 y 0.824; o en % de T, entre 15 y 65; si se requiere, se puede ampliar
78
Espectrofotometría
esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico

(valores de absorbancia para un espectro de un solo haz, utilizando la gráfica
de Ringbom. Servicios Centrales de Instrumentación, 1983).
Celdas
La celda es un depósito transparente especialmente diseñado para contener la

disolución de prueba o el disolvente de referencia (blanco) durante los estudios
espectrofotométricos. Existen celdas o cubetas de diversos tamaños y formas
apropiadas para los diferentes tipos de espectros comerciales (figura 3.1). Las
celdas más comunes para medir espectros en la región del visible-ultravioleta
están fabricadas con cuarzo y tienen un paso de luz de 1.0 cm. Las celdas de
vidrio óptico son apropiadas sólo para mediciones en la región del visible, ya
que absorben la radiación ultravioleta.
Generalmente las celdas son cuadradas con dos lados esmerilados, pero las
hay cilindricas en forma de tubo de ensayo para ser utilizadas en el Spectronic
20. También existen las celdas de flujo que permiten la circulación continua
de una disolución a través de la cubeta. Son útiles para medir la absorbancia de
disoluciones que fluyen de una columna cromatográfica. También existen las
celdas térmicas con recirculación de agua o algún líquido que fluye en una ca-
misa para mantener el contenido de la celda a la temperatura deseada.
Las características de transmisión de las celdas en varias longitudes de onda
son función de los materiales de fabricación. Por ejemplo, el vidrio pyrex transmite
en el intervalo de los 320 a los 2 500 nm. La figura 3.2 muestra las zonas de
absorción de los materiales más comúnmente empleados en la fabricación de
celdas. Se pueden utilizar vidrios o plásticos especiales en la región del visible.
79
Celda cilindrica para

flujo constante
Celda normal
con tapa
Microcelda típica con

tapa
Celda
cuadrada
para flujo
constante
s
Figura 3.1 Diferentes tipos de celdas para espectrofotometria.
80
Espectro fotometría
200 250 300 350 400 nm
1. Spectrosil 4. Vitreosil grado IR

2. Sílice fundido 5. Vidrio óptico especial
3. Cuarzo fundido 6. Vidrio
Figura 3.2 Espectro de transmisión para materiales utilizados en la

fabricación de celdas.
Resulta conveniente contar con una marca en el lado donde incida la luz, de
manera que la celda pueda siempre ser orientada en la misma posición para
permitir la reproducibilidad de los resultados.
81
1
7. Control de longitud de onda 3. Control de cero y de encendido
2. Control de ajuste de 0% de 4. Portaceldas
transmitancia o de absorbancia
Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20.
Operación del espectrofotómetro Spectronic 20
Descripción
El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la

perilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta
82
1
7. Control de longitud de onda 3. Control de cero y de encendido
2. Control de ajuste de 0% de 4. Portaceldas
transmitancia o de absorbancia
Figura 3.3 Espectrofotómetro Spectronic 20.
Operación del espectrofotómetro Spectronic 20
Descripción
El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la

perilla izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj. El aparato se calienta
82
2. Evite el uso de agentes limpiadores que sean abrasivos, corrosivos o

que produzcan coloración de las superficies. Por ningún motivo las limpie
con un escobillón.
3. Enjuague las celdas cuando menos tres veces con pequeñas porciones
de la disolución de prueba antes de tomar la lectura. Evite usar solamente
agua destilada, ya que esto produce un efecto de dilución sobre la muestra
a medir.
4. Cuando introduzca la celda en el compartimento de muestras, limpie el
tercio inferior de la celda con papel especial para lente (nunca use ser-
villetas, pañuelos o la bata), y asegúrese que las paredes no muestren
fibrillas adheridas o manchas.
5. Evite producir rayaduras en las superficies de las celdas, colóquelas
dentro del portaceldas con la línea indicadora alineada con su respectiva
guía
6. Mantenga cerrada la tapa del compartimento de muestras mientras realiza
las mediciones, ya que esto restringe la entrada de luz parásita.
7. Al finalizar todas las mediciones, enjuague con el disolvente puro. Si las
celdas están muy sucias o si presentan depósitos difíciles de remover,
use una mezcla de ácido clorhídrico 3 N y alcohol etílico absoluto 1:1.
Aplique un último enjuague con etanol o metanol grado espectroscópico
y deje secar al aire.
84
Práctica 5
Desarrollo de un método espectrofotométrico
Introducción
Para la cuantificación de sustancias que pueden absorber la luz que las atraviesa,
las técnicas espectrofotométricas son confiables y de fácil manejo. Además,
no sólo sirven para calcular la cantidad de soluto presente en una disolución,
sino también se pueden utilizar para identificar sustancias de manera cualitativa.
Cuando se realiza un proyecto de investigación, se puede requerir el
desarrollo de un método espectrofotométrico para cuantificar algún soluto o
quizás el producto de una reacción, que tengan la cualidad de absorber la luz.
Para conseguir esto se necesita:
a) Conocer la longitud de máxima absorbancia del compuesto, que se

obtiene haciendo un barrido en la región del espectro de absorción de
interés.
b) La preparación de una curva de calibración con disoluciones de
concentración conocida. Conocer la curva permite verificar si la ley
de Lambert y Beer se cumple en el intervalo de trabajo.
c) Conocer si hay interferencias entre los reactivos, si las reacciones
involucradas son estables en las condiciones de trabajo y si hay
reproducibilidad en los resultados experimentales.
Tome en cuenta que la absorción de la energía radiante en las regiones

espectrales del visible y del ultravioleta, depende principalmente del número de
85
arreglos de los electrones de las moléculas o iones absorbentes. En sustancias

inorgánicas se presenta una absorción selectiva, cuando un nivel energético
electrónico incompleto se halla cubierto o sobrepuesto por un nivel de energía
completo, normalmente formado por valencias de coordinación con otros
átomos. En las moléculas orgánicas la absorción selectiva está relacionada con
la localización de los electrones en la molécula. Los compuestos completamente
saturados no muestran una absorción selectiva en las regiones del visible y en
las accesibles del ultravioleta lejano. Las dobles ligaduras conjugadas producen
absorción con mayores longitudes de onda. Si la molécula es muy grande, la
absorción entrará en la región del visible y presentará color, tal como sucede
con la molécula del (3 caroteno (Ewing, 1979).
Objetivo
El alumno aprenderá a utilizar un espectrofotómetro (Spectronic 20) y a
implementar una metodología para la cuantificación de compuestos que absorben
la luz en la región del visible.
Espectrofotómetro Spectronic 20
2 celdas para el espectro
3 matraces aforados 100 mi
5 matraces volumétricos de 25 mi
3 pipetas graduadas de 5 mi
Vidrio de reloj
Agitador de vidrio
Balanza analítica
Espátula
Piseta con agua destilada
NH4Fe(SO4)2*12H2O
H2SO4 concentrado
1,10-fenantrolina
CH3COONa
86
Normas de seguridad
Tome en cuenta los puntos 2, 3 y 4 del apartado "Prevención de
accidentes en el trabajo con sustancias químicas", que se encuentra en
el capítulo 1.
Para preparar soluciones diluidas de ácido sulfúrico es recomendable:
a) Enfriar el recipiente que contenga agua en un baño de hielo.

b) Agregar el ácido al agua en porciones pequeñas, dejando que éste
resbale por la pared del recipiente.
c) Agitar después de cada adición de ácido regresando el recipiente al
baño de hielo.
Procedimiento
1. Metodología para encontrar la longitud de máxima absorbancia del

complejo hierro-fenantrolina: se obtiene haciendo un barrido en la región
del espectro de 400 a 620 nm.
Preparación de disoluciones:
• Disolución estándar del hierro (III). Preparar 100 mi de disolución

1.8 x 10-3MdeNH4Fe(SO4)2 • 12H2O en disolución de H2SO4 0.1 N.
• Disolución de 1,10-fenantrolina alO.l % (p/p) en agua. Preparar 100 ml
• Acetato de sodio 2 M. Preparar 100 ml.
• Coloque 5 ml de disolución estándar de Fe (III) en un matraz volumétrico
de 100 ml. Adicione 10 ml de disolución de acetato de sodio para man-
tener el pH entre 3 y 5. Verifique con papel pH. Adicione 10 ml de 1,
10-fenantrolina y diluya hasta la marca de aforo con agua destila-
da. Deje transcurrir 10 minutos para que se desarrolle el color rojo
anaranjado.
• Mida la absorbancia a intervalos de 10 nm, de 400 a 620 nm. En cada
longitud de onda ajuste la transmitancia a cero y cien porciento, use un
blanco que contenga acetato de sodio y 1,10-fenantrolina.
87
2. La preparación de una curva de calibración con disoluciones de

concentración conocida permite verificar si la ley de Lambert y Beer se
cumple en el intervalo de trabajo.
• Curva estándar. Prepare en matraces volumétricos de 25 mi una serie

de disoluciones que contengan 1,2,3,4 y 5 mi de la disolución estándar
de Fe (III). Agregue 10 mi de disolución de acetato de sodio, 10 mi de
1,10-fenantrolina y diluya hasta la marca con agua destilada. Mídase la
absorbancia de estas disoluciones en la longitud de onda seleccionada.
3. Además se requiere conocer si hay interferencias entre los reactivos, si

las reacciones involucradas son estables en las condiciones de trabajo y
si hay reproducibilidad en los resultados experimentales.
• Solicite al profesor una muestra problema de Fe (III) y mida la ab-

sorbancia. Realice por triplicado la determinación.
Con los resultados del punto 1, construya una gráfica de longitud de

onda en función de la absorbancia. Determine la longitud de onda de
máxima absorbancia para el complejo 1,10-fenantrolina de hierro (III)
que ha de emplearse. Muestre al profesor de laboratorio la longitud de
onda seleccionada, antes de proceder al análisis cuantitativo.
Construya una gráfica de la absorbancia en función de la concentración
(moles/1). Compruebe en qué intervalo la ley de Lambert y Beer se
cumple.
Determine la concentración de la muestra problema y exprésela en mo-
laridadyenppm.
Calcule el coeficiente de extinción molar del complejo colorido.
Calcule la cantidad de mM por mi necesarios para dar una absorbancia
de 1.0.
88
Cuestionario
i. Explique cuáles son las desviaciones que pueden presentarse en la

aplicación de la ley de Beer.
2. ¿Cuáles son los cuidados que se deben tener con las celdas del es-
pectrofotómetro?
3. ¿Cuáles son los factores que se deben tomar en cuenta para la deter-
minación espectrofotométrica de iones inorgánicos por formación de
complejos?
Una disolución de permanganato de potasio 1.28x10"4 M tiene una

transmitancia de 0.5 a 525 nm, en una celda de 1.0 cm.
a) ¿Qué absorbancia tiene esta disolución?

b) Si la concentración fuese el doble, ¿cuál sería la absorbancia y la
transmitancia?
c) ¿Qué concentración correspondería a una transmitancia de 0.75 en
esta celda?
El cobalto (II) forma fácilmente un complejo de color azul cuando

reacciona con el tiocianato. El procedimiento es el siguiente: se prepara
una disolución de tres partes de acetona por una de disolución acuosa al
50% de NH4SCN. Esta disolución se agrega a un matraz que contiene
Co (II), el complejo resultante es de color azul intenso.
Se prepararon las siguientes disoluciones y se efectuó la lectura a
620 nm:
Co, ppm A
3.0 0.10
6.0 0.21
9.0 0.32
12.0 0.42
89
Se tomaron 4.0 mi del líquido que salía de una columna de separación y

se diluyeron hasta 100 mi con acetona y NH4SCN.
La absorbancia medida a 620 nm fue de 0.25. ¿Cuál fue la con-
centración del cobalto, en ppm, en el matraz de 100 mi que contenía la
muestra?
6. Se tienen 20 mi de disolución con 3.0 mg de hierro (II) formando un

complejo con la 1,10-fenantrolina. La absorbancia de la disolución es
de 0.45 en una celda de 1 cm a 515 nm. Calcule el % de Ty el coeficiente
de extinción molar del complejo.
90
Práctica 6
Determinación por espectrofotometría de la

concentración de cobalto y níquel en una mezcla
Introducción
Frecuentemente es preciso analizar mezclas de dos o más sustancias. A veces

es posible hacerlo a través de determinaciones espectrofotométricas simultáneas,
en lugar de efectuar las separaciones físicas o químicas necesarias para analizar
los componentes puros por separado.
Se conocen varios métodos para determinar las concentraciones de sistemas
con dos o más compuestos, el más conocido requiere de establecer los picos
de absorción de cada componente y que cada uno de ellos se encuentre
prácticamente libre de absorciones de los otros compuestos, además, se debe
considerar que las absorbancias de cada uno son aditivas. Existe otro método
para sistemas en los cuales las curvas de absorción se traslapan, de manera
que requieren un barrido de las dos longitudes de onda. En este caso de debe
utilizar la metodología propuesta por Blanco et al. (1989), en la cual se establece
una correlación lineal que permite con base en la pendiente y la ordenada al
origen conocer las concentraciones de mezclas binarias.
En esta práctica se utilizará el primer método para casos en que las longi-
tudes de onda de máxima absorbancia no se traslapan. En la determinación de
la concentración de dos (o más) sustancias hay que tener cuidado, ya que los
pequeños errores experimentales se suman rápidamente. Un error en la lectura
de absorbancia en una longitud de onda puede disminuir la precisión en el re-
sultado final.
91
Objetivo
El alumno aplicará sus conocimientos sobre espectrofotometría para la

cuantificación de una mezcla de dos compuestos.
2 matraces aforados 100 mi
2 matraces volumétricos de 25 mi
Vidrio de reloj
Agitador de vidrio
Balanza analítica
Espátula
Co(NO3)2 • 6 H2O
Ni(NO3)2 •6H 2 O
Normas de seguridad
Tome en cuenta el apartado "Prevención de accidentes en el trabajo con sus-

tancias químicas", que se encuentra en el capítulo 1.
Procedimiento
1. Preparar las siguientes disoluciones:
a) 100 mi de Co(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M.

b) 100 mi deNi(NO3)2 • 6 H2O 0.09 M.
92
Determinación de la concentración de cobalto y níquel en una mezcla
2. Verificar que las longitudes de onda de máxima absorbancia no se

sobrepongan, haciendo un barrido de ± 50 nm, de 10 en 10 nm, para
cada valor. El Co(NO3)2 tiene un máximo de absorción en 510 nm y el
Ni(NO3 )2 lo tiene en 395 nm.
3. Medir la transmitancia del nitrato de cobalto y del nitrato de níquel en
510y395nm.
4. Medir la absorbancia de una mezcla problema en 510 y 395 nm.
A partir de los porcientos de transmitancia calcule los valores de ab-

sorbancia para cada longitud de onda. Si se hacen varias determinaciones,
tome el promedio.
Con estos datos calcule los coeficientes de extinción molar de los dos
iones en las dos diferentes longitudes de onda.
Calcule la concentración molar de cada componente. Para obtener
mejores resultados efectúe los cálculos conservando tres cifras des-
pués del punto decimal. Reporte los resultados en molaridad y en mg de
Ni/ml y mg de Co/ml.
Cuestionario
1. ¿Qué diferencia existe entre la fuente de radiación de los espectrofo-

tómetros de la región ultravioleta y los de la región visible?
2. Calcule la concentración de cada uno de los colorantes en la siguiente

mezcla analizada por espectrofotometría.
Una disolución 0.02 M de un colorante rojo produce una absorbancia
de 0.8 a 515 nm y de 0.15 a 635 nm. Una disolución 0.03 M de un
segundo colorante azul tiene una absorbancia de 0.2 a 515 nm y de 1.0
a 635 nm. Una mezcla de ambos colorantes dio una absorbancia de
0.55 y 0.825 a 515 y 635 nm, respectivamente.
93
Calcule la concentración de una disolución que contiene Fe (III), a partir

de la siguiente técnica: A un mi de disolución con hierro se le adicionan
acetona, disolución de tiocianato de amonio y agua hasta 100 mi. La
determinación se lleva a cabo con una celda de 2 cm. La absorbancia en
480 nm fue de 0.75. El coeficiente de extinción molar fue de 14 000.
Una disolución que contiene una mezcla de AMP y GMP da una

absorbancia de 0.621 en 260 nm y de 0.214 en 280 nm. Calcule la
concentración de AMP y GMP, si los coeficientes de absorción molar
(en litros mol"1 cm"1) en estas longitudes de onda son:
AMP 260 nm 0.0154

280 nm 0.0025
GMP 260 nm 0.0117
280 nm 0.077
AMP = Adenosin mono fosfato

GMP= Glucosa mono fosfato
Las medidas fueron hechas con una celda de 1 cm de longitud de

paso óptico.
94
Espectrofotometría
II. TURBIDIMETRIA
El método turbidimétrico se fundamenta en el fenómeno de que la luz, al pasar

a través de un medio con partículas dispersas, con un índice de refracción
diferente al del medio, disminuye su intensidad debido a la dispersión.
Instrumentalmente se detecta la intensidad de la luz transmitida por el medio, o
sea, la luz no dispersada. La turbidimetría es muy similar a la colorimetría, en
cuanto que ambas se basan en la medición de la luz transmitida por un medio y
emplean aparatos similares.
La intensidad de la luz que se dispersa en cualquier ángulo es función de la
concentración de las partículas dispersantes, de su tamaño y forma, de la longitud
de onda y de la diferencia entre los índices de refracción de las partículas y el
medio. La dispersión total de un determinado número de partículas (suponiendo
que no haya interacciones de dispersión múltiple), está dada por la suma de las
dispersiones individuales, mientras que la absorbancia del sistema es
directamente proporcional a la concentración de partículas (Willard, 1974).
Es importante tomar en cuenta que la relación entre la intensidad de la luz
dispersa y la concentración no es simple, por lo que este tipo de determinaciones
deben tener un carácter empírico. La luz no es realmente absorbida por la
disolución, sino que se dispersa en todas direcciones y no llega al detector. La
absorción aparente o turbidancia obedece a una ecuación análoga a la ley de
Beer en un intervalo limitado de concentraciones.
= kbc
"A " es la absorbancia aparente o turbidancia (Ewing, 1978, utiliza la letra S

como símbolo de turbidancia)
Po es la potencia radiante del haz de luz incidente
P es la potencia del haz de luz emergente
k es una constante
b es el recorrido del haz de luz en la celda
c es la concentración de la disolución
95
El valor de k se determina empíricamente con una serie de patrones (Harris,

1992). Esta ecuación es válida sólo para suspensiones muy diluidas, porque a
medida que la concentración aumenta, una mayor proporción de la luz dispersa
encuentra su camino hacia la fotocelda de medida a través de una dispersión
múltiple (Ewing, 1978).
La ecuación de la absorbancia aparente se puede transformar en:
UT » _ P _ - rb
"T" es la transmitancia de la disolución turbia

T es el coeficiente de turbidez y es igual a 2.303 k.
Prácticamente cualquier espectrofotómetro puede utilizarse en turbidimetría:

se mide la fracción de la luz dispersada (la transmitancia), la cual es in-
dependiente de la intensidad de la fuente luminosa. La turbidimetría aplicada a
titulaciones no es muy precisa, debido a que la detección del punto final depende
del tamaño de las partículas. Sin embargo, la sensibilidad es muy buena, por
ejemplo, los sulfates pueden determinarse hasta el orden de partes por millón.
En cuanto a la selección de la longitud de onda, ésta no es crítica; sin em-
bargo, si la disolución a trabajar contiene un soluto colorido, además del
componente turbio, es preferible escoger una región de longitudes de onda de
mínima absorción. En cambio, si el componente turbio es el que absorbe, deberá
trabajarse en la región donde se presente la longitud de onda de máxima
absorbancia.
96
Práctica 7
Cuantificación turbidimétrica de sulfatos
Introducción
La aplicación de técnicas turbidimétricas es amplia, aunque en los últimos años

ha sido desplazada por la aplicación de otros métodos instrumentales más
sensibles. Actualmente aún existen procedimientos en el área de farmacia y ali-
mentos que la siguen utilizando.
Por ejemplo, en la industria de vinos y también en la de aguardientes la
transparencia y brillantez son características importantes de la calidad de estos
productos. La presencia de materiales suspendidos, aun en cantidades tan
pequeñas que resultan invisibles al embotellar, producirán un sedimento visible
y desagradable después de cierto tiempo. La calidad de las aguas para procesos
industriales y la transparencia del agua para la alimentación de calderas, son
otros ejemplos típicos de aplicaciones comunes.
Hay técnicas donde la turbidez en la muestra se desarrolla en condiciones
controladas. La reacción de precipitación debe efectuarse con rapidez y las
partículas formadas deben ser de baja solubilidad y de tamaño pequeño. La
adición de agentes tensoactivos o de coloides protectores es útil, ya que favorece
el tamaño de las partículas, promueve la nucleación a expensas del crecimiento
de los cristales y aumenta lareproducibilidad de la técnica.
Se pueden presentar problemas con la exactitud del método, pues se
encuentra limitado por la falta de reproducibilidad de la forma física del
precipitado o, una vez formado, por la inestabilidad del mismo.
97
Objetivo
El alumno utilizará una técnica turbidimétricapara la cuantificación de una muestra

problema de sulfates.
Matraz aforado de 500 mi
Matraz aforado de 200 mi
4 matraces aforados de 250 mi
4 matraces Erlenmeyer de 500 mi
Vidrio de reloj
Agitador de vidrio
Balanza analítica
Espátula
Na2SO4
NaCl
HC12M
BaCL
Normas de seguridad

el capítulo 1.
Para preparar soluciones diluidas de ácido clorhídrico es recomendable
hacerlo en la campana de extracción.
98
Cuantifícación turbidimétrica de sulfatos
Procedimiento
1. Disolución estándar de sulfatos. Prepare 500 mi de sulfato de sodio

anhidro con 200 ppm.
2. Disolución de NaCl al 20 % (p/p) en HCl 2 M. Prepare 200 mi.
3. Prepare 4 disoluciones de 250 mi, con las siguientes concentraciones,
para elaborar la curva patrón: 25, 50, lOOy 150ppm. Agregue 25 mi
de la disolución de NaCl en HCl 2 M a cada dilución, antes de llevar a
la marca de aforo.
4. Trasvase cada una de las diluciones a un matraz Erlenmeyer de 5 00 mi
y adicione 1.0 g de BaCl2 a cada sistema. Agite muy bien y mida la
transmitancia, utilizando como blanco la disolución patrón a 3 5 5 nm.
5. Solicite al profesor del laboratorio una muestra problema y mida su
transmitancia.
Trace la gráfica de transmitancia en función de la concentración (mg/1).

Interpole el dato de transmitancia en la gráfica y determine la con-
centración de la muestra problema.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la diferencia entre una determinación turbidimétrica y una efec-

tuada por nefelometría?
2. Investigue dos aplicaciones directas de la turbidimetría dentro de algún

proceso de elaboración o de control de calidad de interés para usted.
3. Para medir la cantidad defluoruroen una muestra de agua de una ciudad,

se utilizaron dos litros de agua a la cual se le adicionaron 0.5 g de nitrato
99
de calcio. Se agitó y la disolución se evaporó hasta 150 mi. Se midió la

transmitancia resultando de 55 %.
La tabla muestra las concentraciones utilizadas en la curva patrón y
los datos de transmitancia obtenidos. Calcule usted la concentración del
fluoruro del agua citadina.
Concentración ppm "A"

12 0.04
25 0.10
50 0.30
110 0.52
100
Bibliografía
Bibliografía
Blanco, M. et al 1989. "A Simple Method for Spectrophotometric Determi-

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Pecsok, R. L. 1973. Métodos modernos de análisis químico. Experimentos.

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Watty, M. B. 1989. Química analítica. Ed. Alhambra, México.
Willard, H. H. et al. 1981. Métodos instrumentales de análisis. Ed. Cecsa,

México.
102
Capítulo 4
MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS
Introducción
Los métodos electroquímicos abarcan una amplia variedad de técnicas, basadas

en los diferentes fenómenos que se llevan a cabo dentro de una celda
electroquímica. Todas las mediciones eléctricas básicas, como la corriente, las
resistencias y el voltaje, se han empleado solas o en combinación para propósitos
analíticos. Los métodos electroquímicos se clasifican en:
1. Potenciometría. Utiliza de manera directa la ecuación de Nernst,

midiendo el potencial de los electrodos no polarizados bajo condiciones
de corriente igual a cero (sin aplicación de corriente).
2. Voltametría y polarografia. Estos métodos se usan para estudiar la
composición de disoluciones electrolíticas diluidas utilizando curvas de
corriente-voltaje. La polarografia se refiere a las aplicaciones del elec-
trodo de goteo de mercurio.
3. Conductimetría. Se emplean dos electrodos inertes idénticos, y se mide
el recíproco de la resistencia que es la conductancia.
4. Cronopotenciometría. En esta técnica se hace pasar una corriente
conocida a través de la disolución y se registra el potencial de los
electrodos en función del tiempo.
5. Coulombimetría. Involucra dos técnicas: a) La coulombimetría de
corriente constante, que mantiene una corriente de este tipo durante
todo el período de la reacción. En este caso se debe agregar un exceso
de un regulador de oxidorreducción para que el potencial no aumente a
un valor que permita la realización de otra reacción no deseada, b) Las
separaciones de potencial controlado o electrogravimetría. Se pueden
lograr separaciones cuantitativas por medio de una oxidación o reduc-
ción electrolítica y medir la sustancia separada por coulombimetría
o gravimetría: se mantiene un potencial de electrodo constante y se
detecta en forma continua el potencial del electrodo de trabajo en
comparación con un electrodo de referencia.
Los métodos de cronopotenciometría, coulombimetríay las separaciones

de potencial controlado no se estudian en el curso de Química analítica II,
pero si existe interés acerca de estos métodos, en la bibliografía de este capítulo
se pueden encontrar referencias sobre el tema.
Todos los métodos electroquímicos se caracterizan por su alto grado de
selectividad y precisión.
Celdas electroquímicas
Existen dos tipos de celdas: la galvánica y la electrolítica. La primera es aquella

en que una reacción de oxidorreducción espontánea genera una corriente
eléctrica (Harris, 1992). Si se suministra energía eléctrica a una celda, con una
fuente de poder, entonces recibe el nombre de celda electrolítica.
Electrodos de referencia
Un electrodo de referencia tiene un potencial conocido y constante, están

constituidos por una hemicelda interna de referencia, que puede ser de plata,
cloruro de plata o de calomel (cada uno de ellos con su respectivo valor de
potencial estándar); tienen un electrólito de puente salino y un pequeño canal
en la punta del electrodo, a través del cual fluye muy lentamente el electrólito,
permitiendo el contacto con los otros componentes de la celda.
Electrodos de calomel
Tienen un elemento no atacable, como el platino, el cual está en contacto con

mercurio, cloruro mercuroso (calomel) y con una disolución neutra de cloruro
de potasio (de concentración conocida) que se encuentra saturada con calomel.
106
Métodos electroquímicos
HgCUs) 2Hg(\) + 2CI-
Existen tres versiones de este electrodo: el electrodo de calomel

saturado (ECS), en donde la disolución de KCl es 4.2 N (figura 4.1), y
los electrodos que tienen 1.0 N o 0.1 N de la disolución de KCl. Estos
últimos se prefieren porque alcanzan sus potenciales de equilibrio más
rápidamente y porque dependen menos de la temperatura que el de tipo
saturado. Los valores para estos tres electrodos a 30 °C son:
Electrodo de calomel saturado (ECS) = 0.241 V

Electrodo de calomel normal (ECN) = 0.280 V
Electrodo de calomel décimo normal = 0.335 V
Si requiere mayor información sobre los valores de potencial de los

electrodos de referencia, consulte el Lange s Handbook ofChemistry
o el Handbook Analytical Chemistry
Figura 4.1 Electrodo de referencia de calomel saturado.
107
Electrodos de plata-cloruro de plata
El electrodo contiene un alambre de plata recubierto con una capa de cloruro

de plata y sumergido en una disolución de cloruro de potasio (de concentración
conocida), la cual también está saturada con cloruro de plata.
AgCl (s) + e~ 4 Ag (s) + Cl-
E° = 0.222 V
E (saturado con KC1) = 0.197 V
Electrodo de vidrio combinado de pH
Es el más utilizado en el análisis químico cuantitativo, y está clasificado entre los

electrodos selectivos de iones.
En la parte interna del electrodo de vidrio hay un alambre de plata con un
extremo sumergido en una disolución de HC10.1 M (figura 4.2). El bulbo de la
parte inferior del electrodo está fabricado con un vidrio de composición espe-
cial. La superficie interior de esta membrana de vidrio está en contacto con la
disolución de HC10.1 M, y la superficie externa, con la disolución cuyo pH se
va a determinar. En las dos superficies la membrana de vidrio absorbe agua,
formando una capa de gel.
La zona del electrodo que responde a las variaciones de pH es la membrana
delgada de constitución y construcción especial, ya que presenta una red de
silicato con átomos de oxígeno cargados negativamente, los cuales se encuentran
disponibles para coordinarse con cationes monovalentes, en particular el Na+.
Esta membrana tiene un espesor aproximado de 0.1 mm.
En estudios realizados con tritio (3H) como trazador radioactivo, se ha
demostrado que los iones hidrógeno no atraviesan la membrana de vidrio del
electrodo de pH. Las dos caras de la membrana están en equilibrio con H+, y
los iones Na+ transportan las cargas a través de la membrana. La diferencia de
potencial entre los electrodos de plata, cloruro de plata interno y externo depende
de la concentración del ion cloruro en el compartimento de cada electrodo, así
como de la diferencia de potencial que existe entre las caras de la membrana.
108
Como la concentración del cloruro es constante en cada compartimento, y la

concentración de H+ es fija en la parte interna de la membrana de vidrio, el
único factor que provoca un cambio en la diferencia de potencial es la variación
del pH de la disolución del analito en la parte externa de la membrana del
electrodo (Harris, 1992).
Un electrodo combinado de vidrio llega a responder en forma muy cercana
a lo indicado por la ecuación de Nernst. Es por esto que cada cambio de una
unidad de pH en un analito da como resultado un cambio de potencial de
59.16mV.
Unión Electrodo de Ag
reemplazable
Protección de \ Membrana
la membrana d e vidrio
de vidrio
Figura 4.2 Vista parcial de un electrodo de vidrio combinado.
Calibración del electrodo de vidrio
Un electrodo de pH debe calibrarse antes de ser utilizado. Para ello existen en

el mercado muchas disoluciones patrón de pH. Se recomienda calibrar el
electrodo y el potenciómetro con una disolución reguladora o de preferencia
con dos, seleccionadas de manera que el pH del problema se sitúe dentro del
intervalo de las disoluciones patrón. El procedimiento de calibración de cada
potenciómetro puede variar con la marca y el modelo, por lo que es
recomendable la lectura de los instructivos de cada aparato en particular.
109
A continuación se describe el uso y manejo del potenciómetro, se explica

como calibrar en dos puntos el medidor de pH Conductronic modelo 20 y el
potenciómetro de campo, Conductronic 10, modelo muy abundante en los
laboratorios de docencia de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud.
Operación del potenciómetro

Conductronic modelo 20 o modelo 10
Descripción
1. El o los electrodos se enjuagan con agua destilada y se secan suavemente

con papel absorbente. Cuide de no frotar el electrodo (sobre todo si el
cuerpo es de vidrio) porque esto produce electricidad estática en la su-
perficie del vidrio.
2. Medir la temperatura de la disolución cuyo pH se desea conocer y ajustar
el dato en el potenciómetro con el botón correspondiente.
3. Sumergir el electrodo en una disolución reguladora de pH 7 y dejar que
alcance su equilibrio (entre 30 y 60 segundos). Se ajusta el aparato al
valor de pH de la disolución amortiguadora. Para realizar una lectura
correcta, el electrodo de vidrio se debe sumergir en una disolución de
pH desconocido hasta una profundidad tal que la unión reemplazable
(figura 4.2), situada en la parte inferior, se encuentre por debajo del
nivel del líquido. Esto permite que los dos electrodos de plata midan la
diferencia del potencial entre las caras interna y externa de la membrana
de vidrio.
4. Colocar el selector de funciones del potenciómetro en standby y sacar
el electrodo de la disolución, enjuagándolo con agua destilada; secarlo y
sumergirlo en una segunda disolución amortiguadora de pH diferente (si
se trabaja en intervalos ácidos, la segunda disolución puede ser de pH
4, si es en la zona básica, el amortiguador puede ser de pH 10). Se
vuelve a mover el selector de funciones del potenciómetro de standby a
pH y se hace la lectura. Si el electrodo responde siguiendo la ecuación
110
de Nernst, el potencial debe variar en 0.05916 V por cada unidad de

pH a 25 °C. Si el valor de pH de esta segunda solución no coincide con
la lectura, ésta se ajusta con el botón de temperatura. Los modelos
Conductronic 20 digitales tienen un tercer botón de "pendiente", ajuste
con él.
Cuidados
Cuando el electrodo no se usa se debe guardar en una disolución acuosa, de

manera que la capa del gel hidratado no se seque. Si el electrodo ya está seco,
se reactiva sumergiéndolo en agua durante varias horas.
Los electrodos de vidrio se desgastan poco a poco, además de ensuciarse
fácilmente con el mal uso, esto hace que la composición del vidrio cambie,
provocando que la respuesta del electrodo se vuelva lenta o errónea; cuando
el problema ya es muy grave, ni siquiera se puede estandarizar. Si esto sucede
se recomienda un lavado con HC16 M y luego enjuagar con agua destilada.
Si el lavado no funciona, reporte el electrodo con su profesor o a la
Coordinación de Laboratorios para que procedan a un lavado más riguroso
con bifluoruro de amonio, NH4HF2, al 20 % p/p. Precaución: este compuesto
provoca quemaduras en la piel y disuelve el vidrio, por lo que se debe preparar
en vaso de precipitados de plástico (Nalgen). El electrodo se sumerge en la
disolución durante un minuto, disolviendo un poco de la membrana de vidrio y
exponiendo una superficie nueva. Enseguida se enjuaga el electrodo con
abundante agua destilada y se calibra nuevamente (Harris, 1992).
111
Práctica 8
Determinación potenciométrica de
constantes de ionización
Introducción
El método potenciométrico consiste en la medición de la diferencia de potencial

entre el electrodo indicador y el electrodo de referencia, en diferentes intervalos,
durante el transcurso de una valoración.
Un potencial de electrodo corresponde aun proceso de equilibrio y durante
su medición no debe alterarse, porque de otro modo el potencial obtenido será
incorrecto. Los dos tipos principales de electrodos usados en el trabajo
potenciométrico son:
a) De referencia: Su potencial no se afecta al cambiar la composición de la

disolución que se estudia.
b) Indicador o de medición: Su potencial depende de la concentración de
uno de los iones en la disolución.
Aunque se dispone de innumerables sistemas de electrodos, se recomiendan

los descritos en la tabla 4.1, porque proporcionan el mayor intervalo de utilidad
(Meloan,1973).
Objetivo
El alumno aprenderá la instalación y el uso de una celda para la determinación

potenciométrica de las constantes de ionización.
113
Tabla 4.1 Electrodos de referencia y medición.
Sistema Referencia Indicador
Ácido base acuoso Calomel Vidrio

Ácido base no acuoso Ag-AgCI Vidrio
Red-ox orgánico Ni Pt
Red-ox inorgánico W Pt
Precipitación, ion Ag Hg 2 so 4 Ag
Precipitación metales pesados Calomel Metal pesado
Potenciómetro
Electrodo combinado de vidrio para medir pH
Pipeta volumétrica de 20 mi
Vidrio de reloj
Espátula
Balanza analítica
Agitador de vidrio
Bureta de 50 mi
Soporte universal
Pinzas para bureta
Parrilla con agitación magnética
Agitador magnético
Ácido tartárico
NaOH
Disolución amortiguadora de pH 4 y 7
114
Determinación potenciométrica de constantes de ionización
Normas de seguridad

el capítulo 1.
Para el manejo del NaOH es necesario el uso de lentes de seguridad y
guantes de neopreno, nitrilo o vinilo. Siempre debe manejarse en la
campana y no deben utilizarse lentes de contacto al trabajar con este
compuesto. Recuerde que es irritante y corrosivo y que puede causar
daño al tracto respiratorio, piel y ojos.
Procedimiento
1. Prepare las siguientes disoluciones:
• 100 mi de ácido tartárico 0.1 M.

• 100 mi de hidróxido de sodio 0.1 M, estandarizado.
2. Calibre el medidor de pH, provisto del electrodo combinado de vidrio,

con las dos disoluciones amortiguadoras. Retire y lave muy bien los
electrodos con agua destilada.
3. Vierta 20 mi del ácido tartárico en un vaso de 100 mi y añada 3 0 mi de
agua destilada. Sumerja el electrodo en la disolución y ajuste la agitación
con una barra magnéticay una parrilla con agitación magnética, de manera
que no golpee los electrodos. Con una bureta agregue disolución de
NaOH en proporciones de 1 mi, salvo cerca del punto de equivalencia,
donde se han de agregar porciones de 0.1 mi.
4. Mida el pH después de cada adición de sosa y realice la determinación
por triplicado.
115
Trace la gráfica de los valores de pH en función de los mi de NaOH.

Con base en el pH de cada punto de equivalencia, obtenido gráficamente,
calcule Kax y Ka2 para el ácido tartárico y compare con los valores
reportados en la literatura. Explique cualquier diferencia que pueda
encontrarse.
Cuestionario
1. ¿Qué características debe tener un electrodo para que pueda utilizarse

como electrodo indicador en un potenciómetro?
2. ¿Qué son los electrodos de referencia?
3. ¿Qué es una celda galvánica y cómo se representa?
4. Una celda preparada de la siguiente manera:
Pt, H2(l atm), HA (0.15 M) // KC1 sat, Hg2Cl2, Hg,
dio un potencial de 0.575 v. Calcular la constante de ionización del ácido.
116
Práctica 9
Titulación potenciométrica del ferrocianuro con cerio
Introducción
El curso de la reacción de titulación potenciométrica se sigue, midiendo con un

potenciómetro la concentración de una o de varias especies. En esta práctica
se estudia la titulación del Fe (II) con el Ce (IV), en donde la variación de las
concentraciones durante la titulación es la siguiente:
Fe2+ + Ce4+ » Fe3+ + Ce3+
Inicio Co
Agregado XCo
A.P.E. Co(l-X) eCo XCo XCo
P.Eq. sCo eCo Co Co
D.P.E. sCo Co(X-l) Co Co
A.P.E. antes del punto de equivalencia

P. Eq. punto de equivalencia
D.P.E. después del punto de equivalencia
s valor pequeño de concentración debido al equilibrio reversible
Co concentración inicial de [Fe2+]
X relación de la concentración del [Fe2+]/[Ce3+]
117
En el inicio sólo se tiene Fe2+, de manera que el valor de potencial no se

puede calcular teóricamente.
Antes del punto de equivalencia (A.P.E.) se encuentran las cuatro especies
(Fe2+? Ce4+, Fe3+, Ce3+), y aunque la cantidad de Ce4+ es muy pequeña,
el valor de potencial se puede medir en estos puntos utilizando la ecuación
de Nernst y el par: Fe 37Fe2+.
En el punto de equivalencia (P. Eq.) los reactivos se terminan y el valor
del potencial está dado por la ecuación:
E=
Después del punto de equivalencia (D.P.E.), la especie que impone el

valor del potencial es el reactivo titulante Ce 47Ce3+.
Métodos para determinar el punto de equivalencia
Existen varios métodos para la determinación del punto de equivalencia, se

describen los tres más utilizados:
1. El método más simple se aplica principalmente a las valoraciones de

ácidos y bases fuertes, donde hay cambios muy grandes de pH en el
punto final. Se traza la gráfica de pH en función de los mililitros de
disolución valorante, como se muestra en la figura 4.3, se escoge el pun-
to medio en el pH como punto de equivalencia y finalmente se baja una
línea perpendicular a la línea base. El punto de intersección con ésta es
el volumen gastado.
2. Método de la primera derivada: Este segundo método es más preciso y
es aplicable en todos los casos de neutralización. Se traza la gráfica de
los valores de ApH/Aml, en función de los mi de disolución valorante.
Se obtiene una curva como la que se muestra en la figura 4.4.
118
pH
H
1
/!
11
/i
/ |
'j
mi de disolución valorante
Figura 4.3 Método gráfico para obtener el volumen en el punto de
equivalencia.
ApH
Aml
Figura 4.4 Método de la primera derivada.
119
Método de la segunda derivada: Consiste en trazar la gráfica de los

valores de A2pH/A2ml en función de los mi de valorante, como se observa
en la figura 4.5. El punto de equivalencia en la segunda derivada es
numéricamente igual a cero, pues el valor de la ordenada pasa con gran
rapidez de un número positivo a uno negativo (Willard, 1981).
A 2 pH
A 2 ml
Figura 4.5 Método de la segunda derivada.
Objetivo
El alumno efectuará una titulación potenciométrica redox, para el estudio ex-

perimental de la curva de valoración del ferrocianuro de potasio con nitrato
cérico amoniacal.
120
Potenciómetro
Electrodo de vidrio para medir pH
Electrodo de referencia de calomel normal
Pipeta volumétrica de 20 mi
Vidrio de reloj
Espátula
Balanza analítica
Agitador de vidrio
Bureta de 50 mi
Soporte universal
Pinzas para bureta
Parrilla con agitación magnética
Agitador magnético
Ferrocianuro de potasio trihidratado
Nitrato cérico amoniacal
HCl concentrado
Disolución reguladora pH 4
Disolución reguladora pH 7
Normas de seguridad

el capítulo 1.
Para el manejo del HCl es necesario el uso de lentes de seguridad y de
guantes de neopreno. Siempre debe manej arse en la campana y no deben
utilizarse lentes de contacto al trabajar con este compuesto. Recuerde
que es irritante, corrosivo y que puede causar daño al tracto respiratorio,
piel y ojos.
121
Procedimiento
1. Prepare las siguientes disoluciones:
• 100 mi de ferrocianuro de potasio trihidratado 0.1 M.

• 100 mi de nitrato cérico amoniacal 0.1 M en HCl 1 M.
• lOOmldeHCllM.
2. Empleando el aparato de la figura 4.6, instale su sistema de titulación.

3. Calibre el potenciómetro.
4. Vierta 20 mi de disolución de ferrocianuro de potasio en un vaso de
precipitados de 100 mi. Agregue 20 mi de HCl 1 M, para cubrir los
electrodos. Titule con la disolución de cerio con adiciones de 1 mi hasta
cerca del punto final, alrededor del cual deberán hacerse adiciones de
0.1 mi. Efectúe la titulación por triplicado.
Potenciómetrro
Electrodo
indicador
Electrodo de
calomel saturado
Figura 4.6 Titulación potenciométrica.
122
Trace las gráficas de:
a) Potencial (E, V) en función de los mi de disolución de cerio.

b) La primera derivada en función de los mi de disolución de cerio.
c) La segunda derivada en función de los mi de disolución de cerio.
Con base en los resultados calcule la concentración del hierro (II).

Utilizando las gráficas, encuentre el punto de equivalencia empleando el
método de la segunda derivada.
Cuestionario
1. Enumere las condiciones experimentales que se requieren para la titulación

potenciométrica del vanadio (II) con permanganato de potasio.
2. Investigue cómo se representa una celda galvánica para la siguiente

reacción, según la IUPAC:
Sn4+ + Fe2+ » Sn2++ Fe3+
en concentraciones Sn4+ 0.2 M y Fe2+ 0.2 M.
3. Se titulan 50 mi deFe 2+ 0.12 M con una disolución de Ce 4+ 0.12 M. La

titulación se efectúa potenciométricamente con electrodos de platino y
calomel saturado. Con base en los siguientes datos, encuentre el volumen
en el punto de equivalencia, empleando una gráfica de equivalencia contra
el volumen del titulante, una gráfica de la primera derivada y una gráfica
de la segunda derivada.
123
V mi de Ce adicionado E(v)
12.5 0.496
25.0 0.524
37.5 0.552
45.0 0.58
47.5 0.559
48.5 0.613
49.5 0.641
49.55 0.644
49.7 0.655
49.8 0.665
49.9 0.683
50 0.944
50.1 1.205
50.2 1.22
50.3 1.233
50.4 1.24
50.4 1.24
51 1.263
55 1.305
62.5 1.328
75 1.346
124
Bibliografía
Bibliografía
Bates, R. G. 1973. Determination ofpH. Theory andPractice. Ed. Wiley

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Brewer, S. 1987. Solución de problemas de química analítica. Ed. Limusa,.

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Willard, H. H., L. L. Merrit Jr, y J, A. Dea. 1981. Métodos instrumentales

de análisis, Cecsa, México.
126

se terminó de imprimir en febrero de 1999
en Grupo Gráfico.
La edición consta de 1 000 ejemplares.
Alberto Reyes Dorantes estudió en

la Facultad de Química de la
UNAM la licenciatura de químico
farmacéutico biólogo, orientación
en Tecnología de Alimentos. Poste-
riormente realizó estudios en
viticultura y enología en la Univer-
sidad Politécnica de Madrid, y
estudió la maestría en Biología en la Facultad de
Ciencias de la UNAM. Ingresó a la UAM-Iztapalapa
en 1980 como profesor investigador de tiempo
completo, y ha impartido cursos de Química de Ali-
mentos, Análisis de Alimentos y Alimentos Fermen-
tados. Actualmente imparte el curso de Enología en la
licenciatura de Ingeniería de los Alimentos. Ha cola-
borado como asesor y director en proyectos de investi-
gación para la obtención de vinos de mesa, vinos espe-
ciales y fabricación de licores. Actualmente, en cola-
boración con estudiantes de la licenciatura en Ingeniería
de los Alimentos, se dedica a aislar, seleccionar y ca-
racterizar cepas naturales de la familia Streptococcaceae
para inducir la fermentación maloláctica en vinos tintos
de la zona vinícola del estado de Zacatecas, México.
Frida P. Malpica Sánchez realizó

sus estudios de licenciatura en la
Universidad Autónoma Metropo-
litana, Unidad Iztapalapa, División
de Ciencias Básicas y de la Salud,
obteniendo el título de Ingeniería
en Alimentos. Comenzó como pro-
fesora-investigadora en este mismo
plantel en 1993, colaborando en diferentes proyectos
de investigación para la obtención de vinos de mesa y
especiales y la fabricación de licores, así como en la
elaboración de notas de curso de temas relacionados
con la química analítica, por ejemplo: espectroscopia
infrarroja, potenciometría y cromatografía líquida de
alta resolución. Así mismo, ha impartido los cursos
de Microbiología General y de Alimentos y Labora-
torios de Química Analítica I y II, así como la materia
de Enología. Ha sido responsable de convenios esta-
blecidos entre la industria privada y la UAM-I para el
desarrollo de diferentes investigaciones, que además
de su importancia intrínseca permiten a estudiantes o
pasantes de la licenciatura realizar su servicio social, a
la vez que establecen un mayor vínculo con la industria
alimentaria. La licenciada Malpica imparte actualmente
el laboratorio de la materia de Enología.
Este manual va dirigido a todas las personas interesadas en conocer los principios y fundamentos
del análisis instrumental.
Las técnicas actuales de control de calidad se basan en gran parte en la cromatografía de gases.
La industria en general requiere de personal capacitado en el manejo de cromatógrafos no sólo de
gases sino también de líquidos de alta resolución.
En este manual se encontrarán los fundamentos de ambas técnicas, así como prácticas para el uso del
análisis cualitativo y cuantitativo en las cuales se manejan las técnicas de uso común en patrones in-
ternos y externos.
En cuanto al análisis espectral, se lleva de la mano al lector para que pueda hacer un análisis
completo, desde la selección de la longitud de onda de máxima absorción hasta la cuantificación de
una muestra problema.
En resumen, este libro puede ser utilizado por alumnos de cualquier licenciatura cuyos programas de
estudio manejen la cromatografía de gases y de líquidos, la potenciometría y la espectrofotometría.
Por su parte, los profesionales de la educación encontrarán en él un apoyo para manejar estos temas
no sólo en la parte práctica sino también en su parte teórica, además de contar con buenas y actua-
lizadas referencias bibliográficas.
N.E. 0726
$65.00
9 789706 543639
Manl. práct. química anal. II Libros
da Texto
UAM-Iztapalapa Librería

Manual de Practicas Instrument Ales y As

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Manual de prácticas

José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Casa abierta al tiempo

Ramón Verde Calvo es egresado

María de Lourdes Escamilla Hur-

Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

Dr. José Luis Gázquez Mateos

Lic. Edmundo Jacobo Molina

Dr. Eduardo Carrillo Hoyo

Dr. José Luis Arredondo Figueroa

Dr. Gerardo Saucedo

Ma. del Rosario Hoyos Alea

José Ramón Verde Calvo

Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes

Frida Malpica Sánchez

Cuidado de la edición y corrección de estilo:

Primera impresión: 1999

© UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11

Práctica 1. Análisis cualitativo de cromatografía

de gases (dos columnas) 33

Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37

Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

Práctica 4. Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas

Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85

Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la

Práctica 7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97

Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103

Práctica 8. Determinación potenciométnca de constantes

Práctica 9, Titulación potenciométnca del ferrocianuro con ceno 117

Por sus características analíticas la cromatografía puede ser:

a) Cromatografía cualitativa, que consiste solamente en la separación

De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de

a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma-

Manual de prácticas de química analítica II

no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las

Figura 1.1 Cromatografía de adsorción.

La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comer-

Tabla 1.1 Columnas capilares comerciales.

HPSoM 200 °C Hidrocarburos, gas natural

Poraplot Q 250 °C Alcoholes volátiles en

Poraplot U 190°C Compuestos volátiles polares,

b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en

Soluto disuelto en la fase

Figura 1.2 Cromatografía de reparto.

El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso

Manual de prácticas de química analítica II

Componentes importantes de un cromatógrafo de gases

Uno de los puntos más importantes a considerar en la cromatografía de gases,

de retención de estos últimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Desty

Manual de prácticas de química analítica II

Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en

Escualeno Escualeno I 20/100

Apienzon L Apienzon L I 50/300

SE-30 100% goma de silicona I 50/300

OV-1 100% goma de silicona I 50/300

UCW-982 goma del 99% metil, 1% vinil II 0/300

DC-200 100% de metil silicona líquida II 0/250

OV-101 100% de metil silicona líquida II 0/350

SP-2100 100% de metil silicona líquida II 0/350

SE-52 0 SE-54 fenilo al 5% II 50/300

Dexsii 300 Metil carbonato de silicona II 50/450