TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM

--------------- ---------------

MÔN HỌC: SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

ĐỀ TÀI GIỮA KỲ

BIOSENSOR TRONG XÁC ĐỊNH ĐẠM

GVHD: PGS.TS. Ngô Đại Nghiệp

Lớp: thứ 7, tiết 8-11
Nhóm 8
Nguyễn Lê Minh Đức 16129016
Nguyễn Minh Đức 16129017
Trần Trung Đức 16129018
Phạm Chí Nghị 16129044
Đặng Châu Phong 16129053

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2017

Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

STT HỌ VÀ TÊN MSSV PHẦN ĐẢM NHIỆM TỶ LỆ %

HOÀN
THÀNH

1 Nguyễn Lê Minh Đức 16129016 Phân công và tổng hợp nội dung 100%
2 Nguyễn Minh Đức 16129017 -Tổng quan về công nghệ trong
cuộc sống.
-Biosensor. 100%
+Biosensor là gì?
+Lịch sử phát triển của biosensor.
+Ứng dụng trong cuộc sống.
3 Trần Trung Đức 16129018 -Thiết bị cảm biến sinh học
aptamer trong xác định protein. 100%
-Ưu nhược điểm.
-Tiềm năng.
4 Phạm Chí Nghị 16129044 +Aptasensors điện hóa.
(electrochemical aptasensor)
+Aptasensors quang học. 100%
(optical aptasensor)

5 Đặng Châu Phong 161290 +Aptasensor nhạy khối lượng.

(mass sensitive aptasensor)
+Aptasensor đo điện thế. 100%
(potentionmetric aptasensors)

Nhóm trưởng: Nguyễn Lê Minh Đức (SĐT 01694727169)

__________________________________________________________
Nhận xét của giáo viên
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………..........
.......................................................................................................................................

1
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Mục lục
A. PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU.................................................................................................................3
1. Lý do chọn đề tài.......................................................................................................................3
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................................................3
3. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................................................3
A. PHẦN HAI: NỘI DUNG...............................................................................................................4
1. Tổng quan công nghệ sinh học..................................................................................................4
2. Biosensor...................................................................................................................................4
2.1 Lịch sử phát triển của biosensor.........................................................................................4
2.2 Biosensor là gì?..................................................................................................................5
2.3 Cấu tạo của biosensor........................................................................................................6
2.4 Ứnng dụng của biosensor...................................................................................................8
3. Biosensor trong xác định đạm....................................................................................................9
3.1 Các nguyên lý phát hiện protein dựa trên aptamer.............................................................9
3.2 Ưu điểm, nhước điểm......................................................................................................29
3.3 Tìm năng..........................................................................................................................30
4. Kết luận...................................................................................................................................30
Danh mục tài liệu tham khảo...............................................................................................................31

A. PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU

2
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

1. Lý do chọn đề tài
Công nghệ ra đời cùng với sự phát triển chóng mặt của nó đã làm thay đổi
bộ mặt của hành tinh này. Từ những khó khăn trắc trở mà giờ đây mọi người có thể
gần nhau hơn, thông tin kết nối toàn cầu. Công nghệ luôn hiện hữu gần như mọi
nơi, dù cũ hay tân tiến thì nó cũng đã giúp ích cho đời sống con người rất nhiều và
trong đó có công nghệ sinh học, đặc biệt là biosensor trong xác định đạm. Đây là
một vấn đề không mấy mới mẻ nhưng sự hữu ích và phát triển của nó thì luôn tạo
ra những bất ngờ cho các nhà khoa học cũng như cuộc sống này, đó là lý do mà
nhóm 8 chọn đề tài này.

2. Mục đích nghiên cứu

Đến với đề tài này, nhóm 8 muốn giúp cho mọi người phần nào hiểu thêm
về biosensor trong xác định đạm, hiểu được cấu tạo, nguyên lý hoạt động, các
công nghệ mới, ưu-nhược điểm của nó và hơn hết là bổ sung một nguồn kiến thức
quan trọng cho chuyên ngành kỹ thuật y sinh.

3. Phương pháp nghiên cứu

+ Bàn luận
+ Phân tích
+ Phản biện
+ Tổng hợp

A. PHẦN HAI: NỘI DUNG

3
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

1. Tổng quan công nghệ sinh học

“Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa
học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công
nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để
sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ
phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường”. Trên thế giới, công nghệ sinh học
truyền thống và hiện đại đã có những bước nghiên cứu, phát triển vượt bậc và
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Ở Việt Nam, các chính sách, đề án,
chương trình về công nghệ sinh học trong nông - lâm nghiệp, thủy sản, y tế, công
nghiệp và môi trường đã và đang được xây dựng và triển khai thực hiện. Bên cạnh
đó, cơ sở hạ tầng phục vụ nghiên cứu và đào tạo nguồn nhân lực về công nghệ sinh
học cũng được ưu tiên đầu tư. Trình độ nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh
học với các công nghệ nền được đẩy mạnh. Công nghệ sinh học đã góp phần tạo ra
nhiều sản phẩm có giá trị. Trong giai đoạn tới, việc gắn kết chặt chẽ giữa nghiên
cứu và triển khai công nghệ sinh học với đầu tư về cơ sở vật chất và đào tạo nguồn
nhân lực; tăng cường ứng dụng rộng rãi các nghiên cứu về công nghệ sinh học vào
các lĩnh vực của đời sống xã hội; xây dựng và phát triển ngành công nghiệp sinh
học sẽ nâng cao mức đóng góp của ngành khoa học này vào sự phát triển kinh tế,
xã hội của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung.
2. Biosensor
2.1 Lịch sử phát triển của biosensor
Giáo sư Leyland D. Clark được biết như là người
đi tiên phong trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Năm
1956 ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá.
Những năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí
nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của
cảm biến như phát hiện được thêm nhiều tác nhân, nâng
cao độ chính xác của cảm biến. Dựa trên kinh nghiệm và
tâm huyết của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích
giúp có thể đo lường được trong cơ thể.
Hình 2.1: Leyland D. Clark Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn
lâm New York, ông đã có
bài diễn thuyết: “To make electrochemical sensors (pH,
polarographic, potentiometric or conductometric) more
intelligent by adding enzyme transducers as membrane
enclosed sandwiches”. Ông đưa ra mô hình đầu tiên về
cảm biến sinh học. Cảm biến sinh học theo mô hình của
D. Clark bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng
giữ enzyme glucose (glucose oxidase). Khi mật độ
glucose trong môi trường phản ứng giảm thì mật độ
chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách
Hình 2.2 điện cực oxi

4
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

tương ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ
glucose trong môi trường cần kiểm tra.
Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo lần đầu tiên công
bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme
đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê
(urease) bằng màng chất lỏng chọn lọc NH4+.
Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic
sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2. Cũng vào năm đó,
công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark
thành hiện thực thông qua việc thương mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm
đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột
mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống.
Biosensor tiến thêm một bước mới là khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được
dung như một yếu tố sinh học trong điện cực vi khuẩn để đo nồng độ cồn.
Năm 1976, La Roche (Thụy Sĩ) giới thiệu máy phân tích lacta (Lactate
analyser- LA640) trong đó sử dụng tác nhân trung gian hexacyanoferrate hòa tan
để chuyển các electron từ lactadehydroxydrogenase tới một điện cực. Mặc dù
không thành công trên thương trường nhưng là một bước đột phá quan trọng cho
một thế hệ Biosensor được ứng dụng trong thể thao và chẩn đoán lâm sàng.
Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm
biến glucose in vivo, là loại cảm biến dạng kim đầu tiên cho các xét nghiệm dưới
da.
Năm 1987, điện cực emzym screen-printed được công bố bởi Medisense
(Cambridge, USA) với dụng cụ đo có kích thước như một chiếc bút cho phép giám
sát lượng glucose trong máu tại nhà. Điện cực này được thiết kế lại làm cho thông
dụng hơn và số lượng bán của Medisense đã đạt tới 175 triệu dolar năm 1996 khi
học được Abbort mua lại. Hiện nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa
học và công nghệ, đặc biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ
thông tin, cảm biến sinh học cũng đạt được những tiến bộ vượt bậc, hứa hẹn ra
những vi thiết bị nhắm xác định nhanh, chính xác các loại vi khuẩn, virut gây bệnh
… Các thiết bị này cũng có thể dò tìm hay phân tích lượng mẫu rất nhỏ (cỡ vài
nm) với độ tin cậy cao. Hai hãng Boehringer, Manheim và Bayer đang cạnh tranh
nhau rất gay gắt về biosensor và lượng bán ra của ba công ty chiếm ưu thế trên thị
trường.
2.2 Biosensor là gì?
Theo IUPAC (International
Union of Pure and Applied
Chemistry) thì: “Cảm biến sinh
học (biosensor) là một thiết bị tích
hợp có khả năng cung cấp thông
tin phân tích định lượng hoặc bán
định lượng đặc trưng, bao gồm
Hình 2.3: từ tín hiệu sinh học sang tín hiệu điện
5
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển
đổi”.
Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học như enzym, các
kháng thể, ... để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất. Do vậy cấu tạo của cảm
biến sinh học bao gồm 3 thành phần cơ bản: thành phần hoá học, thành phần sinh
học và thành phần vật lý.
Và đơn giản hơn ta có thiểu hiểu biosensor thực chất là một thiết bị phân
tích chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu điện.
2.3 Cấu tạo của biosensor
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính: Đầu
thu sinh học: có tác dụng bắt cặp và phát hiện sự có mặt của các tác nhân sinh học
cần phân tích; thứ hai là tác nhân cố định: giúp gắn các đầu thu lên trên điện cực;
thứ ba là bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các
tín hiệu có thể đo đạc được;
cuối cùng là bộ phận xử lý, đọc
tín hiệu ra (bộ phận này có tác
dụng chuyển thành các tín hiệu
Hình 2.4: Sơ đồ cấu tạo
của biosensor
điện để máy tính và các thiết bị

khác có Chú thích: Chất xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P). Bộ biến năng (b)
thể xử lý). chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện
của bộ biến năng. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn hình hiển thị (e).

Đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng và biên dịch thành một đặc
tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này được chuyển đổi
thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện tượng được
nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là cơ quan thụ cảm sinh học
(bioreceptor). Hệ thống này sẽ tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản
ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có
đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất phân tích
Tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo như sau:
Các vi khuẩn: các vi khuẩn thường được phát hiện bởi các cảm biến sinh
học là vi khuẩn Ecoli, vi khuẩn Candida, vi khuẩn bệnh than …
Các phân tử nhỏ: các phân tử nhỏ mà cảm biến sinh học có thể phát hiện
được là CO, CO2, phân tử gluco, phân tử rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit,
paracetamol, aspirin, penicilin, TNT, các tác nhân thần kinh khác, …
Các phân tử sinh học có kích thước lớn: những phân tử này có thể là các
phân tử ADN, RNA, protein, enzyme, các hocmon, …
Đầu thu sinh học:

6
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Nhiều cảm biến sinh học sử dụng các kết hợp đã được phát triển rất cụ thể
cho các ứng dụng. Có hai loại đầu thu sinh học. Đầu tiên, các cảm biến sinh học sử
dụng các enzyme hoặc kháng thể oligonucleotid, ví dụ các chất có nguồn gốc sinh
học, được thiết kế để thực hiện một chức năng cụ thể trong cơ thể sống. Do vậy,
chúng được sử dụng để phát hiện một chất cụ thể. Ngoài ra còn có những đầu thu
sinh học có thể được mô tả giả như ngược với đầu thu sinh học tự nhiên, thông qua
các phương pháp điện hoá có thể phát hiện một số chất.
Đầu thu sinh học (Biological Receptor) là những đầu thu phản ứng trực tiếp
với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học Dựa
vào các tác nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu thu như
sau:
Đầu thu làm từ enzyme: Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng đầu thu
phổ biến nhất. Đó là các đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose, ...
Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có đặc
điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh.
Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các
protein như cảm biến phát hiện hocmôn, xác định các chất kích thích thần kinh, ...
Các đầu thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao. Tuy nhiên, chúng có
nhược điểm là rất khó cách ly.
Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như ADN, ARN có thể sử
dụng làm đầu thu sinh học. Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được sử
dụng để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền.
Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai
hay nhiều các phân tử dạng (enzyme, kháng thể, protein, ...) trên một đế. Việc kết
hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học. Một số cảm biến
dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định vi khuẩn bệnh
than và cảm biến thử thai.
Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các
phân tử, nguyên tử mà nó còn có thể được làm từ các tế bào. Một số tế bào biến
đổi gen của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học. Khi có mặt các phân
tử chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thông qua đó chúng ta xác định được sự
xuất hiện của các phân tử chất độc.
Tác nhân cố định:
Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học.
Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế. Nói một
cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học
(có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ.
Bộ phận chuyển đổi:

7
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Đây là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học. Có nhiều dạng chuyển
đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng
tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ.
Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế
(potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric).
Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng như: hấp
thụ ánh
sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio–
luminiscence; chemi–luminiscence…
Chuyển đổi nhiệt hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entanpi khi hình
thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển
đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển
đổi này có tính chọn lọc thấp.
Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric)
Chuyển đổi hoạt động dựa trên nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao
động khi lực tác dụng lên nó thay đổi. Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là độ nhạy
cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng
đo đạc trong môi trường lỏng và khí.
Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ
Nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng chuyển đổi này như sau: chiếu
một chùm laser đến bộ phản xạ trên bề mặt một thanh dầm rất mỏng, ánh sáng
phản xạ được thu nhận bởi photodetector. Thanh mỏng này được chế tạo sao cho
chỉ với một lực tác động rất nhỏ cũng làm cho thanh bị uốn cong đi. Như vậy tín
hiệu phản xạ thu nhận được trên photodetector sẽ bị thay đổi so với trường hợp
không có lực tác dụng lên thanh. Căn cứ vào sự thay đổi tín hiệu phản xạ này,
người ta có thể xác định được lực tác dụng lên thanh
2.4 Ứnng dụng của biosensor
Ứng dụng trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ: Đây là lĩnh vực có
nhiều cải tiến cũng như nhiều ứng dụng nhất. Chúng ta có thể kể ra rất nhiều loại
cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu, cảm biến huyết
áp, … Những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi tình hình
bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế. Ngày nay, các

8
Nhóm 8, đề tài 4

Hình 2.5: Thiết bị biosensor trong y tế

Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn
được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng.

Ứng dụng trong công nghệ môi trường: Đó là các cảm biến dạng “mũi điện
tử” xác định một hoá chất độc hại nào đó hoặc xác định độ ô nhiễm của môi

Hình 2.6: Cơ chế hoạt động của

biosensor trong xác định và phát
hiện hóa chất trong mẫu phân
tích

trường như cảm biến xác

định nồng độ khí độc
(CO2, H2S), xác định dư lượng thuốc trừ sâu, xác định nồng độ của các kim loại
nặng, ...

Ứng dụng trong các tương tác Người – Máy: Đây cũng là một lĩnh vực mới
mẻ có nhiều nghiên cứu, ứng dụng. Có thể kể ra một số cảm biến dạng này như
cảm biến nhận dạng tiếng nói, hình ảnh, nhận dạng các đặc trưng sinh học của con
người. Đây cũng là lĩnh vực hứa hẹn có nhiều nghiên cứu, ứng dụng mới. Ứng
dụng trong việc điều khiển, quản lý các quá trình trong công nghệ sinh học: Ngày
nay, khi công nghệ sinh học phát triển, đồng thời với việc các chế phẩm sinh học
được sản xuất rộng rãi trên qui mô công nghiệp, cũng như tham gia ngày càng
nhiều vào các quá trình sản xuất khác thì một nhu cầu tất yếu nảy sinh, đó là việc
theo dõi, quản lý, điều khiển các quá trình sinh học như điều chỉnh lượng glucose
Hình 2.7: Biosensor phát hiện E. coli
trong quá trình nuôi vi khuẩn..v.v.... Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu
điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh,
đơn giản và chính xác.
3. Biosensor trong xác định đạm
3.1 Các nguyên lý phát hiện protein dựa trên aptamer
3.1.1 Aptamer
Aptamer là oligonucleotide hoặc peptide có khả năng liên kết với một phân
tử mục tiêu cụ thể. Các aptamers thường được tạo ra bằng cách chọn chúng từ một
tập hợp chuỗi ngẫu nhiên lớn, nhưng aptamers tự nhiên cũng tồn tại
trong riboswitches.
Aptamer bao gồm hai loại chính:

9
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

 DNA hoặc RNA hoặc các aptamer XNA. Chúng bao gồm các sợi
oligonucleotide (thường là ngắn).
 Aptamers peptide. Chúng bao gồm một (hoặc nhiều hơn) các
miền peptide biến đổi ngắn, được gắn ở cả hai đầu với một khung giàn

protein.

Hình 3.1: RNA aptamer Hình 3.2: PNA aptamer

Ngoài ra, ta còn có thể biết thêm có Apffimer (là một dạng tiến hóa của
aptamers peptide) và AptaBiD (AptaBiD hay Aptamer-Facilitated Biomarker
Discovery là một công nghệ để phát hiện ra biomarker. AptaBiD dựa trên thế hệ đa
vòng của aptamer hoặc một nhóm aptamer cho các mục tiêu phân tử khác biệt trên
các tế bào tạo điều kiện phát hiện mũ của các công thức sinh học).
Aptamers là những thành viên quan trọng của gia đình nucleic acid chức
năng nhân tạo, chúng có khả năng nhận diện cao với các chất đặc thù. Bằng cách
sử dụng các cảm biến/giao diện dựa vào aptamer, sự phát hiện các chất cần phân
tích có trong các phân tử nhỏ đến các phân tử lớn như protein và tế bào đã được
Hình 3.3: peptide aptamer

làm thành công.

Thông thường, các aptamers được đánh dấu với các phân tử nhuộm (hoặc
enzyme – enzyme cũng có thể đóng vai trò là thuốc nhuộm) nhằm đạt được độ

10
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

nhạy cao, hoặc các aptamers được đánh dấu bằng các nhóm chức (ví dụ -SH và
-NH2) cho việc tạo nên các giao diện cảm biến cần thiết.
Do ưu thế của minh mà aptamer được ứng dụng trong:
 Thăm dò sinh học
 Thay thế kháng thể
 Trị liệu (ví dụ: pegaptanib- Thuốc tiêm Pegaptanib sodium (tên
thương hiệu Macugen) là một thuốc chống angiogenic dùng để điều
trị thoái hóa điểm vàng do lão hóa)

Hình 3.4: Tiêm thuốc vào

võng mạc để ngăn chặn sự
phát triển của các mạch
máu bất thường

3.1.2 Aptasensors điện hóa (electrochemical aptasensors)

Sự truyền dẫn điện hóa của các cảm biến sinh học sử dụng aptamer như các
bộ cảm biến sinh học bao gồm các phương pháp như Phép đo trở kháng Faradaic,
FAS,
Về nguyên tắc, nó có thể được phân biệt giữa tín hiệu đọc hay dương, nghĩa
là tăng hoặc giảm đáp ứng theo sự tương tác của receptor-target, cf.
Xu-et-al đã chứng minh một phương pháp phát hiện quang phổ trở kháng
điện hóa cho các điện cực mảng sửa đổi aptamer như một phương pháp phát hiện
không có nhãn đối với IgE. Họ so sánh các điện cực dựa trên aptamer DNA với
các điện cực kháng IgE chống lại người và thấy tiếng ồn nền thấp hơn, giảm sự
hấp phụ không đặc hiệu, và sự khác biệt lớn hơn trong tín hiệu trở kháng do kích
thước nhỏ và cấu trúc đơn giản của aptamers so với kháng thể.
Cảm biến trở kháng cho phép theo dõi thời gian thực tín hiệu cảm biến và
có thể làm tăng các khía cạnh động học của tương tác anion-ligand-
analyte. Schlecht et al. đã so sánh một aptamer RNA và một kháng thể để phát hiện
thrombin bằng cách sử dụng một thiết bị cảm biến trở kháng có kích thước nano
nanomet. Họ phát hiện ra rằng cả hai phối tử cho thấy sự phù hợp bình đẳng cho
việc phát hiện chất analyte của chúng. Thiết bị của họ có một cách tiếp cận đa
kênh cho phép đọc song song của năm bộ phận cảm biến. Điều này mở ra khả
năng sử dụng cảm biến tham chiếu cho việc loại bỏ các tín hiệu nền và phát hiện
đồng thời của chất phân tích khác nhau bằng cách immobilizing ligand tương ứng
của họ trên điện cực riêng biệt.
Đối với các phương pháp trở kháng, thường là một tín hiệu đọc cực âm có
thể được tìm thấy trong hậu quả của sự gia tăng điện trở chuyển electron. Tuy
11
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

nhiên, Rodriguez và các cộng sự, 2005 đã mô tả thiết lập một phương pháp dựa
trên trở kháng dương biểu hiện tín hiệu đọc cực dương, sử dụng sự thay đổi điện
tích bề mặt từ âm sang dương khi gắn với protein đích (ở độ pH thích hợp).
Một cách tiếp cận tương tự, cũng phụ thuộc vào sự tương tác tĩnh điện,
được thực hiện bởi Cheng và cộng sự, năm 2007. Một aptamer DNA cho lysozyme
đã được cố định trên bề mặt vàng bằng cách tự lắp ráp và [Ru (NH 3) 6] 3+ gắn với
DNA phosphate xương sống thông qua tương tác tĩnh điện. Mật độ bề mặt của
aptamer có thể được xác định bằng cách đo chiều cao đỉnh giảm [Ru
(NH 3) 6] 3+ trong voltammogram chu kỳ. Khi ràng buộc đích của lysozyme với
aptamers, cation [Ru (NH 3) 6] 3+ bề mặt được giải phóng. Điều này có thể được
phát hiện như là một sự giảm trong phí tích hợp của đỉnh giảm.
Các trở ngại của phản ứng oxi hóa khử của K 3 Fe (CN) 6 trên một bề mặt
vàng do mật độ gia tăng của lớp phủ bằng cách gắn các aptamer DNA cố định với
thrombin mục tiêu của nó đã được sử dụng như là tín hiệu cho phản ứng ràng
buộc. Tín hiệu được đo bằng phép đo điện thế tuần tự. Bộ cảm thụ áp cho
thrombin có thể tái sử dụng và cho phép đo trong phạm vi phân tích thích hợp cho
các ứng dụng lâm sàng (xem hình 3.5).

Hình 3.5: Thiết bị cảm biến sinh học Aptamer cho protein

12
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Một phương pháp miễn phí nhãn khác là sử dụng các bộ phận giao thoa để
ràng buộc đôi vùng bị mắc kẹt của aptamer. Nếu các khu vực này gần với điện cực,
các bộ phận chuyển tiếp có thể phục vụ như là các phóng viên. Khi ràng buộc và
các thay đổi cấu hình liên tiếp, bộ phận chuyển tiếp có thể được giải phóng tạo ra
phản ứng tiêu cực. Một ví dụ được mô tả trong, trong đó một aptamer cho
thrombin được cố định trên một điện cực vàng. Methylene xanh (MB) intercalates
vào một vùng sợi đôi và sẽ được phát hành khi ràng buộc mục tiêu vì sự thay đổi
conformational của aptamer. Nồng độ đỉnh cathodic của MB hiện tại trong xung
điện áp xung khác nhau sẽ giảm khi nồng độ thrombin tăng lên.
Những kỹ thuật được mô tả ở trên là không có nhãn, tức là không nhận biết
sinh học cũng không phải mục tiêu phải gắn nhãn cộng hóa trị bằng các phân tử
chỉ thị và do đó bỏ qua bước tiếp theo trong quá trình sản xuất của cảm
biến. Ngược lại, nhiều chất hoá học điện hóa phụ thuộc vào việc ghi nhãn của bộ
nhận dạng sinh học với một đơn vị phóng viên.
Ví dụ, aptamers có thể được dán nhãn ở cả hai đầu. Ở một đầu, một phân tử
để cố định ở bề mặt được gắn với aptamer và ở đầu kia, phóng viên. Bề mặt điện
cực sau đó được phủ một lớp các aptamer. Khi ràng buộc mục tiêu, tính di động
của aptamer và hoặc mật độ của lớp bị thay đổi do sự thay đổi dạng
conformal. Điều này dẫn đến khoảng cách nhỏ hơn hoặc lớn hơn của đơn vị báo
cáo từ điện cực dẫn đến sự gia tăng hoặc giảm điện tử, tương ứng.
Các thử nghiệm Sandwich dựa trên khả năng có thể tạo ra nhiều hơn một
aptamer cho một mục tiêu protein. Một aptamer, gắn với bề mặt cảm biến, liên kết
mục tiêu ở một epitope. Các aptamer thứ hai, hướng đến một epitope khác nhau
được dán nhãn với phóng viên, ví dụ, (dehydrogenase glucose dehydrogenase)
(PQQ). Gắn kết các aptamers thứ hai vào đích đưa phóng viên vào gần bề mặt cảm
biến. Sau bước rửa, mối liên kết này được phát hiện (trong trường hợp này bằng
amperometry sau khi bổ sung glucose làm chất nền cho (dehydrogenase glucose
dehydrogenase) (PQQ) dẫn đến một tín hiệu đọc cực dương qua chất trung gian
redox 1-methoxyphenazine methosulfate.
3.1.3 Aptasensors quang học (optical aptasensors)
Các phương pháp truyền dẫn quang học trong aptasensors bao gồm việc sử
dụng cộng hưởng plasmon bề mặt, quang phổ sóng huỷ hoại, cũng như sự không
đẳng hướng huỳnh quang và phát hiện phát quang.
Sự cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) và các máy cảm biến sinh học dựa
sóng dựa sóng dựa vào sự thay đổi các tham số quang học khi những thay đổi
trong lớp gần bề mặt nhạy cảm hơn. Vì sự gắn kết của các protein vào một lớp thụ
cảm của các cảm biến sinh học này làm thay đổi chỉ số khúc xạ của lớp, nên sự
kiện ràng buộc có thể được phát hiện và định lượng theo cách miễn phí nhãn.
Một nền tảng sinh học mới để phát hiện protein nhanh kết hợp một trong
những phương pháp đơn giản nhất cho nồng độ phân tử sinh học, hình thành vòng
cà phê với một chương trình phát hiện quang học nhạy cảm dựa vào
aptamer. Trong cách tiếp cận này, các đèn hiệu aptamer được sử dụng cho việc

13
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

truyền dẫn tín hiệu, trong đó một tín hiệu huỳnh quang được phát ra trong sự hiện
diện của phân tử đích. Sự khuếch đại tín hiệu đạt được bằng cách tập trung các
phức hợp aptamer-target trong các giọt chất lỏng, dẫn đến sự hình thành các
"điểm" của vòng cà phê. Các bề mặt với nhiều lớp phủ hóa học đã được sử dụng
để khảo sát sự tương quan giữa tính k surface nước bề mặt, hiệu suất tập trung và
khuếch đại tín hiệu. Dựa trên kết quả của chúng tôi, chúng tôi thấy rằng sự gia tăng
đường kính vòng bánh cà phê với lượng giọt lớn hơn độc lập với bề mặt không hấp
dẫn. Hơn nữa, chúng tôi chỉ ra rằng các bề mặt có tính k highly nước cao tạo ra
nồng độ hạt tăng lên, thông qua hình thành vòng cà phê, dẫn đến cường độ tín hiệu
gấp 6 lần so với bề mặt ưa nước. Để xác nhận nền tảng sinh học này để phát hiện
các mẫu bệnh phẩm, chúng tôi đã phát hiện α-thrombin trong huyết thanh người và

Hình 3.6: Những hình ảnh huỳnh quang của các vòng tròn cà phê trên bề mặt được xử lý kính,
HDMS, và RainX. Mặt Hydrophobic tập trung các hạt có hiệu quả hơn các bề mặt ưa nước,
làm cho đường kính vòng nhỏ hơn. Mặt kính và bề mặt HDMS được chụp ở độ phóng đại 2
lần và các bề mặt được xử lý bằng Rainx được chụp ảnh ở độ phóng đại 10 lần.
4 lần pha loãng toàn bộ máu. Dựa trên kết quả của chúng tôi, các điểm đục cà phê
tạo ra các tín hiệu phát hiện 40x lớn hơn các mẫu trong các giọt chất lỏng. Ngoài
ra, bộ cảm biến sinh học này có giới hạn phát hiện thấp hơn 2 ng / mL (54 pM)
trong huyết thanh và 4ng / ml (105 pM) trong máu. Dựa vào tính đơn giản và hiệu
suất cao, nền tảng này thể hiện tiềm năng to lớn như một công cụ chẩn đoán không
tốn kém cho việc phát hiện các dấu hiệu sinh học của bệnh, đặc biệt là sử dụng ở
các nước đang phát triển thiếu các nguồn lực và cơ sở cần thiết cho thực tiễn sinh
học thông thường.
Phương pháp thực nghiệm như sau:
- Vật liệu và hóa chất
Các dung dịch keo của các vecni polystyrene nhuộm huỳnh quang (kích
thích/phát xạ: 580/605 nm) có chứa nồng độ 2% hạt nhân và hạt có kích thước
0,02 μm từ Invitrogen (Carlsbad, CA). Dung dịch được pha loãng trong nước khử
ion (DI) tinh khiết (Barnstead EASYpure) với điện trở suất ~ 18,3 MΩ / cm. Kính
hiển vi kính hiển vi được làm sạch trước đã được Fischer Scientific (Pittsburg,
PA). HDMS (hexamethyldisilazane) đến từ Cơ sở Nghiên cứu Nanoelectronics tại
UCLA và RainX đến từ một nhà cung cấp địa phương. Các trình báo cảnh báo
aptamer chống thrombin được sử dụng trong nghiên cứu này là AlexaFluor®647-

14
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

5-'CACTGTGGTTGGTGTGGTTGG-3', dán nhãn là FLUORapt, và 5'-

CAACCACAGTG-3'-3BHQ2, có nhãn là BHQ2apt. AlexaFluor®647 có bước
sóng kích thích/phát xạ 650/670 nm và có khả năng quang phổ đặc biệt. Tất cả các
oligomers là từ Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) và a-thrombin của
người từ Haematologic Technologies, Inc. (Essex Junction, VT). Huyết thanh
người và toàn bộ máu là từ Bioreclamation, LLC, (Westbury, NY). Protein và
aptamer được lưu trữ ở -20 ° C trước khi thí nghiệm.
- Chuẩn bị lớp phủ bề mặt và đặc tính bề mặt
Ba loại bề mặt khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu này: thủy tinh,
kính được xử lý bằng HDMS và kính được xử lý bằng kính RainX. Xử lý bề mặt
bằng HDMS: Trượt kính được làm sạch trong isopropanol, rửa sạch bằng nước DI
và làm khô ở 150 ° C trong 5 phút. Các phiến này đã được tiếp xúc với hơi HDMS
bão hòa trong 30 phút. Xử lý bề mặt RainX: RainX là phương pháp xử lý bề mặt
tổng hợp, không tạo bọt, thường được sử dụng trên kính chắn gió ô tô. Xử lý bề
mặt được thực hiện bằng cách cho ra dung dịch RainX lên khay thủy tinh và đánh
bóng bề mặt cho đến khi tất cả chất lỏng còn lại đã được loại bỏ. Các mẫu đã được
xử lý ngay trước góc tiếp xúc (CA) và các phép đo đặc tính vòng cà phê để giảm
thiểu sự biến động của các tính chất bề mặt có thể là do sự lưu trữ kéo dài. Tất cả
ba bề mặt được đặc trưng bằng cách thực hiện các phép đo CA tĩnh sử dụng một hệ
thống đo góc góc tiếp xúc FTA4000 First Ten Angstroms (Portsmouth, VA). Các
giọt nước DI của 5 μL được phân bổ lên bề mặt và hình ảnh đã được chụp và phân
tích bằng phần mềm FTA.
- Sự hình thành và mô tả nhân tố cà phê
Sự hình thành vòng các hạt cà phê của các dung dịch keo được tạo ra như
đã được Wong chứng minh trước đó. Tóm lại, các dung dịch keo được pha loãng
từ nồng độ cổ phiếu đến một phần nhỏ hơn ~ 0.0001%. Các giọt nhỏ 0.5, 1, 1.5, 3
và 5 μL được đưa vào ba bề mặt khác nhau bằng pipet và để khô trong điều kiện
bình thường khí quyển (nhiệt độ ~ 25 ° C và độ ẩm tương đối ~ 46%). Hình thành
vòng hạt cà phê đã được chụp ảnh dưới một bộ lọc huỳnh quang xanh (555 nm)
bằng kính hiển vi đảo ngược của TEXS Nikon Eclipse. Hình thành vòng tròn cà
phê trên bề mặt kính và bề mặt HDMS đã được chụp bằng cách sử dụng mục tiêu
2x và các bề mặt của Rainx đã được chụp ảnh bằng cách sử dụng mục tiêu
10x. Hình ảnh được chụp bằng một máy ảnh CCD Photometric (Tucson, AZ)
CoolSNAP và các tín hiệu huỳnh quang đã được phân tích bằng phần mềm RS
Image.
- Chuẩn bị Aptamer và phát hiện thrombin
Các xét nghiệm được thực hiện để phát hiện α-thrombin ở nồng độ hàng
loạt từ 1 đến 500 ng / mL. Các tia chớp chống trombin aptamer được tạo ra bằng
cách trộn FLUORapt và BHQ2apt với nhau trong bộ đệm Tris-EDTA (TE) (10mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA), làm nóng hỗn hợp đến 90 ° C trong 3 phút và làm mát
đến 25 ° C ở 0,2 ° C / s. Chuẩn bị Aptamer đã được thực hiện bằng cách sử dụng
một máy làm lạnh nhiệt của MJ Research. Thrombin được pha loãng trong bộ đệm
báo hiệu (20mM Tris pH 8,3, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2), huyết thanh hoặc 4 lần

15
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

pha loãng toàn bộ máu (trong nước DI), trộn với ađamer beacon (pha loãng tới 1
μg / mL) và ủ trong 30 phút ở 25 ° C, 31 ° C, 37 ° C và 43 ° C. Sau khi ủ, các giọt
nhỏ 1 μL của hỗn hợp aptamer-thrombin được đưa vào các phiến kính được xử lý
bằng RainX, sấy khô và phân tích bằng kính hiển vi huỳnh quang. Các giọt hỗn
hợp aptamer-thrombin không bị tập trung đã được chụp ảnh ngay sau khi được đưa
vào bề mặt. Mỗi phép đo được thực hiện trong vòng 5 giây và quan sát được
photobleaching không đáng kể. Tất cả các phép đo cường độ huỳnh quang được
thực hiện ở ~ 25 ° C bằng kính hiển vi đảo ngược định hướng Nikon Eclipse
TE2000. Các phép đo trong bộ đệm báo hiệu đã được chụp hình sử dụng mục tiêu
10x, và các phép đo trong huyết thanh và toàn bộ máu được chụp ảnh bằng mục
tiêu 4x. Tất cả các xét nghiệm phát hiện được chụp ảnh dưới một bộ lọc huỳnh
quang đỏ (647 nm), có biểu hiện tự phát huỳnh quang của máu và huyết thanh
không đáng kể. Các phép đo trong bộ đệm báo hiệu đã được chụp hình sử dụng
mục tiêu 10x, và các phép đo trong huyết thanh và toàn bộ máu được chụp ảnh
bằng mục tiêu 4x. Tất cả các xét nghiệm phát hiện được chụp ảnh dưới một bộ lọc
huỳnh quang đỏ (647 nm), có biểu hiện tự phát huỳnh quang của máu và huyết
thanh không đáng kể. Các phép đo trong bộ đệm báo hiệu đã được chụp hình sử
dụng mục tiêu 10x, và các phép đo trong huyết thanh và toàn bộ máu được chụp
ảnh bằng mục tiêu 4x. Tất cả các xét nghiệm phát hiện được chụp ảnh dưới một bộ
lọc huỳnh quang đỏ (647 nm), có biểu hiện tự phát huỳnh quang của máu và huyết
thanh không đáng kể.
Kết quả thí nghiệm:
- Tính k hydro nước bề mặt ảnh hưởng đến hình thành vòng cà phê
Điểm đốm cà phê được hình thành bằng cách sử dụng các dung dịch keo
của các hạt nhỏ huỳnh quang (ở nồng độ 200 μg / mL) trên ba mặt khác nhau: thủy
tinh, thủy tinh được xử lý bằng HDMS và kính được xử lý bằng kính RainX. Mỗi
bề mặt này có độ thủy nhiệt khác nhau: kính thuỷ tinh (CA ~ 26 ° ± 3 °), thủy tinh
được xử lý bằng HDMS nhẹ (CA ~ 65 ° ± 4 °) và thủy tinh được xử lý bằng kính
RainX là hydrophobic (CA ~ 96 ° ± 3 °). Các giọt nhỏ có thể tích từ 0.5 đến 5 μl đã
được sử dụng để điều tra sự tương quan giữa tính k hydro nước bề mặt và đường
kính vòng bánh cà phê. Như thể hiện trong “hình 1” , nhiều bề mặt k hydro nước
tạo ra đường kính vòng nhỏ hơn cho tất cả các thể tích giọt. Cơ chế cơ bản đầu tiên
mô tả phản ứng này là vùng tiếp xúc lỏng đến bề mặt và chu vi gắn pin tương ứng.
Ví dụ, một giọt nhỏ trên bề mặt k hydro nước (RainX) có diện tích tiếp xúc nhỏ
hơn so với cùng một giọt trên bề mặt ưa nước (thủy tinh). Do đó, chu vi đường dây
tiếp xúc, tức là nơi giọt được gắn lên bề mặt, được cô đặc và tạo ra một vòng cà
phê nhỏ hơn. Một trong những đặc điểm của sự hình thành vòng cà phê đặc biệt
phù hợp cho các ứng dụng sinh học là khả năng hình thành các cấu trúc vòng nhỏ
gọn từ các giọt các loại chất lỏng khác nhau như đệm, huyết thanh và máu. Đây là
một tính năng quan trọng, đặc biệt là khi sử dụng cảm biến này để phát hiện các
mẫu lâm sàng.
Phân tích định lượng để so sánh hành vi sinh trưởng của các vòng cà phê
được thực hiện bằng cách chuẩn hóa dữ liệu lên đường kính vòng ở 0,5 μL (Hình
3.7A). Từ biểu đồ này, chúng tôi chỉ ra rằng sự tăng trưởng đường kính vòng (từ

16
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

một giọt nhỏ hơn đến lớn hơn) có thể so sánh được trên tất cả các bề mặt và do đó
độc lập với bề mặt hydrophobicity. Các phép đo cũng được thực hiện bằng huyết
thanh và máu có hoạt động sấy tương tự như trong đệm. Sự tương đương về tăng
trưởng đường kính có thể được giải thích bằng thủy động lực học của sự hình
thành vòng tròn cà phê, tức là gắn dây nối. Đường kính vòng được xác định bởi
khối lượng giọt và đường nối dây ghim chuông, được dictated bởi CA. Bằng cách
cố định CA, đường kính vòng trở thành một chức năng của thể tích giọt. Chúng tôi
cũng chỉ ra rằng các vòng tròn cà phê trên bề mặt k hydro nước trở nên rộng hơn
khi chu vi bị giảm, làm tăng nồng độ hạt. Phân tích định lượng nồng độ vòng cà
phê trên các bề mặt khác nhau được thực hiện bằng cách đo tín hiệu huỳnh quang,
như cường độ đỉnh trên một đơn vị diện tích, các điểm đốm cà phê (Hình
3.7B). Các bề mặt của RainX tạo ra cường độ tín hiệu lớn nhất gấp 6 lần so với các
bề mặt ưa nước ở tất cả các giọt. Ngoài việc cung cấp khuếch đại tín hiệu tối ưu,
bề mặt RainX tạo ra những điểm đeo cà phê bị hạn chế trong một lĩnh vực hẹp,
ngay cả đối với các khối lượng giọt khác nhau. Đặc tính này đặc biệt thuận lợi cho
các hệ thống biosensing dựa trên quang học, điều này chỉ đòi hỏi một mục tiêu
phóng to cố định, cho phép tích hợp dễ dàng với các máy dò không tốn kém. Cũng
cần lưu ý rằng sự tạo ra các điểm vòng dây chuyền cà phê tạo ra các cấu trúc tương
đối đồng nhất với biến đổi hình học tối thiểu, cho phép tăng cường khả năng lặp
lại, đây là một thuộc tính được mong muốn cao đối với các phép đo phân tích.

Hình 3.7: (A) Sự phát triển của đường kính vòng hạt cà phê với lượng giọt tăng lên. Các bộ
dữ liệu được chuẩn hóa với đường kính vòng ở 0,5 μL. (B) Tín hiệu huỳnh quang của các
vòng cà phê từ việc tăng lượng giọt trên các bề mặt khác nhau. Mỗi thanh tượng trưng cho độ
lệch chuẩn ± độ lệch chuẩn (SD) của ba phép đo riêng biệt

17
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

- Đặc tính nhiệt độ cho hoạt động

gắn kết aptamer tối ưu
Các nghiên cứu được thực hiện để xác định nhiệt độ tối ưu cho sự kết hợp
aptamer để có được tín hiệu phát hiện cao nhất. Điểm đốm cà phê có chứa phức
aptamer-protein được tạo ra trong bộ đệm báo hiệu ở nhiệt độ khác nhau và tín
hiệu huỳnh quang thu được được đo. Chúng tôi sử dụng một đèn hiệu aptamer bao
gồm một aophamer chống thrombin được gắn nhãn fluorophore và một
oligonucleotide thứ yếu gắn với một máy làm lạnh. Trong cấu hình ban đầu của nó,
aptamer và oligonucleotide được lai tạo sao cho chất fluorophore và quencher sát
nhau, ức chế đèn hiệu từ huỳnh quang (Sch 1A). Aptamer được thiết kế để ưu tiên
bám vào thrombin; Do đó, khi thrombin có mặt, sự thay đổi cân bằng liên kết sẽ
làm cho protein gắn kết với aptamer và oligonucleotide để phân ly (Sch 1B). Kết
quả là, chất fluorophore không còn ngưng lại dẫn đến sự phát huỳnh quang huỳnh
quang. Sử dụng chiến lược thiết kế này, nồng độ thrombin được xác định bằng
cách định lượng cường độ huỳnh quang đỉnh của các điểm đốm cà phê.
Các điều kiện tối ưu cho sự kết dính aptamer phụ thuộc vào nhiều yếu tố,
bao gồm cấu trúc hóa học bên trong aptamer, và các yếu tố bên ngoài như thành
phần của môi trường mẫu và nhiệt độ kết dính aptamer. Bởi vì cảm biến này đã
được sử dụng để phát hiện các mẫu lâm sàng, nơi không thể kiểm soát thành phần,
chúng tôi tập trung nỗ lực của chúng tôi vào việc tối ưu hóa nhiệt độ aptamer. Các
bề mặt RainX được sử dụng độc quyền cho các nghiên cứu còn lại trong công trình
này, nhờ khả năng tạo ra mức khuếch đại tín hiệu lớn nhất và cường độ phát hiện
cao nhất.
“Hình 3.8” trình bày các dữ liệu định lượng về cường độ tín hiệu, như tỷ số
tín hiệu đến hậu trường (SBRs), điểm đốm cà phê ở nhiệt độ khác nhau, từ 25 ° C
đến 43 ° C và nồng độ protein khác nhau, dao động từ 1 đến 500 ng / mL. Từ biểu
đồ này, có thể nhận thấy tín hiệu phát hiện cao nhất thu được ở 37oC trong toàn bộ
dải nồng độ protein. Những kết quả này phù hợp với những kết quả được Hall et
al. Ở nhiệt độ <37 ° C, tín hiệu phát hiện thấp hơn đáng kể so với ở 37 ° C, đặc
biệt là từ 1 đến 30 ng / mL. Mặc dù dữ liệu này cho thấy rằng nhiệt độ thấp hơn
giảm thiểu hoạt động gắn kết aptamer, nó cho thấy rằng các tín hiệu phát hiện
không tăng tương ứng với nhiệt độ trên 37 ° C. Cụ thể, nhiệt độ vượt ngưỡng này

18
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

làm giảm hoạt động kết dính aptamer và giảm động học aptamer (ví dụ nhận dạng
protein, thay đổi gấp và thay đổi cấu trúc).

- Hiệu suất của cảm biến sinh học

vòng cà phê
Việc phát hiện ra α-thrombin trong huyết thanh người và 4x máu loãng toàn
phần đã được thực hiện để chứng minh khả năng áp dụng của nền tảng này để phát
hiện các mẫu lâm sàng. Các protein không bị cô lập trong các giọt dung dịch đệm
cũng được đo để so sánh sự cải thiện của khuếch đại nhận ra bằng cách sử dụng
nồng độ vòng cà phê. Hình 3.9 cho thấy dữ liệu định lượng về cường độ tín hiệu
đỉnh, như SBRs, trong huyết thanh ( Hình 3.9A) và máu ( Hình 3.9B). Từ những lô
này, chúng ta có thể thấy rằng các tín hiệu phát hiện của các điểm đốm cà phê cao
hơn đáng kể so với những người bị lơ lửng trong đệm. Đặc biệt, các tín hiệu huỳnh
quang của các mẫu giọt không tập trung không thể phát hiện được ngay cả ở nồng
độ protein được thử nghiệm cao nhất, 500 ng / mL, trong cả huyết thanh và
máu. Ngược lại, sự hình thành các điểm vòng tròn cho phép các phức hợp
aptamer-protein được tập trung chủ yếu, dẫn đến tăng cường khuếch đại tín
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động gắn kết aptamer và việc phát hiện protein tiếp
theo. α-thrombin được phát hiện trong đệm ở 25 ° C, 31 ° C, 37 ° C và 43 ° C bằng cách sử dụng
vòng tạo vòng cà phê trên bề mặt RainX. Đây là những nhiệt độ mà tại đó các dung dịch aptamer
được chuẩn bị và các giọt đã được làm khô. Dữ liệu được vẽ trong các đơn vị huỳnh quang tương
đối (RFU) và biểu thị tỷ số tín hiệu tới nền (SBR) của mỗi phép đo. Mỗi điểm dữ liệu thể hiện
mức trung bình ± SD của ba phép đo riêng biệt.

hiệu. Dựa trên các xét nghiệm pha loãng nối tiếp, bộ cảm biến sinh học này giới
hạn phát hiện ra 2ng / ml (54 pM) trong huyết thanh và 4ng / ml (105 pM) trong
máu, tương đương với các aptasensors thrombin đã được báo cáo trước đây.
Những giá trị này nằm trong phạm vi của nhiều biomarkers có liên quan lâm sàng,
làm cho cảm biến sinh học này phù hợp với các ứng dụng chẩn đoán khác
nhau. Ngoài ra, bằng cách so sánh dữ liệu này với phát hiện trong đệm (Hình 3.8),
chúng ta có thể thấy rằng hiệu suất tăng lên một chút là đạt được trong huyết thanh
và toàn bộ máu. Vì hoạt động aptamer và hiệu suất liên kết bị ảnh hưởng bởi thành
phần mẫu, chúng tôi suy đoán rằng hoạt tính aptamer được cải thiện trong các mẫu
lâm sàng này là kết quả của các thành phần bổ sung (các phân tử sinh học, chất
điện phân, vv) không có trong đệm. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng axit
nucleic bị ảnh hưởng bởi các tương tác với các phân tử khác (ví dụ các protein
trong tế bào) và các ion, ảnh hưởng đến cấu trúc gấp lại của chúng và hoạt động
gắn kết. Trên cơ sở các báo cáo này, chúng tôi suy luận rằng sự ổn định của phức
hợp aptamer-thrombin của chúng tôi được cải thiện trong máu và huyết thanh, nơi
sự tách biệt của aptamer khỏi oligonucleotide làm nguội được tăng cường, dẫn đến
các tín hiệu huỳnh quang khuếch đại thậm chí ở các nồng độ thrombin thấp hơn.

19
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

(Hình 3.8: Phát hiện α-thrombin trong huyết thanh người (A), và (B) 4x máu loãng toàn bộ từ
đốm cà phê và các giọt chất lỏng. Kết dính Aptamer được thực hiện ở 37oC và các vòng cà phê
được tạo ra trên bề mặt RainX. Dữ liệu được vẽ trong các đơn vị huỳnh quang tương đối (RFU) và
thể hiện SBR của mỗi phép đo. Mỗi thanh thể hiện trung bình ± SD của ba phép đo riêng biệt )

Phát hiện trong máu toàn bộ kết quả là cường độ huỳnh quang đã được thấp
hơn một chút so với những người trong huyết thanh. Vì toàn bộ máu chứa các
thành phần khác (tế bào máu, fibrinogen) không có trong huyết thanh, chúng có
thể gây cản trở hoạt động gắn kết aptamer, do đó giảm thiểu tín hiệu huỳnh
quang. Ngoài ra, các phép đo trong máu toàn bộ cần hình ảnh lâu hơn (0,55 giây)
so với các phép đo trong huyết thanh (0,02 giây), chúng tôi cho rằng có sự hiện
diện của các tế bào máu. Cụ thể, sự phát huỳnh quang được hấp thụ và nghẽn bởi
các tế bào máu, dẫn đến các tín hiệu phát hiện thấp hơn so với những tế bào trong
huyết thanh. Chúng tôi cũng quan sát thấy rằng việc hình thành các vòng cà phê
trong huyết thanh và toàn bộ máu đòi hỏi thời gian ủ bệnh ngắn hơn một chút so
với các chất được tạo ra trong đệm. Điều này có thể được quy cho các thành phần
khác nhau của huyết thanh và máu, có chứa nồng độ chất tan cao hơn so với dung
dịch đệm. Mặc dù các phép đo trong huyết thanh và máu đòi hỏi một số sửa đổi
nhỏ đối với phương pháp thực nghiệm, hiệu ứng vòng cà phê vẫn hiệu quả trong
việc tập trung phức hợp aptamer-thrombin để tăng cường khuếch đại tín hiệu, dẫn
đến các tín hiệu phát hiện cao hơn so với các mẫu trong các giọt chất lỏng.
Phân tích dữ liệu được thực hiện bằng cách vẽ ra các cường độ phát hiện
trong một định dạng log-log để nghiên cứu hiệu suất của cảm biến sinh học trong
một phạm vi rộng. Như thể hiện trong (hình 3.10), các phép đo trong máu thể hiện
mối tương quan tuyến tính trên toàn bộ phạm vi của các nồng độ được kiểm định
từ 1 đến 500 (người/mL). Đặc biệt, dữ liệu thể hiện một mối quan hệ tuyến tính
trong một định dạng log-log có thể được gắn với luật năng lượng y = axe n trong
đó cường độ y, tỉ lệ thuận với nồng độ x, bởi một hệ số mũ n. Chúng tôi xác
định n bằng cách lắp các đường hồi quy tuyến tính vào dữ liệu, được thể hiện trong
cốt truyện. Trong phạm vi nồng độ thử nghiệm, chúng tôi thu được giá trị 0,37
chon với hệ số tương quan là 0,97. Có tính đến các kết quả trước đây được trình
bày trong nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh rằng bộ cảm biến nhẫn vòng cà

20
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

phê này có hiệu quả cao trong việc tập trung các protein để khuếch đại tín hiệu,
cho phép tăng cường cường độ tín hiệu. Khi kết hợp với một chương trình cảm
nhận nhạy cảm, nền tảng này cung cấp một phương pháp đơn giản và chi phí
thấp để phát hiện ra phân tử sinh học, mang lại nhiều ưu điểm chính so với các thử
nghiệm dựa trên phòng thí nghiệm thông thường mà thường đòi hỏi phải tốn nhiều
thiết bị và quá nhiều lao động khuếch đại mẫu và các phép đo độ nhạy cao.

Hình 3.10: Log-log âm mưu của cường độ tín hiệu so với nồng độ α-thrombin trong 4x máu pha
loãng toàn bộ. Dữ liệu thể hiện sự tương quan tuyến tính giữa 1 đến 500 ng / mL có thể được lắp
vào một mối quan hệ quyền lực pháp luật. Kết hợp các đường hồi quy tuyến tính với dữ liệu dẫn
đến yếu tố mũ, n, là 0,37 với một hệ số tương quan là 0,97. Mỗi điểm dữ liệu thể hiện mức trung
bình ± SD của ba phép đo riêng biệt.

Kết luận
Chúng tôi báo cáo một aptasensor vòng cà phê mới cho phát hiện phân tử
sinh học dựa trên một nền tảng biosensing không tốn kém, nhạy cảm cao. Công
nghệ này sử dụng chiến lược khuếch đại tín hiệu cực kỳ đơn giản dựa trên nồng độ
vòng cà phê. Các chất nền với tính chất bề mặt khác nhau đã được điều tra, cho
thấy các bề mặt có tính k highly nước cao làm cho nồng độ lên tới 6 lần so với bề
mặt ưa nước. Ngoài ra, bề mặt k hydro nước giữ chặt vòng kính vòng cà phê trong
một phạm vi hẹp của xem, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tích hợp với các đơn vị
phát hiện chi phí thấp di động. Kết hợp với một chương trình cảm biến nhạy cảm
aptamer, chúng tôi sử dụng nền tảng này để phát hiện các protein liên quan lâm
sàng. Đặc biệt, α-thrombin được sử dụng như một hệ thống mô hình có thể phát
hiện ở nồng độ xuống đến 2 ng / ml (54 pM) trong huyết thanh và 4 ng / ml (105
pM) trong máu toàn phần pha loãng 4 lần. Hơn nữa, các phức hợp aptamer-
thrombin trong cà phê vòng vòng tạo ra tín hiệu huỳnh quang 40x lớn hơn so với
các giọt chất lỏng. Tóm lại, nền tảng sinh học này cung cấp một công nghệ phát
hiện đơn giản và hiệu quả về chi phí, trước đây là nhu cầu sử dụng các bộ khuếch
đại mẫu đòi hỏi nhiều lao động và các bộ cảm biến có độ nhạy cao. Hơn nữa,
chúng ta hình dung rằng nền tảng này có thể được sử dụng để kiểm tra chẩn đoán
trong các cơ sở hạn chế nguồn lực và các nước đang phát triển để giảm thiểu gánh

21
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

nặng của các bệnh truyền nhiễm, như HIV (virus gây suy giảm miễn dịch ở người),
sốt rét và lao...
3.1.4 Aptasensors nhạy khối lượng (mass sensitive aptasensors)
Các phương pháp vi lượngvimetric trên các tinh thể thạch anh áp điện dựa
trên sự thay đổi tần số dao động của tinh thể khi thay đổi khối lượng tại bề mặt của
nó do sự kết hợp của receptor-target (thạch anh thạch anh, QCM). Sự thay đổi tần
số dao động này là tín hiệu được phát hiện. Với phương pháp này, bạn có thể phát
hiện ra mục tiêu theo nhãn. Tuy nhiên, việc sử dụng "nhãn trọng lượng" - ví dụ
như aptamer chức năng Au nano hạt - cho sự khuếch đại của các phản ứng liên kết
trên bề mặt QCM có vẻ hữu ích
Tinh thể thạch anh được tráng với lớp vàng và streptavidin sau đó được cố
định. Các aptamer biotinyl được bổ sung và sử dụng làm lớp thụ thể. Aptamers
DNA được sử dụng để phát hiện IgE với giới hạn phát hiện là 100 μg / L và phạm
vi phát hiện tuyến tính từ 0 đến 10 mg / L. HIV-1 protein Tat được phát hiện bằng
cách sử dụng aptamers RNA như các thụ thể. Các giới hạn phát hiện là 0.25 ppm
và 0.65 ppm với các dãy phát hiện tuyến tính từ 0 đến 1.25 ppm và 0-2.5 ppm
tương ứng đã đạt được

3.1.5 Aptasensors tìm năng (potentionmetric aptasensors)

Cảm biến Potentiometric dựa trên sự đo lường sự khác biệt về điện thế giữa điện
cực làm việc và điện cực tham chiếu gây ra bởi sự khác biệt về nồng độ các chất phân
tích. Transistor hiệu ứng Field thuộc về lớp cảm biến Potentiometric. Các bóng bán dẫn
hiệu ứng trường nano cacbon (CNT-FETs) là những ứng cử viên hứa hẹn nhất có thể
thành công với công nghệ CMOS (bổ sung kim loại oxide-chất bán dẫn) bằng cách thu
nhỏ lại. Các hành vi bán dẫn của CNTs là lý do chính cho nỗ lực để xây dựng CNT-FETs.
Các thiết bị CNT-FETs cải tiến của Aptamer để phát hiện IgE được xây dựng và so
sánh với các cảm biến sinh học CNT-FET dựa trên một kháng thể monoclonal (mAb)
chống lại IgE. 5'-amino-sửa đổi aptamers 45-mer và IgE-mAb đã được cố định trên các
kênh CNT tương ứng. Lượng ròng ròng ròng tăng lên phụ thuộc vào nồng độ IgE sau khi
đưa IgE vào CNT-FET đã được sửa đổi aptamer. Đã xác định giới hạn phát hiện 250 pM
và dải động tuyến tính 250 pM đến 20 nM. Bộ cảm biến IgE-mAb chỉ cho thấy một sự
thay đổi nhỏ về dòng rò rỉ lưới tại 0,2 và 1,8 nM IgE. Các CNT-FETs đã cải tiến aptamer
cho thấy khả năng phát hiện IgE tốt hơn trong các điều kiện tương tự so với kháng thể
đơn dòng dựa trên CNT-FET.
Sau đây, chúng ta sẽ tìm hiểu về công nghệ phát hiện protein với
potentionmetric aptasensors: một nghiên cứu so sánh giứa polynaniline và đầu dò
ống nana carbon đơn tường.
Chất liệu và phương pháp:
- Cảm biến SWCNT:
25mg SWCNTs đã được tinh chế và làm khô được nghiền trong một máy
xay cẩm thạch và hòa tan trong 10mL nước Milli-Q có chứa 100mg sodium

22
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

dodecyl sulfat (SDS) để tăng độ hòa tan của SWCNT trong nước. Dung dịch được
sonicate trong 30 phút ở 2s-1 để đạt được độ đồng nhất cao nhất. Giải pháp
sonicated được phun với ám suất khoảng 1 bar lên bề mặt glassy carbon dưới máy
thổi khí bằng nhiệt độ cao (khoảng 200oC) bằng cách phun 35 lần, nhúng bề mặt
vào nước Milli-Q trong điều kiện chuyển động trong khoảng 5 lần xịt để loại bỏ
SDS vì sự có mặt của chúng làm giảm độ dẫn của mạng SWCNT. Chúng tôi đặt
một lớp dày khoảng 30µm (đo bằng SEM) của SWCNT tinh khiết vào đầu đã đánh
bóng của một bề mặt glassy carbon (GC). Cuối cùng, để đảm bảo chắc chắn lại bỏ
SDS, các que GC được phun SWCNT được đặt vào lò CVD ở 300 oC trong 1 giờ
dưới lưu lượng không khí thấp. Các nhóm carboxylic của SWCNT được kích hoạt
bằng dung dịch chứa 200 mM EDC và 50mM NHS [25] (hòa tan trong MES
buffer, 50mM and pH 5.0). Bề mặt GC chứa SWCNTs được nhúng trong dụng
dịch này trong 30 phút. Để liên kết hóa trị TBA vào các thành SWCNTs thông qua
sự tấn công hạt nhân của amin đến các nhóm carboxylic hoạt động, cảm biến sau
đó được nhúng qua đêm trong dung dịch chứa 0,001M PBS và 1µM 5’-amin-TBA.
- Cảm biến PANI
Các màng Polyaniline đã được tạo màng hóa điện vào đầu cuối của một
thanh glassy carbon qua phương pháp tuần hoàn với hệ thống điện ba cực bao gồm
một điện cực tham chiếu Ag/AgCl, một dây platinum như một điện cực ngược
chiều, và một que GC như một điện cực hoạt động. Trước khi điện phân, que GC
được xử lý trước với điện thế 0,85V trong thời gian 10s để kích hoạt bề mặt. Quá
trình điện phân của anilin được thực hiện bằng phương pháp động lực học trên que
GC trong phạm vi điện thế từ -0,15 đến 0,85V trong dung dịch 0.5M H 2SO4 bằng
cách sử dụng 50 chu trình điện thế với tốc độ quét là 100mV/s. Cuối cùng, đầu dò
PAIN- cải tiến GC được nhúng vào dung dịch 5µM TBA qua đêm để vô hiệu hóa
aptamer thrombin thông qua sự thay thế aromatic ở bề mặt dẫn polymer, theo cách
này thu được aptasensor PANI Potentiometric.
Cả hai loại cảm biến đã được rửa triệt để với nước milli-Q để loại bỏ các
aptamer không đính kèm.
Đo đạt:
Các phép đo điện thế vecto cho cả quá trình mạ điện của phép tính PANI và
mật độ ligand được thực hiện trong một tế bào điện cực khoảng đơn có dung tích
10mL. Hỗ trợ chất điện phân, H2SO4 và hexaammineruthenium, được khử oxy hóa
bằng cách tẩy với khí nitrogen trong 10 phút trước khi đo và khí nitrogen được tạo
bọt tỏng suốt quá trình thí nghiệm. Các phép đo Potentiometric được tiến hành
trong dung dịch PBS 5mM. Điều này rất quan trọng để duy trì mức độ sinh lý pH
của aptamers và thrombin. Dung dịch được khuấy đều trong suốt quá trình với tốc
độ 1000 vòng/phút. Hệ thống điện hai cực bao gồm điện cực tham chiếu Ag/AgCl
và cảm biến GC được khai triển để làm điện cực hoạt động.
- Đo mật độ bề mặt của TBA

23
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Số lượng các TBA thăm dò được liên kết hóa trị vào PANI tính được dựa
vào các phân tử oxi hóa của hexaammineruthenium tạo thành các cặp ion với anion
của TBA không bền. Phép bù được cung cấp các nhóm anion phosphate trong TBA
bởi cation, điển hình là Na+, K+ và H+. Các cation này dễ dàng trao đổi với các
cation khác trong môi trường vì sự liên kết liên tục giữa các cation TBA phosphate
tăng theo cation thay đổi. Khi một cảm biến TBA được đặt trong chất điện phân có
cường độ ion thấp có chứa cation đa trị, các cation cuối trao đổi với cation gốc và
trở nên tĩnh. Các cation bị giữ, hexaammineruthenium trong tường hợp của chúng
ta, do tính oxy hóa có thể dễ dàng mất đi tại các điện cực như một loại hạn chế bề
mặt. Kết quả thay đổi tại bề mặt có thể dàng tính được từ chu kỳ voltammogram
bằng cách các cực tiểu phù hợp. Trong điều kiện bão hòa, lượng
hexaammineruthenium liên kết bề mặt tỷ lệ thuận với mật đồ bề mặt của các
aptamer gắn với ống nano carbon và chất nền PANI. Mục tiêu là để các định bề
mặt điện cực bằng cách xác định tổng số và mật độ của TBA trong cả mặt cảm
biến và để giải thích độ nhạy và sự khác biệt về độ ổn định được quan sát giữa hai
cảm biến đã được nghiên cứu.
- Thiết lập potentionmetric
Các giá trị EMF đucợ ghi lại với SWNCTs được thay đổi bởi TBA và cảm
biến PANI được đo với điện cực tham chiếu Ag/AgCl với một điện kế đa kênh
Lawson trong dung dịch 5mM PBS để duy trì cường độ ion thấp. Đối với thí
nghiệm phát hiện thrombin, các tế bào potentionmetric được đưa vào dung dịch
trong đó các dung dịch thrombin được liên tiếp bổ sung làm tăng nồng độ
thrombin từ 0.5mM đến 800mM, tương đương với mức sinh lý tối đa trong máu.
Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt dộ 37oC.
Kết quả vào thảo luận:
- Mật độ Phối tử mặt đưa vào Functionalized PANI và SWCNTs
Voltammetric TRU là phép đo trực tiếp mật độ điện tích (mol/cm 2) của cặp
ion [Ru(NH3)6]3+ với các nhóm photphat của các cảm biến TBA sửa đổi. Nó có thể
được tính bằng

TRU = ,

Khi Q thu được từ tích phân oxy hóa khử không bền trong chu kỳ
voltammograms của phức hợp hexaammineruthenium ở điểm bão hòa (Hình 3.11),

24
Nhóm 8, đề tài 4

Hình 3.11A Hình 3.11B

Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

n là số các electron trong phản ứng khử từ Ru(III) đến Ru(II), F là hằng số
Faraday, và A là diện tích của điện cực hoạt động.

Giá trị TRU được tính có thể được chuyển đổi trực tiếp thành mật độ bề
mặt TBA, TTBA, trong mol/cm2 sử dụng mối quan hệ:

TRU = TRU ( NA,

Khi m là số nucleotic trong TBA, z là lượng hexaammineruthenium tham

gia phản ứng oxy hóa khử, đó là 3 trong trường hợp của chúng ta, và N A là số
Avogadro. Để xác định được mật đô bề mặt phối tử, 1mM dung dịch
hexaammineruthenium được thêm vào tế bào điện hóa từ 1µM tới 130µM
hexaammineruthenium với sự có mặt của 5mM PBS cho đến khi bão hòa như đucợ
biểu diễn trong hình 1. Với mỗi bước tiếp theo, một chu kỳ CV được ghi lại sau
khi bổ sung lượng hexaammineruthenium tương ứng mà không có bất kỳ sự thay
đổi nào đối với tế bào điện hóa. Tất cả CV được phủ lên và hiển thị cho PANI
(Hình 3.11A) và SWCNT (Hình 3.11B).
Theo các dữ liệu trong hình 1, ở cả hai cảm biến, CV có các đỉnh cực âm
(giảm) và anot (oxy hóa) liên quan đến hexaammineruthenium, nhưng cực tiểu
được chuyển đổi tới với hexaammineruthenium với TBA, cho thấy tín hiệu bắt đầu
từ hexaammineruthenium bị ràng buộc trong TBA. Lý tưởng nhất, không nên có
sự cách biệt các cực anot và catot cho một phân tử bị hạn chế bề mặt. Khoảng cách
các cực có thể bị gây ra bởi sự điều khiển vận động hoặc tốc độ truyền electron
giữa các bề mặt tương đương với tốc độ quét. Nguyên nhân khác cho sự có mặt
của “nonideality” có thể là sự phân lý và kết hợp của [Ru(NH 3)6]3+/2+ đi kèm với
quá trình điện hóa do sự khác nhau tỷ lệ stoichiometric PO 43-/
hexaammineruthenium khi hexaammineruthenium ở trạng thái oxy hóa và trạng
thái bị giảm. Kết quả này chũng chỉ ra rằng hexaammineruthenium có chút hiện
dieneh ở bề mặt PANI. Điển hình của điện dung đối với cảm biến nano carbon
được quan sát trong hình 1(b). Thu vực dưới cực catot (trừ đi sự đóng góp điện
dung) liên quan đến tổng số phức hợp hexaammineruthenium đã bị giảm. Theo các
khu vực có được theo PANI và cực SWCNTs, có sự tích tụ điện tích trên SWCNT
cao hơn nhiều. Những kết quả này có thể là do điện tích bề mặt của ống nano
carbon lớn hơn và mật độ bề mặt cao hơn của aptemer thormbin liên kết hóa trị với
bề mặt sau.
Giá trị tủng bình của bão hòa điện tích ở 130µM được sử dụng để tích toán
mật độ hexaammineruthenium, TRU (mol/cm2). Giá trị này là 5,18.10 -12 mol/cm2 và
5,19.10-12 đối với cảm biến PANI và SWCNTs, Đặt giá trị này cho tổng mật độ bề
mặt aptamer trên mỗi cm2. Sau khi ước lượng diện tích gàn đúng của mỗi cảm
biến, mật độ bề mặt aptamer có thể dễ dàng tính toán.

25
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Theo IUPAC, diện tích bề mặt của điện cực không kim loại có thể ducojw
ước lượng bằng cách xác định tổng điện dung của bề mặt điện cực và giả định lớp
gấp đôi, đó là phần ghi lại điện dung, là quá trình duy nhất trong trạng thái các
đường cong voltammetric được ghi lại. Chúng tôi phải ước tính tổng điện tích (Q)
bằng cách tích hợp các cực trung bình cation bắt đầu từ 1µM đến 130µM trong chu
kỳ voltammgrams của hexaammineruthenium trong hình 1 và sau đó tính toán tổng
điện dung, CT, bằng cách chia nso bởi tốc đọ quét theo biểu thức C T = δQ/δE =
Iδt/δE= I/(δE/δt). Diện tích cảm biến thu được bằng cách chia ước lượng tổng điện
dung, CT, bằng giá trị tham chiếu thực nghiệm, C * (10µF/cm2), được sử dụng cho

điện dung của SWCNT, như sau: có thể dễ dàng tính được A =

Bảng 3.1 cho thấy giá trị thu được từ việc bổ sung
hexaammineruthenium đến bộ cảm thụ dựa trên PANI và SWCNT. Kết quả thu
được thể hiện sự khác biệt đáng kể về diện tích bề mặt cho cả hai cảm biến: 164,29
cm2 cho SWCNT với 11,27 cm2 cớ PANI với độ lệch chuẩn 25.7 cm 2 và 2.16cm2
cho SWCNTs và PANI, tương ứng (N=3). Diện tích bề mặt cảu glassy carbon là
0,07cm2. Sự gia tăng diện tích cảu cảm biến PANI được cho là do cấu tạo của các
polymer trên bề mặt tạo sự ghồ ghè nhẹ với bề mặt GC. Sự khác biệt diện tích giữa
các cảm biến PANI và SWCNTs có thể là kết quả thực tế tỷ lệ diện tích với dung
tích của SWCNTs cao hơn nhiều so với chuỗi PANI được đặt trong không gian
cảm biến 2 chiều của bề mặt cảm biến. Hơn nữa, hệ thống giống spaghetti của
SWCNTs so với phân bố có trật tự của chuỗi PANI cũng giúp thu được kết quả
này. Tổng tiêu tốn trên bề mặt có thể được tính bằng 5,53.10 -6 C với PANI và
8,21.10-5 C với các cảm biến dựa trên SWCNT với độ lệch chuẩn là 1,08.10 -6C và
1,29.10-5C cho PANI và SWCNTs, tương ứng (N=3). 6,23.10 11 và 6,24.1011 Các
phân tử TBA trên mỗi cm2 của các bề mặt PANI và SWCNT, tương ứng, dẫn đến
tổng của 7,03.1012 phân tử aptamer trên PANI và 1,03.1014 phân tử aptamer trên
SWCNT trên tổng mật độ bề mặt. Tất cả độ lệch tiêu chuẩn được trình bình trên
bảng 3.1.

TTBA NTBA trên diện

A(cm2) Q(C) TRU(mol/cm2)
(molecule/cm2) tích bề mặt
PANI 11,27 5,63.10-6 5,18.10-12 6,23.1011 7,03.1012
SWC
164,29 8,21.10-5 5,19.10-12 6,24.1011 1,03.1012
NT
PANI
St. 2,16 1,08.10-6 9,94.10-13 1,20.1011 1,00.1012
dev.
SWC 25,7 1,29.10-6 8,11.10-13 9,77.1010 1,06.1013
NT
St.

26
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

dev.

- Potentionmetry
Các phản ứng Potentiometric của các TBA biến đổi dựa trên cảm biến PANI
và SWCNTs chống lại thormbin được đánh giá. Đánh giá được thực hiện khi xem
xét rằng hệ thống cảm biến không dựa trên quá trình cân bằng; do đó, nó không thể
được giải thích bởi lý thuyết Nernstian. Các cảm biến không chứa bất kỳ màng nào
để cung cấp cho quá trình cân bằng cần thiết để thực hiện lý thuyết Nernstian, và
chúng tương tự như các vùng transistors (FETs), cũng được coi là các cảm biến
potentiometric .Thay vào đó, mục tiêu của chúng tôi là một
Bảng 3.1
protein trung tính, nơi điểm đẳng điện cực nằm trong khoảng
pH 7,0-7,6. Ý tưởng là sự thay đổi cấu trúc của aptamer trong suốt quá trình ràng
buộc sẽ làm thay đổi giá trị điện dung của môi trường xung quanh SWCNTs /
PANI (các phần tử truyền tải) dẫn đến tín hiệu phát hiện được. Trong trường hợp
này, phản ứng có thể được coi là nhạy cảm, ít nhất đối với bất kỳ loại phát hiện bán
hoặc định lượng nào, vì chất phân tích đích là một protein cho thấy một bệnh trên
hoặc dưới mức độ nghiêm trọng trong máu.
Thời gian ổn định cho cảm biến PANI dài hơn (16 giờ) so với khoảng 30
phút cần thiết cho cảm biến ống nano cacbon sử dụng cùng điều kiện thí nghiệm.
Nó có thể liên quan đến thời gian cần thiết để đạt được trạng thái cân bằng của
phân đoạn axit nucleic trên các bề mặt khác nhau và thiết lập lớp đệm hai mặt
trong bộ cảm biến PANI chứ không phải là cảm biến SWCNT. Điều này cũng có
thể là do sự ổn định hóa học tương đối thấp và độ nhạy sáng cao hơn của PANI đối
với SWCNTs. Hình 2 cho thấy các phản ứng Potentiometric thu được khi tăng tổng
nồng độ Thrombin trong dung dịch. Cả hai cảm biến được giữ mà không có chất
phân tích cho đến khi đạt đến trạng thái ổn định, và các bộ phận bổ sung đã được
thực hiện đồng thời ở cả hai bộ cảm biến vì lý do kỹ thuật. Độ nhạy được tính là
2,97 mV/decade và 8,03 mV/decade đối với các bộ cảm ứng PANI và SWCNTs.
Các kết quả này phù hợp với mật độ bề mặt cao hơn của aptamers trong cảm biến
chiết áp SWCNT. Hình 2 cho thấy đường cong hiệu chuẩn trung bình (N=3) của
phản ứng Potentiometric cho cả SWCNT và PANI.

27
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Hình 3.12

Sự lựa chọn của cả hai cảm biến được đo lường đối với elastase và BSA
riêng biệt. Cả hai cảm biến không cho thấy phản ứng đáng chú ý cho đến khi đạt
mức 2 μM. Các lần bổ sung được thực hiện đầu tiên bằng khoảng từ 0,5 μM đến
800 nM như trong các thí nghiệm Cảm biến mà không có phản ứng đáng chú ý.
Sau đó, bổ sung đã được tiến hành vởi 1 μM đầu tiên và sau đó là 2 μM các protein
gây cản trở, ở đó chúng cho thấy một tín hiệu đáng chú ý.
So sánh hiệu suất của PANI và SWCNTs như các đầu dò trong các
aptasensor potentiometric, khía cạnh đầu tiên là PANI có thể được lắng đọng bằng
điện hóa lên bề mặt GC với độ kiểm soát rất cao về độ dày. Việc kiểm soát độ dày
tương tự khó tiếp cận với ống nano cacbon sử dụng bất kỳ kỹ thuật lắng đọng sẵn
có nào. Tuy nhiên, giao diện cảm biến được sản xuất rất khác nhau ở cả hai cảm
biến: trong khi chúng ta có bề mặt khá đồng nhất với PANI (diện tích = 11,27cm 2),
bề mặt ống nano cacbon nano giống spaghetti rất thô và không đồng nhất tạo ra
một giao diện bề mặt rất lớn (diện tích = 164,29cm2).
Chất hóa học được sử dụng để cố định aptamer thrombin vào bề mặt cho
kết quả rất giống nhau về chỉ định mật độ bề mặt của phối tử (T TBA khoảng xấp xỉ
6,2.1011 molecule cm2 trong cả hai cảm biến). Trong khi sự thay thế liên quan đến
một nhóm thiol được sử dụng để liên kết các aptamers với PANI (hình 3.13), các
liên kết hoá trị qua các nhóm carboxylic đã được thiết lập giữa các thụ thể và
SWCNTs. Tuy nhiên, rất khó để có thể dùng các diện tích bề mặt trong cả hai chất
nền cho thấy sự khác biệt lớn trong tổng số phối tử liên kết với bề mặt (N TBA =
7,03.1012 trong ANI và 1,03.1014 trong SWCNTs).

28
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Hình 3.13

Xét rằng SWCNTs có tổng diện tích bề mặt tương đói lớn hơn bề mặt
PANI, một tỷ lệ phần trăm cao hơn của aptamers cố định và hoạt động có thể là
nguyên nhân của sự khác biệt trong độ cảm quan sát được. Một lý do khác cho sự
cảm cao hơn có thể là do mối quan hệ tương đối cao hơn được gây ra bởi trục
chính hóa trị của sự tương tác acid-amoni cacboxylic. Ngoài ra, có một số tương
tác tĩnh điện gây ra trục chính phosphate của TBA và bề mặt tích điện dương của
PANI. Các tương tác này phải cao hơn các tương tác giữa TBA và CNTs để tổng
năng lượng cần thiết cho TBA để có được giữ quyền chủ mức bốn G sẽ thấp hơn
trong trường hợp CNTs được cho là nguồn phản ứng tiềm năng. Cần có những
nghiên cứu sâu hơn để có thể giải thích sự khác biệt này dựa trên sự tương đồng và
khác biệt trong cả hai cơ chế chuyển đổi. Tuy nhiên, cả hai bộ cảm biến đều có
cùng độ phát hiện (LOD) (80 nM cho cảm biến dựa trên SWCNT và 71 nM cho
cảm biến dựa trên cảm biến PANI). Mức độ ồn tương đối thấp trong cảm biến dựa
trên PANI được cho là đáng tin cậy hơn LOD một chút.
Để kết luận, sử dụng một phân tử oxy hóa để xác định tổng lượng điện
tích trên bề mặt của bộ cảm biến biến đổi TBA và kết quả là có thể tính được mật
độ bề mặt phối tử có thể giúp tăng cường hiệu năng của cảm biến. Tuy nhiên,
phương pháp hiện tại không cung cấp thông tin về sự hình thành và sự phân bố của
các phân tử aptamer trên bề mặt SWCNT / PANI. Cần phải nghiên cứu thêm để
xác định sự hình thành chính xác của aptamers để hiểu rõ hơn các hiện tượng tiềm
ẩn của EMF được tạo ra. So với cảm biến chiết áp dựa trên CNT đã được báo cáo
trước đó, cảm biến dựa trên PANI không cung cấp độ nhạy và độ ổn định tốt. Tuy
nhiên, cả hai bộ cảm biến phản ứng với các protein cản trở biểu hiện một hành vi
chọn lọc tương tự.
3.2 Ưu điểm, nhước điểm
3.2.1 Ưu điểm

29
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Aptamer có khả năng tương tác cao và tính đặc hiệu của nó đối với các
phần tử dù rất nhỏ, chẳng hạn như các ion, hoặc các phân tử nhỏ...tính chính xác
cao.
Một khi lựa chọn được đối tượng, Aptamer có thể nhanh chóng tổng hợp
hàng loạt sản phẩm thông qua phản ứng hoá học… hiệu quả về thời gian.
Các Aptamer dễ dàng phản ứng hơn các kháng thể, đặc biệt là với sự thay
đổi của môi trường làm ảnh hưởng: Nhiệt độ, cảm ứng điện từ…
Các Aptamer có tính oligonucleotide, chúng có thể tương tác với các phân
dử DNA hoặc RNA khác, do đó có thể tạo ra các máy cho nhiều ứng dụng khác
liên quan.
3.2.2 Nhược điểm
Vì nó rất nhỏ nên từ nghiên cứu chuyển sang ứng dụng đại trà là một việc
khó.
Kết hợp giữa phần điện tử với phần sinh học trở nên khó khăn hơn khi các
phản ứng xảy ra trong trạng thái nhỏ.
Các kĩ thuật về Aptamer để nâng cao hiệu suất và kinh tế vẫn là điều mới
mẻ, do đó ít được biết đến.
Cấu trúc và tính đặc hiệu của Aptamer thường phụ thuộc vào độ pH, nồng
độ Ion và độ nhớt, Các phản ứng không phải do tính đặc hiệu của Aptamer cũng
xảy ra ngẫu nhiên do đó các điều kiện sinh hoá học này sẽ ảnh hưởng đến kết quả.
3.3 Tìm năng
Aptamer sẽ là một bước tiến mới trong công nghệ phát hiện đạm cũng như
phát hiện các phân tử khác có liên quan.
Sử dụng Aptamer trong xác định Đạm nếu được phát triển sẽ được người
dùng phổ thông ưa chuộng vì các tính chính xác cao và giảm kích thước sản phẩm,
dẫn đến giảm giá thành sản xuất thiết bị.
4. Kết luận
Việc sử dụng aptamers như các thụ thể sinh học mới có thể đẩy nhanh sự
phát triển của các cảm biến sinh học có liên quan thực tế. Do sự ổn định đặc biệt
cao, tính chọn lọc và độ nhạy, các aptasensors có khả năng vượt qua được sự thiếu
ổn định về chức năng và lưu trữ của hầu hết các cảm biến sinh học (ngoài một số
trường hợp ngoại lệ như glucose và chất xúc tác lactat được thiết lập trên thị
trường). Tổng quan này cho thấy có rất nhiều nguyên tắc cảm biến sinh học (ví dụ
điện hóa, quang học, khối lượng nhạy cảm) có sẵn để sử dụng aptamers như là thụ
thể sinh học. Tuy nhiên, chỉ cho một vài protein (thrombin, lysozyme, IgE và một
số khác) đã được mô tả aptasensors. Các aptamers hơn cho các protein sẽ được
phát triển và đặc trưng, càng nhiều aptasensors sẽ được phát triển trong tương lai

30
Nhóm 8, đề tài 4
Biosensor trong xác định đạm
___________________________________________________________

Danh mục tài liệu tham khảo

 Tài liệu tiếng Việt (1-4), tiếng Anh (5-8)

1, đ.-á. (n.d.). http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-tong-quan-tai-lieu-ve-biosensor-53065/.

2, h. h. (n.d.). http://hoahocngaynay.com/vi/nghien-cuu-giang-day/bai-nghien-cuu/658-cam-bien-
sinh-hoc.html.

3, l. (n.d.). https://linhvucysinh.chatvoinhakhoahoc.vn/2017/01/09/thua-co-em-muon-biet-la-the-
nao-la-aptamer-va-ung-dung-cua-aptamer/.

4, r.-s. (n.d.). https://hoclai.wordpress.com/2012/11/02/aptamer-la-gi.

5, n. (n.d.). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3697175/.

6, n. (n.d.). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4131697/.

7, h. (n.d.). https://www.hindawi.com/journals/tswj/2013/282756/.

8, w. (n.d.). https://en.wikipedia.org/wiki/Aptamer.

31
Nhóm 8, đề tài 4