Procedimiento experimental tomado de Chemicol composición and oxidativo

evolución of Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L.) oil Fromm Xishuangbanna

(China)

1. Curva de calibración con ácido gálico

En este ejemplo se hará una disolución de ácido gálico de 3125 mg/L (disolución
concentrada o madre), a partir de esta disolución se prepararán 10 mL de
disoluciones diluidas de concentraciones crecientes de ácido gálico entre 50 y 500
mg/L, según se detalla en la tabla 2. Para ello se procederá de la siguiente manera:

a. Preparar los tubos de ensayo numerados.

b. Añadir a cada tubo la cantidad correspondiente de agua destilada (tabla 2).
c. Añadir a cada tubo la cantidad correspondiente de ácido gálico (tabla 2).
d. Agitar en vortex y mantener en oscuridad y en refrigeración.

REACTIVOS CONCENTRACIÓN µg/mL

Concentración
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
dilución µg/mL
Sol. Madre
0.16 0.32 0.48 0.64 0.8 0.96 1.12 1.28 1.44 1.6
GAE mL
Agua mL 9.84 9.68 9.52 9.36 9.2 9.04 8.88 8.72 8.56 8.4

Tabla 2. Preparación de la curva patrón de ácido gálico a partir de una disolución

concentrada de 3125 mg/L.

e. Tomar 2mL de cada disolución patrón de ácido gálico y colocarlos en

matraces aforados de 25 mL.
f. Diluir con agua hasta llegar a un volumen de 5mL.
g. Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin Ciocalteu
h. Homogeneizar el contenido de los matraces y dejar reposar 3 minutos en
oscuridad.
i. Transcurrido este tiempo, adicionar a cada matraz 1mL de la disolución de
carbonato sódico (35 % v/v), mezclar y llevar a un volumen de 10 mL con
agua destilada.
j. Homogeneizar los matraces y mantener en oscuridad a temperatura
ambiente durante 2 horas.
k. Medir la absorbancia a 725 nm.
l. A partir de los valores de absorbancia obtenidos de cada concentración de
ácido gálico se construirá la correspondiente recta de calibrado. Absorbancia
vs µg/L GAE.
2. Extracto metanolico

a. Disolver 2,5g de aceite en 5 mL de hexano.

b. Extraer con metanol/agua (80:20 v/v) por 2 minutos, bajo una atmosfera de
nitrógeno con un electronic blender.
c. Centrifugar por 20 min a 4000 rpm.
d. Repetir el proceso de extracción 2 veces.
e. Unir los extractos y almacenar a -20°C

3. Determinación de compuestos fenoles totales en el extracto.

a. Diluir 2 mL de la fase metanolica con agua hasta un volumen total de 5 mL.

b. Adicionar 0,5 mL del reactivo de Folin.
c. Homogeneizar el contenido de los matraces y dejar reposar 3 minutos en
oscuridad.
d. Transcurrido este tiempo, adicionar a cada matraz 1mL de la disolución de
carbonato sódico (35 % v/v), mezclar y llevar a un volumen de 10 mL con
agua destilada.
e. Homogeneizar los matraces y mantener en oscuridad a temperatura
ambiente durante 2 horas.
f. Medir la absorbancia a 725 nm.
g. A partir de los valores de absorbancia obtenidos de cada concentración de
ácido gálico se compara con la curva patrón de GAE.
h. Se expresa los resultados como mg de GAE por 100 g de aceite. (mg
GAE·100 g-1 oil).

4. ¿Cómo se pueden cuantificar los polifenóles en la muestra de aceite con

los datos de la recta patrón?

Para ello hay que sustituir el valor de la absorbancia obtenida para la muestra en la
ecuación de la recta de calibrado (valor de la ordenada, “y”) y despejar “x” que
corresponde a la concentración de ácido gálico en el aceite.
Para poder expresar los resultados en mg de ácido gálico por 100 g de aceite,
hemos de tener en cuenta la cantidad de disolvente empleado en la extracción y la
cantidad de muestra que hemos tomado para realizar el análisis.
Así, en nuestro ejemplo: si se tomaron 2,5g de aceite y se emplearon 10 mL de
metanol en la extracción, se procedería de la siguiente manera

solución madre
ítem diluciones extracto curva ensayo
50mL
GAE mg 156,25
metanol/agua 80:20 54
aceite g 7.5
hexano mL 15
reactivo de Folin ml 5 1.5
carbonato de sodio al
10 3
35% mL
agua destilada mL 50 100 30 9
solución madre mL 10 30
dilución ml 20
extracto mL 6
REACTIVOS PARA DPPH Y FENOLES TOTALES

ÍTEM cantidad
DPPH mg 29.9988

ACIDO GÁLICO g
3

ACETATO DE ETILO mL
423.76

ACEITE SACHA INCHI g

16.5

n--hexano mL
40

metanol/agua (80:20 v/v) mL

150
hexano mL 20

reactivo de Folin mL
10

carbonato de sodio al 35% mL

15

agua destilada mL
500