Universidad Nacional Federico Villarreal

Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

Cuando hablamos de la calidad del agua, la primera idea que nos viene a la
cabeza es que al igual que algunos minerales tales como, el oro, la plata y el cobre, el
agua también debe ser totalmente libre de impurezas. La palabra “calidad” cuando la
aplicamos al agua, no se refiere normalmente a un estado de pureza química, si no a
las características con que es encontrada en la naturaleza.

El agua pura solamente es encontrada en los

laboratorios, es por ello la importancia de realizar
esta 1° practica de laboratorio de microbiología para
poder así realizar preparaciones de muestras y
diluciones que confirmen la presencia o no de
microorganismos presentes en las aguas que esta a
nuestro alcance. El agua no apta para nuestro
consumo es aquella que no contiene oxígeno disuelto,
por lo tanto, no es adecuada para los peces y otros
animales acuáticos; no posee substancias minerales en
solución, lo que, además de impedir la vida de las
plantas acuáticas, es impropia para beber; no contiene compuestos orgánicos, los
cuales sirven de alimento para animales y microorganismos.

Es importante distinguir patrón de calidad de patrón de potabilidad. El primero

se refiere a todos los usos posibles del agua, mientras que el segundo se refiere
solamente a su utilización para fines de ingestión humana. Entre los posibles usos
dentro de los modelos sanitarios pueden ser citados, además del abastecimiento
doméstico de agua potable, los usos con animales de pasto, recreación, cría de
peces, irrigación agrícola y procesos industriales.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

I.- OBJETIVOS

 Acondicionar de manera correcta

e higiénica las muestras a analizar.
 Realizar las diluciones correctas para
la prueba de presunción de organismos
conformes y otros.
 Realizar correctamente el tomado de
muestras.
 Determinar la veracidad del
tratamiento implementado en las H2O potables y hasta que punto reduce el
crecimiento de las coliformes.

II.- GENERALIDADES:

Cuando nos encontramos ante un problema de contaminación, es fundamental

definir los aspectos que estaremos considerando. Existe entre las personas que
trabajan con la sanidad el concepto de contaminación íntimamente ligado a la
transmisión de enfermedades, como por ejemplo el índice de coliformes y la
existencia de compuestos, o elementos químicos tóxicos, o potencialmente tóxicos.
Los elementos que perjudican la calidad estética (se refiere a los caracteres
organolépticos: sabor, color, olor, aspecto) del agua potable son considerados en un
segundo plano.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

Una coloración verde intensa, que puede ser repugnante para quien bebe el
agua, está casi siempre relacionado a un sabor fuerte que es producto de la
existencia de plancton, que es deseable como alimento básico para los peces. Los
agentes de salubridad tienen terror de las sales de nitrógeno y fósforo, porque ayudan
al desarrollo de las algas, mientras que los piscicultores acostumbran a añadir
nitratos, fosfatos y excrementos de aves y bovinos al agua.

La palabra polución proviene del verbo latín polluere, que significa “ensuciar” y
tiene un significado más relacionado a la apariencia, la estética, que a los daños que
ella produce. De esa forma, no sería considerada agua contaminada aquella, que
poseyendo substancias tóxicas y agentes patógenos, presentase una apariencia
limpia y transparente. También, no consideraríamos como polución térmica al
aumento en pocos grados de la temperatura en las aguas de un río, lo que en la
realidad causa la pérdida de oxígeno disuelto y como consecuencia la alta mortalidad
en los peces, fenómeno que es frecuente cuando son arrojadas bebidas gaseosas
provenientes de máquinas térmicas.

Los métodos utilizados para el aislamiento y recuento de los microorganismos

presentes en los alimentos no líquidos requiere el tratamiento previo de la muestra
para liberar en un medio fluido aquellos microorganismos que pueden estar
aprovisionados en el interior del alimento o en las superficies secas o gelatinosas.

El procedimiento más frecuente empleado con este fin consiste en la utilización

de aparatos eléctricos de trituración y mezcla provisto de cuchillas cortantes que
pueden girar a gran velocidad (homogeneizadores). De esta forma, se prepara una
suspensión homogénea de alimento y microorganismos que permite la preparación de
las oportunas diluciones que posteriormente podrán ser utilizadas en diversos
métodos de recuento o enumeración.

Muchos diluyentes, pueden ser utilizados como el agua destilada, la solución

salina, las soluciones tampón fosfato y la solución de Ringer, son tóxicos para algunos
microorganismos, especialmente si se prolonga de forma excesiva el tiempo de
exposición.

Un diluyente de uso general es el agua Peptonada al 0.1%. Los conocimientos

actuales indican que los diluyentes más adecuados son aquellos que contiene un
0.1% de peptona en agua destilada o en solución salina.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

III.- TECNICA

3.1. Material y Aparatos

o Homogeneizador de una o dos velocidades.

o Vasos o recipientes de vidrio o metal adecuados para el
homogeneizador (250 mi de capacidad) con tapa, resistentes a las
temperaturas de esterilización.
o Balanza de la capacidad no inferior a 2.5 g y de una sensibilidad de 0.1g.
o Instrumentos para la preparación de la muestras (cuchillos, pinzas,
tijeras, cucharas, espátulas todo debidamente esterilizados).
o Pipetas bacteriológicas de 1 ml, 10 ml.
o Refrigeradora de 2 a 5°C
o Agua peptonada para diluciones al 0.1%

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

3.2 Procedimiento

1. Después de la toma de muestras, comenzar a trabajar tan pronto como sea posible.
Refrigerar de O a 5°C, siempre que esta no pueda ser analizada inmediatamente
después de su llegada al laboratorio.

2. Tarar el vaso del homogeneizador, con una precisión de 0.1g pesar al menos 10g
representativos de la muestra total.

3. Añadir un volumen de diluyente igual a 9 veces la muestra. Así se obtiene una

dilución 10-1

4. Hacer funcionar el homogeneizador según su velocidad, el tiempo suficiente para el

proceso no debe superar los 2.5 minutos.

5. Mezclar el contenido del vaso por agitación y pipetear por duplicado alícuotas de 1
ml en tubos conteniendo 9 ml de diluyente. Con cada una de las dos series de
diluciones llevar a cabo los pasos que a continuación se detallan (7 y 8).

6. Mezclar cuidadosamente aspirando 10 veces con una pipeta estéril.

7. Transferir con la misma pipeta 1 ml a otro tubo de dilución, conteniendo 9 ml de

diluyente y mezclar utilizando una nueva pipeta.

8. Repetir los pasos 7 y 8 hasta obtener el número necesario de diluciones. La

concentración disminuirá 10 veces en cada dilución sucesiva.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo agua destilada en

cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente
purificados.
 La muestra para análisis bacteriológico debe efectuarse con el mayor cuidado.
 Las muestras de aguas superficiales purificadas o profundas se sembraran
directamente y diluidas 1/10, para las aguas superficiales no purificadas se
emplearan diluciones 1/10, 1/100, 1/1000.

TOMA DE MUESTRA:

Para la recolección de nuestra muestra se realizo con el envase de aprox.

120ml (vidrio) debidamente esterilizado, en el momento de la recolección se
introdujo el envase unos 10cm para obtener el agua en sus profundidades
(agua residual). No fue necesario utilizar tiosulfato al 10% ya que nuestra
muestra no contiene altos índices de cloro disuelto. Inmediatamente obtenido
la muestra se cerró herméticamente para evitar una contaminación cruzada.
La muestra se refrigero para evitar la multiplicación de bacterias y ser más
veraces en el estudio de los coliformes fecales en ese momento.

V. CONCLUSION

 Es obligatorio el uso del mandil en el laboratorio como lo es también el uso de

tapaboca, guantes y un gorro para poder así evitar todo tipo de contaminación
cruzada.
 Lavarse las manos antes y después de realizar una experiencia en el laboratorio,
pues se requiere la mayor limpieza posible al manipular los materiales y la
preparación de muestras y diluciones.
 Limpiar con alcohol la mesa en que se va a trabajar.
 Rotular los tubos de ensayo indicando que concentración es la que le
corresponde.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial

 Universidad Nacional Federico Villarreal
Laboratorio de Microbiología II –Preparación de Muestras y Diluciones

 Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2005. © 1993-2004 Microsoft

Corporation.

Ing. Vanessa García Díaz Ingeniería Agroindustrial