Ingeniería Bioquímica

Bioquímica del Nitrógeno y Regulación

Genética

Practica # 2
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE BIOMOLECULAR:
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Catedrático: Dra. Ma. Del Socorro Heredia Ruiz

Aguiar Hernández Alfonso. 10211532

Ceniceros Montiel Blanca Sonia. 10211630
García Padilla Johann Benjamín. 10211510
Ruiz Pérez Cristina Maitee 10211524

20 de septiembre de 2012
 Resumen

Se realizo una técnica de separación de biomoléculas por medio de capa fina, son
dependientes a la cromatografía ya que sus componentes son mezclas las cuales son
separadas por medio de la diferencia entre los tipos de solubilidad entre los dos
sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfica son: el soporte, la fase
estacionaria, y la fase móvil o eluyente. En esta técnica la fase estacionaria es una
capa fina de gel de sílice u otro soporte con propiedades adsorbentes dispuesta sobre
un soporte de vidrio. El eluyente o fase móvil será la mezcla de disolventes. A
continuación se muestra como se llevo a cabo práctica para la separación de una
mezcla de aminoácidos, mediante la reacción con la ninhidrina que en esta ocasión fue
el revelador
 Índice

Introducción……………………………………………………………………………1

Antecedentes…………………………………………………………………………...2

Metodología…………………………………………………………………………....4

Resultados……………………………………………………………………………..5

Cuestionario…………………………………………………………………………...6

Conclusiones…………………………………………………………………………..8

Bibliografía…………………………………………………………………………….10
Introducción

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos
esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las
placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en
la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

De forma general, en las técnicas cromatográfica existe una distribución de las

moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que
permanece fija en el espacio, y la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en
íntimo contacto con ésta.
Antecedentes

El botánico ruso Mikhail Tswett estableció las ventajas de la cromatografía y fue el

primero en utilizar este término.

La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versátil que

presenta distintas variantes. En toda separación cromatografía hay dos fases (sólida,
líquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra
manteniendo un contacto íntimo.

La cromatografía de capa fina es una técnica cromatografía La placa cromatografía

consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a
una superficie solida con algún agente cementante.
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método
ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en
vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para
conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las paredes se
impregnan del eluyente.

La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza

para separar moléculas relativamente pequeñas. La separación de mezclas de
moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el principio del reparto
entre dos fases. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y
una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase
estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente
proporcional a la afinidad por la fase estacionaria.

La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de
silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio,
aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de
fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que
se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La
fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o
una mezcla de ambos.2
En la cromatografía en capa fina (ccf), el grado de elución de las sustancias depende
tanto de su propia polaridad como de la polaridad del eluyente utilizado. El
adsorbente se coloca en forma de una capa delgada adherida sobre un soporte
rígido, que pueden ser placas de vidrio, aluminio o poliéster. Los tamaños de la placa
para cromatografía de capa convencional son: 20 x 20; 't0 x20 y 5x2 cm.

Hay adsorbentes que contienen un indicador de fluorescencia para facilitar la

identificación de muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son coloridos,
se requerirán otras técnicas de revelado.3

Coeficiente de reparto

El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar, e íntimamente

relacionado con él, se emplea el denominado Rf, característico de cada sustancia y
definido como la relación entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre
la fase móvil. Los componentes de la mezcla más insolubles en el disolvente empleado
tendrán un Rf próximo a cero, mientras que el de los más solubles se acercará a uno.
Metodología

Resultados
Rf=D/Df

Siendo D la distancia recorrida por cada muestra y Df la distancia del frente de avance.
Cuestionario

1. ¿Qué naturaleza tienen las fases estacionaria y móvil empleadas? Con una
fase móvil más polar la separación ¿sería mejor o peor? ¿por qué?

El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de

los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas
(coeficientes de reparto). Con un solvente más polar la separación seria mejor ya que
la elución seria con mayor velocidad.4

2. Describa la reacción de ninhidrina con los aminoácidos, y los colores

obtenidos.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el

grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con
reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina
reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un
compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la
excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el
grupo amino está sustituido).El derivado coloreado presenta máximo de absorción en
torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH
comprendidos entre 4 y 8.4

3. ¿Podrían diferenciarse, por una cromatografía de este tipo, los 20

aminoácidos proteicos? ¿Qué se entiende por cromatografía en placa
bidimensional? ¿para que la emplearía?

Si.

La cromatografía en placa fina bidimensional de intercambio anicónico permite la

resolución de mezclas complejas de nucleótidos que resultan de difícil separación
sobre papel o en una sola columna.5
4. La detección precoz de algunas enfermedades congénitas relacionadas
con el metabolismo de aminoácidos se realiza por esta técnica, empleando una
muestra de sangre. El caso más importante es la fenilcetonuria. Consultar el
problema metabólico que origina la enfermedad y describir que observaciones en
la cromatografía de un suero fenilcetonurico.

Es un desorden del metabolismo; el cuerpo no metaboliza adecuadamente un

aminoácido, la "fenilalanina", por la deficiencia o ausencia de una enzima llamada
fenilalanina hidroxilasa. Como consecuencia, la fenilalanina se acumula y resulta tóxica
para el sistema nervioso central, ocasionando daño cerebral.
Conclusiones

En esta práctica logramos conocer y aplicar la cromatografía por capa fina, sus
características y los factores que influyen en la separación por cromatografía, además
de aprender a calcular los valores del factor de retención de las sustancias, además de
que La técnica de cromatografía en capa fina tiene numerosas ventajas, aparte de ser
rápida, sencilla, barata... tiene también la ventaja de utilizar poca cantidad de muestra.
al final pudimos ver el Rf de los aminoácidos.

Aguiar Hernández Alfonso

Mediante esta práctica se realizo la identificación un compuesto comparando su

comportamiento cromatográfica en base a los objetivos de esta práctica. Se observaron
los aminoácidos correspondientes en la palca los puntos de color violeta, durante la
realización de la practica no se presento ningún inconveniente para asi posteriormente
calcular el Rf de los aminoácidos analizados y asi poder constatar que se habían
analizado los aminoácidos correctos.

Ceniceros Montiel Blanca S.

En base a los resultados obtenidos se pudo calcular el Rf de los aminoácidos

analizados y es base a estos cálculos se realizaron comparaciones entre los valores
correspondientes de estos aminoácidos que ya se encuentran tabulados.

Con las muestras problemas se calcularon los Rf al ser una mezcla se observaban
varios puntos en este segmento y estos coincidían con los puntos de los aminoácidos
conocidos por lo que a simple vista se podría decir que aminoácidos formaban las
mezclas problemas, pero para confirmar esto nos basamos en los cálculo del Rf.

García Padilla Johann B.

En base a los resultaos obtenidos pudimos observar la efectividad de la técnica para la

identificación de los aminoácidos, utilizamos la técnica de cromatografía en capa fina,
la cual se basa en una separación de de las moléculas absorbidas en la placa ( fase
estacionaria), la fase móvil la cuales eran los disolventes se utilizaron como flujo para
su desplazamiento.

Las manchas observadas de los aminoácidos sobre la placa al rosearla con nihidrina y
después colocado sobre una estufa para su secado.

Utilizamos nihidrina debido a que sirve para la determinación de aminoácido que

reacciona con los aminoácidos de grupo amino libre, este a su vez se reduce a
hidrindantina que reacciona con el amoniaco y la nihidrina para dar un compuesto el
cual presenta una coloración purpura.

Sabemos que la prolina no contiene un grupo libre, sino NH y al reaccionar con la

nihidrina se forma de color amarillo, esto lo pudimos observar en la hoja de celulosa en
la que realizamos la técnica.

Ruiz Pérez Cristina M

Bibliografía
1. Técnicas de separación de biomoléculas. Recuperado 18/2012
http://es.scribd.com/doc/57923179/7/RECUADRO-I-3-Las-tecnicas-de-separacion-
de-las-biomoleculas
2. http://es.scribd.com/doc/14172689/5-Cromatografia-en-Capa-Fina Recuperado el
19 de septiembre 2012
3. http://organica1.org/1311/1311_6.pdf Recuperado el 19 de septiembre del 2012
4. Jorrin Novo (s.f) separación de aminoácidos por cromatografía de capa fina.
Recuperado el 17 de septiembre de
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE
%20AAs.pdf
5. Adams, R. L. P.; Burdon, R. H. (1980) Bioquímica de los ácidos
nucleicos de Davidson. España: Reverte.