I.

INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica de separación que se basa una fase estacionaria y

una móvil (Harris, 2003). Con el fin de que los diversos componentes de una mezcla se
separen a través de la fase móvil, la cromatografía logra la separación de diversos
compuestos en diferentes estados de agregación, ya sea sólido-líquido, gaseoso-gaseoso
entre otros. La cromatografía es de suma importancia debido a su gran uso tanto en la
industria como en el campo de la salud y la biología, por lo que se busca con esta práctica
enseñar algunos tipos de cromatografía (como la de capa fina y columna).

En la práctica se lograron separar los pigmentos de extracto de brocoli, además de

comprobar la afinidad de algunos analgésicos en diferentes disolventes para la
cromatografía de capa fina, además de la cromatografía de tiza. El objetivo principal de la
práctica fue la separación e identificación de los principales compuestos de una mezcla
mediante la cromatografía. (Candela, L. 1998).

II. OBJETIVO GENERALES:

 Conocer la cromatografía como técnica de separación de mezclas de

sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen.
 Estudiar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
 Analizar la influencia del solvente en la separación cromatografía.

 Observar las diferentes características de la placa en la cromatografía.

III. MARCO TEÓRICO:

3.1. Cromatografía:

Una de las definiciones de la técnica más correcta seria, la dada por Keulemans:
"Método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen en
dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran desarrollo
 superficial y la otra un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario
(fase móvil)."

En todo proceso cromatográfico la fase móvil es la que provoca un movimiento de las

distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria la que
suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que condiciona
que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.

La cromatografía es un método de separación de diferentes componentes de

una muestra, este método logra la separación de los mismos a través del paso de una
muestra por una fase estacionaria con la ayuda de la fase móvil, cada componente
de la muestra tiene propiedades particulares que permitirá su interacción en
forma diferente entre la fase estacionaria y móvil, de esta forma cada componente se
retrasa en forma particular y si el caudal, las característica de la fase estacionaria y
móvil y la longitud de la columna son las adecuadas se lograra la separación completa
de todos los componentes de la muestra (Nuez, F. 2001).

3.2. Cromatograma:

Es la representación gráfica de la señal en función del tiempo una vez que la muestra
es inyectada a un sistema cromatografico. Para obtener este cromatograma
a la salida de la columna se coloca un sistema de detección y registro, que permite
responder a una propiedad de la solución que contiene el analito o del propio analito
en función del tiempo, Figura 1.

Fig. 1: Cromatograma de componentes

2.2.1. Tiempo de Retención:

El tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el pico del analito
alcance el detector se denomina tiempo de retención y se le da el símbolo t R . (Figura 1)
2.2.2. Tiempo Muerto:

Es el tiempo tM para que la especie no retenida alcance el detector (Figura 1)

2.3. Clasificación de los métodos cromatográficos:

Son clasificados según el estado físico de la fase, el mecanismo de separación y el

tipo de soporte. La fase móvil puede ser un gas o un líquido, y la estacionaria u líquido
o un sólido.

Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografía: gas-líquido, líquido-líquido,

gas-sólido, líquido-sólido.

2.3.1. Cromatografía en papel

La cromatografía en papel es la técnica de separación e identificación de

sustancias químicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de
papel de filtro.

Se toma una pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita una
gota de la solución que contiene la mezcla de las sustancias que se quieren separas.
Se deja secar la gota y quedara la mancha de las sustancias mezcladas.

El extremo del papel más próximo a la mancha se introduce en un disolvente

apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en él. Existen muchos tipos
de cromatografía sobre papel, una primera división de las variadas clases podría
ser:

1- Cromatografía ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del

recipiente que sostiene al papel y va subiendo a través de el por capilaridad.

2- Cromatografía descendente: el disolvente está en un recipiente está en un

recipiente del que cuelga el papel, fluye por él hacia abajo por una combinación de
capilaridad y gravedad.(Candela, L. 1998).

En ambos casos el disolvente avanza a lo largo del papel pasando por encima de la
mancha, al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha, cada una de ellas
se mueve, por lo general a distinta velocidad que las otras.
 Se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y se
observan las sustancias separadas si tienen color, o en caso de no tener color se
procede al revelado por una reacción química apropiada. Esta técnica se conoce
como cromatografía mono dimensional y el papel resultante recibe el nombre de
cromatograma mono dimensional.

Fig. 2: Esquema de los tipos de cromatografía en papel

La resultante de las fuerzas: Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las
sustancias, comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras
que retardan.

 Las fuerzas propulsoras actúan apartando las sustancias de su punto de origen y

desplazándolas en dirección del flujo de origen.
 Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias,
llevándolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrás en el papel. (Candela, L. 1998).

La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la
resultante de estas dos clases de fuerzas.

A) Fuerzas propulsoras: Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas

propulsoras más importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada
sustancia en el disolvente.

 Flujo del disolvente: Si la sustancia cromatografía fuera completa e

instantáneamente soluble en el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azúcar,
 y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascenderá desde el origen hasta
donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera completamente insoluble
en el disolvente en movimiento no se movería del origen.
 La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha, así
pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantánea y completamente
todas las sustancias, estas avanzarían juntas hasta el final de la trayectoria
del disolvente y terminaríamos donde empezamos con todas las sustancias juntas.
 Solubilidad: Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las
sustancias que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular
solubilidad de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza
propulsora que tiende a desplazarla, manteniéndola en movimiento a lo largo del
papel. (Candela, L. 1998).

B) Fuerzas retardantes: Hay también dos fuerzas retardantes principales: la adsorción

y el reparto.

 Adsorción: La celulosa de la que está hecho el papel de filtro, posee

propiedades adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel, en
cromatografía, pueden ser más o menos adsorbidas en el papel. La adsorción es
otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas sustancias son
adsorbidas más que otras y, por consiguiente, la liberación de las sustancias de las
manchas variará de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la
separación. Mientras que se va realizando el cromatograma, las sustancias más
fuertemente adsorbidas se van quedando atrás, mientras que las adsorbidas con
menos fuerza avanzan hacia el frente.
 Reparto: La cromatografía se basa, en una medida considerable, en la presencia
de dos fases liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente
circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel
de filtro. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre uno y 12% de
agua firmemente adherida a la celulosa. Aquí es donde entra en función el reparto.
Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es
expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartirá entre ellos. La cantidad que se
encuentre en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad del soluto en
 cada uno. El grado de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama
coeficiente de reparto o razón de distribución.

C) Constante Rf: El último punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina

frente del disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las
distancias relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El
símbolo utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante:

Rf = Distancia recorrida por el compuesto desde el origen

Distancia del origen al frente del disolvente

Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debería ser un

decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje.

Así un Rf de 50 indicaría que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del

frente del disolvente. (Candela, L. 1998).

2.3.2. Cromatografía de adsorción en columna

La fase estacionaria está constituida por un sólido que se empaqueta en una

columna, normalmente de vidrio. Los componentes a separar se añaden en forma
soluble por la parte superior de la columna, quedando retenidos en la misma.
Posteriormente los componentes se desplazan arrastrados por una fase móvil líquida.
Dependiendo de la absorción selectiva de cada uno de ellos por la fase
estacionaria se desplazan a distinta velocidad, efectuándose la separación. Para
que haya una separación efectiva de los componentes, su velocidad a través
de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna,
adecuada.

2.3.2.1. Análisis frontal.-

Supongamos una disolución conteniendo tres componentes A, B y C, que se introduce

continuamente en una columna en la que la adsorción sigue el orden C, B, A. La
especie menos adsorbida, A, emerge la primera por la parte inferior de la columna,
y sigue saliendo indefinidamente. Después de un período en que sólo sale A,
 comienza a salir también B, obteniendo una mezcla A + B. Finalmente sale el
componente más retenido C, junto con A y B.

2.3.2.2. Análisis por desplazamiento.-

La mezcla a ser separada se absorbe en una pequeña zona en la parte superior de la

columna. Posteriormente se introduce un disolvente (o una disolución) que sea más
fuertemente absorbido que cualquiera de los componentes. El efecto resultante
es que los componentes son desplazados de la columna por el disolvente-
desplazaste y, ademá s, cada uno de ellos desplaza al inmediatamente menos
absorbido. (Mallol, J. 2008).

2.3.2.3. Análisis por elución.-

Después de fijar los componentes en la parte superior se pasa un disolvente puro que
no se adsorbe. Los componentes van avanzando por la columna dependiendo de la
fuerza con que son adsorbidos; cada uno de los cuales es distribuido en una pequeña
zona. Si la columna es suficientemente larga y los valores de Rf difieren bastante,
se puede lograr la separación de mezclas bastante complejas. Cada componente
puede ser recogido y analizado a la salida de la columna. (Mallol, J. 2008).

2.3.3 Cromatografía de reparto en columna

Esta técnica es semejante a la mencionada anteriormente en cuanto a materiales

utilizados, métodos operativos, etc. La diferencia reside en la fase estacionaria
utilizada y, en consecuencia, en el mecanismo de separación.

En cromatografía de reparto la fase estacionaria es un líquido, poco miscible con la

fase móvil. Los solutos se distribuyen entre las dos fases dependiendo de su
solubilidad en cada una de ellas, es decir, según su coeficiente de reparto.

2.3.4.. Cromatografía sobre geles porosos

El fundamento de este tipo de cromatografía consiste en que al hincharse el gel queda una
cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares que son capaces de
adsorber agua u otros disolventes polares. Según el número de ligaduras entre las grandes
cadenas existe un tamaño crítico (límite de exclusión) de molécula que puede entrar
en el interior del gel, mientras que las moléculas de mayor tamaño pasarán a través del
mismo, con lo que, en principio, se origina una separación de moléculas de acuerdo con su
diferente tamaño. El fenómeno puede considerarse como una filtración a través de un
tamiz molecular y por eso a esta técnica se la llama también “cromatografía con tamiz
molecular” (ctm); así mismo se la ha denominado, Penetración sobre gel, exclusión
molecular y tamizado molecular. (Harris, D. 2003).

2.3.5. Cromatografía de capa fina

La llamada “capa fina” consiste en una placa de vidrio, rectangular o cuadrada,

denominadas cromatoplacas, o simplemente placas sobre cuya superficie se deposita
una capa uniforme muy delgada (en ocasiones de algunas micras de espesor) de
una substancia absorbente, casi siempre silicagel o alúmina, en condiciones tales
que resulte uniformemente extendida y suficientemente adherida. (Nuez, F. 2001).

2.3.6. Electroforesis

El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla

de especies cargadas (algunas pueden ser neutras). Por aplicación de un campo
eléctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en función de
su carga y su movilidad iónica en ese medio. Para favorecer el paso de la corriente
se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos), que son generalmente
disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso,
debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del
problema. (Nuez, F. 2001).

2.3.7. Cromatografía de gases

Esta técnica es similar a la cromatografía de columna, con la diferencia de que el

sistema es cerrado y la fase móvil es un gas. La separación de los componentes
gaseosos se produce por adsorción selectiva sobre un sólido (C.G.S.) o por
reparto entre un gas inerte y un líquido no volátil que constituye la fase
estacionaria (C.G.L.). En la actualidad esta técnica (C.G.L.) es la más empleada,
aplicándose el análisis de gases o de líquidos y sólidos que puedan volatilizarse a
temperatura no superior a 400°C. L C.G.S. es análoga a la C.L.S.
 Los componentes del gas problema son sostenidos selectivamente por un sólido
absorbente dispuestos en columna metálica, recta o en espiral. El gas problema es
inyectado en la corriente de un gas inerte que le conduce hasta la columna y que hace
la fase móvil. En la distribución de los componentes del problema entre el gas
portador y el sólido absorbente se verifica una separación por lo que emergen
de la columna a distintos tiempos pasando finalmente por un detector que los
identifica y cuantifica. (Nuez, F. 2001).

 Aplicaciones: La cromatografía de gases constituye el mejor método analítico

ideado para la separación de gases, líquido o sólidos que pueden pasar fácilmente
al estado de vapor o transformándolos previamente en otros estados volátiles Ej.
metilación de ácidos grasos en el análisis de aceite ha resuelto problemas de
muy difícil solución para la química analítica empleada hace una década. Por
eso su utilización es indispensable en análisis industriales, forenses
bromatológicos, toxicológicos, clínicos y de contaminación ambiental.

2.3.8. Cromatografía liquida de alta resolución

En las cromatografías clásicas, en las que la fase móvil es un líquido que fluye a través
de un sólido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolución sería necesario
emplear columnas excesivamente largas, lo que se traduciría en un desarrollo
muy lento de los cromatogramas. (Mallol, J. 2008).

Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografía de alta resolución, en la

que se trabaja con pequeñas columnas, muy empaquetadas y forzando el paso de la
fase móvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones muy
efectivas en un plazo muy corto de tiempo. Dependiendo de la fase estacionaria,
el mecanismo de separación puede ser reparto, adsorción, tamaño molecular
(geles) e incluso cambio iónico, aunque los métodos más utilizados están basados en
reparto y adsorción. (Mallol, J. 2008).

APLICACIONES:

a) Concentración de trazas
b) Separación de iones interferentes en análisis clásico
c) Separaciones de iones de características similares
d) Desmineralización del agua
 e) Preparación de disoluciones patrón
f) Disolución de sustancias insolubles.

2.4. Clasificación de las cromatografías

Tabla 1: Cromatografía en columna abierta

Fuente: Rubinson (2001)

Tabla 2: Cromatografía en columna cerrada

Fuente: Rubinson (2001)

Tabla 3: Cromatografía en papel

Fuente: Rubinson (2001)

IV. Materiales y Métodos

 Papel filtro de 23.8 cm. de lardo por 10.9 cm de ancho

 Vaso precipitado

 Alcohol de 96°

 Acetona

 Agua destilada

 Sal

 Extracto de brócoli

V. Resultados
los puntos dibujados con pluma del extracto de brocoli después de unos minutos fue
ascendiendo del pigmento del brócoli llega a una altura de 14 cm se muestra en el
anexo, no se pudo llegar a evaluar la RF debido a la rápida evaporación del alcohol,
acetona y agua con sal.

Foto N° 1: muestras en solución Foto N° 1: muestras finales al finalizar la

evaporación de las muestras

Foto N°3: medición de la altura de ascenso del pingmento del extracto de brocoli
VI. Conclusión

De acuerdo con los resultados obtenidos, mediante la prueba de

cromatografía podemos determinar la cantidad de pigmentos que predomina
en ciertos alimentos, por ejemplo, la clorofila que es en brócoli.

Esta técnica de separación es una de las más sencillas y también son una
de las más fáciles de realizar pudiendo así ver si algunas sustancias fueron
adulteradas o no, mientras que también se es posible determinar el tipo de
sustancias que se encuentren en una determinadas sustancias a analizar.

VII. Bibliografía

Rubinson. 2001. Análisis Instrumental. Editorial Pretice Hall

Harris, D. 2007. Análisis Químico Cuantitativo. 3era edición. Editorial Reverté

Holler. 2008. Principios de Análisis Instrumental. Segunda Edición. Editorial Reverté

Bruice, P. (2007). Química Orgánica (5ta. Edición). México: Pearson Educación.

Climent, J. (2005). Experimentación en química : química orgánica, ingenieria química. Valencia:

Univerisidad Politécnica de Valencia.

Harris, D. (2003). Ánalisis Químico Cuantitativo (6ta edición). Barcelona: Editorial Reverté.

Herrera, C.; Bolaños, N.; Lutz, G. (2003) Química de Alimentos: Manual de Laboratorio. Editoria
Universidad de Costa Rica, 1ª edición, San José, Costa Rica, Pp4.

Mallol, J. (2008). Manual de Radiofarmacia. Ediciones Díaz de Santos, España, Pp71.

Morell, I.; Candela, L. (1998). Plaguicidas: aspectos ambientales, analíticos y toxicológicos. 3º

edición, Universidad de Jaume, España, Pp171.