Maria Fernanda Cordova Hernandez

PRACTICA 6: DETERMINACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

1. Introducción

Muchas veces podemos reconocer plantas afectadas por bacterias por los síntomas
específicos que presentan: manchas foliares (tizones, cancros), agallas, marchitez,
necrosis vasculares, y podredumbres blandas. Pero, muchas veces por la
naturaleza misma de la acción bacteriana encontramos plantas en estado de
descomposición. Para recuperar al causante del daño, la opción es recurrir a
inocularlas en tejidos de reserva adecuados, que permitan obtenerlas e
identificarlas (Delgado, 2019).

2. Objetivos
-Reconocer los principales síntomas que ocasionan las bacterias fitopatógenas en
los principales cultivos de la región.
- Determinar la Prueba de Gram.
- Conocer algunos métodos para su identificación: Pruebas biológicas, Prueba de
microcorrida y Prueba del flujo bacteriano.

3. Materiales
-Material vegetal enfermo
-Microscopio
-Mechero de alcohol
-Sacabocados
-Medio de cultivo PDA
-Asa de siembra
-Cámaras de humedad
-Papel toalla
-Porta y cubreobjetos
-Pipetas

4. Metodología
Prueba biológica
De la planta con pudrición bacteriana avanzada, se toma una pequeña muestra del
mucilago, esta porción se coloca en un trozo de papa o zanahoria bien lavadas,
secas, y recién cortadas, se agrega una gota de agua destilada estéril para facilitar
la movilización de la bacteria. Se coloca en una cámara de humedad, y se evalúa
después de las 48 horas hasta alcanzar los 7 días. Todo esto se realiza bajo
condiciones de asepsia.

Aislamiento bacteriano
Las muestras con síntomas asociados a los producidos por bacterias deberán
someterse a los siguientes pasos:
1° Lavar muy bien con agua de cano
2° Cortar trozos que involucren el tejido afectado
3° Someter a hipoclorito de sodio al 0,5% por Imin. Enjuagar
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4° Lacerar el tejido con un bisturí flameado, en una placa de Petri limpia, que
contenga agua estéril. Machacar el tejido en un mortero con agua estéril.
5° Con un asa bacteriológica, coger del líquido de la placa y estriar en medio
PDA sin antibiótico
6° Incubar
7° Identificación en base a forma de colonia y color de colonia

Prueba de flujo bacteriano

Se realiza en tallos de plantas con marchitez violenta. Se corta un trozo del tallo
de la planta afectada y se lo suspende dentro de un vaso o tubo de ensayo
conteniendo agua. A los pocos segundos podrá observarse la presencia de una
turbidez a manera de hilos que salen de los haces vasculares afectados.

Prueba de microcorrida
Consiste en tomar un trozo de tejido foliar, que presente sintomas asociados a
bacterias fitopatógenas, como son manchas acuosas angulares o manchas
necróticas con halos, y colocarlo sobre una gota de agua en un portaobjetos muy
limpio, colocar el cubreobjetos, y observar a nivel de microscopio la difusión de
la bacteria desde el trozo de tejido hacia el agua a manera de una turbidez.

Tincion Gram
Preparar los frotis bacterianos, coger una muestra del flujo bacteriano sobre una
gota de agua.
2. Teñir con cristal violeta 1 min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1 min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o solo alcohol hasta que la preparación deje de
perder color (30%)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teñir con safranina 1 min
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparación.
11. Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada preparación.
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5. Resultados
1. Selección y desinfección de material de trabajo
a) Órganos con pudrición
 Tomate

Figura 1. Tomate con síntoma de Figura 2. Corte de zona afectada

pudrición Fuente: Elaboración propia
Fuente: Elaboración propia

Figura 3. Machacar tejido con agua esteril

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 Lechuga

Figura 4. Lechuga con pudrición a Figura 5. Desinfección de hoja con

nivel de la hoja pudrición, a través de batería.
Fuente: Elaboración propia Fuente: Elaboración propia

Figura 6. Añadir 1 ml de agua Figura 7. Molienda de tejido con

estéril pudrición y agua estéril
Fuente: Elaboración propia Fuente: Elaboración propia

b) Papa para prueba biológica

Figura 8. Papa sana bien lavada Figura 9. Desinfección de papa

Fuente: Elaboración propia mediante la batería de
desinfección
Fuente: Elaboración propia
Maria Fernanda Cordova Hernandez

2. Prueba biológica

Figura 11. Con la

Figura 10. Papa
siguiente herramienta se Figura 12. Se hecho 1
desinfectada , se cortó
procedió a hacer una ml de agua en la herida
en mitades, guardando
herida en la rodaja de hecha
condiciones de asepsia
papa Fuente: Elaboración
Fuente: Elaboración
Fuente: Elaboración propia
propia
propia

Figura 13. Se procedió Figura 14. Se procedió a

a armar una cámara inocular a la papa, con el
húmeda macerado del tejido
Fuente: Elaboración afectado
propia Fuente: Elaboración propia
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Figura 15. Se colocó la papa inoculada
en la cámara húmeda por una semana
Fuente: Elaboración propia
3. Aislamiento bacteriano
Figura 16. Macerado de tomate
Fuente: Elaboración propia
Figura 18. Con una asa de siembra
esterilizada se cogio una gota del
macerado
Fuente: Elaboración propia
Figura 16. Papa inoculada después
de una semana, no se observa
pudrición
Fuente: Elaboración propia
Figura 17. Macerado de Lechuga
Fuente: Elaboración propia
Figura 19. Sembrado de gota de
macerado en placa de PDA,
guardando condiciones de asepsia y
esterilización
Fuente: Elaboración propia
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Figura 20. Cultivo de lechuga, Figura 21. Cultivo de malva (mala

después de una semana. Se observa
colonias blancas
Fuente: Elaboración propia
hierba en cultivo de lechuga),
después de una semana. Se observa
dos tipos de colonias, una naranja
(levadura), y otra blanca.
Fuente: Elaboración propia

6. Conclusiones
-La tinción Gram, Prueba de microcorrida y flujo bacteriano, son pruebas difíciles
de observar, debido a que requieren de un estado de pudrición muy avanzada.
-La Prueba biológica en papa, es un método sencillo, que requiere de una papa
sana y limpia, en la cual se inoculara un macerado del tejido afectado, y se dejara
reposar en una cámara de humedad durante una semana para observar la bacteria
en estudio y poder identificarla.
-El aislamiento bacteriano es una prueba que requiere de asepsia, en la cual se
inoculara el macerado del tejido afectado en una placa de PDA, y se podrá observa
la morfología de las colonias, para poder identificar a la bacteria en estudio.

7. Bibliografía
Delgado M. (2019). Prácticas de Fitopatología. Universidad Nacional de San
Agustín: Arequipa.