INTRODUCCIÓN A LA

CROMATOGRAFÍA

POR:
Q.F. MANUEL ALFREDO
VALLE CAMPOS
 La cromatografía se define como una
 técnica analítica que permite aislar, identificar
y cuantificar, en base a la distinta afinidad de
los componentes de una mezcla compleja, con
una F.E. por una parte y una F.M. por otra. La
afinidad se debe a interacciones entre soluto y
F.M. y soluto y F.E., dentro de las cuales se
pueden mencionar: ión – ión; ión – dipolo;
dipolo – dipolo; puentes de hidrógeno; fuerzas
de Van der Waals, etc.
 La cromatografía puede cumplir dos funciones
básicas que no se excluyen mutuamente:
 Separar los componentes de la mezcla, para
obtenerlos más puros y que puedan ser usados
posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la
mezcla (finalidad analítica). En este caso, las
cantidades de material empleadas son
extremadamente pequeñas.
 CROMATROGRAFÍA
 La separación del analito de los posibles
interferentes es de vital importancia en los
procedimientos analíticos . El modo mas
común es la cromatografía inventada a
principios del S-XX por el botánico ruso
Mikhail Tswett .
 CHROMO= Color
 GRAPHEIN = Escribir
 Definición según UIPAC
 Método usado principalmente para la separación de
los componentes de una muestra, en el cual los
componentes son distribuidos entre dos fases, una de
las cuales es estacionaria, mientras que la otra es
móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz).
La fase estacionaria puede ser empaquetada en una
columna, extendida en una capa, distribuida como
una película, etc
 HISTORIA

 La cromatografía tuvo sus comienzos en 1850

con la separación de anilinas por el químico
Friedrich Ferdinand Runge. Descubrió que
cationes orgánicos se podían separar por
migración cuando se colocaba una solución
que los contenía sobre un material poroso,
como papel.
 A partir de 1940 los métodos cromatográficos
adquieren extensión mundial de forma que en
1940 Tiselius divide los métodos
cromatográficos en cromatografía por análisis
frontal, desarrollo por elución
y desarrollo por desplaza-
miento. Obtuvo el premio No-
bel por sus trabajos, en 1948.
 Otros investigadores que contribuyeron al avance de la
cromatografía fueron: Los químicos Khun, Kamer y
Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la
química orgánica e inorgánica, donde obtienen el
premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939
respectivamente.

 Al mismo tiempo que Tiselius la cromatografía se

aplicaba en el campo de la bioquímica, y así Martin y
Synge consiguen separar algunos aminoácidos
acetilados. Reciben Premio Nobel en Química en 1952.
 Fundamento

 Conjunto importante y diverso de métodos que

permite separar componentes en mezclas
complejas que no se logran por otros métodos .
En cromatografía la muestra se disuelve en una
fase móvil ( liquido , gas o FSC) que pasa a
través de la fase estacionaria inmiscible que se
mantiene en una columna o superficie sólida .
 CLASIFICACIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍA
Por la forma de soporte de la fase
estacionaria:
a.-C. en columna ( gravedad o presión )
b.-C. plana (capilaridad o gravedad).
Por el tipo de Fase Móvil.
a.- C. Líquida
b.-C. gaseosa
c.- C. Fluidos súper críticos
 CLASIFICACIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍA
 Por el tipo de interacción de la muestra con la F.E.
a) Adsorción
b) Partición o Reparto
c) Fase Reversa
d) Intercambio Iónico
e) Exclusión de Tamaño

Por el tipo de F.M y F.E.

a) C.L.L b) C.L.S.
c) C.G.L. D) C.G.S.
 Tabla N° 1 Relación de los Diferentes Métodos Cromatograficos
Clasificación General Método Especifico Fase Estacionaria Tipo de Equilibrio
Cromatografía de Líquido – Líquido o de Líquido adsorbido sobre Distribución entre líquidos
Líquidos. F.M. Líquidos Reparto un sólido inmiscibles
Líquido – fase unida Especies orgánicas Distribución entre el
químicamente enlazadas a una líquido y la superficie
superficie sólida enlazada.
Líquido – sólido, o Sólida Adsorción
adsorción
Intercambio Iónico Resina de intercambio Intercambio Iónico
Iónico

Exclusión por tamaño Líquido en los intersticios Distribución/Exclusión

de un sólido polimérico

Cromatografía de Gases. Gas – Líquido Líquido adsorbido sobre Distribución entre un gas
F.M. Gas un sólido y un líquido

Gas – fase unida Especies orgánicas Distribución entre el

químicamente enlazadas a una líquido y la superficie
superficie sólida enlazada

Gas - Sólido Sólido Adsorción

Cromatografía de Fluídos Especies orgánicas Distribución entre el
Supercríticos. F.M. Fluído enlazadas a una fluido supercrítico y la
Supercrítico superficie sólida superficie enlazada
 Términos Cromatograficos más
comunes
 1.-Constante de distribución (K).- Es el
equilibrio que en la cromatografia describe la
transferencia de un analito entre las fases
estacionarias y móviles:
K = Cs
CM
También se le conoce como coeficiente de
distribución o coeficiente de reparto.
 2.-Factor de Retención o Factor de
capacidad (K’).- Describe las velocidades de
migración de los solutos en las columnas
cromatograficas. Ejemplo para un soluto A
K’A = KA.Vs
VM
donde: Vs y Vm representan los volumenes de
soluto en la F.E. y F.M respectivamente.
 3.- Factor de Selectividad (α ).- En una
columna cormatografica esta definido para dos
analitos A y B como la razón entre el
coeficiente de distribución del analito más
fuertemente retenido y el coeficiente de
distribución del menos retenido o que eluye
con mayor rapidez.
α = KB
KA
A partir de esta definición el factor de
selectividad siempre es mayor que la unidad.
 4.- Velocidad lineal promedio de migración
del soluto(V): Es la relación entre la longitud
del relleno de la columna L y el tiempo de
retención del soluto tR
V = L/tR
5.-Velocidad lineal promedio del
movimiento de las moléculas de la fase móvil
(u).- Es la relación entre la longitud del relleno
de la columna y el tiempo muerto.
u = L/tM
 Técnicas de Desarrollo en una
columna
 Dentro de las técnicas de desarrollo en una
columna tenemos:
 Análisis Frontal.-Se coloca una gran cantidad
de muestra y el primer eluyente es el único que
eluye puro los siguientes componentes
aparecen como mezclas el análisis términa
cuando la mezcla que eluye tiene la
composición de la muestra.
 Análisis por Desplazamiento.- En este tipo de
análisis la muestra es disuelta en una pequeña
cantidad de solvente; se coloca en la fase
estacionaria y se hace migrar sobre ella a la
Fase móvil que tiene un agente desplazante
que tiene como caracteristica ser más
fuertemente retenido por la F.E.

 De esta forma fuerza a que los analitos vayan
siendo desplazados por acción de este agente
el análisis culmina cuando emerge el agente
desplazante.
 Posee dos ventajas.
 Posibilidad de aislar en estado puro una
fracción de cada analito presente y
 que la muestra se concentra en vez de diluirse.
 No se usa para análisis cuantitativos.
 Desarrollo por elución
 Representa el concepto básico de la separación
cromatográfica y es la técnica más usada en los distintos
métodos cromatográficos (gaseosa, líquido-gas, líquido-
líquido, sólido-líquido).
 Para describir esta técnica considérese una mezcla de sólo
dos componentes. Dicha mezcla se introduce en el extremo
superior de una columna adsorbente y sus componentes se
separan en zonas, al pasar uno o más eluyentes a través de la
columna, debido a las distintas afinidades entre los
componentes y ambas fases.
 La fase móvil es adsorbida débilmente por la fase sólida
estacionaria. Este ideal teórico de desarrollo por elución no
siempre se consigue en la práctica. Es un método analítico
esencial.
 Teorías Cromatograficas
 Existen dos teorías que explican el proceso
cromatografico:
 A) T. de los Platos.- Basada en que un sistema
cromatografico esta constituido por una serie de
capas discretas de platos teoricos,en los cuales se
alcanza un equilibrio entre la F.M y la F.E. El soluto
se mueve por transferencia paso a paso por cada
plato.
 B) T. Cinetica o de la Velocidad.-Considera que el
movimiento de los analitos se realiza atraves de los
espacios vacios de la F.E. a medida que son
transferidos hacia ella y através de ella.
 Ecuación de Van Deemter
 Expresa la aproximación matematica del
comportamiento de una columna cromatografica y se
puede escribir de la siguiente manera:
 H = A + B/u + Cu o H = A + B/u + (Cs + Cm)u
 Donde:
 H = Altura de plato en cm.
 A = Camino múltiple
 B = Difusión Longitudinal
 C = Transferencia de masa entre las fases
Difusión en remolino o de Eddy o
camino múltiple
 Se debe a los distintos caminos que toman las
moléculas del soluto al atravesar la fase
estacionaria. Aquellas partículas de soluto que
atraviesen canales más amplios, viajarán más
rápido con la fase móvil, y aquellas que vayan
por canales más estrechos viajarán más
lentamente.
 DIFUSIÓN LONGITUDINAL
 „Este es un término mas importante en
cromatografía de gases. Se debe a que las
moléculas del soluto se mueven en distintas
direcciones en la fase estacionaria debido a la
porosidad de las partículas que la forman. Esto
hace que algunas moléculas del soluto salgan
retrazadas de la columna respecto a la mayoría
ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Y EFECTO DE LAS
VELOCIDADES DE MIGRACIÒN
 Velocidades de migración de las
especies
 La efectividad de una columna
cromatogràfica para dispersar dos analitos
depende en parte de las velocidades relativas
con las que eluyen las dos especies:
TIEMPO DE RETENCIÒN .
TIEMPO MUERTO.
ELUCIÒN
 Cromatograma

tŔ
SEÑAL DETECTOR tR

tM

compuesto analito TIEMPO

no retenido
por FE
 COMO DESCRIBIR LA EFICACIA DE
COLUMNA
 MARTIN Y SYNGE : mayor N y menor H
 ALTURA DE PLATO ( H ).- Esta relacionada con
la forma gaussiana que tienen los picos por lo que
aplicando un concepto estadistico a estos picos o
bandas cromatograficas se les puede aplicar la
varianza ( σ2) por lo que la altura de un plato
teorico sería:
H = σ2/ L
 NÙMERO DE PLATOS TEÒRICOS ( N )

N=L/H
L = Longitud del relleno de la colùmna.
 VARIABLES QUE INFLUYEN EN LA EFICACIA
DE COLUMNA

Velocidad de la fase móvil

Coeficiente de distribución en la FM( aumenta
con el aumento de temperatura y disminución
de la viscosidad)
Coeficiente de distribución en la FE
Factor de capacidad ( K )
Diámetro de la partícula de relleno
Grosor del recubrimiento líquido en la F.E.
 OPTIMIZACIÒN DE LA EFICACIA DE
UNA COLUMNA

 La separaciòn cromatografica se optimiza

variando las condiciones experimentales hasta
que los componentes de la mezcla se separen
totalmente en el menor tiempo posible.Para
lograrlo se puede variar la temperatura o la
composiciòn de la FM , utilizando un relleno
de columna distinto, cambiar N, cambiando la
long. De onda y H , por alteraciòn del caudal
de FM.
EL PROBLEMA GENERAL DE
LA ELUCIÒN
RESOLUCIÓN DE COLUMNA ( Rs )

 Constituye una medida cuantitativa

de su capacidad para separar dos
analitos .
 Esto se logra alargando la columna ,

aumentando el N ,pero ello puede

llevar al aumento de la temperatura
para la separaciòn.
Aplicaciónes de la cromatografìa
 Análisis cualitativos ( TR )
 Análisis cuantitativos ( rapidez , simplicidad ,
bajo costo, .)
º Basados en la altura de pico
º Basados en área de pico
º Calibración y patrones .
º Método del estándar interno.