Universidade Estadual de

Londrina

RELATÓRIO SOBRE
AULA PRÁTICA DE
CROMATOGRAFIA DE
TROCA IONICA

Aluno: Maykon César Gonçalves de Andrade

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1. SUMÁRIO
2. Introdução ....................................................................................... 3

3. Objetivos ......................................................................................... 4

4. Materiais ......................................................................................... 4

5. método ............................................................................................ 4

6. Resultados ...................................................................................... 5

7. Discusões ....................................................................................... 7
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2. INTRODUÇÃO

A cromatografia por troca iônica é uma técnica analítica importante para

a separação e determinação de compostos iônicos, juntamente com a
cromatografia de exclusão iônica e interação iônica. A cromatografia de troca
iônica é baseada na interação iônica entre analitos polares e iônicos, os íons e
grupos funcionais que estão presentes no eluente e se fixam na fase suporte da
cromatografia por dois mecanismos distintos; troca iônica devido a atração entre
as moléculas e exclusão iônica devido a repulsão entre moléculas de cargas
similares na fase líquida e na fase suporte (BAHADIR, 2013). Na Figura 1
podemos visualizar como se comporta o sistema de atração.

Figura 1 - Representação visual da ligação iônica.

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3. OBJETIVOS

Aplicar a técnica da cromatografia de troca iônica para a separação de

proteínas e peptídeos.

4. MATERIAIS

a. Coluna cromatográfica com resina de DEAE-Celulose

b. 100mg de Triptona
c. 100mg de albumina
d. Solução 0,5N de NaOH
e. Solução 0,5N de HCl
f. Tampão Fosfato 10mMol/L de Ph=6,8
g. Refratômetro
h. Solução NaCl 0,5mol/L

5. MÉTODO

Para a obtenção do gráfico de cromatografia iremos utilizar duas amostras

de proteínas conhecidas que são a triptona e a albumina, para isso iremos
realizar a pesagem de 100mg de cada e diluir até completar 5ml de amostra. O
próximo passo então é o da preparação da coluna e nessa preparação temos
que levar em consideração a quantidade por ml que a resina consegue reter de
proteína, no caso da resina DAEA-celulose ela é capaz de reter de 1 a 2 mg de
proteína por mL, além disso temos que escolher a coluna que irá ser o suporte
da resina pelo volume da resina.
A próxima fase da montagem do experimento seria o tratamento da resina
e o empacotamento da coluna com a resina já tratada, portanto para o tratamento
nós utilizamos 4 vezes o volume da resina de uma solução de NaOH na
concentração de 0,5N, colocamos a resina imersa na solução e agitamos durante
30 minutos, após a agitação verificamos o coeficiente de hidratação da resina e
lavamos a mesma com água destilada até que o ph fique igual ao da água, então
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novamente realizamos o mesmo procedimento anterior de lavagem porém com

uma solução de HCl. Só então adicionamos a resina já ativada à coluna
cromatográfica.
Seguimos então com a fase de tamponamento da resina na qual
utilizamos o tampão de fosfato 10mMol/L no ph de 6,8 e enxaguamos a resina já
disposta na coluna por várias horas até que o ph da resina seja igual ao do
tampão, finalizada a etapa de tamponamento já podemos realizar a aplicação da
amostra.
Aplicamos a amostra de proteína preparada previamente no topo da
coluna e aguardamos a penetração de todo o volume na coluna, posteriormente
fechamos o sistema e acertamos o fluxo para que as frações de 3ml sejam
coletadas a cada minuto.
Iniciar a aplicação do gradiente de NaCl na concentração de 0,5mol/L e o
volume deste gradiente deve ser 4 vezes superior ao volume da coluna
empacotada de resina, no experimento a seguir o gradiente começou a ser
aplicado na 76 amostra.
Paralelamente ao fluxo de coletas realizado automaticamente pelo
sistema de fracionamento nós vamos analisando as amostras já eluídas da
coluna em um refratômetro na faixa de absorbância de 280nm, a plotagem de
todos os valores lidos pelo refratômetro irá nos dar um gráfico indicando a
concentração de forma indireta para cada fração eluída da coluna.

6. RESULTADOS

A seguir estão dispostos os resultados na forma de tabela na Tabela 1 e

na forma de gráfico na Figura 1.
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Tabela 1 - Leituras de absorbância para cada fração.

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Absorbancia em função das frações

3 1
0.9
2.5
0.8
Aplicação do
Absorbância 280nm

0.7
2 Gradiente
0.6
1.5 0.5
0.4
1
0.3
0.2
0.5
0.1
0 0
0 20 40 60 80 100 120 140
Numero de Fração

Figura 2 - Visualização em forma gráfica das eluições.

7. DISCUSÕES

Podemos verificar pela visualização gráfica das eluições que próximo da

amostra 20 tivemos o início do desprendimento de uma das proteínas da coluna
de cromatografia finalizando próximo da amostra 40. Já quando aplicamos o
gradiente de NaCl a outra proteína que estava presa na resina começou a se
desprender e por volta da amostra 90 começamos a ter a presença dessa
proteína na amostra com o pico de concentração por volta da amostra 95 até a
amostra 124 ainda tínhamos a presença dessa segunda proteína.