AVM Faculdade Integrada

MBA em Gestão da Qualidade

Rogério Pereira Gomes

Métodos de Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em

Medicamentos Injetáveis.

Anápolis
2016
 AVM Faculdade Integrada
MBA em Gestão da Qualidade
Rogério Pereira Gomes

Métodos de Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em

Medicamentos Injetáveis.

Artigo apresentado à AVM

Faculdade Integrada como parte
Integrante do conjunto de tarefas
avaliativas do Trabalho de Conclusão de
Curso do MBA em Gestão da Qualidade.
Róbison Gonçalves de Castro.

Anápolis
2016
 Dedico este trabalho primeiramente a
Deus, depois minha esposa que sempre
me ajuda a superar a todas as
dificuldades, a todos meus colegas de
curso que me ajudaram muito a concluir
mais essa etapa em minha vida e por
último e não menos importantes a todos
os professores do curso que me
indicaram o caminho para elevar meus
conhecimentos.

Resumo
 Este trabalho demonstra uma introdução sobre citologia bacteriana e demonstra
também as vias utilizadas para administração parenteral, e explica os métodos in vivo e
in vitro para o teste de pirogênio e a importância de sua realização. Este estudo explica
o que é pirogênio e também determina os processos de despirogenização para os
materiais utilizados nos testes, evitando possíveis contaminações. Objetivamente,
mostra as diferentes metodologias para detecção de endotoxinas bacterianas
investigadas em produtos farmacêuticos estéreis e em soluções parenterais, e também
qual o método mais eficaz utilizado atualmente.

Palavras chave: Pirogênio, Despirogenização, Endotoxinas Bacterianas.

ABSTRACT
 This work demonstrates an introduction to bacterial cytology and also shows
the routes used for parenteral administration, and explains the methods in vivo and in
vitro for the pyrogen test and the importance of his achievement. This study explains
what pyrogen and also determines the depyrogenization processes for the materials
used in the tests , avoiding possible contamination. Objectively shows the different
methodologies for bacterial endotoxin detection investigated in sterile pharmaceutical
and parenteral solutions, and also what the most effective method currently used.

Keywords: Pyrogen, Depyrogenization, Bacterial Endotoxin.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO......................................................................................9
 1.1 TEMA.....................................................................................10

1.2. PROBLEMA................................................................................10

1.3. JUSTIFICATIVA...........................................................................10

1.4. OBJETIVOS...............................................................................10

1.4.1 OBJETIVO GERAL...................................................................10

1.4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS........................................................10

2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................11

2.1 CARACTÉRISTICAS DAS CÉLULAS BACTERIANAS..............................11

2.1.2 PRODUTOS FARMACÊUTICOS INJETÁVEIS...................................13

2.1.3 VIAS PARENTERAIS DE ADMINISTRAÇÃO.....................................13

2.1.4 VIA INTRAVENOSA..................................................................14

2.1.5 VIA INTRAMUSCULAR..............................................................15

2.1.6 VIA SUBCUTÂNEA...................................................................15

2.1.7 VIA INTRADÉRMICA.................................................................16

2.1.8 TIPOS OFICIAIS DE INJETÁVEIS.................................................16

2.1.9 SOLVENTES E VEÍCULOS PARA INJETÁVEIS.................................17

2.1.10 PREPARAÇÃO INDUSTRIAL DE PRODUTOS PARENTERAIS.............18

2.2. HISTÓRICO................................................................................19

2.3. Pirogenios e Mecanismo de Febre.....................................................21

2.3.1 Endotoxina Bacteriana...............................................................22

 2.3.2 NIVEIS PIROGÊNICOS..............................................................24

2.4. MÉTODOS PARA DESPIROGENIZAÇÃO............................................25

2.4.1. DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DA ENDOTOXINA............25

2.4.2 HIDRÓLISE ÁCIDO-BASE.......................................................25

2.4.3 OXIDAÇÃO..........................................................................25

2.4.4. ALQUILAÇÃO......................................................................26

2.5. PROCESSO TÉRMICO.................................................................26

2.5.1. TRATAMENTO POR CALOR SECO............................................26

2.5.2. RADIAÇÃO IONIZANTE.........................................................27

2.5.3 POLIMIXINA B......................................................................27

2.6. DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DAS ENDOTOXINAS...............27

2.6.1. LAVAGEM...........................................................................27

2.6.2. DESTILAÇÃO......................................................................28

2.6.3. ULTRAFILTRAÇÃO................................................................28

2.6.4. Osmose Reversa.................................................................28

2.6.5. CARVÃO ATIVO...................................................................29

2.6.6. ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA...................................................29

2.6.7 ATRAÇÃO POR MEMBRANA HIDROFÓBICA................................30

2.6.8 OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÉNOS.................................30

2.7. TESTE DE PIROGÊNIO...............................................................30

 2.7.1. TESTE DE PIROGÊNIO MÉTODO IN VIVO...................................31

2.7.2. TESTE DE PIROGÊNIO MÉTODO IN VITRO..................................33

2.8. MÉTODOS ANÁLITICOS..............................................................36

2.8.1. COAGULAÇÃO EM GEL (GEL CLOTH).......................................36

2.8.2. TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS...................................................37

2.8.3. TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA...................................................38

2.8.4. TÉCNICA CROMOGÊNICA......................................................38

3. CONCLUSÃO..................................................................................40

4. REFERENCIAS..............................................................................41
 9

INTRODUÇÃO

Na indústria farmacêutica como em qualquer outro segmento, investir em

programas de qualidade é muito importante, para tentar cada vez mais melhorar seu
processo produtivo, e assim como consequência melhorar a qualidade final de seu
produto.
No ramo farmacêutico, os medicamentos injetáveis exigem um cuidado ainda
maior no seu processo produtivo e também nos seus controles de qualidade, uma
análise muito importante que é extremamente necessária no controle de qualidade
de produtos injetáveis é a análise de endotoxina bacteriana, mais por que essa
análise é tão necessária?
Para responder essa pergunta esse trabalho vem com o objetivo descrever sobre
a endotoxina bacteriana e a importância de sua detecção nos produtos injetáveis e
soluções parenterais, relatando um pouco sobre as características da citologia
bacteriana (metabolismo bacteriano, diferença das bactérias Gram positivas e Gram
negativas e suas respectivas funções), Os produtos farmacêuticos injetáveis, suas
vias de administração (intravenosa, intramuscular, subcutânea e intradérmica) e
seus tipos, são citados durante o desenvolvimento do trabalho.
O pirogênio tem um grande destaque no trabalho, citando-se sua história, suas
fontes e seu mecanismo de ação. As endotoxinas, o lipopolissacarídeo, sua
composição química, sua atividade biológica e os níveis pirogênicos são detalhados
ao longo do trabalho. Para evitar qualquer tipo de contaminação, existem os
processos de despirogenização dos materiais a serem utilizados ao longo do teste.
O teste do pirogênio é fundamental para qualquer tipo de material estéril. Os
métodos citados no trabalho são o método in vivo e o in vitro, e para finalizar tem-se
uma avaliação comparativa de testes de pirogênios em produtos farmacêuticos.

1.1 TEMA
 10

Métodos de Determinação de Endotoxina Bacteriana (Pirogênio) em

Medicamentos Injetáveis.

1.2. PROBLEMA
Qual o método dentre os utilizados para determinação de endotoxina bacteriana em
medicamentos injetáveis, é o mais eficiente?

1.3. JUSTIFICATIVA

Os medicamentos injetáveis são aqueles aplicados por injeção, por serem injetados
diretamente dentro do organismo de quem o recebe se faz necessário que o mesmo
seja estéril livre da presença de micro-organismos, mais alguns desses micro-
organismos mesmo depois de eliminados ainda podem comprometer a qualidade do
medicamento e a saúde de quem recebe esse medicamento, as endotoxinas
bacterianas, que são toxinas encontradas dentro da célula bacteriana que são liberadas
após sua eliminação, foram apontadas como causadoras de varias mortes de crianças
em 1996 no Brasil, por isso determinar a presença ou não de endotoxina bacteriana em
medicamentos injetáveis é essencial, conhecer os métodos disponíveis no mercado
hoje e através disso determinar qual o mais eficaz é o principal objetivo deste estudo.

1.4. OBJETIVOS

1.4.1 OBJETIVO GERAL

Apresentar os principais métodos de determinação de endotoxina bacteriana
existentes e seus meios de detecção.

1.4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Conhecer o que é endotoxina Bacteriana.
 Conhecer os principais métodos de despirogenização.
 Conhecer os métodos de detecção disponíveis.
 Conhecer os males que a presença de endotoxina bacteriana em medicamentos
injetáveis causa ao ser humano.
 11

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CARACTÉRISTICAS DAS CÉLULAS BACTERIANAS

Existem vários fatores que podem interferir no metabolismo bacteriano, entre
eles podem-se citar os fatores fisiológicos (que interferem na síntese): a fonte de
energia, tensão de oxigênio, temperatura, PH e os fatores bioquímicos, que englobam a
respiração, a fermentação, a putrefação, entre outros (ANDRADE ET AL, 2003). As
bactérias são divididas em dois grupos através do método da coloração de Gram:
bactérias Gram positivas e bactérias Gram negativas, que têm a mesma importância. A
técnica de Gram acaba expressando muitas características, principalmente na
composição química, estrutura, permeabilidade da parede celular, fisiologia,
metabolismo e patogenicidade das bactérias (HENDERSON ET AL, 1996).

A parede das células Gram negativas é composta por muitas camadas

complexas e a parede das células Gram positivas é composta de uma única camada
(RIETSCHEL et al, 1994).

A parede das bactérias Gram negativas possuem uma camada de

peptidioglicano e três outros componentes externos (lipoproteína, membrana externa e
LPS). A camada de peptidioglicano tem como função manter a forma das células e
proteger o citoplasma das diferenças de pressão osmótica entre os meios interno e
externo e também, confere rigidez ao corpo bacteriano.

Está formado por dois açúcares aminados, o N- acetil glicosamina e o ácido N-

acetil murâmico. A camada de peptidioglicano está localizada no espaço periplasmático
entre a membrana citoplasmática (interna) e a membrana externa, onde estão às
enzimas hidrolíticas, que mantém a nutrição bacteriana proteínas de ligação, que por
sua vez fazem a captação de açúcares e aminoácidos (DING; HO, 2001).

A camada externa apresenta como função uma barreira molecular, para prevenir
ou dificultar a perda de proteínas periplasmáticas, e para evitar o acesso de enzimas
hidrolíticas e alguns antibióticos ao peptidioglicano. Possui também receptores para
 12

bacteriófagos e bacteriocinas e participa da nutrição microbiana (TORTORA; FUNKE;

CASE, 2005).

A composição da parede celular das bactérias Gram positivas e Gram negativas

são diferentes bem como a espessura das mesmas (sendo que a da bactéria Gram
negativa é menos espessa) (DINARELLO, 1984).

O envelope celular das bactérias é formado pela membrana celular juntamente

com a membrana citoplasmática. O envelope das células Gram negativas, consiste de
fosfolipídeos (20 a 25%) e proteínas (45 a 50%). O restante é composto de LPS (30%).
A membrana citoplasmática está localizada junto à parede celular e é formada por dupla
camada fosfolipoproteica, tendo significativa importância na estrutura bacteriana.

Essa membrana atua como barreira osmótica e é permeável aos íons sódio e
aminoácidos. É importante por atuar também em sistemas enzimáticos, biossíntese de
lipídios, transporte de elétrons, além de participar do processo de fosforilação oxidativa
(LONNEMANN ET AL, 1988). As bactérias necessitam de condições físico-químicas
para seu devido crescimento e reprodução. Dentre essas condições, pode-se citar: a
temperatura, o PH, pressão osmótica, concentrações de substrato, dióxido de carbono
e oxigênio (POOLE ET AL, 2001).

As bactérias Gram negativas são as mais encontradas na água de hemodiálise

(em torno de 90%). Esse tipo de bactéria se multiplica rapidamente, mesmo em água
estéril (> 100.000 col/ml), em menos de 48horas (SANTOS ET AL, 2000).

A parede das células Gram positivas possuem uma única camada espessa,
quase toda composta de peptidioglicano, que tem como função a manutenção da célula
e sua rigidez. A camada de peptidioglicano é apenas uma camada espessa e frágil. O
componente da parede das células Gram positivas é o peptidioglicano ligado
diretamente de modo covalente ao ácido lipoteicóico. Para ativação celular, pode-se
citar o glicolipídeo e o ácido lipoteicóico, se ligando as membranas celulares (linfócitos
e macrófagos). Ativam também a cascata do complemento, induzindo à inflamação
(DANNER et al, 1990).
 13

2.1.2 PRODUTOS FARMACÊUTICOS INJETÁVEIS

Injetáveis são preparações destinadas à administração parenteral, portanto,
devem ser estéreis e livres de pirogênios. O termo parenteral é um tipo de via de
administração de injetáveis e significa “fora do intestino”, denotando-se vias de
administração diferentes da oral (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).

Essa via de administração é utilizada quando se deseja a ação rápida do

medicamento, em situações de emergência, quando o paciente está inconsciente ou
impossibilitado de aceitar ou tolerar medicamentos pela via oral, ou quando este
medicamento não é eficaz através de outras vias (HANSON, 1992).

O primeiro medicamento injetável oficialmente reconhecido foi a injeção

hipodérmica de solução de morfina. Hoje existem centenas de medicamentos e
produtos farmacêuticos para administração parenteral (ANSEL; POPOVICH; LOYD,
2000).

2.1.3 VIAS PARENTERAIS DE ADMINISTRAÇÃO

Geralmente, os medicamentos são injetados em órgãos e regiões do corpo: nas
articulações (intra-articular), áreas que contém líquidos nas articulações (intrasinovial),
coluna vertebral (intravertebral), líquido cerebroespinhal (intratecal), artérias (intra-
arterial) ou até mesmo no coração (intracardíaca). Comumente são executadas
injeções em veias (intravenosa- IV), em um músculo (intramuscular- IM), na pele
(intradérmica- ID, intracutânea), ou debaixo da pele (subcutânea, SC, hipodérmica),
(HOFFMANN, 2005).

Os fármacos que são destruídos ou desativados pelo trato gastrointestinal ou

que são mal absorvidos, são administrados pela via parenteral (que também pode ser
usada quando se deseja uma rápida absorção). Esta via também é útil para pacientes
que não cooperam, que estão inconscientes ou que são incapazes de aceitar a
medicação oral (COUPE; DAVIS; WILDING, 1991).

A administração parenteral apresenta uma desvantagem que, quando o fármaco

é injetado, não há como retroceder (quando a substância está no interior dos tecidos ou
 14

é colocada diretamente na corrente sangüínea é mais difícil de ser retirada). Como esta
forma de administração deve ser estéril, é mais cara e exige profissionais competentes
e treinados (HOFFMANN, 2005).

2.1.4 VIA INTRAVENOSA

A injeção intravenosa de medicamentos teve sua origem em 1656. Os
medicamentos intravenosos foram aplicados pela primeira vez em seres humanos em
1662, mas foram abandonados durante certo tempo, devido à ocorrência de trombose e
embolia nos pacientes assim tratados (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).

Só a partir da invenção da seringa hipodérmica no século XIX, que foi renovado

o interesse pelas técnicas intravenosas e, no final deste mesmo século, a administração
intravenosa de soluções de cloreto de sódio e glicose tornou-se popular. Atualmente,
essa via de administração de medicamentos é uma ocorrência rotineira nos hospitais,
embora ainda sejam reconhecidos os perigos associados a essa prática (KWAN, 1989).

Os medicamentos administrados por via intravenosa têm ação rápida em

comparação com as outras vias de administração e, como a administração do
medicamento não é um problema, concentrações sanguíneas ideais podem ser
alcançadas com precisão e rapidez impossíveis através de outras vias. As veias são
grandes, superficiais e fáceis de ver e perfurar (DABBAH et al, 1980). Rígidas
precauções de assepsia devem ser tomadas para evitar o risco de infecções.

Não só as soluções injetadas precisam ser estéreis, mas as seringas e agulhas

empregadas também devem ser esterilizadas e o ponto de entrada deve ser
desinfetado para reduzir a possibilidade de transportar bactérias da pele para o sangue,
através da agulha. Geralmente os medicamentos administrados pela via intravenosa
devem ter a forma de solução aquosa (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).

2.1.5 VIA INTRAMUSCULAR

Possui efeitos mais lentos, mas com duração maior que os obtidos pela via
intravenosa. Soluções ou suspensões aquosas podem ser administradas pela via
intravenosa e a absorção vai depender do tipo de preparação empregada. As injeções
 15

intramusculares são aplicadas diretamente nos músculos esqueléticos, e devem estar

longe dos nervos e vasos sanguíneos (DABBAH et al, 1980). Os danos provocados por
injeções intramusculares relacionam-se com o ponto no qual a agulha entrou e onde o
medicamento foi depositado. Estes danos incluem paralisia por dano neurológico,
abcessos, cistos, embolia, hematoma, necrose da pele e formação de cicatriz
(HOFFMANN, 2005). A injeção deve ser feita a uma profundidade de 5 a 7,5 cm, com
agulhas de calibre 19 ou 20 (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).

2.1.6 VIA SUBCUTÂNEA

Esta via é utilizada para injeção de pequenos volumes de medicamento.
Normalmente, a injeção é dada sob a superfície da pele nos tecidos intersticiais frouxos
da face lateral do braço, superfície anterior da coxa e na região inferior do abdômen. Os
medicamentos irritantes são aplicados na forma de suspensão (AKERS; WRIGHT;
CARLSON, 1991).

Os injetáveis intradérmicos, quando aplicados no paciente com frequência, devem ter

alternados os locais de aplicação, reduzindo assim as irritações teciduais (COUPE;
DAVIS; WILDING, 1991). A irrigação sangüínea no local da injeção é um fator muito
importante ao considerar a velocidade de absorção, ou seja, quanto mais próximos
estiverem os capilares do local da injeção, mais rapidamente o fármaco entrará na
circulação sangüínea (KWAN, 1989).

2.1.7 VIA INTRADÉRMICA

A injeção intradérmica pode ser aplicada na face anterior do braço. Os produtos
administrados por essa via são geralmente para determinar diagnósticos, sensibilização
ou imunização (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).

Emprega-se a agulha curta (0,95 cm) e de calibre fino (23 a 26). Esta agulha é
inserida horizontalmente na pele com o bisel voltado para cima. A injeção é feita quando
o bisel desaparece no cório e, em geral, só 0,1 ml pode ser administrado dessa maneira
(ERSTAD; MEEKS, 1993).
 16

2.1.8 TIPOS OFICIAIS DE INJETÁVEIS

Para preparar um medicamento para uso parenteral, deve-se levar em
consideração a natureza, os aspectos físicos e químicos e a eficácia terapêutica deste.
De acordo com ANSEL, POPOVICH e LOYD, (2000), existem cinco tipos de injetáveis:

• Medicamentos, soluções ou emulsões adequados para injeção, com rótulos do

tipo “Injeção”. Ex: Injeção de Insulina, United States Pharmacopeia (USP).

• Sólidos secos ou líquidos concentrados, que não contenham tampões,

diluentes ou outras substâncias que, com a adição de solventes, produzam soluções
que se adequam em todos os aspectos às exigências para injeções, e que se
distinguem por rótulos do tipo “Estéril”. (Ex: Ampicilina Sódica Estéril, USP).

• Algumas preparações, exceto por conterem um ou mais tampões, diluentes ou

outros componentes, se distinguem por rótulos do tipo “para Injeção”. (Ex: Meticilina
Sódica para Injeção, USP).

• Sólidos suspensos em meio líquido adequado e que não devem ser injetados
por via intravenosa ou no canal vertebral e que se distinguem por rótulos do tipo
“Suspensão Estéril”. (Ex: Suspensão de Acetato de Dexametasona Estéril, USP).

• Sólidos secos que, com a adição de veículos adequados, geram preparações

que se conformam sob todos os aspectos às exigências para Suspensões Estéreis, e
que se distinguem por rótulos do tipo “Estéril para Suspensão“. (Ex: Ampicilina Estéril
para Suspensão, USP).

Se um fármaco for instável em solução, pode ser preparado como um pó seco

que poderá ser reconstituído com o solvente adequado no momento da administração
ou ser preparado como suspensão de partículas em veículo no qual o fármaco seja
insolúvel. Se o fármaco for instável na presença de água, esse solvente será
substituído por outro, parcialmente ou totalmente, no qual o fármaco seja insolúvel
(BUTLER; MUNSON; DELUCA, 1980).
 17

O início e a duração da ação de um fármaco podem ser controlados, em certa

medida, pela forma química do fármaco, pelo estado físico do injetável e pelo veículo
empregado. É desejável uma ação prolongada do fármaco para reduzir a necessidade
de injeções frequentes e repetidas (KWAN, 1989).

2.1.9 SOLVENTES E VEÍCULOS PARA INJETÁVEIS

O solvente mais utilizado é a Água Estéril para Injeção, USP (pois esta é
purificada por destilação ou por osmose reversa). Não precisa ser estéril, mas necessita
ser livre de pirogênios. A Água Bacteriostática para Injeção USP, é a água estéril para
injeção que contém um ou mais agentes antimicrobianos (CRAWFORD; NARDUCCI;
AUGUSTINE, 1991).

A presença do agente antimicrobiano faz com que a água seja usada apenas
para administração parenteral de pequeno volume, pois, para grandes volumes, tem a
presença de muitos agentes antimicrobianos e que talvez sejam tóxicos para esse tipo
de administração (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).

Os veículos selecionados não devem ser irritantes, nem tóxicos nas quantidades
administradas, e não sensibilizantes.

As propriedades físicas e químicas devem ser levadas em consideração e devem

ser avaliadas, como nos solventes. Alguns aspectos que podem ser levados em
consideração, são 20 estabilidade física e química, viscosidade, fluidez, temperatura,
miscibilidade em líquidos corporais, facilidade de purificação e padronização (KWAN,
1989).

2.1.10 PREPARAÇÃO INDUSTRIAL DE PRODUTOS PARENTERAIS

A endotoxina bacteriana foi aprovada para teste em produtos humanos
parenterais em 1980 nos Estados Unidos e foi seguida por outras nações (YAMAMOTO
et al, 2000). Em indústrias, para manipulação de tais produtos, a área deve ser mantida
livre de bactérias através de luzes ultravioletas, ar filtrado, fabricação estéril e roupas
esterilizadas para as pessoas que trabalham na área. As matérias-primas necessárias
 18

são dissolvidas de acordo com as Boas Práticas de Fabricação (BPF) de água para
injeção (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).

As soluções são passadas por um filtro de membrana para ficarem limpas. Após
a filtração, as soluções devem ser passadas com o maior cuidado e assiduidade
possíveis para os recipientes adequados.

Depois destes processos, o produto é esterilizado em autoclave e, então, é feito

o teste de esterilidade e pirogênios (BOMMER; RITZ, 1987). É necessário que todas as
técnicas para preparação de produtos parenterais sejam assépticas, para evitar
qualquer tipo de contaminação cruzada (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).

2.2. HISTÓRICO

O estudo sobre a febre, especulações sobre suas causas, mecanismos e efeitos

são tão antigos quanto à medicina, datando de mais de 2000 anos atrás.

Os primeiros médicos gregos visualizavam a febre mais como mecanismo de

terapêutico que patofisiológico. A ideia de que a febre pudesse ter valor terapêutico
sobreviveu por vários séculos, sendo que inicialmente injeções intravenosas de material
pútrido eram administradas a animais em caráter experimental. Em etapa subsequente,
preparações altamentes pirogenicas de células mortas de salmonela Typhosa foram
empregadas como vacinas. (BUSSEY; TSUJI, 1984)

Alguns autores não viam a febre como benéfica; no inicio do século XIX dois
farmacêuticos franceses, Pelletier e Caventue isolaram um antipirético, a quinina. E a
partir disso com estudos em animais foi possível conhecer os efeitos de pirexia e
antitérmicos. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Um professor dinamarquês de fisiologia chamado Panaum, investiu um

considerável tempo estudando a elevação térmica a partir de substancias pútridas, e
 19

concluiu que a substancia indutora de febre era termoestável, solúvel em água,

insolúvel em álcool, diferente de bactérias vivas e que poucos miligramas injetados via
intravenosa eram suficientes para induzir febre elevada. (PINTO; KANEKO; OHARA,
2000).

Billbroth foi o primeiro investigador a usar o termo pyrogen, ou pirogenio, para

descrever o principio promotor da febre. Ele foi capaz de produzir hipertemia em
cachorros injetando água destilada. O termo pyrogen e “substancia pirogenica” foi
subsequentimente usado por outros autores, entre os quais burdon- Sanderson. Estes
escreveram extensivamente sobre o processo da febre originada de agente exógeno,
como bactéria, ou origem endógena, da célula do hospedeiro. (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2000).

Durante a ultima década do século XIX, Cetanni conduziu estudos significantes

quanto aos agentes responsáveis pela febre. Ele descreveu um procedimento para
isolar a toxina bacteriana responsável pela ação febril. Mantendo culturas de bactérias
Gram (-) sob autólise durante longos períodos, procedendo a filtração esterilizante e
então submentendo a fracionamento em álcool, ele obteve pó branco altamente
pirogenico, a partir da larga variedade de bactérias. Centanni foi o primeiro a
reconhecer a relação causa-efeito entre endotoxina (pirotoxina) e a febre. Ele foi
também o primeiro a demonstrar o “terceiro tipo de imunidade”, posteriormente
chamada de tolerância pirogenica, evidenciada após injeções repetidas de endotoxina.
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Os microbiologistas demostraram a seguir que as endotoxinas eram encontradas

em muitas bactérias. Com a descoberta de Gram em 1884 quando o processo de
coloração recebeu seu nome, os investigadores rapidamente aprenderam que as
endotoxinas estavam associadas exclusivamente a gram (-).

No século seguinte vários pesquisadores estavam preocupados com febres que

às vezes acompanhavam injeções, bem como outros efeitos colaterais associados á
administração parenteral de agentes terapêuticos. Porem apenas a eliminiação de
 20

bactérias por esterilização térmica ou filtrante não eliminava a pirogenicidade destas

preparações, quem primeiro relatou sobre a chamada “febre das injeções foi Hort e
Penfold em 1912. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Estes pesquisadores foram os primeiros a planejar e padronizar o teste de

pirogenio em coelhos. Com este teste, foram capazes de classificar bactérias em
pirogenicas e não pirogenicas, o que as correlacionava com o esquema Gram de
classificação bacteriana. Cultura mortas foram comparáveis as viáveis quanto a indução
de febre. Também demonstraram que a pirogenicidade de água destilada era
relacionada á concentração bacteriana. Eles concluíram que uma substancia
termostável era a provável causa das febres de injeção. (PINTO; KANEKO; OHARA,
2000).

Em 1923 o pesquizador Seibert demonstrou que todas as febres decorrentes de

injeção eram resultantes de pirogenios filtráveis, termoestáveis e produzidos por bacilos
Gram (-).

Após duas décadas um estudo colaborativo foi desenvolvido pelo U.S. National
institute of Health e 14 industrias farmacêuticas para estabelecer um sistema animal
que pudesse ser usado para avaliar pirogenicidade de soluções. Este estudo resultou
no desemvolvimento do primeiro teste de pirogenio oficial em coelhos, que foi
incorporado na USP (United States Pharmacopeia) XII, em 1942.

Shear e Turner se esforçaram no sentido de purificar e caracterizar a endotoxina,

eles conseguiram isolar um preparação de endotoxina de Serratia Marcescens, e foram
os primeiros a aplicar o termo lipopolissacarídeo ao extrato de endotoxina, um termo
que descreve a natureza da endotoxina e que se tem mantido na linguagem cientifica.

2.3. Pirogenios e Mecanismo de Febre

As substancias que induzem febre são chamados pirogenios, segundo Fukumori
a palavra pirogenio é relacionada a palavra grega pyro que significa ardente ou fogo.
 21

Os Pirogenios são dividos em duas classes, eles podem ser endógenos e

exógenos. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Exógenos são aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevações

térmicas quando injetados em animais e no homem. Embora o Lipopolissacarídeo
(endotoxina) seja o mais significativo, há outros produtos, de constituição química
diversa que também produzem elevação de temperatura quando injetados sob
condições apropriadas. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Como fonte de pirogenio podemos citar uma grande variedade de fontes, desde
bacteriana, de fungos e vírus, bem como componentes de bactérias Gram (-) e de
bactérias Gram (+), assim como pirogênios não microbianos, como alguns fármacos,
esteroides, frações do plasma, e o adjuvante Sintetico muramil dipeptide.

Endógenos é produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estimulo

de pirogenios exógenos, consiste de substancia homogenia, sintetizada por diferentes
células do hospedeiro após a exposição ao pirogênio exógeno, sendo considerado o
mediador da febre.

2.3.1 Endotoxina Bacteriana

São Complexos de alto peso molecular associados a menbrana externa de
bactérias Gram (-), e se constituem na mais significante fonte de pirogênio para a
industria farmacêutica. Endotoxinas não purificadas podem conter lípidies, carboidratos
e proteínas, porem quando purificadas são denominadas de Lipopolissacarídeos (LPS)
para enfatizar sua natureza química. Por isso, como nos produtos farmacêuticos podem
ser encontradas unidades não purificadas nas fases em processo ou nos produtos
terminados, prefere-se a terminologia de endotoxinas.

Embora sejam termoestáveis, as endotoxinas são inativas por ciclo de calor

seco, condições alcalinas ou ácidas e polimixina B sob certas condições. Apesar de ser
reconhecida apenas como causadora de febre, soube-se recentemente de ação
biológica de amplo espectro, a ação biológica é associada à porção lipídica da
molécula, porem distinta da endotoxina é responsável em grande parte pela
 22

antigenicidade especifica das bactérias Gram (-), respondendo por milhares de

sorotipos (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Suas características de universalidade, relativa estabilidade térmica, e

capacidade de provocar profundas alterações fisiológicas quando administrada via
parenteral, tornam sua detecção e eliminação um considerável desafio ao produtor de
parenterais, de artigos vinculados à sua administração ou de próteses (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2000).

Quanto a sua composição química a endotoxina tem o posicionamento na

menbrana do Gram (-), é a parte mais interna da molécula é constituída do Lipídeo A,
por sua vez ligado a um núcleo polissacarídeo central. Mais externamente estão
situadas as cadeias O-especificas (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

O lipídeo A é composto de um dissacarídeo de glucosamina, altamente

substituído por ácidos graxos de cadeia longa com agrupamentos amida e Ester. O
acido graxo com ligação amida de estrutura mais comum, com cadeia de 14 carbonos,
é o ácido 3-hidroximiristico; os ácidos graxos com ésteres ligados são mais variáveis e
comumente incluem ácidos cáprito, láurico, mirístico, palmítico e esteárico (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2000).

Tipicamente o lipídeo A é ligado ao núcleo de heteropolissacarídeos por ácido

2ceto-3deoxioctônico, um açúcar ácido de 8 carbonos, exclusivo de lipopolissacarideo
bacteriano. Esta porção conhecida como cadeia central age como um transportador de
soluto no meio aquoso para a porção lipídica (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

Muitas atividade biológicas são atribuídas à unidade lipídeo A da endotoxina,

entre as quais as seguintes foram demonstradas: pirogenicidade, toxicidade letal,
leucopenia seguida de leucocitose, fenômeno de Shwartzman, necrose da medula
óssea, reabsorção do osso embrionário, ativação do complemento, queda de pressão
sanguínea, agregação plaquetaria, ativação do fator de hagemem, indução do fator
plasminogenio, toxidade aumentada pelo pré tratamento com BCG, toxidade
aumentada pela adrenalectomia, reatividade dérmica aumentada à epinefrina, indução
 23

de resistência não especifica à infecção, indução de tolerância a endotoxina, indução

de estado refratário precoce à alteração de temperatura, atividade de macrófagos,
indução de síntese de LgG em camundongos neonatos, indução á produção de
interferon, indução à produção de fator de tumor necrótico, indução à produção de
quinase-piruvato em fígado de camudongo, hipotermia em camundongos, gelificação do
lisado do amebócito Limulus (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

2.3.2 NIVEIS PIROGÊNICOS

Os níveis pirogênicos tornam-se muito importantes no que diz respeito à
liberação de produtos na área farmacêutica. Foi estabelecido um limite de 50 pg/ mL
para a devida liberação desses produtos, mas houve proposta de redução para 35 pg/
mL. O limite aceitável para soluções parenterais é de 100 pg/ mL e, assim, podese ter
uma boa segurança para o teste em coelhos. Os níveis de endotoxina não foram
estabelecidos quando se iniciou o teste em coelhos (MAN et al, 1988).

É importante saber que quando os testes oficiais em coelhos foram

desenvolvidos, não houve tentativas no sentido de definir os níveis de endotoxina que
fossem pirogenicos a coelhos ou humanos.

Em 1956, Westphal obteve resultados indicando que a dose pirogênica mínima

de endotoxina purificada de salmonela abortus equi por kilograma foi comparável em
coelhos e humanos. Estes resultados foram confimados por pesquizadores que
reconheceram a importância de determinar a sensibilidade relativa de coelhos e
humanos a varias endotoxinas, uma vez que o teste de pirogenicidade era feito
objetivando segurança no uso de medicamento parenteral em humanos (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2000).

Os níveis aceitáveis para coelhos e humanos são: 0,1 e 0,14 ng/ Kg para S.
thypi, 1,0 ng/Kg para E. coli e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp (DABBAH et al,
1980).

A pirogenicidade pode depender ou não tanto da endotoxina como do nível de

dose. Conclui-se que o limite razoável seria 0,1 ng/ ml, pois estaria acima do menor
 24

limite de confiança, sendo considerado o “padrão de referência de atividade pirogênica”

e seria comparado com o teste de endotoxina in vitro (PINTO; KANEKO; OHARA,
2000).

2.4. MÉTODOS PARA DESPIROGENIZAÇÃO

Os pirogênios podem ser muito difíceis de serem removidos da solução, pois têm
pesos moleculares bem distintos e sua estabilidade e pH são facilmente alterados
(PEARSON, 1985).
A despirogenização pode ser obtida de duas formas, seja pela inativação ou
remoção das endotoxinas (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

2.4.1. DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DA ENDOTOXINA

2.4.2 HIDRÓLISE ÁCIDO-BASE

Usando esse método se reduz ou elimina a atividade biológica de LPS,

desativando o lipídeo A, presente no LPS bacteriano. A hidrólise ácida age na ligação
cetosídica lábil, separando o lipídio A do restante da molécula do lipopolissacarídeo,
sendo incapaz de ligar-se nas células endoteliais, submetendo-se a inativação.
Porem a hidrólise também pode apenas agir sobre uma fração do lipídeo A,
alterando, a conformação da molécula em sítios funcionais essenciais, ou
simplesmente, clivando ácidos graxos, afetando a solubilidade e pirogenicidade do
lipídeo.

2.4.3 OXIDAÇÃO

Este processo utiliza o peróxido de hidrogênio para destruição de pirogênios na

solução.
Embora o mecanismo da ação do peróxido de hidrogênio não seja conhecido, é
possível que decorra da oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS.
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).
 25

A inativação por este método depende da concentração, do pH e do tempo.É

facilmente eliminado da solução e inativa endotoxinas em condições não extremas à
5%. Além de ser um agente oxidativo muito importante na degradação de solutos e
soluções, fornece vantagens em aplicações específicas. Existem outros agentes
oxidantes a serem citados, como por exemplo, ácido hipoclorito, ácido periódico, 30
permanganato de potássio diluído, neutro, ácido nítrico, dicromato e dióxido de selênio
(SILVEIRA et al, 2004).

2.4.4. ALQUILAÇÃO

A alquilação ocorre por substituição eletrofílica na ligação glucosamina no lipídeo

A ou na etanolamina do núcleo. Através deste método, ocorre redução de atividade.
observando-se resultados satisfatórios, com redução de 100 a 1000 vezes, quando se
usa anidrido acético e succínico. um outro agente alquilante utilizado seria o óxido de
etileno, pois também gerou bons resultados, considerando sua eficácia na destruição
das endotoxinas (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Este tipo de esterilização é usada para materiais que são sensíveis ao calor e à
umidade (como, por exemplo, materiais médicos e cirúrgicos, cateteres, agulhas,
seringas descartáveis na embalagem plástica), além de outras preparações
termolábeis, como antibióticos e outros medicamentos.

2.5. PROCESSO TÉRMICO

2.5.1. TRATAMENTO POR CALOR SECO

O tratamento por calor seco é realizado em estufas específicas para este fim, que
funcionam com gás ou eletricidade, controladas por termostato. Este tratamento é
considerado menos eficaz para matar microrganismos do que o calor úmido, pois utiliza
altas temperaturas por períodos mais longos (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
Esse tipo de metodo tem sido a melhor escolha para materiais termoresistentes,
com ênfase para frascos de vidro e instrumentos metálicos.
 26

O metodo consiste como é descrito em vários compêndios é de exposição a não

menos que 250°C por não menos que 30 minutos, sendo o mecanismo de inativação a
incenaração.

2.5.2. RADIAÇÃO IONIZANTE

A Radiação Ionizante com 60CO reduz a toxidade das endotoxinas bacterianas,

sendo as alterações físicas e biológicas relatadas como dose dependentes. Porém
como este processo aumenta a possibilidade de alterações químicas desconhecidas
em fármacos e soluções parenterais, o uso de radiação ionizante na despirogenização
de materiais não tem sido considerado. Os riscos de toxidade decorrente do processo
superam as propriedades benéficas (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

2.5.3 POLIMIXINA B

A polimixina B pode anular a atividade biológica do lipopolissacarídeo,

inativando-o, porem os dados são conflitantes.
Deve-se tomar cuidado na interpretação dos resultados envolvendo esta
inativação, até que outros estudos sejam feitos para maior conhecimento a respeito
desta (DING; HO, 2001).

2.6. DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DAS ENDOTOXINAS

2.6.1. LAVAGEM

A lavagem é um método bem antigo e mais simples para remover endotoxinas de

superfícies sólidas. Esse método geralmente acontece com uso da Água Estéril para
Injeção USP (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).
A lavagem com água pode ser monitorada durante o processo com o teste LAL,
para validar a remoção de endotoxinas (HANSON, 1992).
Níveis baixos de endotoxina superficial podem ser removidos da vidraria, tampas
e dispositivos, como procedimentos corretos de lavagem.
 27

2.6.2. DESTILAÇÃO
É o método mais antigo que efetivamente remove pirogenios da água, Na
destilação, as moléculas de Lipopolisacarideos, permanecem na fase liquida enquanto
à água pela fervura passa ao estado de vapor, molécula de LPS que estiverem em
estado liquido tendem a cair por gravidade, devido ao seu alto peso molecular, tornando
a água recém destilada coletada em frasco apirogena livre de pirogenios.

2.6.3. ULTRAFILTRAÇÃO

Membranas de Ultrafiltração tem seu mecanismo fudamentado em limites de

exclusão de peso molecular, no processo de ultrafiltração as endotoxinas são retidas na
superfície da membrana quando excedem o limite de peso molecular normalmente de
10.000 Daltons.
A ultrafiltração é muito utilizada para remoção de pirogênios também em
fármacos e soluções de baixo a médio peso molecular, Se a solução tiver alto peso
molecular, também pode ser ultrafiltrada e com resultados eficazes utilizando-se a
desagregação das endotoxinas empregando-se tensoativos ou agentes alquilantes
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

2.6.4. OSMOSE REVERSA

O sistema de osmose reversa é utilizado principalmente no tratamento da água,

sendo considerada a solução do problema da presença da endotoxina para preparar
fluidos parenterais (HINDMAN et al, 1975).
Na Osmose Reversa a endotoxina é removida pela simples exclusão de
tamanho, já que os poros de 0,25 micras são pequenos suficientes para impedir a
passar da endotoxina.
Para esse método, utiliza-se membrana de acetato de celulose ou poliamida,
com pequenos poros para exclusão de íons. Membranas convencionais são utilizadas
para remover endotoxinas por exclusão de tamanho, já que os poros não permitem a
passagem de pirogênios (MAN et al, 1988).
 28

Na despirogenização não é muito efetivo, pois moléculas distintas e pequenas da

água passam através desses poros, mas são muito utilizados para remover endotoxina
da água. Essas membranas retém 99,5% a 99,9%dos pirogênios. Por isso, além da
destilação, a osmose reversa também é um método reconhecido pela USP (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2000).

2.6.5. CARVÃO ATIVO

Esse processo consiste na adição do carvão à solução e, após agitação, esta é
filtrada ou precipitada para remoção do carvão (DING; HO, 2001).
Como o carvão possui grande afinidade por substancias não ionizadas de alto
peso molecular, a sua aplicação tende a ser limitada.

2.6.6. ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

As fibras finas, juntamente a atração eletrostática, atuam como eficiente filtro de
profundidade. Através dos profundos poros, ocorre a retenção de partículas por ação
mecânica (DING; HO, 2001).
As endotoxinas negativamente carregadas são adsorvidas por membranas
revestidas por poliamida ou por amina covalente (DABBAH et al, 1980). Para soluções
farmacêuticas, utilizam-se membranas com potencial negativo para devida
despirogenização (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).

2.6.7 ATRAÇÃO POR MEMBRANA HIDROFÓBICA

A endotoxina tem afinidade por alguns polímeros através dos grupos hidrófilos
ionizáveis presentes nestes. Alguns destes polímeros são: polímeros alifáticos,
polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno (ELISSON,
2000).

2.6.8 OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÉNOS

 29

Para cada produto, deve-se verificar um tipo de despirogenização, seja ele por
remoção ou por inativação de endotoxinas, pois cada um deles tem um tipo de natureza
diferente. Devem-se aplicar todos os conceitos de Boas praticas de fabricação, de
forma que o produto seja obtido de forma apirogenica desde o começo do processo,
sem se preocupar com maiores tratamentos.
Todas etapas críticas devem ser monitoradas e devem-se validar periodicamente
estufas ou túneis de despirogenização (DING; HO, 2001).
Todas as monitorações de processo, assim como testes de matérias-primas, com
particular atenção a origem natural, e do produto terminado, devem empregar técnicas
analíticas validadas, seja com a metodologia clássica ou métodos empregando técnicas
in vitro. (PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).

2.7. TESTE DE PIROGÊNIO

O teste de pirogenio é usado para detectar ou quantificar endotoxinas de

bacterais gram negativas presentes em amostras para qual o teste é preconizado.
Este teste é obrigatório para produtos injetáveis e determinam, em níveis
aceitáveis, os riscos de uma possível ação febril em pacientes receptadores do produto
injetado (ANDRADE et al, 2003).
Os testes da hipertermia realizado em coelhos (teste in vivo) e do LAL (teste in
vitro), são muito importantes para o devido controle de contaminantes pirogênicos em
produtos injetáveis e na validação de metodologias de investigação (BARTH et al,
2007).

2.7.1. TESTE DE PIROGÊNIO MÉTODO IN VIVO

O teste de pirogênios fundamenta-se na medida do aumento da temperatura
corporal de coelhos, após injeção intravenosa da solução estéril em análise. Para
produtos bem tolerados pelos animais, utilizar uma dose que não exceda 10 mL/kg,
injetada em tempo não superior a 10 minutos. Para os produtos que necessitem
 30

preparação preliminar ou condições especiais de administração, seguir as

recomendações estabelecidas na monografia.
Condições gerais:
Usar coelhos do mesmo sexo, adultos, sadios, preferencialmente da mesma
raça, pesando, no mínimo, 1,5 kg. Após a seleção, manter os animais em gaiolas
individuais em sala com temperatura uniforme entre 20 e 23 ºC livre de perturbações
que possam estressá-los. A temperatura selecionada pode variar até ± 3 ºC. Realizar
condicionamento para determinação da temperatura dos animais, pelo menos uma vez,
até sete dias antes de iniciar o teste.
Os animais deverão ser condicionados segundo o mesmo procedimento do teste
apenas sem inoculação do produto. Animais que apresentarem elevação de
temperatura igual ou superior a 0,5 ºC, em relação à temperatura inicial, não deverão
ser utilizados no teste.
Quando da realização do teste, usar apenas animais com temperatura igual ou
inferior a 39,8 o C e que não apresentem, de um para o outro, variação superior a 1,0
ºC. Registro da temperatura, Usar termômetro clínico calibrado com precisão de ± 0,1
ºC ou qualquer outro dispositivo de registro de temperatura calibrado de igual
sensibilidade. Introduzir o termômetro no reto do animal em profundidade aproximada
de 6 centímetros.
Se for utilizado dispositivo registrador, que deva permanecer no reto durante o
período do teste, conter os coelhos de maneira que fiquem em postura natural de
repouso.
Quando se empregar termômetro clínico, deixar transcorrer o tempo necessário
(previamente determinado) para que alcance a temperatura máxima, antes de proceder
à leitura. Material As seringas, agulhas e vidrarias estéreis e apirogênicas. Os diluentes
e soluções extratoras ou de lavagem devem, também, ser estéreis e apirogênicos.
Procedimento:
Executar o teste em área especialmente destinada para o teste, sob condições
ambientais controladas, livre de perturbações que possam estressar os coelhos.
 31

Nas duas horas precedentes e durante o teste, suprimir a alimentação. O acesso

à água é permitido, mas pode ser restringido durante o teste. No máximo 40 minutos
antes da injeção da dose do produto a ser testado, registrar a temperatura de cada
animal mediante duas leituras efetuadas com intervalo de 30 minutos.
A média das duas leituras será adotada como temperatura de controle
necessária para avaliar qualquer aumento individual de temperatura subsequente à
injeção da amostra. Preparar o produto a ser testado conforme especificado na
monografia e aquecer a 37 ± 2 ºC.
Para o teste de pirogênios de materiais de uso hospitalar lavar, com solução
fisiológica estéril, as superfícies do material que entram em contato com o produto, local
de injeção ou tecido interno do paciente. Efetuar os procedimentos assegurando que a
solução não seja contaminada. Injetar pela veia marginal da orelha de três coelhos não
menos do que 0,5 mL nem mais que 10 mL da solução por kg de peso corporal ou a
quantidade indicada na monografia.
A injeção não deve durar mais que 10 minutos, a menos que na monografia se
especifique tempo diferente. Registrar a temperatura de cada animal em intervalos de
30 minutos durante 3 horas após a injeção.
Interpretação:
Não considerar os decréscimos de temperatura apresentados pelos animais
durante o teste.
O aumento de temperatura é verificado pela diferença entre a maior temperatura
apresentada pelo coelho durante o teste e a sua temperatura de controle. Se nenhum
dos três coelhos apresentar aumento individual da temperatura igual ou superior a 0,5 o
C, em relação às suas respectivas temperaturas controle, o produto cumpre com os
requisitos do teste de pirogênios. Se algum coelho apresentar aumento da temperatura
igual ou superior a 0,5 o C, repetir o teste utilizando outros cinco animais.
O produto em exame cumpre os requisitos para ausência de pirogênios se no
máximo três dos oito coelhos apresentarem aumentos individuais de temperatura iguais
ou superiores a 0,5 o C, e se a soma dos aumentos individuais de todos os coelhos não
exceder a 3,3 o C.
 32

Absorvância medida durante o período da reação e valores de velocidades são

determinados para aquelas leituras.

2.7.2. TESTE DE PIROGÊNIO MÉTODO IN VITRO

Desde 1885, Howell descreveu a coagulação do sangue do Limulus polyphemus,

o caranguejo em forma de ferradura de cavalo. Na década de 1950, Bang descobriu
que as bactérias Gram negativas causavam a coagulação do sangue do Limulus. Em
1964, Levin e Bang determinaram que a reação é enzimática, mostrando que a
coagulação é iniciada por um componente estrutural único da parede celular bacteriana
denominado endotoxinas (apud PINTO; KANEKO; OHARA, 2000).
O teste de endotoxina bacteriana pelo método in Vitro é usado para detectar ou
quantificar endotoxinas de bactérias gram negativas presentes em amostras para qual o
teste é preconizado. Utiliza-se o extrato aquoso dos amebócitos circulantes do Limulus
polyphemus ou do Tachypleus tridentatus preparado e caracterizado como reagente
LAL.
O método se baseia na reação entre a endotoxina e um componente protéico do
LAL.
Lisado de Amebócito O lisado de amebócito é um liofilizado obtido do lisado de
amebócitos de crustáceo em forma de ferradura (Limulus polyphemus ou Tachypleus
tridentatus). Este reagente refere-se apenas ao produto manufaturado de acordo com
as regulamentações de autoridade competente.
O lisado reage também com alguns B-Glucanos além de endotoxinas. Preparado
do lisado que não reage com B-Glucanos também estão disponíveis; eles são
preparados ou por remoção ou por inibição do fator G, que reage com os glucanos.
Estes preparados podem ser utilizados para teste de endotoxina na presença de
glucanos.
Esse método “in vitro”, começou com os trabalhos de Frederik Bong, na
Universidade Jonh Hopkins, que observou a reação de coagulação intravascular
causada por bactérias em caranguejos de espécie Limulus polyphemus. Assim, o
 33

cientista descobriu que o fenômeno de coagulação estava nos amebócitos ou células

sanguíneas circulantes do caranguejo, e que a endotoxina produzia uma reação de
gelificação com o lisado obtido desses amebócitos por processo enzimático (apud
ADNER et al, 1991).
Um estudo feito em 1970 mostrou que o teste de LAL é mais sensível do que os
testes realizados em coelhos, pois a intensidade com que o gel é formado é semelhante
à concentração das endotoxinas (LEVIN; BANG, 1964).
Há duas técnicas com sensibilidade diferente para este teste:
1. MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou
gel (método semi-quantitativo)
2. MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem:
O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após
quebra de um substrato endógeno);
O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra
de um complexo peptídeo sintético cromógeno).
Qualquer um destes procedimentos pode ser realizado, a menos que indicado
contrário na monografia.
No método de coagulação em gel, a determinação do ponto final da reação é
feita a partir de diluições da substância sob teste em comparação direta com diluições
paralelas da endotoxina padrão.
As quantidades de endotoxinas são expressas em unidades de endotoxina (UE)
definidas. Nota: 1 UE é igual a 1 UI (unidade internacional).
O reagente LAL (lisado de amemócito de Limulus sp.) é preparado para as
leituras turbidimétricas ou colorimétricas e estes procedimentos podem ser utilizados se
cumprirem os requisitos dos métodos.
Para sua calibração é necessária a elaboração de uma curva padrão obtendo-se
a sua regressão linear, na qual se determina, por interpolação, a concentração de
endotoxina da substância sob teste. O procedimento inclui incubação da endotoxina
padrão para obtenção de uma curva de calibração e das soluções controle com
 34

reagente LAL, por tempo pré-determinado e leitura espectrofotométrica no comprimento

de onda adequado.
No caso do procedimento do método turbidimétrico, a leitura é feita
imediatamente após período final de incubação, e para o procedimento colorimétrico a
reação enzimática é interrompida no final do tempo pré-determinado pela adição do
reagente, antes das leituras. Para os procedimentos cinéticos turbidimétricos e
colorimétricos os valores de absorvância medida durante o período da reação e valores
de velocidades são determinados para aquelas leituras.

2.8. MÉTODOS ANÁLITICOS

2.8.1. COAGULAÇÃO EM GEL (GEL CLOTH)

O mais simples e o mais amplamente utilizado por seu custo baixo, é o processo
para detecção de endotoxinas que se baseia na gelificação.
Procedimento:
Realize os testes em duplicatas com as soluções A, B, C, D como se segue.
Prepare solução de amostra diluída sem adição de endotoxina (solução A); com adição
de endotoxina (controle positivo do produto) a 2 λ (solução B); água grau reagente LAL
com adição de endotoxina a 2 λ (solução C) e água grau reagente LAL sem adição de
endotoxina (solução D - controle negativo).
A diluição da solução A e B não deve ultrapassar o MDV. Interpretação. O teste
somente será valido se as réplicas dos controles positivos das soluções B e C
formarem gel, e a réplicas dos controles negativos das soluções A e C não formarem
gel.
Resultados contrários, não serão válidos e deverão ser repetidos. Ensaio do
teste pela coagulação em gel Misture um volume (ex. 100 µL) de LAL com igual volume
das soluções acima, amostra, padrões, e controle negativo do teste em tubos de ensaio
10 x 75mm, em duplicatas. Incubar os tubos por 1 hora a 37 ºC ± 1 ºC, evitando
vibrações.
 35

Após este período retire os tubos um a um, virando a 180 graus e verificando a
integridade do gel; se o gel permanecer firme após a inversão dos tubos considere o
resultado como positivo, e se não houver formação de gel ou o mesmo não se
apresentar firme considere como negativo. O teste somente será válido se as seguintes
condições forem obedecidas: Se ambas as réplicas do controle negativo (D)
apresentarem reações negativas; Se ambas as réplicas do controle positivo do produto
(B) apresentarem reações positivas; Se a média geométrica da solução C estiver dentro
da faixa de 0,5 λ a 2 λ. Para calcular a concentração de endotoxina da solução A,
calcule a concentração do ponto final de cada réplica da serie de diluições,
multiplicando cada fator de diluição do ponto final pela sensibilidade rotulada do
reagente LAL (λ) A concentração de endotoxina na solução teste é a média geométrica
da concentração do limite das replicas.
Se o teste é realizado na amostra diluída, determine a concentração de
endotoxina na solução original multiplicando o resultado pelo fator de diluição da
amostra. Se nenhuma das diluições da amostra teste for positiva, expresse o resultado
da concentração de endotoxina como menor que a sensibilidade do LAL (λ) ou menor
do que a sensibilidade do LAL multiplicado pelo menor fator de diluição da amostra.
Se todas as diluições da amostra apresentarem reações positivas, a
concentração de endotoxina é expressa como igual ou maior que λ multiplicado pelo
mais alto fator de diluição da amostra. A amostra encontra os requerimentos do teste se
a concentração de endotoxina for menor do que o limite individual especificado na
monografia.

2.8.2. TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS

Os métodos fotométricos quantitativos incluem:
A. Método cinético turbidimétrico: baseado no desenvolvimento de turbidez após
quebra de um substrato endógeno.
B. Método cinético cromogênico: baseado no desenvolvimento de cor após
quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno.
C. Método cromogênico limite (endpoint).
 36

D. método turbidimétrico limite (endpoint).

2.8.3. TÉCNICA TURBIDIMÉTRICA

Esta técnica baseia-se na medida de aumento de turbidez, e dependendo do
principio empregado, pode ser classificado em 2 tipos:
A. Limite Turbidimétrico: baseado na relação entre a concentração de
endotoxina e a turbidez (absorvância ou transmissão) da reação
B. Cinético Turbidimétrico: método baseado no tempo de reação (onset time)
necessário para a mistura de a reação atingir uma absorvância pré-determinada ou na
relação de desenvolvimento de turbidez. O teste é realizado numa temperatura de
incubação recomendada de 37 ºC ± 1 ºC.

2.8.4. TÉCNICA CROMOGÊNICA

Esta técnica é baseada na medida de um cromóforo liberado por um peptídeo
cromogênico pela reação da endotoxina com o lisado e dependendo do principio
empregado pode ser classificado em dois tipos: A. Teste cromogênico limite- é baseado
na relação entre a concentração de endotoxina e a quantidade do cromóforo liberado
no final de um período de incubação. B. Teste cinético cromogênico: baseado na
medida do tempo de reação (onset time) necessário para a mistura de a reação atingir
uma pré-determinada absorvância ou na velocidade de desenvolvimento de cor. O teste
é realizado numa temperatura de incubação recomendada de 37 ±1 ºC.
Preparação do teste:
Para assegurar a precisão e validade dos testes turbidimétricos e cromogênicos,
testes preparatórios são realizados para assegurar os critérios para a curva padrão são
satisfatórios e a amostra em teste não interfere com o teste.
A validação do método é requerida quando qualquer mudança nas condições
experimentais é realizada e pode interferir no teste. Critérios para a curva padrão
Prepare uma curva padrão utilizando três concentrações de endotoxina, usando uma
 37

solução preparada de padrão de endotoxina, e realize o teste, no mínimo em triplicata

de cada concentração, como recomendado pelo fornecedor do LAL (relação de volume,
tempo de incubação, temperatura e pH,etc.)
Se for desejado uma faixa maior que 2 logs, uma concentração padrão deverá
ser adicionada para aumentar a faixa da curva padrão. O valor absoluto de correlação
linear R deverá ser maior ou igual a 0,980 para a faixa. De concentração de endotoxina
indicada pelo fornecedor de LAL.
Teste para fatores de interferência para as técnicas fotométricas Prepare
soluções de amostra diluída sem exceder a MDV (máxima diluição válida) sem
endotoxina (solução A) e com endotoxina adicionada (solução B) na concentração igual
ou próxima do ponto médio da curva padrão. Prepare também uma série de controle
positivo com soluções de endotoxina (sedução C) com três concentrações diferentes, e
também o controle negativo com água apirogênica (solução D) e realizar os testes
adicionando reagente LAL, no mínimo em duplicata (siga as orientações do reagente
utilizado com relação ao volume de amostra e do reagente, tempo de incubação), o
ponto mais baixo da curva é considerado λ.
Calcule a média de recuperação da endotoxina adicionada à amostra subtraindo-
se a média da concentração de endotoxina na solução teste (solução A) (se houver) da
média da solução cuja endotoxina foi adicionada (solução B).
A solução teste é considerada livre de interferentes se a medida da concentração
de endotoxina adicionada á solução teste (solução B) estiver na faixa de 50 a 200% de
recuperação, após subtração de qualquer endotoxina detectada na solução sem adição
de endotoxina. Quando a recuperação de endotoxina estiver na faixa de especificação,
fatores interferentes devem ser removidos conforme descritos na seção da técnica de
coagulação em gel.

3. CONCLUSÃO
 38

Através deste estudo foi possível conhecer sobre a endotoxina bactériana que trata-
se de um lipopolissacárido, abreviado LPS, ou seja, uma forma de um açúcar. Trata-se
de uma estrutura composta por complexos de lípidos e açúcares, que pode causar
varias enfermidades, podendo causar até a morte caso seja injetados medicamentos
contamindados em pacientes como imunidade comprometida.
Os testes para se detectar a endotoxina bacteriana são de extrema necessidade
para detectar a contaminação de fármacos, e materiais de uso hospitalar, Atualmente
as indústrias farmacêuticas tem investido muito nesse tipo de análise.
E cumprindo o objetivo principal desse estudo foram apresentados vários métodos,
dentre eles o método por coagulação em gel e o metodo cinético turbidimetrico, que
hoje são os mais recomendados pela agencia reguladora, para ser utilizado na indústria
farmacêutica.
E dentre esses dois métodos através das informações obtidas neste estudo, foi
possível observar que o metodo de Coagulação em gel que é um método qualitativo é
menos eficaz que o método cinético turbidimetrico, pois vários estudos demonstraram
vários falsos positivos em seus testes, ficou comprovado que o método cinético
turbidimetrico que é um metodo quantitativo, ou seja, com ele possível quantificar com
precisão a quantidade de endotoxina presente na amostra analisada, é hoje em dia o
método mais eficaz para se analisar medicamentos.

4. REFERENCIAS
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