Nghiên Cứu Chiết Xuất Dịch Chlorophyll Chống Oxy Hóa Từ Lá Bắp

i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này, trước tiên tôi xin gửi đến Ban giám hiệu_Trường
Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công
nghệ Thực phẩm lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập tại Trường trong những
năm qua.
Lời cảm ơn sâu sắc xin được giành cho cô Th.S Nguyễn Thị Mỹ Trang_Bộ
môn Đảm bảo Chất lượng và An toàn Thực phẩm và Th.S Đặng Xuân Cường_
Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá
trình thực hiện đồ án này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm, các
cán bộ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Xin giành lòng biết ơn đến cha mẹ đã tạo điều kiện cho tôi được học tập
trong suốt thời gian qua.
Xin cảm ơn bạn bè đã chia sẽ cùng tôi những khó khăn trong quá trình học
tập tại trường.
Nha Trang, ngày tháng năm 2012

Người thực hiện
Nguyễn Thị Minh Trang

ii
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN----------------------------------------------------------------------------------i
MỤC LỤC--------------------------------------------------------------------------------------ii
DANH MỤC BẢNG-------------------------------------------------------------------------iv
DANH MỤC HÌNH--------------------------------------------------------------------------vi
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. --1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................ --3
1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) ................................................................. --4
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô..................................................................... --4
1.1.2. Đặc tính trồng trọt................................................................................... --5
1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới .............................................. --5
1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng.................................... --8
1.2.1. Đặc tính của chlorophyll ......................................................................... --8
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll............................................................... --8
1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll...................................... --9
1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll.......................................... -----11
1.2.5. Tác dụng của chlorophyll........................................................ -------------13
1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường: ................................... --14
1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới.................. --16
1.3.1. Trong nước ........................................................................................... --16
1.3.2. Trên thế giới ......................................................................................... --16
1.4. Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm ...... --22
1.4.1. Các phương pháp chiết tách chlorophyll ............................................... --23
1.4.2. Các phương pháp xác định chlorophyll ................................................. --26
1.5. Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken .............................................. --28
1.5.1. Cơ sở lý thuyết...................................................................................... --28
1.5.2. Các bước tiến hành ............................................................................... --30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU-----------------32
2.1. Nguyên liệu ............................................................................................. --33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... --33
2.2.1. Phương pháp định lượng....................................................................... --33
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa .................................... --34
2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu ...................................................................... --34
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm.............................................................. --35
2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa--------------------------------------------------------41
2.3. Dụng cụ và hóa chất-------------------------------------------------------------------42
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... --43
3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll............................................................................................... --44
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy
hóa của chlorophyll ........................................................................................ --46
iii
3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính chống
oxy hóa của chlorophyll ................................................................................. --48
3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll sau chlorophyll ............................................................................ --50
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll ..................................................................................................... --53
3.6. Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa.................... --55
3.7. Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp------------61
3.8. Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp--63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ --64
iv
DANH MỤC BẢNG
STT TÊN BẢNG TRANG
1 Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế 6
giới (1961-2007)
2 Bảng 1.2. Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007) 7
3 Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử 10

chlorophyll.
4 Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực 41
5 Bảng 2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực 41

sử dụng mô hình Box-Behnken
6 Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55
7 Bảng 3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và 56

F của các yếu tố
8 Bảng 3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của 56

hai hàm mục tiêu
v
DANH MỤC HÌNH
STT TÊN HÌNH TRANG

Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt 8
1 -3
nước biển (mg chl m ).
Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll. 10
2
Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường 15
3
Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu 17
4
chlorophyll.
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 35
5
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi 36
6
chiết
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung 37
7
môi chiết
8 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/ 38
nguyên liệu
9 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết 39
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiết độ chiết 40

10
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng 44
11
chlorophyll
Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính 44
12
chống oxy hóa của chlorophyll
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm 46
13
lượng chlorophyll
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt 46
14
vi
tính chống oxy hóa chlorophyll

Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu đến 48
15
hàm lượng chlorophyll
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến 49
16
hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng 50
17
chlorophyll
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính 51
18
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng 53
19
chlorophyll
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính 54
20
21 Hình 3.11. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y1 57
22 Hình 3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2 58
Hình 3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố 58

23
lên hàm mục tiêu Y1
Hình 3.13b. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố 58
24
lên hàm mục tiêu Y2
Hình 3.14. Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục 59
25
tiêu Y1 và Y2
Hình 3.15. Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61

26
Hình 3.16. Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết 63
27
Hình 3.17. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau 63
28
mỗi lần chiết
1
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay sự biến đổi khí hậu và môi trường toàn cầu đang ở mức đáng báo
động cao. Con người luôn có thể phải tiếp xúc với phóng xạ, các bức xạ năng lượng
cao, ngộ độc, nhiễm độc thức ăn, nấm mốc, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc diệt cỏ
(dioxin), tia tử ngoại, khói thuốc lá (mỗi hơi thuốc lá sản sinh khoảng 114 gốc tự
do), stress, dư thừa chất béo…. Chính các yếu tố trên đã làm tăng nhanh quá trình
lão hóa và mắc bệnh cho con người, như ung thư, Alzehmer,….
Chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và khoa học gia từng đoạt giải
Nobel, Bác Sĩ Hans Frischer, đã khám phá ra cấu trúc của hồng huyết cầu rất giống
như cấu trúc của Chlorophyll. Trong cơ thể con người, hồng huyết cầu có nhiệm vụ
chuyển tải dưỡng khí cho cơ thể với chất sắt (Fe) là nhân tố của hồng huyết cầu
trong khi magnesium (Mg) là nhân tố của Chlorophyll. Chính điều này giúp cơ thể
chúng ta biến đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu làm gia tăng chỉ số hồng huyết
cầu trong cơ thể, bổ gan, hoá giải các độc tố và tiêu trừ các chất độc trong máu.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất
chống oxy hoá của cơ thể, có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá (khả năng: quét
các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion, khử sắt, tạo phức chelat với các iôn hóa trị,
oxy hóa lipid), ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương…
Cây bắp là một trong năm loại cây lương thực chủ đạo trên thế giới cũng như
ở Việt Nam. Năm 2009 chỉ tính riêng huyện Khánh Vĩnh, trong tổng số 2.680 ha
cây lương thực, diện tích trồng bắp trên địa bàn huyện đạt hơn 1.500 ha với năng
suất 32 – 35 tạ/ ha.
Ở nước ta cây bắp chủ yếu được trồng để lấy hạt, còn thân cây, lá cây, vỏ
bắp và lụa bắp chủ yếu được làm thức ăn gia súc hoặc tồn tại ở dạng phế liệu nông
nghiệp gây ô nhiễm môi trường. Từ lá bắp, vỏ bắp,…thu nhận chlorophyll, sau vẫn
có thể sử dụng phần còn lại để sản xuất nhiên liệu sinh học từ bã chiết.
Do vậy, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang
phân công nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy
2
hóa từ lá bắp”, với mục đích tận dụng lá bắp để thu nhận chlorophyll dùng trong
thực phẩm.
Nội dung đề tài:
1) Xác định một số thông số cho quá trình chiết rút chlorophyll chống oxy
hóa từ lá bắp: loại và nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu,
thời gian và nhiệt độ chiết;
2) Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;
3) Sơ bộ đánh giá hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;
Do thời gian nghiên cứu có hạn và lần đầu làm quen với nghiên cứu
chlorophyll. Do vậy đồ án này chắc hẳn sẽ còn có những hạn chế. Em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp của quý thấy cô và bạn bè để nghiên cứu này thêm hoàn
thiện. Xin chân thành cảm ơn.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
4
1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp)

Ngô, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L. ssp. mays) là loại cây
lương thực thuần canh bắt nguồn ở Trung Mỹ, sau đó được trồng phổ biến ở châu
Mỹ. Cuối thế kỷ 15 đầu thế kỷ 16, khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ,
bắp đã được trồng phổ biến trên toàn thế giới.
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô [39]
Một vài giống ngô có thể cao tới 7m, còn chiều cao các giống ngô thương
phẩm chỉ khoảng 2,5m và ngô ngọt (Zea mays var. rugosa hay Zea mays var.
saccharata) thường thấp hơn.
Cây ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản,
dài 50 – 100cm, rộng 5 - 10cm; thân thẳng, thường cao 2–3 m, nhiều mấu, với các
lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Bắp ngô ôm sát thân cây và nằm dưới lá. Khi còn
non chúng dài ra khoảng 3cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ.
Thân cây ngô có đốt với các khớp (mấu hay mắt), các khớp cách nhau khoảng 20 –
30cm, trông tương tự thân cây tre.
Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một
số lớp lá, và bao chặt vào thân. Chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu
ngô màu vàng hung từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô là các núm nhụy
thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần
sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đuôi sóc hình chùy chứa các hoa đực,
được gọi là cờ ngô. Mỗi râu ngô đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô
trên bắp. Các bắp ngô non có thể dùng làm rau ăn với toàn bộ lõi và râu, nhưng khi
bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngô trở nên cứng và râu thì
khô đi nên không ăn được.
Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu
quả thông thường ở họ Hòa thảo (Poaceae), gần giống loại quả phức về cấu trúc,
ngoại trừ là các hạt riêng biệt không bao giờ hợp nhất thành một khối. Hạt ngô có
kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối đều xung quanh một
5
lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25cm, có khoảng 200 -
400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng, khi được nghiền
thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì. Tuy nhiên, chúng không
có gluten như lúa mì nên có độ trương nở nhỏ hơn khi sử dụng cho các thức ăn dạng
nướng [39].
1.1.2. Đặc tính trồng trọt [39]
Ngô cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trong môi trường phù hợp với nhiệt
độ lớn hơn 10°C (50°F) và biên độ ảnh hưởng này được quyết định theo di truyền
và được điều chỉnh bởi hệ thống sắc tố thực vật. Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị
sai lệch đối với các giống cây trồng ở khu vực nhiệt đới (thời gian ban ngày kéo dài
làm cho cây phát triển rất cao và không đủ thời gian ra hoa, tạo hạt trước khi bị chết
vì sương giá). Tuy nhiên, đặc tính này hữu ích khi sử dụng ngô làm nguồn cung cấp
nhiên liệu sinh học
Do ngô chịu lạnh kém nên ở khu vực ôn đới, ngô thường được trồng vào
mùa xuân. Hệ thống rễ nông, nên phụ thuộc nhiều vào độ ẩm của đất. Là một loại
thực vật C4 (thực vật có cơ chế quang hợp C4), nên chúng sử dụng nước hiệu quả
hơn so với thực vật C3 như (cỏ linh lăng hay đậu tương). Chúng nhạy cảm nhất với
khô hạn khi trổ bắp, lúc hoa (râu) ngô đã sẵn sàng cho việc thụ phấn. Tại Hoa Kỳ,
vụ thu hoạch bội thu theo truyền thống được dự đoán là khi ngô "cao ngang đầu gối
vào ngày 4 tháng 7", mặc dù các giống lai ghép hiện nay nói chung đều vượt quá tỷ
lệ phát triển này. Ngô sử dụng để làm cỏ ủ chua được thu hoạch khi cây còn non và
bắp chưa già. Ngô ngọt được thu hoạch khi hạt ở "giai đoạn sữa", sau khi thụ phấn
nhưng trước khi hình thành tinh bột, ở Mỹ là vào khoảng cuối mùa hè, đầu đến giữa
mùa thu [39].
1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới [38]
 Trên thế giới
Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (riêng tại Hoa
Kỳ, sản lượng là khoảng 270 triệu tấn/ năm). Các giống ngô lai được ưa chuộng hơn
so với các giống ngô thông thường, do năng suất cao.
6
Ngành sản xuất ngô trên thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỉ 20 đến nay, nhất
là trong hơn 40 năm gần đây, ngô là cây trồng có tốc độ tăng trưởng về năng suất là
cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu. Năm 1961, năng suất ngô trung bình của
thế giới chỉ chưa đến 20 tạ/ha, năm 2004 đã đạt 49,9 tạ/ha. Năm 2007, theo Bộ
Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), diện tích ngô đã vượt qua lúa nước với 157 triệu ha,
năng suất 4.9 tấn/ha và sản lượng đạt kỉ lục với 766,2 triệu tấn.
Kết quả trên có được trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi lý thuyết ưu thế lai
trong chọn tạo giống, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh
tác. Đặc biệt, từ 10 năm nay, cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống lai
nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với công nghệ sinh học thì việc ứng dụng
công nghệ cao trong canh tác ngô đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên
trên lúa mì và lúa nước. Với 52% diện tích trồng bằng giống được tạo ra bằng công
nghệ sinh học, năng suất ngô nước Mỹ năm 2005 đạt hơn 10 tấn/ha trên diện tích 30
triệu hecta. Năm 2007, diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới đã đạt 35,2 triệu
ha, riêng ở Mỹ đã lên đến 27,4 triệu ha, chiếm 73% trong tổng số hơn 37,5 triệu ha
ngô của nước này [38].
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới (1961-2007)
Năm Diện tích Năng suất Sản lượng

(1000 ha) (tấn/ha) (1000 tấn)
1961 104,8 2,0 204,2
2004-2005 145,0 4,9 714,8
2005-2006 145,6 4,8 696,3
2006-2007 148,6 4,7 704,2
2007-2008 157,0 4,9 766,2
 Trong nước
Năng suất ngô của Việt Nam những năm 1960 chỉ đạt trên 1 tấn/ha, với diện
tích hơn 200 ngàn hecta. Đến đầu những năm 1980, năng suất cũng chỉ đạt 1,1
tấn/ha và sản lượng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô địa phương với kĩ
7
thuật canh tác lạc hậu. Từ những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm cải tạo Ngô
và Lúa mì Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở
nước ta, góp phần nâng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990. Tuy
nhiên, ngành sản xuất ngô ở nước ta thật sự có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu
những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống ngô lai ra
sản xuất, đồng thời cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác theo đòi hỏi của giống
mới.
Năm 1991, diện tích trồng ngô lai chưa đến 1% trên hơn 400.000 hecta trồng
ngô. Năm 2007, giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta. Năng
suất ngô nước ta tăng nhanh liên tục với tốc độ cao hơn trung bình thế giới trong
suốt hơn 20 năm qua. Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung
bình thế giới (11/32 tạ/ha), năm 1990 bằng 42% (15,5/37 tạ/ha), năm 2000 bằng
60% (25/42 tạ/ha), năm 2005 đạt 73% (36/49 tạ/ha) và năm 2007 đã đạt 81%
(39,6/49 tạ/ha). Năm 1994, sản lượng ngô của Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn,
năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007, chúng ta đạt diện tích, năng suất và
sản lượng cao nhất từ trước tới nay. Diện tích là 1.072.800 ha, năng suất là 39,6
tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn là 4.250.900 tấn [38].
Bảng 1.2. Sản xuất ngô của Việt Nam (1961-2007)
Năm 1961 1975 1990 1994 2000 2005 2007
Diện tích
229,20 267,00 432,00 534,60 730,20 1052,6 1072,8
(1000 ha)
Sản lượng
260,10 280,60 671,00 1143,9 200,.9 3787,1 4250,9
(1000 tấn)
Năng suất
11,4 10,5 15,5 21,4 25,1 36,0 39,6
(tạ/ha)
8
1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng

1.2.1. Đặc tính của chlorophyll
Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll) là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá
cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam. Lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc
vào lượng sinh khối [25]. Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến
quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng.
Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém
hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng. Do đó, màu các mô chứa
chlorophyll có màu xanh lá cây [30].
Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển
(mg chl m-3)
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll
Chlorophyll được phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre
Joseph Pelletier vào năm 1817 [6].
Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các
năng lượng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một cách nào đó để giữ năng lượng
mặt trời. Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt
9
trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ được
năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940
và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn.
1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll
 Cấu trúc chlorophyll
Cấu trúc chung của chlorophyll được làm sáng tỏ bởi Hans Fischer vào năm
1940. Năm 1960, hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến, Robert
Burns Woodward đã xuất bản một tổng hợp tổng số về phân tử. Năm 1967, việc giải
thích lập thể còn lại cuối cùng đã được hoàn thành bởi Ian Fleming [9]. Chlorophyll
f được công bố tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả năng
hình thành stromatolites, năm 2010 [5]. Chlorophyll có công thức phân tử là
C55H70O6N4Mg và cấu trúc 2-formyl-chlorophyll đã được phân tích dựa trên NMR,
quang học và phổ khối [24].
Chlorophyll có nhân porphyrin. Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol liên kết
nhau qua cầu nối ethyl tạo thành vòng kín với tâm là Mg. Bên cạnh đó còn có vòng
phụ thứ 5. Nhân porphyrin có 2 gốc rượu methanol (CH3OH) và fythol (C20H39OH)
nối nhau tại vị trí C10 và C7, và 10 nối đôi tạo cơ sở cho quá trình quang hóa.
Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở
chlorophyll a là nhóm -CH3, còn ở chlorophyll b là nhóm -CHO [33].
10
Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d
Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll

Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau:
Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll
Diệp lục tố Diệp lục tố

Diệp lục tố a Diệp lục tố b Diệp lục tố d
c1 c2
Công
thức C55H72O5N4 C55H70O6N4 C35H30O5N4 C35H28O5N4 C54H70O6N4
phân Mg Mg Mg Mg Mg
tử
Nhóm
-CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CH=CH2 -CHO
C3
Nhóm
-CH3 -CHO -CH3 -CH3 -CH3
C7
Nhóm -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3

11
C8
- - - - -
Nhóm
CH2CH2COO CH2CH2COO CH=CHCOO CH=CHCOO CH2CH2COO
C17
-Phytyl -Phytyl H H -Phytyl
Liên
kết
Đơn Đơn Kép Đơn Kép
C17-
C18
Vi khuẩn lam
Tần Đa số thực Các loại tảo Các loại tảo
Phổ biến (cyanobacteri
suất vật khác nhau khác nhau
a)
 Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll

Ở thực vật, chlorophyll có thể được tổng hợp từ succinyl-CoA và glycine,
mặc dù tiền chất trước đó để hình thành chlorophyll a và b là protochlorophyllide.
Trong thực vật hạt kín, bước cuối cùng trong quá trình chuyển đổi
protochlorophyllide thành chlorophyll, có sự phụ thuộc vào ánh sáng và thực vật có
màu nhạt nếu được trồng trong bóng tối. Thực vật không mạch và các loại tảo xanh,
có một enzyme bổ sung không phụ thuộc vào ánh sáng và phát triển màu xanh ngay
cả trong bóng tối. Chlorophyll được gắn kết với protein và có thể chuyển năng
lượng hấp thụ theo hướng yêu cầu [13].
1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó được biết đến là các chất có hoạt động
chống oxy hóa. Việc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của nó
như chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thư. Vì vậy,
việc áp dụng một chế độ ăn uống giàu chlorophyll có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn
sự khởi đầu của một số bệnh như ung thư, đó là các biểu hiện lão hóa được gây ra
bởi các gốc tự do.Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng, các dẫn xuất của
12
chlorophyll, như chlorophyllin, đã cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là như
vitamin C. Các chức năng của chlorophyll đối với động vật được biết đến là giúp ức
chế quá trình peoroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi sự hư hại gây ra bởi các gốc tự
do khác nhau và các loại phản ứng oxy hóa khác. Chlorophyllin cũng được báo cáo
là giúp ngăn chặn các bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể [37].
Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất của
chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được đánh giá. Hoạt tính chống oxy hóa được
xác định bằng khả năng của mỗi hợp chất sau đây trong việc nhặt gốc tự do như
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonate) (ABTS +) . Hoạt động Antimutagenic đã được khảo nghiệm với một
chủng vi khuẩn vi hình gây đột biến đảo ngược, bằng cách sử dụng vi khuẩn
Salmonella typhimurium TA100 và benzo[a]pyrene như một chủng thử nghiệm và
gây đột biến tương ứng. Các chất dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả
năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b. Hơn nữa,
các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll như chlorins, pheophytins, và
pyropheophytins cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim
loại như Mg-chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytina,
and Cu-chlorophyllins. Những kết quả này đã chứng minh rằng các dẫn xuất của
chlorophyll trong chế độ ăn uống ở cả hai loại thực phẩm tươi và thực phẩm chế
biến, chế độ ăn uống bổ sung có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động
antimutagenic [22].
Nghiên cứu về chlorophyll từ bột Spirulina (Spirulina sp.) đã được thực hiện
để xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái và suy thoái động
học của chlorophyll a và chiết xuất thô, cũng như điều tra sự khác biệt của hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll khi có chiếu xạ hoặc không có chiếu xạ. Hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll a được xác định bằng cách phương pháp DPPH. Kết
quả cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được tăng lên sau 60
phút chiếu xạ [28].
13
Hoạt động của chất chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh hoặc trà có nguồn
gốc polyphenol đã được nghiên cứu rộng rãi. Tuy nhiên, hoạt động của chất chống
oxy hóa trong các phần không có polyphenolic của trà xanh thì ít được phân tích.
Trong nghiên cứu này, họ đã phân tích hoạt động chống oxy hóa của các phần
không chứa polyphenolic của phần trà xanh còn lại (Camellia sinensis) sau khi chiết
xuất bằng nước nóng bằng việc sử dụng phương pháp clorua nhôm. Phần không
chứa polyphenolic của trà xanh còn lại gây ra sự ức chế đáng kể đối với
hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic theo cách phụ thuộc vào liều. Khi tập
trung các phần không chứa polyphenolic được áp dụng cho tấm silicagel TLC và
phát triển, sáu điểm màu đã được quan sát, chúng được cho là chlorophyll a và b,
pheophytins a và b, carotenoid, như beta-carotene và lutein. Mặc dù tất cả các sắc tố
đều biểu hiện hoạt động của các chất chống oxy hóa quan trọng, mức độ của hoạt
động ức chế chống lại hydroperoxide của chlorophyll a> lutein> pheophytin a>
chlorophyll b> beta-carotene > pheophytin b. Những kết quả này cho thấy rằng
phần không chứa polyphenolic trong phần trà xanh còn lại, có hoạt tính ức chế
mạnh chống lại hệ hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic, nó có nguồn gốc từ
hoạt động chống oxy hóa của chlorophyll a và b, pheophytins a và b, beta-carotene
và lutein. Phát hiện này cũng có nghĩa là sự kết hợp của các phần polyphenol tan
trong nước với các sắc tố chống oxy hóa có trong phần không chứa polyphenolic
của trà xanh, sẽ có hiệu quả hơn để ngăn chặn các bệnh mãn tính [14].
1.2.5. Tác dụng của chlorophyll
Chlorophyll được đăng kí như một phụ gia thực phẩm ( chất nhuộm màu) và
số E của nó là E140. Các đầu bếp sử dụng chlorophyll để tạo màu sắc đa dạng cho
thực phẩm và các loại đồ uống có màu xanh lá cây như mì ống và absinthe [2]..
Chlorophyll không tan trong nước nên đầu tiên nó được trộn với một lượng nhỏ dầu
thực vật để có được những giải pháp mong muốn. Chiết xuất chlorophyll lỏng được
coi là không ổn định và luôn luôn biến đổi cho đến năm 1997, khi Frank S.& Lisa
Sagliano sử dụng việc làm đông khô chlorophyll lỏng tại trường đại học tại Florida,
ổn định nó ở dạng bột, bảo quản và để sử dụng trong tương lai.
14
Ngoài ra, chlorophyll còn có nhiều tác dụng trong y học [36] :
- Giúp cải thiện tính năng tinh lọc máu tự nhiên của cơ thể.
- Chống thiếu máu ,vi chất trong quá trình tạo hemoglobin.
- Tăng số tế bào hồng cầu, làm các tế bào mạnh thêm.
- Tăng lượng máu.
- Tăng cường các phản ứng miễn dịch chủ yếu trong cơ thể.
- Chống lại các chất độc tố/ Chống lại chất gây ung thư.
- Giúp cơ thể thải loại các chất cặn bã.
- Ngăn ngừa sự suy hô hấp.
- Làm dịu thấp khớp.
- Giúp phòng chống các bệnh tim mạch, các dấu hiệu sớm tuổi già.
- Tăng cường chức năng thận và bàng quan.
- Giảm giãn tĩnh mạch.
- Tăng cường chức năng tiêu hoá.
- Chống táo bón bằng việc tăng cường sự lưu thông của đường mật.
- Cải thiện tình trang đái tháo đường.
- Chống các bệnh về tuyến giáp.
- Tăng cường chức năng gan và cải thiện vấn đề gan.
- Giảm chóng mặt.
- Chống mất ngủ.
- Giảm thiếu máu não.
1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường:
 Chlorophyll Fibersol Plus:

Diệp lục trong sản phẩm Chlorophyll
Fibersol Plus được lấy từ cỏ linh lăng.
Trong tiếng Arab cỏ linh lăng nghĩa là "cha
của thực phẩm", vì nó tốt cho sức khỏe, rễ
15
cây đâm sâu xuống lòng đất 30feet do vậy có thể hút rất nhiều loại chất khoáng:
Canxi, sắt, magie...
- 1 gói= dinh dưỡng chứa trong 1kg rau xanh
- Cỏ linh lăng chứa hàm lượng diệp lục cao gấp 4 lần so với các loại rau thông
thường, 1 gói Chlorophyll Fibersol Plus chứa lượng dinh dưỡng có trong 1 kg rau
xanh, do vậy có thể nói rằng đây là phương pháp tự nhiên tuyệt vời để cải thiện sức
khỏe con người.
 Chiết xuất diệp lục (Liquid chlorophyll- synerry):
- Sản phẩm được nghiên cứu và sản xuất tại Mỹ. Tập đoàn Synergy -
Nature's Sunshine là nhà nhập khẩu cỏ Linh Lăng lớn nhất
toàn cầu. Tập đoàn sử dụng cỏ Linh Lăng để chiết xuất ra
chất diệp lục.
- Sản phẩm của tập đoàn chứa 8 loại Enzym cơ bản
ở dạng tự nhiên, các vi lượng và khoáng chất, hoàn toàn
không có hoá chất, chất bảo quản và độc tố gây hại cho cơ
thể người.
Ngoài ra còn một số sản phẩm khác như:
Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường

16
1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới
1.3.1. Trong nước
Nghiên cứu chlorophyll trong nước chủ yếu áp dụng cho việc đánh giá năng
suất sinh học sơ cấp ở vùng sinh thái biển ven bờ, thông qua việc đánh giá hàm
lượng chlorophyll a, số liệu được thu thập thông qua các đơn vị gam Chlorophyll
a/m3 hay gam Chlorophyll a/m2.
1.3.2. Trên thế giới
Methanol được biết đến là dung môi thích hợp nhất để trích xuất chlorophyll
từ dòng Nannochloropsis gaditana, bằng cách áp dụng Lichtenthaler 1983 [21], sau
24 giờ chiết tách. Hơn nữa, ngoài khả năng ly giải của dung môi còn có việc sử
dụng các kỹ thuật bổ sung phá vỡ vách tế bào, giúp tăng năng suất chiết tách. Kĩ
thuật làm đông hay không làm đông với N2 lỏng được cho thấy là hiệu quả hơn so
với việc sử dụng siêu âm trong 15 phút để giải nén các sắc tố bền hơn, chẳng hạn
như carotenoid. Dung môi ưa nước như methanol đóng vai trò chính trong việc
chiết tách, mà không chịu ảnh hưởng của việc sử dụng các phương pháp gián đoạn
vật lý hay cơ học.
Hầu hết các phương pháp để đánh giá chlorophyll được tìm thấy đã được
phát triển để đánh giá mức độ dinh dưỡng của các vùng biển. Chlorophyll thường là
các tham số được sử dụng như các chỉ số dinh dưỡng, chủ yếu là do mối quan hệ
giữa hàm lượng các sắc tố này với số lượng của sinh khối tảo là khá trực tiếp. Sinh
khối tảo được liên kết mạnh mẽ để có thể nhìn thấy bằng chứng của hiện tượng phú
dưỡng. Định lượng chlorophyll a sẽ dễ dàng hơn sinh khối tảo của chính nó [3, 7]và
có thể được sử dụng như một phương pháp gián tiếp để xác định số lượng sinh khối
tảo.
Nhưng khó khăn của sự đánh giá này là sự biến đổi của hàm lượng
chlorophyll a trong mỗi loài (từ 0,1 đến 9,7% trọng lượng khô tế bào), cững như
việc lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp, có tính đến sự khác biệt về sức đề
kháng của vách tế bào. Trong thực tế, nguồn gốc của vật liệu sinh học quyết định
đến việc lựa chọn phương pháp tốt nhất.
17
Dung môi chiết

methanol acetone ethanol
Tương quan sử
Mackinney Porra Lichtenthaler
dụng
(1941) (1989) (1983)
Jeffrey Strickland Unesco

(1975) (1968) (1968)
Kaczmar
(2004)
Thời gian chiết

20 phút 24h 20 phút 24h, 24h 24h 24h 24h,
80 C 80 C
Tiêu chuẩn
(ST)
L ST ST ST ST
Siêu âm
(U)
U U U U U U U
Làm
đông/không
làm đông F F F F F
(F)
Làm
đông/không
làm với N2
lỏng
(FN)
Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu chlorophyll

18
Pepe và cộng sự [23] đã giới thiệu hai phương pháp chiết tách khác nhau cho
việc định lượng chlorophyll a. Một có liên quan đến ethanol và một là việc sử dụng
methanol lạnh. Sự khác biệt được quan sát vào năng suất chiết tách đã được giải
thích bởi các thành phần thực vật tảo phù du, theo các chủng vi tảo chiếm ưu thế.
Các phương pháp chiết tách bằng ethanol đã cho kết quả tốt hơn đối với chủng
chiếm ưu thế Chlorophyceae và Dinophyceae, trong khi phương pháp chiết tách
bằng methanol lại cho thấy là thuận lợi hơn đối với các chủng khác như
Bacillariophyceae. Điều này có nghĩa là khả năng chiết tách của dung môi phụ
thuộc vào khả năng hydrat hóa và tính thấm của thành tế bào vi tảo. Một phần từ sự
ảnh hưởng của cấu tạo thành tế bào trong sự đánh giá chlorophyll, sự biến đổi của
sắc tố trong quá trình chiết tách [21] cũng như sự ảnh hưởng của các sắc tố khác lên
sắc tố chlorophyll, có thể gây ra sự phức tạp trong việc xác định nó và dẫn đến sai
sót trong ước tính.
Louda và Monghkonsri đã so sánh ước tính quang phổ hàm lượng
chlorophyll với các kết quả thu được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Họ
kết luận rằng đánh giá quang phổ chlorophyll bằng việc sử dụng UNESCO [32] và
phương trình của Jeffrey và Humphrey [16] đã cho kết quả tuyệt vời. Những cộng
sự trong hai nghiên cứu này cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa hai
phương pháp được giới thiệu. Phân tích quang phổ là ít tốn kém và nhanh hơn nhiều
so với phân tích HPLC, là một công cụ tốt để đánh giá thường xuyên chlorophyll.
Nannochloropsis gaditana chỉ có chlorophyll a, do đó việc đánh giá tổng số
chlorophyll là tương đương với việc đánh giá cụ thể một loại sắc tố. Có một số
phương pháp có sẵn để định lượng chlorophyll. Các bước thông thường của việc
tiến hành dựa trên quang phổ bao gồm:
1. tách các tế bào vi tảo nổi trên mặt nước
2. chiết tách các sắc tố với một dung môi hữu cơ
3. sử dụng quang phổ để xác định nồng độ của chlorophyll trong chiết tách
19
Việc lựa chọn dung môi để thúc đẩy quá trình chiết tách là một vấn đề rất
quan trọng vì nó quyết định mức độ của mối quan hệ với các thành phần hóa học
của các chất được chiết tách. Ngoài khả năng hòa tan các hợp chất được chiết tách
và định lượng, dung môi còn đóng vai trò quan trọng trong ly giải tế bào. Dung môi
tích cực hơn có thể làm tăng năng suất chiết tách đối với cả vách tế bào cứng.
Methanol là dung môi đầu tiên được sử dụng để chiết tách, nhưng do độc tính của
nó, nó đã được thay thế bằng các dung môi khác. Theo khuyến nghị Edler [20], đến
năm 1995, việc đánh giá hàm lượng chlorophyll được thực hiện bằng cách sử dụng
phương pháp chiết tách với acetone. Kể từ đó, việc sử dụng ethanol như một dung
môi chiết tách đã được đề xuất.
Trong kĩ thuật phá vỡ vách tế bào, hai nhóm chính có thể được sử dụng là:
cơ học và phi cơ học. Trong nhóm đầu tiên, siêu âm được sử dụng trong một số các
phương pháp thử nghiệm. Trong số các kĩ thuật phi cơ học của ly giải tế bào, có quá
trình hóa học liên quan đến đến dung môi sử dụng và phương pháp vật lý, chẳng
hạn quá trình làm đông hay không làm đông [5]. Quá trình cuối cùng này có thể
được thực hiện chậm hay nhanh chóng (bằng cách sử dụng nitơ lỏng) để tạo ra một
cú sốc nhiệt lớn trong vật liệu sinh học, làm tăng hiệu quả phá vỡ thành tế bào.
Thời gian tiếp xúc giữa các hợp chất tế bào được chiết tách với dung môi có
thể là yếu tố quyết định đến số lượng sản phẩm chiết. Khi ly giải tế bào, nồng độ
của dung môi không nên quá cao để tránh gây thiệt hại đến các hợp chất cần được
chiết tách. Một khoảng thời gian chiết tách dài hơn sẽ làm tăng hiệu quả của quá
trình này.
Để đơn giản hóa việc so sánh các phương pháp khác nhau và việc xác định
các ảnh hưởng của mỗi bước trong một phương pháp chiết tách, các định nghĩa sau
đây được đề xuất:
- Một phương pháp phân tích được thực hiện bởi một tập hợp các hạng mục
khác nhau hoặc các thủ tục cần thiết để hoàn thành việc đánh giá các sắc tố được
nghiên cứu.
20
- Mỗi hạng mục hoặc thủ tục được mô tả bởi một thời gian cụ thể được rút
ngắn.
 Kết quả:
Sử dụng methanol như một dung môi chiết tách để định lượng nồng độ
chlorophyll a, kết quả thu được đối với Mackinney 1941, là tốt hơn so với Porra và
cộng sự. Theo cả hai nghiên cứu trên, một sự gia tăng trong năng suất chiết tách
chlorophyll a được quan sát thấy khi có sự tham gia của quá trình cơ học hoặc vật lý
để phá vỡ vách tế bào, quá trình đóng băng hay không đóng băng cho kết quả cao
nhất, còn siêu âm dẫn đến sự lây lan kết quả.
Khi sử dụng dung môi acetone, kết quả năng suất chiết tách chlorophyll a
thấp hơn nhiều so với mẫu sử dụng dung môi methanol. Đối với acetone, chỉ có các
mẫu làm đông/không làm đông mới cho kết quả gần với các mẫu thu được với
methanol, nhưng với tương quan kém thuận lợi của Porra và cộng sự. Nó được
khẳng định là một bước ly giải tế bào dẫn đến sự lây lan kết quả.
Khi các mẫu được áp dụng với các điều kiện như nhau, ba nghiên cứu này
được sử dụng cho kết quả gần giống nhau, chúng được mong đợi để tính đến sự
tương tự của các phương trình thực nghiệm liên quan.
Ethanol là dung môi ít được sử dụng cho việc chiết tách và định lượng các
sắc tố. Ở đây chỉ có Kaczmar đã được thử nghiệm. Kết quả thu được cho thấy
phương pháp này là khá tốt hơn so với mẫu thu được với acetone, nhưng chúng có
cùng bậc độ lớn với mẫu thu được với methanol. Trong trường hợp này, các kỹ
thuật phá vỡ vách tế bào không góp phần đáng kể vào việc chiết tách chlorophyll,
cho các giá trị tương tự nhau với nồng độ của nó. Thủ tục tiêu chuẩn này cho thấy
kết quả có sự phân tán, có lẽ là do sự không đồng nhất của các mẫu.
Theo các thí nghiệm trên, phương pháp tốt nhất cho việc đánh giá hàm lượng
chlorophyll a trong tế bào vi tảo biển, cho giá trị nồng độ sắc tố cao là việc sử dụng
methanol là dung môi chiêt tách đối với Mackinney 1941 hoặc ethanol đối với
Kaczmar.
21
Trong thực tế, phương pháp đầu tiên có thuận lợi hơn vì thời gian chiết ngắn
(20 phút), cho phép đánh giá hàm lượng chlorophyll trong cùng một ngày. Với
ethanol thì thời gian cần thiết để hoàn thành việc chiết tách là 24 giờ. Acetone
không cho thấy có hiệu quả để chiết tách chlorophyll trong loại vi tảo này, giá trị
thu được là rất thấp. Kết quả này không được mong đợi vì phương pháp sử dụng
acetone được biết đến là phương pháp phổ biến nhất để định lượng chlorophyll
trong nước như một tham số dinh dưỡng.
Một khía cạnh quan trọng khác được tính đến là khả năng đề kháng tốt của
vách tế bào Nannochloropsis gaditana. Đã có khẳng định rằng chủng vi tảo này có
một cấu trúc vững chắc mà rất khó để phá vỡ kể từ khi việc sử dụng phương pháp
phá vỡ vách tế bào giúp thuận lợi cho quá trình chiết tách chlorophyll được tiết lộ.
Có lẽ do hydrophylicity của nó, chỉ có một dung môi với khả năng chiết tách cao,
chẳng hạn như methanol mới cho hiệu quả và khả năng phục hồi chlorophyll nhanh.
Các kỹ thuật phá vỡ vách tế bào khác nhau đã được thử nghiệm trong phần
trước, mặc dù mục tiêu chính là đánh giá sự ảnh hưởng của các loại dung môi khác
nhau trong việc chiết tách chlorophyll từ vi tảo Nannochloropsis gaditana. Ở đây, sự
chú ý được đặt vào hiệu quả của kĩ thuật phá vỡ vách tế bào cơ học và vật lý, cũng
như ảnh hưởng của thời gian chiết tách đến năng suất.
 Kết luận:
Methanol là dung môi tách chiết được sử dụng, vì nó là dung môi giúp thu
được hàm lượng chlorophyll cao nhất từ vi tảo Nannochloropsis gaditana.
Methanol và ethanol được so sánh là hai dung môi chiết tách tốt, sử dụng
trong đánh giá chlorophyll trong sinh khối vi tảo. Cả hai đều cho thấy là tốt hơn so
với acetone, là dung môi không hiệu quả trong chiết tách và định lượng các sắc tố
từ các tế bào tự dưỡng. Trước đây, hầu hết các phương pháp đều sử dụng acetone
làm dung môi chiết tách, và họ đã chỉ ra như là phương pháp tốt để đánh giá mức độ
ding dưỡng vùng biển [3]. Tuy nhiên, việc này khẳng định dữ liệu Pepe và cộng sự
[23] và Dere và cộng sự, đã cho thấy rằng, đối với định lượng chlorophyll trong
Nannochloropsis gaditana (Eustigmatophyceae), dung môi tốt nhất là methanol.
22
Một phương pháp quang phổ để định lượng chlorophyll là sử dụng methanol với
Mackinney 1941, ngay cả không có sự có mặt của quá trình phá vỡ vách tế bào, có
lợi thế hơn so với việc sử dụng ethanol với Kaczmar, thời gian đánh giá ngắn (20
phút).
Tuy nhiên năng suất chiết tách chlorophyll với methanol có thể được cải
thiện bằng cách:
- Tăng thời gian chiết.
- Sử dụng Lichtenthaler 1983 thay vì Mackinney 1941
- Áp dụng 15 phút siêu âm
- Sử dụng các phương pháp làm đông/không làm đông với nitơ lỏng.
Ngoài ra còn có rất nhiều phương pháp tách chiết chlorophyll đã được công
bố. Một số tác gia Karsten, U.,Schumann, R., Haubner, N., & Klausch, S. (2005)
[18] đã dùng acetone 90% để trích ly chlorophyll trên tảo. Các tác gia này đã dùng
hạt micro-bead trong quá trình đồng hóa để tăng khả năng phá vách tế bào lên gấp 3
lần các phương pháp khác. Hiệu suất thu hồi chlorophyll trong nghiên cứu này đạt
39-85%.
Trong một nghiên cứu khác Ronen, R., & Galun, M, (1984) [29], các tác giả
đã dùng dimethyl sulfoxide ( DMSO) để chiết tách chlorophyll từ địa y (Ramalina
duriaei). Ronen cùng các cộng sự cũng sử dụng acetone 90% có bổ sung MgCO3 để
tách chlorophyll ở nhiệt độ lạnh và ánh sáng mờ.
Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu Nhật bản Irijama, K., Shiraki, M., &
Yoshiuma, M. (2011) [15] cũng tiến hành nghiên cứu tách chiết chlorophyll từ rau
chân vịt (spinach) bằng acetone, methanol trong điều kiện lạnh và tối.
1.4. Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm
 Cơ sở lý thuyết của phương pháp tách chiết chlorophyll
Do nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với
protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị
nước và hướng tới cấu trúc lipid của màng tilacoit, nên phân tử chlorophyll chủ yếu
hòa tan trong các dung môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt chlorophyll ra khỏi lá,
23
người ta không dùng ether petrol hay benzen mà dùng cồn hoặc acetone pha với
một ít nước để tách được hết phân tử chlorophyll từ lá. Các sắc tố thuộc nhóm
carotenoit cũng được chiết tách theo phương pháp này.
Chlorophyll tách rời khỏi phức hệ sắc tố vẫn có khả năng hoạt động quang
hóa, tức là vẫn có khả năng bị kích thích bởi ánh sáng và khi đó có thể làm được vai
trò chuyển H+ và e trung gian. Hiện tượng này gọi là tính chất cảm quang của
chlorophyll.
1.4.1. Các phương pháp chiết tách chlorophyll
1.4.1.1. Chiết xuất với phương pháp siêu âm
Khi áp dụng âm thanh vào trong chất lỏng, các sóng âm thanh sẽ được tạo
thành và di chuyển trong nước, thay đổi đều từ tình trạng áp xuất cao qua áp xuất
thấp. Ở giai đoạn áp xuất thấp, trong nước hình thành các bọt chân không chứa
nhiều năng lượng. Khi bọt chân không đủ lớn chúng sẽ nổ bùng vào bên trong
(implode) trong giai đoạn áp xuất cao. Khi nổ, các lực có năng lượng cao được giải
phóng và sẽ tạo ra các khoảng không bị ép. Tại vùng bị phát nổ sẽ hình thành áp
xuất rất cao, các lực ép sẽ làm vỡ tế bào và tạo điều kiện trao đổi chất dễ dàng hơn.
Hiệu ứng này hỗ trợ sự chiết xuất chất lipide của tảo được dễ dàng hơn.
Nếu áp dụng phương pháp chiết xuất bằng enzyme, thì lực áp siêu âm có thể
hỗ trợ enzyme thâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng. Qua đó, giải pháp này sẽ
cho ra kết quả tốt hơn và nước sẽ đóng vai trò hòa tan như các dung dịch khác trong
khi enzyme phân hủy các thành tế bào.
1.4.1.2. Chiết soxhlet
Bộ chiết soxhlet là một loại máy móc ở phòng thí nghiệm được phát minh
năm 1879 bởi Franz Von Soxhlet [10]. Ban đầu nó được thiết kế để chiết tách lipid
từ vật liệu rắn. Thông thường bộ chiết soxhlet chỉ cần được yêu cầu là nơi để hòa
tan các hợp chất mong muốn vào dung môi, và không hòa tan các tạp chất vào dung
môi đó. Nếu các hợp chất mong muốn có mức hòa tan đáng kể vào trong dung môi
thì sau đó chỉ cần một quá trình lọc đơn giản là có thể phân tách các hợp chất từ các
chất không hòa tan.
24
Thông thường thì một loại nguyên liệu rắn có chứa một vài hợp chất cần tách
chiết, sẽ được gói vào trong một loại giấy được làm từ giấy lọc dày, rồi được nạp
vào buồng chính của bộ soxhlet (bình trụ chiết).
 Nguyên tắc hoạt động
Bộ soxhlet sẽ được đặt vào một bình có chứa dung môi để chiết tách. Sau đó,
bộ soxhlet được lắp với một bình ngưng. Dung môi được làm nóng để bay hơi. Hơi
dung môi sẽ đi lên theo ống dẫn hơi và tràn vào bình trụ chiết. Bình ngưng đảm bảo
hơi dung môi được làm mát, ngưng tụ rồi rơi lại xuống bình trụ chiết chứa gói mẫu.
Bình trụ chiết chứa mẫu sẽ từ từ được làm đầy bởi dung môi ấm, một vài hợp
chất mong muốn sẽ được hòa tan vào dung môi ấm. Khi bình trụ chiết gần như được
làm đầy bởi dung môi, thì tự động dung môi sẽ theo ống xi-phông chạy xuống trở
lại bình chứa dung môi. Chu kì này được cho phép lặp lại nhiều lần trong giờ hoặc
trong ngày.
Trong mỗi chu kì, một phần các hợp chất không bay hơi sẽ hòa tan vào dung
môi. Sau nhiều chu kì, các hợp chất mong muốn sẽ được tập trung vào bình chưng
cất.
1.4.1.3. Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn
 Nguyên tắc
Bất kỳ dung môi nào cũng sẽ ở trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ
và áp suất trên giá trị tới hạn.
Đối với mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ
tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng và khí. Nếu nén chất khí
tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở
đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà
rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật
chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là
dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng.
25
Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ, áp suất tới
hạn của nó (trên TC = 310C, PC = 73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới
hạn.
Tại trạng thái này CO2 mang hai đặc tính: Đặc tính phân tách của quá trình
trích ly và đặc tính phân tách của quá trình chưng cất.
Nó có khả năng hoà tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3
dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần giảm áp suất
thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được
thoát ra ở bình hứng.
Ở mỗi điều kiện nhiệt độ, áp suất khác nhau sẽ tương ứng với mỗi một đối
tượng cần chiết tách khác nhau.
 Ưu điểm của phương pháp so với các phương pháp truyền thống
 Sản phẩm có chất lượng cao: đối với tinh dầu thì có màu, mùi tự nhiên,
không lẫn nhiều thành phần không mong muốn, với các hợp chất tự nhiên thì tách
được các chất có hoạt tính cao.
 Không còn lượng dung môi dư
 Tách các hoạt chất với hàm lượng cao
 Không gây ô nhiễm môi trường.
 Là một phương pháp có công nghệ cao và an toàn với các sản phẩm tự nhiên
1.4.1.4. Một số loại dung môi chiết chlorophyll
 Acetone
Dung môi acetone được sử dụng rộng rãi trong cả hai phương pháp trắc
quang và huỳnh quang. Đối với phương pháp trắc quang cần ly tâm để loại bỏ ảnh
hưởng của độ đục của dung dịch, nhưng với phương pháp huỳnh quang thì có thể bỏ
qua vì kĩ thuật này không nhạy với độ đục ở mức độ bình thường. Nếu mẫu trắng
(blank) có giá trị đo huỳnh quang cao hoặc không thể xét giá trị bằng 0 cho máy
huỳnh quang bằng một dung môi acetone trắng, thì có nghĩa là acetone đã bị nhiễm
bẩn. Sự nhiễm bẩn thông thường là do sự sánh dầu từ quá trình chế tạo các bình
chứa kim loại.
26
 Methanol
Methanol có hiệu quả hơn acetone trong một vài trường hợp. Phương pháp
này có thể đo huỳnh quang trực tiếp khi không cần độ chính xác cao và hàm lượng
pheophitin thấp. Khi cần độ chính xác cao hơn và pheophitin có mặt với lượng đáng
kể, dịch chiết methanol được làm khô và chuyển sang acetone 90%. Phổ pheophitin
a và b khá nhạy với pH của môi trường trong dung môi methanol nhưng không
nhạy trong dung môi acetone 90%. Nếu có thể loại bỏ ảnh hưởng của pH thì có thể
hiệu chỉnh trong quá trình tính toán nhưng không thể. Kết quả của những ảnh hưởng
này là những biểu hiện không theo qui tắc nào trong các phép xác định trắc quang
cũng như phương pháp đo huỳnh quang.
 DMSO (dimethyl sunfoxide)
Dung môi này có hiệu quả khi ngâm chiết các loại tảo nâu, một loại không bị
ngâm chiết bởi các dung môi khác. Dung môi này cho phép ngâm chiết hầu như
hoàn toàn các loại tảo, chúng không để lại một chút sắc tố nào trong bã thải. Dường
như DMSO phá vỡ các thể hạt bên trong và cấu trúc màng của tảo nâu và tảo lam.
1.4.2. Các phương pháp xác định chlorophyll
Có 4 phương pháp xác định chlorophyll
+ Phương pháp trắc quang.
+ Phương pháp huỳnh quang.
+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng ( HPLC).
+ Phương pháp điện hóa.
Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn phương pháp trắc quang, do
đó, đối với các mẫu có hàm lượng chlorophyll nhỏ, phương pháp huỳnh quang sẽ
ưu tiên được sử dụng.
HPLC là thiết bị phức tạp hơn nhưng vẫn dựa trên nguyên tắc của phương
pháp huỳnh quang và trắc quang.
Phương pháp điện hóa xác định chlorophyll a bằng cực phổ tuần hoàn trực
tiếp thông qua điện cực màng carbon (SPCE) thu được mũi đơn thuận nghịch oxy
hóa tại cực dương ở EV = +400 mV, điện cực so sánh là Ag/AgCl. Theo kết quả
27
nghiên cứu cho thấy là chlorophyll a hấp thụ trên bề mặt màng SPCE. Hiện tượng
hút bám này cho phép phát triển phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll a
dựa trên sự trao đổi trung gian bằng cực phổ tích góp hòa tan (AdSV). Phương thức
cuối cùng để tối ưu phương pháp là khảo sát pH của dung dịch đệm tích góp, thời
gian tích góp và lượng acetone của đệm tích góp. Sử dụng phương pháp tối ưu này
để xác định hàm lượng chlorophyll a trong dung dịch đệm phosphate với nồng độ
khoảng 0,014-2,24µM.
1.4.2.1. Phương pháp huỳnh quang
a. Phương pháp đo trực tiếp: phương pháp này cho phép xác định chlorophyll trong
phiêu sinh vật mà không cần chiết hay xử lí hóa học.
Phương pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách:
- Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trường.
- Đo trên mẫu nước riêng lẻ tại hiện trường hoặc phòng thí nghiệm.
Thiết bị cho phương pháp đo trực tiếp này là máy đo huỳnh quang hiện
trường 10-AU hay máy huỳnh quang cho phòng thí nghiệm DT-700.
b. Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp):
Các phép đo huỳnh quang trong dung môi ngâm chiết từ các tế bào bị phá vỡ
thường được dùng để xác định lượng tuyệt đối của chlorophyll hiện diện và lượng
sản phẩm phân hủy chính pheophytin (chlorophyll bị mất ion Mg).
Hầu hết các thí nghiệm thông thường, chất liệu được quan tâm là chlorophyll
a và pheophitin a.
 Lưu ý trong quá trình chiết tách chlorophyll:
Vấn đề quan trọng trong xác định chlorophyll bằng phương pháp ngâm chiết
luôn là việc tách định lượng chlorophyll ra khỏi tế bào. Có 3 hệ dung môi dùng
trong toàn bộ các thí nghiệm là: acetone 90%, methanol và DMSO (Dimethyl
sulfoxide). Điều cần lưu ý là dù dùng bất kì phương pháp nào thì chlorophyll đều
không ổn định với chất acid và ánh sáng. Lượng vết acid sẽ làm cho chlorophyll
chuyển thành pheophitin tương ứng. Vì vậy, dụng cụ phải được trung hòa đảm bảo
không có acid. Ánh sáng mặt trời hay ánh sáng huỳnh quang sẽ làm chlorophyll
28
phân hủy rất nhanh. Do đó cần tiến hành thí nghiệm ở ánh sáng dịu và dụng cụ chứa
cản sáng. Nên nghiền mẫu trước khi chiết. Đã có nghiên cứu cho thấy rằng nghiền
mẫu trước khi chiết sẽ làm tăng lượng chlorophyll tách được từ 5 – 60%. Một số thử
nghiệm sử dụng dung môi DMSO thì không cần nghiền.
1.4.2.2. Phương pháp trắc quang
Nguyên tắc: ba dạng chlorophyll a, b, c có thể ngâm chiết bằng acetone. Mỗi
loại có một phổ hấp thu ánh sáng đặc trưng với peak hấp thu riêng. Phần ngâm chiết
acetone được phân tích trên máy so màu ở ba peak này. Chiều cao peak biểu thị
nồng độ chlorophyll.
Phép xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc quang bao gồm các quá
trình: lọc, phá vỡ tế bào và ngâm chiết chlorophyll a sau đó đo độ hấp thụ.
1.4.2.3. Ưu nhược điểm trong việc xác định chlorophyll a bằng phương pháp trắc
quang và huỳnh quang:
Độ nhạy: phương pháp huỳnh quang có độ nhạy lớn hơn 1000 lần. Xử lí mẫu
cho phương pháp huỳnh quang dùng kĩ thuật ngâm chiết tương tự như phương pháp
trắc quang nhưng có độ nhạy cao hơn và lượng mẫu sử dụng ít hơn.
Tốc độ: phương pháp trắc quang phải đo mẫu ở một vài bước sóng, trong khi
phương pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bước sóng.
Chọn bước sóng đo: với máy huỳnh quang kết quả đo không phụ thuộc vào
việc chọn bước sóng.
Cuvet: phương pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng
như sự tương thích của cuvet.
1.5. Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken
1.5.1. Cơ sở lý thuyết [1]
Ưu điểm
- Làm giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết, do đó sẽ làm giảm thời
gian tiến hành thí nghiệm và chi phí vật chất.
- Nhận được mô hình toán học thực nghiệm do đó đánh giá được vai trò của
các tác động qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu.
29
- Cho phép xác định điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một
cách khá chính xác bằng các công cụ toán học thay cho cách giải gần đúng, tìm tối
ưu cục bộ như ở các thí nghiệm theo phương pháp cổ điển.
Sử dụng thiết kế Behnken-Box trong thống kê để bố trí thí nghiệm tối ưu
hóa. Thiết kế Behnken-Box là thiết kế thử nghiệm cho phương pháp bề mặt phản
ứng, được nghĩ ra bởi George EP Box và Donald Behnken vào năm 1960, nhằm đạt
được các mục tiêu sau đây:
 Mỗi yếu tố, hoặc biến độc lập, được đặt tại một trong ba giá trị cách đều nhau.
(Ít nhất ba cấp độ là cần thiết cho mục tiêu tiếp theo).
 Thiết kế nên vừa đủ để phù hợp với một mô hình bậc hai, đó là có chứa các giới
hạn bình phương và các sản phẩm của hai yếu tố.
 Tỷ lệ của số lượng các điểm thử nghiệm với số lượng các hệ số trong mô hình
bậc hai nên hợp lý (trên thực tế, các thiết kế thường giữ nó trong khoảng từ 1,5
đến 2,6).
 Phương sai ước tính nên nhiều hoặc ít, chỉ phụ thuộc vào khoảng cách từ trung
tâm ( điều này đạt được sự chính xác cho các thiết kế với 4 và 7 yếu tố), không
nên thay đổi quá nhiều bên trong khối lập phương nhỏ nhất chứa các điểm thử
nghiệm.
 Thiết kế với 7 yếu tố được tìm thấy đầu tiên trong khi tìm kiếm một thiết kế tài
sản mong muốn liên quan đến phương sai ước lượng, và sau đó các thiết kế
tương tự đã được tìm ra cho số các yếu tố khác.
 Mỗi thiết kế có thể được xem như là một sự kết hợp của một thiết kế giai thừa
bậc hai (đầy đủ hoặc phân đoạn) với một thiết kế khối không đầy đủ. Trong mỗi
khối, một số lượng nhất định các yếu tố được đặt thông qua tất cả các kết hợp
cho thiết kế giai thừa, trong khi các yếu tố khác được giữ ở các giá trị trung tâm.
 Thiết kế cho 8 yếu tố không có trong giấy tờ gốc. Thiết kế cho số lượng các yếu
tố khác cũng đã được phát minh ra (ít nhất lên đến 21). Một thiết kế cho 16 yếu
tố tồn tại chỉ có 256 điểm giai thừa. Hầu hết những thiết kế này có thể được chia
thành các nhóm (các khối), mỗi mô hình sẽ có một giới hạn hằng số khác nhau,
30
nói một cách khác là các hằng số khối sẽ không tương quan với các hệ số khác
[11].
1.5.2. Các bước tiến hành
Bước 1: Chọn thông số nghiên cứu:
Diễn biến quá trình

(Hộp đen)
Yếu tố đầu vào Yếu tố đầu ra
(Biến tiên đoán) (Hàm mục tiêu)
(Yếu tố ảnh hưởng) (Biến đáp ứng)
X Y
- Phải chọn hàm mục tiêu.
- Chọn biến tiên đoán.
Phân tích từ các biến tiên đoán để chọn ra các yếu tố ảnh hưởng chính, loại
bỏ những yếu tố không cần thiết nhằm đảm bảo tính khả thi và tính hiệu quả của
thực nghiệm. Những biến tiên đoán này phải điều khiển, kiểm tra, khống chế, kiểm
soát được nó.
Bước 2: Xác định miền thí nghiệm
Miền thí nghiệm là khu vực trong đó các nhân tố biến thiên hay nói cách
khác đó là miền mà chúng ta tiến hành thí nghiệm.
Để xác định miền thí nghiệm có 3 cơ sở:
+ Dựa vào lý thuyết
+ Tham khảo các công trình nghiên cứu đã công bố
+ Làm thí nghiệm thăm dò
Bước 3: Bố trí thí nghiệm
(Phương pháp thực nghiệm theo mô hình Box - Behnken)
*Lập ma trận thí nghiệm
N U1 U2 ... Y
1
31
... ...
Bước 4: Chuyển biến thực qua biến mã

Umin U0 Umax
U (biến thực)
U
X (biến mã)
-1 1
(U0: là giá trị trung bình)

U  U0
X , X   1,1 .
U
*Lập ma trận biến mã
N X1 X2 ... Y
... ...
Bước 5: Kiểm định hệ số và phương trình

Bước 6: Tối ưu hóa
32
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
33
2.1. Nguyên liệu:

Lá bắp: sử dụng lá bắp tươi thu được từ cây bắp được trồng tại Diên Khánh-
Khánh Hòa. Sau khi thu nhận sử dụng lá bắp làm nguyên liệu cho quá trình chiết rút
chlorophyll.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp định lượng
 Xác định hàm lượng chlorophyll
Đối với dung môi methanol, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 665nm
(Mackinney 1941), 665nm và 652nm (Porra và cộng sự) hoặc ở hai bước sóng
470nm và 666nm (Lichtenthaler 1941). Mẫu trắng trắng (blank) là mẫu chỉ chứa
dung môi ở nồng độ tương ứng. Nồng độ chlorophyll được tính theo công thức.
Mackinney: µg chlorophyll/ ml dd = 13,43A665v/ (lV) [13]
Porra và cộng sự: µg chlorophyll/ ml dd = (16,29A665- 8,54A652)v/ (lV) [37]
Lichtenthaler: µg chlorophyll/ ml dd = (1000A470 – 44,76A666)/ 221 [21]
Đối với dung môi acetone, mẫu được đo độ hấp thu ở các bước sóng 664nm,
647nm, 630nm (Jeffrey và Humphrey 1975) hoặc ở các bước sóng 665nm, 645nm,
630nm (Strickland và Parson 1968) hoặc ở các bước sóng 663nm, 645nm, 630nm
(UNESCO 1966). Mẫu trắng là mẫu chỉ chứa dung môi ở nồng độ tương ứng. Nồng
độ chlorophyll được tính theo công thức:
Jeffrey and Humphrey:
µg chlorophyll/ml dd = (11,85A664-1,54A647-0,08A630)v/(lV) [17]
Strickland and Parson:
µg chlorophyll/ ml dd = (11,66A665- 1,31A645- 0,14A630)v/(lV) [31]
UNESCO:
Đối với dung môi ethanol, mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 663nm,
645nm, 630nm. Mẫu trắng là mẫu chỉ chứa dung môi ở nồng độ nhất định. Nồng độ
chlorophyll được tính theo công thức:
34
Kaczmar:
Trong đó: v: là thể tích dịch chiết sau khi lọc (ml)
l: là bề dày của cuvet (l=1cm)
V: là thể tích mẫu đem đi đo độ hấp thụ (V=3ml)
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
Theo mô tả bởi Prieto và cộng sự (1999), lấy 100µl mẫu bổ sung 900µl nước
cất và thêm 3 ml dung dịch A (H2SO4 0,6 M, sodium phosphate 28 mM and
ammonium Molybdate 4 mM). Hỗn hợp được giữ 90 phút ở 950C. Sau đó đo ở
bước sóng 695 nm với chất chuẩn là acid ascorbic.
Cách pha đường chuẩn là pha dung dịch acid ascorbic 1mg/1ml, sau đó lấy
30µl, 50µl, 80µl, 100µl rồi bổ sung nước cất tương ứng cho đủ 1ml sau đó thêm
3ml dd A vào và giữ 90 phút ở 950C. Sau đó đo ở bước sóng 695nm. Với kết quả đo
được thì vẽ đường chuẩn đưa ra phương trình. So sánh kết quả mẫu chiết với đường
chuẩn thì có hoạt tính tương ứng mg acid ascorbic [27].
2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu
Xử lý số liệu bất thường bằng Dulcan. Phân tích thống kê, ANOVA và hồi
quy bằng phần mềm Excell. Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa bằng phần mềm
Design Expert version 8 trial. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần (n=3).
35
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
Lá bắp
Rửa sạch
Xay nhỏ
Chiết
Xác định:
Dịch Chlorophyll thô Hàm lượng chlorophyll
Hoạt tính chống oxy hóa
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Chuẩn bị mẫu:
Lá bắp tươi rửa sạch, để ráo, lấy 8,5kg lá bắp tươi cắt nhỏ.
Cho vào máy xay cùng với một lượng MgCO3 chiếm khoảng 0,05% so với lá
bắp. Xay nhiều lần, mỗi lần xay với thời gian ngắn khoảng từ 5-7 giây để tránh sự
gia tăng nhiệt độ, gây ảnh hưởng đến thành phần chlorophyll.
Mẫu đồng nhất trên được bảo quản trong ngăn lạnh để sử dụng cho tất cả các
thí nghiệm chiết.
Chiết:
Cân chính xác 100g mẫu đã chuẩn bị vào cốc thủy tinh được bọc tối, thêm
dung môi chiết với lượng xác định, bổ sung MgCO3 với lượng chiếm khoảng 0,05%
so với mẫu chiết, cho mẫu vào bể điều nhiệt giúp cho sự ổn định nhiệt độ chiết để
tiến hành ngâm chiết. Sau khoảng thời gian xác định, mẫu chiết được đem đi lọc
bằng giấy lọc.
Dịch chiết sau lọc được tiến hành xác định hoạt tính chống oxy hóa và hàm
lượng chlorophyll.
36
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi chiết
Nồng độ dung môi 80%

Tỷ lệ DM:NL 25:1
Thời gian: 24h
Chiết MgCO3: 0,05%
Nhiệt độ chiết: 600C
Aceton Methanol Ethanol
Lọc
Đánh giá:
Hàm lượng chlorophyll
Chọn loại DM
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi chiết
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu lấy 100g lá đã xay nhỏ cho vào lọ chiết tối màu.
Mẫu 1: bổ sung dung môi acetone nồng độ 100% với tỉ lệ giữa nguyên liệu
và dung môi là 25:1.
Mẫu 2, mẫu 3 bổ sung dung môi lần lượt là methanol và ethanol với nồng độ
và tỉ lệ tương tự.
Sau đó cho vào cả 3 mẫu một lượng MgCO3 nhất định là 0,05%, lắc đều rồi
tiến hành ngâm chiết trong bể ổn nhiệt ở chung một điều kiện: ở nhiệt độ 600C trong
thời gian 24h.
37
2.2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung môi chiết
Chiết
Tỉ lệ DM/NL: 25/1
Thời gian: 24h
70% 80% 96%
Lọc
Đánh giá:
Chọn nồng độ dung môi chiết
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung môi chiết
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu lấy 100g lá đã xay nhỏ cho vào lọ chiết tối màu.
Mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3 bổ sung dung môi đã chọn với nồng độ lần lượt là
70%, 80% và 96% với tỉ lệ dung môi: nguyên liệu là 25/1.
Sau đó lắc đều rồi ngâm chiết trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C trong 24h.
38
2.2.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/nguyên liệu
Chiết

Thời gian: 24h
10/1 20/1 30/1 40/1 50/1
Lọc
Đánh giá:
Chọn tỉ dung môi/nguyên liệu

ng môi
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/nguyên liệu
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu lấy 100g lá bắp cho vào lọ chiết tối màu.
Mỗi mẫu tiến hành bổ sung dung môi với nồng độ đã chọn theo các tỉ lệ
dung môi/nguyên liệu tương ứng sau: 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1.
Sau đó lắc đều rồi ngâm chiết trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C trong 24h.
39
2.2.4.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
Chiết
U
Nhiệt độ 600C
0,5h 1h 1,5h 2h 2,5h 8h 16h 24h 40h 48h
Lọc
Đánh giá:
Chọn thời gian chiết
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
Cách tiến hành
Mỗi mẫu tiến hành bổ sung dung môi với nồng độ và tỉ lệ đã chọn.
Sau đó lắc đều rồi tiến hành ngâm chiết trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C
trong thời gian các khoảng khác nhau, lần lượt là 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 2,5h, 8h, 16h,
24h, 32h, 48h.
40
2.2.4.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết
Chiết
Nhiệt độ 400C 500C 600C 700C 800C

phòng
Lọc
Đánh giá:
Chọn nhiệt độ chiết
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết

Cách tiến hành:
Mỗi mẫu tiến hành bổ sung dung môi với nồng độ và tỉ lệ đã chọn.
Sau đó cho vào cả 6 mẫu một lượng MgCO3 nhất định là 0,05%, lắc đều rồi
tiến hành ngâm chiết trong bể ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau, lần lượt là nhiệt độ
phòng (300C), 400C, 500C, 600C, 700C và 800C trong thời gian đã chọn.
41
2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa

Sau khi khảo sát một số thông số ảnh hưởng lên công đoạn chiết dịch
chlorophyll chống oxy hóa, các thí nghiệm tối ưu hóa được tiến hành bố trí và
nghiên cứu. Bảng 2.1 và 2.2 sau đây sẽ thể hiện biến mã và biến thực trong quá
trình nghiên cứu.
Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực
Mức biến mã
Yếu tố đầu vào
-1 0 1
0
Nhiệt độ chiết ( C) (X1)
50 65 80
Thời gian chiết (giờ) (X2)
8 16 24
Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu (v/w)
20 30 40
(X3)
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực sử dụng mô hình
Box-Behnken
Stt Thí
U1 U2 U3 X1 X2 X3
nghiệm
1 -1 -1 0 12 50 8 1:30
2 1 -1 0 13 80 8 1:30
3 -1 1 0 9 50 24 1:30
4 1 1 0 11 80 24 1:30
5 -1 0 -1 4 50 16 1:20
6 1 0 -1 14 80 16 1:20
7 -1 0 1 8 50 16 1:40
8 1 0 1 15 80 16 1:40
9 0 -1 -1 3 65 8 1:20
10 0 1 -1 7 65 24 1:20
11 0 -1 1 6 65 8 1:40
12 0 1 1 2 65 24 1:40
13 0 0 0 10 65 16 1:30
14 0 0 0 1 65 16 1:30
15 0 0 0 5 65 16 1:30
42
2.3. Dụng cụ và hóa chất

 Dụng cụ:
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ sẵn có tại phòng thí nghiệm Công nghệ Thực
phẩm
+ lọ thủy tinh (được bọc tối), có nắp đậy
+ ống đong
+ ống nghiệm và giá đựng ống nghiệm
+ máy so màu UV-VIS
+ bể ổn nhiệt
+ giấy lọc
 Hóa chất:
+ MgCO3 dạng bột
+ các loại dung môi: acetone, ethanol, methanol
+ acid ascorbic
+ H2SO4 0,6M
+ sodium phosphate
+ ammonium molybdate
+ nước cất
Các hóa chất sử dụng trong đồ án đều là các hóa chất tinh khiết do Trung
Quốc sản xuất.
43
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
44
3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu sử dụng 100g lá bắp để nghiên cứu
chiết rút chlorophyll bằng các dung môi khác nhau.
Mẫu 1 chiết rút bằng methanol, mẫu 2 bằng acetone, mẫu 3 bằng ethanol.
Quá trình chiết rút được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C trong khoảng
thời gian 24 giờ. Sau khi chiết rút đem đi lọc, sau đó tiến hành đánh giá hàm lượng
chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết chlorophyll thu nhận được.
Kết quả được thể hiện ở hình 3.1 và 3.2.
211
hàmlượng chlorophyll (microgam)
y = 2,5045x + 202,91
210 2
R = 0,9953
209
208
207
206
205
204
203
202
Methanol Acetone Ethanol
Loại dung môi
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng chlorophyll
Hoạt tính chống oxy hóa ( mg
16,2
acid ascorbic/100g NL)
16,1
16
15,9
15,8
15,7
15,6
Methanol Acetone Ethanol
Loại dung môi
Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll
45
Từ hình 3.1 và 3.2 cho thấy, hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy
hóa chịu ảnh hưởng của loại dung môi chiết. Loại dung môi chiết khác nhau thì hàm
lượng chlorophyll thu được khác nhau. Hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll, khi khảo sát với hệ dung môi, tăng dần theo trình tự sau: methanol/
acetone/ ethanol. Quy luật tăng dần này tuân theo phương trình bậc 1 với độ tương
quan rất mạnh. Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa dung môi chiết với hàm
lượng chlorophyll như sau:
Y = 2,0545x + 202,91 với R2 = 0,9953
Phương trình liên hệ giữa hoạt tính chống oxy hóa và dung môi như sau:
Y = 0,175x +15,647 với R2 = 0,9997
Theo một số nghiên cứu trước đây, methanol là dung môi đầu tiên được sử
dụng để chiết tách chlorophyll, nhưng do độc tính của methanol nên chúng đã được
thay thế bằng các loại dung môi khác. Theo khuyến nghị Edler [20], đến năm 1995,
việc đánh giá hàm lượng chlorophyll được thực hiện bằng cách sử dụng các loại
dung môi khác và việc sử dụng ethanol như một dung môi chiết tách đã được gợi ý
đến.
Các nghiên cứu về cấu tạo của chlorophyll cho thấy, tại vị trí C7 của
chlorophyll b là nhóm formyl (-CHO) [35]. Như đã biết, acetone có công thức phân
tử là (CH3)2CO, trong khi đó, methanol ( CH3OH) và ethanol ( C2H5OH) là hai
dung môi có chứa nhóm methyl, ethyl ( -CH2) và nhóm hydroxyl (-OH) rất dễ dàng
chuyển sang nhóm formyl, làm tăng hàm lượng chlorophyll b, giúp làm tăng lượng
chlorophyll tổng số. Từ đó, hoạt tính chống oxy hóa của chúng cũng tăng lên. Mặt
khác, khả năng hòa tan của chlorophyll khác nhau dựa trên loại dung môi khác nhau
cũng dẫn đến sự khác biệt trong kết quả thí nghiệm trên.
Kết quả nghiên cứu khảo sát hệ dung môi này là hoàn toàn phù hợp với các
nghiên cứu trước đây. Trên cơ sở đó cùng với tính an toàn, hiệu quả kinh tế, đồ án
quyết định chọn ethanol là dung môi chiết chlorophyll từ lá bắp.
46
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống
oxy hóa của chlorophyll
Sau khi chọn ethanol làm dung môi chiết, tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu
xác định nồng độ của ethanol phù hợp cho quá trình chiết. Tiến hành 3 mẫu thí
nghiệm chiết rút chlorophyll từ lá bắp bằng ethanol với ba nồng độ ethanol khác
nhau: 70%, 80% và 96%. Các thí nghiệm đều sử dụng 100g lá bắp, chiết rút trong
bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C trong thời gian 24 giờ. Sau khi chiết rút đem đi lọc, sau
đó tiến hành đánh giá hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa của dịch
chiết chlorophyll thu nhận được. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3 và 3.4.
250
y = 92,852x - 82,465
Hàmlượngchlorophyll
2
R = 0,9291
200
(microgam)
150
100
50
0
70% 80% 96%
Nồng độ ethanol
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng chlorophyll
18
y = 5,6035x - 2,3057
Hoạt tínhchốngoxyhóa(mgacid
16 2
R = 0,782
14
ascorbic/100gNL)
12
10
8
6
4
2
0
70% 80% 96%
Nồng độ dung môi
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll
47
Nồng độ ethanol ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng chlorophyll, hoạt tính
chống oxy hóa dịch chiết, hàm lượng các chất hòa tan đi kèm trong quá trình chiết,
cũng như độ ổn định của dịch chiết theo thời gian. Ví dụ: làm tăng quá trình hòa tan
của các polysaccharide hòa tan trong nước, khi đó sẽ tạo liên kết bền hoặc không
bền với chlorophyll.
Thực nghiệm ở hình 3.3 cho thấy, sử dụng ethanol ở nồng độ 96% thu được
hàm lượng chlorophyll cao hơn so với các nồng độ khác và chúng tuân theo phương
trình hồi quy tuyến tính bậc 1 với độ tương quan R2 = 0,9291, phương trình hồi quy
như sau: Y = 92,852x – 82,465
Kết quả thực nghiệm ở hình 3.4 cho thấy, sử dụng ethanol ở nồng độ 96%
thu được dịch chống oxy hóa từ lá bắp cao hơn so với các nồng độ khác, và chúng
tuân theo phương trình hồi quy tuyến tính bậc 1 với R2 = 0,782, phương trình hồi
quy như sau: Y = 5,6035x –2,3057
Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết và thực nghiệm trước đây, vì
về bản chất chlorophyll không tan trong nước, chỉ tan trong dung môi hữu cơ như
cồn, acetone, DMSO, nên hàm lượng chlorophyll chiết được khi dùng ethanol 96%
là cao nhất.
Như vậy căn cứ theo kết quả thu được, hàm lượng và hoạt tính chống oxy
hóa của chlorophyll có sự thay đổi theo nồng độ dung môi sử dụng. Ethanol 96% là
nồng độ dung môi cho kết quả tốt nhất. Theo một số nghiên cứu trước đây (Barrett
& Jeffrey, 1964), enzyme chlorophyllase vẫn còn giữ một phần hoạt tính ở các nồng
độ dung môi khác nhau, làm cho chlorophyll bị chuyển sang các dạng đồng phân
khác. Có thể chính hoạt động của enzyme này trong quá trình chiết tách (giai đoạn
xay mẫu, ngâm chiết trong dung môi ở các nồng độ khác nhau), đã dẫn đến sự khác
biệt về lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll.
Phân tích sự tương quan giữa hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy
hóa thấy rằng, chúng tương tác với nhau rất mạnh và chặt chẽ với R2 = 0,95. Chúng
tương tác với nhau thông qua phương trình:
Y = 0,064x + 2,268
48
3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính
Sau khi chọn ethanol 96% làm dung môi chiết, tôi tiếp tục tiến hành nghiên
cứu xác định tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu phù hợp cho quá trình chiết. Tiến hành 5
mẫu thí nghiệm chiết rút chlorophyll từ lá bắp bằng ethanol 96% với 5 tỉ lệ dung
môi/ nguyên liệu lần lượt là 10/1, 20/1, 30/1, 40/1, 50/1. Các thí nghiệm đều sử
dụng 100g lá bắp, chiết rút trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C trong thời gian 24 giờ.
Sau khi chiết rút đem đi lọc, sau đó tiến hành đánh giá hàm lượng chlorophyll và
hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết chlorophyll thu nhận được. Kết quả được thể
hiện ở hình 3.5 và 3.6.
2
500 y = -58,42x + 410,87x - 329,42
2
R = 0,8137
450
hàm lượng chlorophyll (microgam)
400
350
300
250
200
150
100
50
0
10:01 20:01 30:01 40:01 50:01
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỉ DM/ NL đến hàm lượng chlorophyll
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ DM/ NL lên công đoạn chiết, thấy có sự
khác biệt lớn so với các nghiên cứu về loại và nồng độ dung môi. Hàm lượng
chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa tương quan với nhau rất mạnh theo phương
trình bậc 1:
Y = 35,08x – 147,7 với R2 = 0,98
49
20 2
y = -1,7929x + 12,365x - 5,736
Hoạt tính chống oxy hóa (mg acid

18 2
R = 0,8563
16
ascorbic/100g NL) 14
12
10
8
6
4
2
0
10:01 20:01 30:01 40:01 50:01
Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ DM/ NL đến hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll
Căn cứ vào kết quả phân tích thống kê thu được và hình 3.5 và 3.6, tỉ lệ giữa
dung môi/ nguyên liệu có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết tách chlorophyll.
Hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll đạt cực đại tại tỉ lệ 30/1
tương ứng với hai giá trị 463,08 ± 27,03 µg chlorophyll/100g lá bắp và 17,58 ± 2,18
mg acid ascorbic/100g lá bắp.
Khi tăng tỉ lệ chiết lên đến tỉ lệ 30/1, hiệu quả chiết có sự tăng lên đáng kể,
lên đến 60% đối với hàm lượng chlorophyll và hơn 42% đối với hoạt tính chống
oxy hóa so với hai tỉ lệ 10/1 và 20/1. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng tỉ lệ chiết thì hiệu
quả chiết có sự giảm nhẹ xuống 20-30% về cả lượng và hoạt tính chống oxy hóa.
Nguyên nhân của sự thay đổi trên là do khi lượng dung môi quá ít, không đủ
để hòa tan, trích ly hết lượng chlorophyll ra khỏi tế bào. Do đó, khi tiếp tục tăng
lượng ethanol thì hàm lượng chlorophyll có sự tăng mạnh. Từ đó, hoạt tính chống
oxy hóa của nó cũng được cải thiện. Tuy nhiên, khi ngâm chiết với lượng dung môi
quá nhiều, mà hàm lượng chlorophyll trong lá bắp là một số cố định nên sẽ nhanh
chóng dẫn đến sự cân bằng giữa các pha, làm hiệu quả trích ly chlorophyll không
tăng.
50
Tóm lại, việc bổ sung lượng dung môi chiết tách là rất quan trọng, cần theo
một tỉ lệ thích hợp để đạt được hiệu suất chiết tách cao nhất.
Sự tương tác giữa tỷ lệ DM/ NL đối với hàm lượng chlorophyll và hoạt tính
chống oxy hóa tuân theo phương trình hồi quy phi tuyến bậc 2 với R2 lớn hơn 0,81.
Phương trình phi tuyến cụ thể của từng hàm mục tiêu có thể coi trong hình 3.5 và
3.6 ở trên.
3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll
Sau khi chọn được tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu, tôi tiếp tục tiến hành nghiên
cứu xác định thời gian phù hợp cho quá trình chiết. Tiến hành 10 mẫu thí nghiệm
chiết rút chlorophyll từ lá bắp bằng ethanol 96% với tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là
30/1. Các thí nghiệm đều sử dụng 100g lá bắp, chiết rút trong bể ổn nhiệt trong các
khoảng thời gian lần lượt như sau: 0,5h, 1h,1,5h, 2h, 2,5h, 8h,16h, 24h, 40h, 48h ở
nhiệt độ 600C. Sau khi chiết rút đem đi lọc, sau đó tiến hành đánh giá hàm lượng
chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết chlorophyll thu nhận được.
Kết quả được thể hiện ở hình 3.7 và 3.8.
3 2
Hàm lư ợ ng ch lorophyll (m icrogam )
270 y = -0,1516x + 1,8334x - 0,2383x + 224,54

2
R = 0,9013
260
250
240
230
220
210
200
0,5 1 1,5 2 2,5 8 16 24 40 48
Thời gian chiết (giờ)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng chlorophyll
51
10
9
8
ascorbic/100g NL)
7
6
5 3 2
y = -0,0002x - 0,0724x + 1,1431x + 4,956
4
3
2
1
0
0,5 1 1,5 2 2,5 8 16 24 40 48
Thời gian chiết (giờ)
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết lên công đoạn chiết, thấy có
điểm chung so với nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL. Hàm lượng
chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa tương quan với nhau rất mạnh theo phương
trình bậc 1:
Y = 0,082x – 12,14 với R2 = 0,88
Phân tích thống kê thấy, hàm lượng chlorophyll đạt giá trị 264,65 ± 13,18
µg/100g lá bắp và hoạt tính chống oxy hóa tương đương 9,48 ± 1,09 mg acid
ascorbic/100g lá bắp (hình 3.7).
So sánh với kết quả trong bố trí thí nghiệm tỷ lệ DM/NL, cho thấy tỷ lệ
DM/NL tác động lên hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ
hơn thời gian chiết.
52
Căn cứ vào kết quả thu được và hình 3.7. và 3.8, cho thấy có sự thay đổi về
hàm lượng cũng như hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll trong các khoảng thời
gian chiết tách khác nhau. Tuy nhiên sự thay đổi này là không quá lớn trong các
khoảng thời gian chiết dài (từ 8h đến 40h hàm lượng chlorophyll chỉ dao động từ
252,19 - 254,79 µg chlorophyll/100g lá bắp).
Thời gian ngâm chiết càng lâu thì hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
càng tăng, song thời gian chiết quá dài sẽ không mang lại hiệu quả. Trong các
khoảng thời gian thử nghiệm, hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa đạt được cao
nhất sau 24 giờ ngâm chiết.
Do sử dụng phương pháp ngâm chiết nên điều kiện chiết tách chlorophyll
trong thời gian ngắn không mang lại hiệu quả cao. Thời gian ngâm chiết quá dài,
lượng dung môi chiết bay hơi đáng kể, đồng thời dẫn đến sự chuyển hóa
chlorophyll tạo pheophytin và các đồng phân khác do sự tác động của các yếu tố
không thuận lợi, nên làm giảm lượng cũng như hoạt tính chống oxy hóa của chúng.
Thực nghiệm cho thấy, hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa
đều tuân theo phương trình hồi quy phi tuyến bậc 3 với độ tương quan mạnh.
Phương trình tương quan giữa hàm lượng chlorophyll và thời gian chiết như
sau:
y = -0,151x3 + 1,833x2 – 0,238x + 224,5 với R2 = 0,9013
Phương trình tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và thời gian chiết như
sau:
y = -0,0002x3 – 0,072x2 + 1,143x + 4,956 với R2 = 0,8577
Tóm lại, việc ngâm chiết chlorophyll cho hiệu quả cao nhất sau 24h chiết tách.
Đây cũng là thời gian chiết tối ưu trong các quá trình chiết tách chlorophyll từ dòng
tảo Nannochloropsis gaditana [13,16,21,32].
53
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll
Sau khi chọn được thời gian chiết, tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu xác định
nhiệt độ phù hợp cho quá trình chiết. Tiến hành 6 mẫu thí nghiệm chiết rút
chlorophyll từ lá bắp bằng ethanol 96% với tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu là 30/1. Mỗi
thí nghiệm đều sử dụng 100g lá bắp, chiết rút trong bể ổn nhiệt trong các khoảng
thời gian 24 giờ ở các nhiệt độ lần lượt là nhiệt độ phòng (300C), 400C, 500C, 600C,
700C. Sau khi chiết rút đem đi lọc, sau đó tiến hành đánh giá hàm lượng chlorophyll
và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết chlorophyll thu nhận được. Kết quả được
thể hiện ở hình 3.9 và 3.10.
300 y = 2,4368x3 - 35,195x2 + 143,1x + 78,237

R2 = 0,9385
Hàm lượng chlorophyll (microgam)
250
200
150
100
50
0
30 40 50 60 70 80
Nhiệt độ chiết (0 C)
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng chlorophyll
Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên công đoạn chiết, thấy
không có điểm chung so với nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL, thời gian
chiết. Hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa tương quan với nhau rất
mạnh theo phương trình bậc 3:
với R2 = 0,707
54
Dựa vào hình 3.9 cho thấy, hàm lượng chlorophyll đạt giá trị 254,77 ± 28,7
µg/100g lá bắp và hoạt tính chống oxy hóa tương đương 11,19 ± 2,05 mg acid
ascorbic/100g lá bắp.
Hoạt tính chống oxy hóa (mg acid ascorbic/100g
12
10
8
NL)
2
6 y = -0,4709x + 3,9354x + 2,063
2
R = 0,7368
4
0
30 40 50 60 70 80
0
nhiệt độ chiết ( C)
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll
Dựa vào hình 3.9 và 3.10 đã cho thấy, nhiệt độ chiết cũng có ảnh hưởng
không nhỏ đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll. Hiệu quả
chiết chlorophyll là cao nhất ở nhiệt độ chiết 600C.
Khi nhiệt độ chiết tăng sẽ làm tăng hiệu quả của quá trình chiết tách, thể hiện
ở việc hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa tăng lên rõ rệt theo quá trình tăng từ
nhiệt độ phòng lên 600C, tương ứng với hai giá tri 254,77µg chlorophyll/100g lá
bắp và 11,19 mg acid ascorbic. Tuy nhiên, có sự giảm dần về lượng và hoạt tính
chống oxy hóa khi tiếp tục tăng nhiệt độ chiết chlorophyll lên 700C và 800C.
Nguyên nhân của sự thay đổi trên chủ yếu là do khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng
khả năng hòa tan của chlorophyll vào dung môi chiết. Dung môi ethanol bay hơi ở
78,390C, do đó qua trình chiết ở nhiệt độ cao sẽ làm thất thoát một lượng dung môi
55
đáng kể, từ đó làm giảm hiệu quả chiết tách. Đồng thời, nhiệt độ cao sẽ xúc tác cho
sự chuyển hóa chlorophyll sang các dạng đồng phân khác, làm giảm hàm lượng
cũng như hoạt tính chống oxy hóa của nó.
Thực nghiệm cho thấy, hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa
đều tuân theo phương trình hồi quy phi tuyến bậc 3 với độ tương quan rất mạnh.
Phương trình tương quan giữa hàm lượng chlorophyll và nhiệt độ chiết như
sau:
y = 2,4368x3 – 35,195x2 + 143,1x + 78,273 với R2 = 0,9385
Phương trình tương quan giữa hoạt tính chống oxy hóa và nhiệt độ chiết như
sau:
y = -0,2577x3 + 2,2348x2 – 4,2332x + 8,5567 với R2 = 0,9423
Tóm lại, việc ngâm chiết chlorophyll cho hiệu quả cao nhất ở 600C.
3.6. Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa
Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 2 hàm mục tiêu và 3 yếu tố đầu vào được
trình bày ở bảng 3.1 sau.
Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa
Stt U1 U2 U3 X1 X2 X3 Y1 Y2
1 -1 -1 0 50 8 1:30 214,68 6,6
2 1 -1 0 80 8 1:30 242,27 7,45
3 -1 1 0 50 24 1:30 263,05 8,09
4 1 1 0 80 24 1:30 222,25 6,84
5 -1 0 -1 50 16 1:20 114,08 3,51
6 1 0 -1 80 16 1:20 151,07 4,65
7 -1 0 1 50 16 1:40 354,96 10,92
8 1 0 1 80 16 1:40 297,66 9,16
9 0 -1 -1 65 8 1:20 103,52 3,18
10 0 1 -1 65 24 1:20 125,65 3,86
11 0 -1 1 65 8 1:40 357,79 11,01
12 0 1 1 65 24 1:40 326,73 10,05
13 0 0 0 65 16 1:30 284,12 8,74
14 0 0 0 65 16 1:30 284,91 8,76
15 0 0 0 65 16 1:30 284,7 8,76
56
Kết quả tối ưu hóa cho thấy rằng, giá trị hàm Y1 nằm trong khoảng 103,52 –
357,79 µg chlorophyll/ 100g nguyên liệu, giá trị hàm Y2 dao động từ 3,18 – 11,01
mg acid ascorbic/100g nguyên liệu. Độ lệch chuẩn (SD) của nhiệt độ là 10,95, SD
của thời gian là 5,84 và SD của tỷ lệ là 7,3. Điều này chứng tỏ độ phân tán dữ liệu
quanh đường chuẩn của thời gian là nhỏ nhất. Phân tích dữ liệu cũng cho thấy các
hàm mục tiêu tuân theo mô hình bậc 2 với R2 hiệu chỉnh là 0,98, chứng tỏ sự tương
quan rất mạnh giữa các yếu tố với các hàm mục tiêu. Bảng 3.2 sau đây sẽ thể hiện
chi tiết điều đó.
Bảng 3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và F của các yếu tố
Yếu tố Độ lệch chuẩn R2 (hệ số tương quan)

F Fcrit
X1 10,95 R2 hiệu 2
R tiên đoán
X2 5,84 chỉnh
15,36 0,0059
X3 7,30 0,98 0,88
Phân tích cụ thể từng bề mặt đáp ứng, thấy rằng các thông số trong phương
trình hồi quy của các bề mặt là hoàn toàn phù hợp và có ý nghĩa trong thống kê và
mô hình bậc 2 là hoàn toàn phù hợp với lý thuyết và thực nghiệm, chi tiết thể hiện ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của 2 hàm mục tiêu
p Hệ số p Hệ số tiên
Mô hình
tiên đoán đoán
Hệ số tự do < 0,0001 284,5767 < 0,0001 8,753333
A-Nhietdo 0,3795 -4,19 0,3873 -0,1275
B-Thoigian 0,6007 2,42749 0,6017 0,075
C-Tyle < 0,0001 105,3525 < 0,0001 3,2425
AB 0,0389 -17,0975 0,0400 -0,525
AC 0,0122 -23,5725 0,0126 -0,725
BC 0,0829 -13,2975 0,0840 -0,41
A^2 0,0133 -23,9971 0,0138 -0,73667
B^2 0,0113 -25,0171 0,0115 -0,77167
C^2 0,0046 -31,1371 0,0048 -0,95667
57
Qua bảng 3.3 cho thấy rất rõ, p = 0,0001 < 0,05 nên mô hình hoàn toàn phù
hợp với thực nghiệm và lý thuyết. Các hệ số của mô hình cũng có p < 0,05 nên
chúng hoàn toàn có ý nghĩa về mặt thống kê và phù hợp với mô hình. Tuy nhiên
thời gian và nhiệt độ của cả 2 hàm mục tiêu đều có p > 0,05 nên những hệ số này
không có ý nghĩa về thống kê.
Từ bảng 3.3 thấy, hàm mục tiêu Y1 và Y2 tuân theo mô hình bậc 2 với
phương trình cho hàm mục tiêu Y1 đối với biến thực như sau:
Y1 = -1383,5 + 20,57981*X1 + 27,05968*X2+ 42,09175*X3 -
0,14248*X1*X2 - 0,15715*X1*X3 - 0,16622*X2*X3 - 0,10665*X12 -
0,39089*X22 - 0,31137*X32
Phương trình cho hàm mục tiêu Y2 đối với biến thực như sau:
Y2 = -42,5363 + 0,63213*X1 + 0,833333*X2+ 1,294417*X3 -
0,00438*X1*X2 - 0,00483*X1*X3 - 0,00513*X2*X3 - 0,00327*X12 -
0,01206*X22 - 0,00957*X32
Phân tích dữ liệu và mô hình hóa dưới dạng bề mặt 3D có bề mặt tương tác
giữa 2 yếu tố nhiệt độ và thời gian đối với hàm mục tiêu Y1 thể hiện như hình 3.11.
Mô hình này có độ lệch chuẩn là 12,29898 và độ tương quan rất mạnh (R2 hiệu
chỉnh = 0,98).
Hình 3.11. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y1

58
Hình 3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2

Thông qua mô hình 3D của 2 bề mặt đáp ứng thấy rằng thật sự không có sự
khác biệt nhiều giữa điểm tối ưu với các điểm khác trên mô hình nghiên cứu. Ít nhất
1 trong 3 yếu tố có điểm tối ưu ở điểm biên nghiên cứu. Lý giải này rõ ràng hơn ở
hình 3.13 sau:
Hình 3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự Hình 3.13b. Đồ thị 2D thể hiện sự
tương tác giữa 3 yếu tố lên hàm mục tương tác giữa 3 yếu tố lên hàm mục
tiêu Y1 tiêu Y2
59
Từ hình 3.13 thấy, đối với 2 bề mặt đáp ứng chỉ có yếu tố thời gian là đạt
được điểm tối ưu ở gần điểm trung tâm, còn yếu tố tỷ lệ và nhiệt độ có điểm tối ưu
sát biên, phù hợp với mô hình 3D của 2 hàm mục tiêu thể hiện ở trên. Sau khi phân
tích và tiến hành trùng lấp 2 bề mặt đáp ứng thấy rằng, hàm lượng chlorophyll dự
đoán là 366,775 µg chlorophyll/100g nguyên liệu và dao động trong khoảng
337,056 – 396,494 µg chlorophyll/ 100g nguyên liệu. Hoạt tính chống oxy hóa dự
đoán đạt 11,284 mg acid ascorbic và dao động trong khoảng 10,3638 – 12,205 mg
acid ascorbic. Điều này nghĩa là với 366,775 µg chlorophyll/ 100g nguyên liệu sẽ
có hoạt tính chống oxy hóa tổng gấp 11,284 lần so với acid ascorbic. Hình 3.14 sau
thể hiện mô hình 2D sự trùng lắp các bề mặt mục tiêu.
Hình 3.14. Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2
Sau khi tiến hành trùng lắp hàm mục tiêu, thu được điều kiện tối ưu như sau:
nhiệt độ là 57,230C, thời gian 15,69h và tỷ lệ là 39,99 (v/w) với bề mặt đáp ứng Y1,
Y2 dự đoán tương ứng là 366,78 và 11,28, đồng thời tính toán được độ lệch chuẩn
cho hàm Y1 là 11,298 và hàm Y2 là 0,38. So sánh với một số kết quả nghiên cứu về
hàm lượng chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa đã có trên thế giới thấy rằng, kết
60
quả trên là hoàn toàn phù hợp. Trong một nghiên cứu về ảnh hưởng của chế phẩm
Oligoglucosamine đến hàm lượng chlorophyll trong lá lạc, đã cho thấy hàm lượng
chlorophyll tổng số trong lá lạc chiếm 4,357mg/g lá. Ở một nghiên cứu khác về
rong Porphyra sp. cũng đã cho thấy hàm lượng chlorophyll a chiếm khoảng 0,58-
1,96 mg/g trọng lượng tươi, chlorophyll b chiếm 0,23-0,63 mg/g trọng lượng tươi
và tổng chlorophyll chiếm khoảng 0,82 mg/g chlorophyll, tương đương với 820
µg/g trọng lượng tươi (J.I.,R.N. Kumar, Bora, Amb, & S. Chakraborthy, 2009).
61
3.7. Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp
Từ kết quả nghiên cứu trên cho phép đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll
từ lá bắp như sau:
Lá bắp
Rửa sạch
Căt nhỏ
Ethanol 960: 100%
Tỉ lệ DM:NL: 40:1
MgCO3: 0,05% Chiết Nhiệt độ: 57,230C
Thời gian: 16h
Lọc
Dịch thô chlorophyll
Hình 3.15. Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp
* Thuyết minh qui trình

 Lá bắp:
Yêu cầu: lá bắp nguyên liệu được thu về từ các ruộng bắp ngay sau khi vừa
thu hoạch xong. Yêu cầu lá còn độ tươi vừa phải, vẫn còn giữ được màu xanh,
không sử dụng lá đã ngả màu vàng.
Lá bắp sau khi thu về cần đem rửa sạch và sử dụng chiết tách ngay, để tránh
các ảnh hưởng bất lợi của ánh sáng tới hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll. Nếu lá bắp sau khi thu về chưa được sử dụng ngay thì cần rửa sạch và
bảo quản ở nơi có nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng.
 Rửa sạch:
Lá bắp sau khi thu về cần đem rửa sạch tạp chất.
Mục đích: để loại bỏ tạp chất, đất, cát, sạn và vi sinh vật, hạn chế các ảnh
hưởng xấu đến chất lượng dịch chiết sau này.
62
 Cắt nhỏ:
Lá bắp sau khi rửa sạch, để ráo rồi đem cắt nhỏ.
Mục đích của quá trình này là giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, tạo điều kiện cho
các sắc tố tách ra và hòa tan vào dung môi khi chiết.
Đồng thời bổ sung MgCO3 với lượng 0,05%, giúp trung hòa các acid thoát ra
từ tế bào, ổn định nhân Mg của phân tử chlorophyll.
Lá bắp sau khi được xay nhỏ, cần bảo quản trong dụng cụ tối màu ở nhiệt độ
thấp.
 Chiết:
Lá bắp sau khi được làm nhỏ nên được đem đi chiết ngay.
Mục đích: trích ly và hòa tan các sắc tố vào dung môi chiết.
Cân một lượng lá bắp đã được làm nhỏ nhất định cho vào dụng cụ chiết tối
màu. Bổ sung 100% dung môi ethanol 960 với tỉ lệ 40:1 (v:w), lắc đều rồi cho ngay
vào bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 57,230C. Giữ mẫu chiết cố định ở nhiệt độ trên trong
khoảng thời gian là 16h.
 Lọc:
Sau thời gian chiết 16h ở nhiệt độ 57,230C với tỷ lệ DM/NL là 40:1 (v/w),
đem mẫu đi lọc.
Sử dụng giấy lọc hoặc vải lọc để lọc mẫu. Chú ý quá trình lọc tiến hành
trong điều kiện tránh ánh sáng. Mẫu sau lọc cũng phải được chứa trong dung cụ tối
màu, hạn chế sự chuyển hóa của chlorophyll.
Yêu cầu: dịch thô chlorophyll sau chiết trong và có màu xanh đặc trưng.
 Dịch chlorophyll thô:
Dịch thô chlorophyll cần được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thấp và
tránh ánh sáng.
63
3.8. Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp
Sau khi tìm được các thông số tối ưu trên, tôi tiến hành nghiên cứu chiết rút
triệt để chlorophyll từ lá bắp và đánh giá sơ bộ hiệu suất thu hồi chlorophyll. Kết
quả thể hiện ở hình 3.16 và 3.17.
400
Hàm lượng chlorophyll (microgam)
350
300
250
200
150
100
50
0
chiết lần 1 chiết lần 2 chiết lần 3
Số lần chiết
Hình 3.16. Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết
12
10
ascorbic/ 100g NL)
0
chiết lần 1 chiết lần 2 chiết lần 3
Số lần chiế t
Hình 3.17. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau mỗi lần chiết
Dựa vào hình 3.16 và 3.17 cho thấy, sau 2 lần chiết đã chiết tách được hoàn
toàn lượng chlorophyll có trong nguyên liệu. Sau lần chiết đầu tiên, hơn 90% lượng
chlorophyll đã được chiết tách. Từ hai kết quả trên cho thấy, hiệu suất chiết tách
chlorophyll trong quá trình nghiên cứu trên là rất cao đạt 97,3%.
64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Đã nghiên cứu và nhận thấy, ethanol là dung môi chiết thích hợp để thu
nhận chlorophyll từ lá bắp về cả phương diện kinh tế lẫn hiệu suất và hoạt tính
chống oxy hóa của nó.
2) Nồng độ dung môi ethanol thích hợp là 96%.
3) Các thông số thích hợp cho quá trình chiết rút chlorophyll từ lá bắp bằng
ethanol 96% là: nhiệt độ chiết thích hợp là 57,230C, thời gian chiết thích hợp là
15,69h và tỉ lệ ethanol/ lá bắp là 39,99/1 (v/w).
4) Đã đề xuất quy trình thu nhận chlorophyll từ lá bắp với hiệu suất thu nhận
chlorophyll là 97,3%.
2. Kiến nghị
Qua quá trình nghiên cứu tôi có vài kiến nghị như sau:
Trong thực nghiệm về chlorophyll cần tiến hành kiểm tra pH dịch
chlorophyll trước khi tiến hành đo độ hấp thụ. Theo các nghiên cứu trước đây (R. J.
Porra, 2002), chlorophyll a và b khi bị acid hóa sẽ tạo thành pheophytin a và b,
trong khi đó, ở pH kiềm vòng isocyclic của chlorophyll a và b sẽ bị mở ra và tạo
thành rhodochlorins a và b. Do đó, việc kiểm soát pH của dịch chlorophyll trong
quá trình chiết tách và lưu giữ sẽ rất quan trọng và có ảnh hưởng rõ rệt lên kết quả
nghiên cứu.
Cần duy trì pH ở 7-7,5 trong dung dịch để tránh không làm cho chlorophyll
bị chuyển thành các dạng đồng phân khác trong quá trình chiết tách.
Chlorophyll đều không ổn định với chất acid và ánh sáng. Lượng vết acid sẽ
làm cho chlorophyll chuyển thành pheophitin tương ứng. Vì vậy, dụng cụ phải được
trung hòa đảm bảo không có acid.
Ánh sáng mặt trời hay ánh sáng huỳnh quang sẽ làm chlorophyll phân hủy
rất nhanh. Do đó cần tiến hành thí nghiệm ở ánh sáng dịu và dụng cụ chứa cản sáng.
Nghiền mẫu trước khi chiết sẽ làm tăng lượng chlorophyll chiết được.
65
Đồng thời việc bổ sung ion MgCO3 có ảnh hưởng rất tích cực đến lượng
chlorophyll thu nhận được. Trong tất cả các thí nghiệm, tôi cố định lượng MgCO3
bổ sung ở 0,05%. Tuy nhiên, đây chưa phải là lượng tối ưu cho chiết tách
chlorophyll. Việc bổ sung ion Mg2+ giúp đảm bảo ion này luôn có dư trong dung
dịch, hạn chế trường hợp mất nhân Mg2+ trong cấu trúc hóa học của chlorophyll.
Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa.
66
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt
1.Đặng Văn Giáp (2002), Thiết kế & tối ưu hóa công thức và quy trình, Nxb Y học,
Hà Nội.
Tiếng Anh
2. Adams, Jad, (2004), Hideous absinthe: A history of the devil in a bottle, Madison,
Wisconsin: University of Wisconsin Press, 22.
3. A. Gitelson, Y. Grits, D. Etzion, (2000), Optimal properties of Nannochloropsis
sp and application to remote estimation of cell mass, Biotechnology Bioengineering
69, 516.
4. Chen, Min, Schliep, Martin, Willows, Robert D. et al, (September 2010), A Red
Shifted Chlorophyll, Science 329 (5997), 131.
5. Chisti Y, Moo-Young M., (1986), Disruption of microbial cells for intracellular
products, Enzyme Microb Technol, 8, 194 – 204.
6. Delépine, Marcel, (September 1951), Joseph Pelletier and Joseph Caventou,
Journal of Chemical Education, 28 (9), 454.
7. Dere S, Gunes T and Sivaci R., (1998), Spectrophotometric determination
of chlorophyll –A, B and total carotenoid contents of some algae species using
different solvents, Tr J Botany, 22, 13-17.
8. Dr. Richard L. Duble, (2010), Iron Chlorosis in Turfgrass, Professor and
Extension Turfgrass Specialist, Texas A&M University, 213-216.
9. Fleming Ian, (14 October 1967), Absolute Configuration and the Structure of
Chlorophyll, nature 216 (5111), 151–152.
10. F. Soxhlet, (1879). Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes,
Dingler’s Polytechnisches Journal, 232, 461-465.
11. George Box, Donald Behnken, (1960), Some new three level designs for the
study of quantitative variables, Technometrics, Volume 2, 455–475.
67
12. Gitelson, Anatoly A; Buschmann, Claus; Lichtenthaler, Hartmut K, (1999), The

Chlorophyll Fluorescence Ratio F735/F700 as an Accurate Measure of the
Chlorophyll Content in Plants, Remote Sensing of Environment 69 (3), 296.
13. G. Mackinney, (1941), Absorption of light by chlorophyll solutions, J. Biol.
Chem., 140, 315-322.
14. Higashi-Okai K, Yamazaki M, Nagamori H, Okai Y, (2001), Identification and
antioxidant activity of several pigments from the residual green tea (Camellia
sinensis) after hot water extraction, Pubmed, 23(4), 335-44.
15. Irijama, K., Shiraki, M., & Yoshiuma, M. (2011), An improved method for
extraction, partial purification, separation and isolation of chlorophyll from
spinach leaves, Journal of Chromatography, 2, 2, 255-276.
16. Jeffrey S. W., Humphrey G.F., (1975), New spectrophotometric equations
for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural
phytoplankton, Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), 167.
17. Jeffrey, S. W.; Shibata, Kazuo, (1969), Some Spectral Characteristics of
Chlorophyll c from Tridacnacrocea Zooxanthellae, Biological
Bulletin (MarineBiologicalLaboratory), 136(1), 5462.
18. Karsten, U.,Schumann, R., Haubner, N., & Klausch, S. (2005), Chlorophyll
extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building
facades, International biodeterioration & Biodegradation, 55 (3), 213-222.
19. Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody, (1987), Experimental organic
chemistry: Principles and Practice, Illustrated edition ed., 122-125.
20. L. Edler, (ed.), (1979), Recommendations for marine biological studies in the
Baltic Sea. Phytoplankton and chlorophyll, The Baltic Marine Biologists Publ. 5, 1-
38.
21. Lichtenthaler H, Wellburn A, (1983), Determinations of total carotenoids and
chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochemical Society
Transactions, 11, 591–592.
68
22. M.G. Ferruzzi, V. Böhm, P.D. Courtney, S.J. Schwartz, (September, 2002),.
Antioxidant and Antimutagenic Activity of Dietary Chlorophyll Derivatives
Determined by Radical Scavenging and Bacterial Reverse Mutagenesis Assays,
Volume 67, Issue 7, 2589–2595.
23. M. Pepe, C. Giardino, G. Borsani, (2001), Relationship between apparent
optical properties and photosynthetic pigments in the sub-alpine Lake Iseo, The
Science of the Total Environment, 268(1-3), 31.
24. Müller, Thomas; Ulrich, Markus; Ongania, Karl-Hans; Kräutler, Bernhard
(2007), Colorless Tetrapyrrolic Chlorophyll Catabolites Found in Ripening Fruit
Are Effective Antioxidants, Angewandte Chemie 46 (45), 8699–8702.
25. Norbert Wasmund, I. T., Dirk Schories, (2006), Optimising the storage and
extraction of chlorophyll samples, Oceanologia, 48 (1), 125-144.
26. Panagiota Karageorgou and Yiannis Manetas, Tree Physiol, (2006), The
importance of being red when young: anthocyanins and the protection of young
leaves of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light, 26 (5), 613-621.
27. Prieto, P., Pineda, M., & Aguilar, M, (1999), Spectrophotometric quantitation
of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:
Specific application to the determination of vitamin E, Analytical Biochemistry,
269, 337–341.
28. Rebecca Christiana, Hari Kristopo, Leenawaty Limantara, (2008).
Photodegradation and antioxidant activity of chlorophyll a from spirulina
(spirulina sp.) powder, Indonesian journal of chemistry, 8(2), 236-241.
29. Ronen , R., & Galun, M, (1984), Pigment Extraction from Lichens with
Dimethylsulfoxide (Dmso) and Estimation of Chlorophyll Degradation,
Environmental and Experimental Botany, 24 (3), 239-245.
30. Speer, Brian R, (1997), Photosynthetic Pigments, UCMP Glossary (online),
University of California Museum of Paleontology, Retrieved 2010-07-17.
31. Strickland, J. D. H. and T. R. Parsons, (1968), A practical handbook of
seawater analysis. Bull. Fish. Res. Bd. Canada No. 167, 1-311.
69
32. UNESCO, (1966), Rep. SCOR/UNESCO WG 17, UNESCO, Paris, Monogr

Oceanogr Methodol, 1, 11.
33. Vollenweider, R. and J. Kerekes, (1982), Eutrophication of waters, Monitoring,
assessment and control OECD, Paris, 154.
34. Wellburn, A. R.. (1994), The spectral determination of chlorophyll a and
chlorophyll b, as well as total carotenoids, using various solvents with
spectrophotometers of different resolution. Journal of Plant Physiology, 144(3),
307-313.
35. Woodward, R. B.; Ayer, W. A.; Beaton, J. M., (July 1960), The total synthesis
of chlorophyll, Journal of the American Chemical Society 82 (14), 3800–3802.
Các trang web đã tham khảo
36. http://www.baomuabanraovat.com/raovat/100914/nuoc-diep-luc-liquid-
chlorophyll-qua-tang-cua-dat-troi-synergy
37. http://www.dietaryfiberfood.com/antioxidants/chlorophyll-health benefits.php
38. http://www.docstoc.com/docs/22163735/I-T%C3%ACnh-h%C3%ACnh-
s%E1%BAA3n-xu%E1%BA%A5t-ng%C3%B4-tr%C3%AAn-th%E1%BA%BF-
gi%E1%BB%9Bi
39. http://www.vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%B4
40. http://www.water.iopan.gda.pl/~kaczmar/bdo/pigments.htm.
41. http://www.xetnghiemdakhoa.com/diendan/showthread.php?tid=75

Nghiên Cứu Chiết Xuất Dịch Chlorophyll Chống Oxy Hóa Từ Lá Bắp

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Nghiên Cứu Chiết Xuất Dịch Chlorophyll Chống Oxy Hóa Từ Lá Bắp

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

i

Nha Trang, ngày tháng năm 2012

Nguyễn Thị Minh Trang

DANH MỤC BẢNG

STT TÊN BẢNG TRANG

2 Bảng 1.2. Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007) 7

3 Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử 10

4 Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực 41

5 Bảng 2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực 41

6 Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55

7 Bảng 3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và 56

8 Bảng 3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của 56

DANH MỤC HÌNH

STT TÊN HÌNH TRANG

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiết độ chiết 40

tính chống oxy hóa chlorophyll

22 Hình 3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y2 58

Hình 3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố 58

Hình 3.15. Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61

1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp)

Năm Diện tích Năng suất Sản lượng

Bảng 1.2. Sản xuất ngô của Việt Nam (1961-2007)

Năm 1961 1975 1990 1994 2000 2005 2007

1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng

Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d

Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll

Diệp lục tố Diệp lục tố

Nhóm -CH2CH3 -CH2CH3 -CH2CH3 -CH=CH2 -CH2CH3

 Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll

1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường:

 Chlorophyll Fibersol Plus:

Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường

Dung môi chiết

Jeffrey Strickland Unesco

Thời gian chiết

Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu chlorophyll

Diễn biến quá trình

Bước 4: Chuyển biến thực qua biến mã

(U0: là giá trị trung bình)

Bước 5: Kiểm định hệ số và phương trình

2.1. Nguyên liệu:

2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Nồng độ dung môi 80%

Aceton Methanol Ethanol

70% 80% 96%

Chọn nồng độ dung môi chiết

2.2.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/nguyên liệu

Nhiệt độ chiết: 600C

10/1 20/1 30/1 40/1 50/1

Chọn tỉ dung môi/nguyên liệu

2.2.4.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết

0,5h 1h 1,5h 2h 2,5h 8h 16h 24h 40h 48h

Chọn thời gian chiết

2.2.4.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết

Nhiệt độ 400C 500C 600C 700C 800C

Chọn nhiệt độ chiết

Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết

2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa

2.3. Dụng cụ và hóa chất

Loại dung môi

Hoạt tính chống oxy hóa (mg acid

Tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu

270 y = -0,1516x + 1,8334x - 0,2383x + 224,54