INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

ACADEMIA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

LABORATORIO DE INGENIERÍA DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS

PRÁCTICA 3
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN CONEJOS

ALUMNOS:
• Chávez Hernández José Ignacio
• Flores Portillo Angel Alexis
• Gómez Téllez Vianey Lucille
• Lamas Ayala Jorge Luis
• Parra López Isadora
• Valadez Gil Juan Emanuel

Grupo: 8FV1 Equipo: Bunny Team

PROFESORAS:
Chávez Infante Verónica
Cabrera Laura Cristina
Moreno Guerrero Karen Gisela
Ocampo Ocampo Israel

Ciudad de México a 04 de diciembre de 2018

Contenido
1. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 3
1.1 Objetivo General .................................................................................................................... 3
1.2 Objetivos específicos. ............................................................................................................ 3
2. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 3
3. MARCO TÉORICO ....................................................................................................................... 4
4. METODOLOGÍA ........................................................................................................................... 5
4.1 Obtención del suero pre-inmune y post protocolo del sujeto de pruebas ............................... 5
4.2 Obtención del antígeno (Suspensión de eritrocitos humanos 47.3 % transmitancia) ............. 5
4.3 Inmunización del sujeto de prueba......................................................................................... 5
4.3.1 Calendario de inmunización ............................................................................................ 6
4.4 Precipitación medio sólido: Inmunodifusión doble .................................................................. 6
4.5 Precipitación medio líquido: Precipitación en capilar. ............................................................. 6
5. RESULTADOS ............................................................................................................................. 7
5.1 Resultados de precipitación en medio sólido: inmunodifusión doble ...................................... 7
5.2 Resultados de precipitación en medio líquido: Precipitación en capilar .................................. 8
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS ..................................................................................................... 10
7. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 11
8. REFERENCIAS .......................................................................................................................... 11
ANEXOS ............................................................................................................................................ 12
A1. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE SANGRE A HUMANOS ................................................ 12
A2. PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN ......................................................................................... 13
A3. MANEJO DE ANIMALES ......................................................................................................... 15

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 PRÁCTICA 3
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN CONEJOS

1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Producir anticuerpos policlonales con eritrocitos como antígeno en conejo () como sistema de
producción.

1.2 Objetivos específicos.

 Establecer un protocolo de inmunización para la obtención de anticuerpos policlonales.
 Obtener eritrocitos como antígeno.
 Ensayar las técnicas de inmunización con animales de uso común (conejos) en el laboratorio.
 Comprobar producción de anticuerpos policlonales mediante precipitación en capilar e
inmunodifusión doble.
 Efectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a una
saturación final del 33%.
 Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reacción de precipitación que ocurre
cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo homólogo.

2. INTRODUCCIÓN

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 3. MARCO TÉORICO
Los antígenos son moléculas de procedencia exógena o endógena que resulta extraña al organismo,
para aquellos antígenos que inducen una respuesta inmune se ha propuesto el término inmunógeno.
La inmunogenicidad es la potencia o capacidad que tiene una molécula para generar una respuesta
inmune y depende tanto de su naturaleza, como de la inherente al individuo en el que actúa. Por
ejemplo, es importante el tamaño del antígeno, polisacáridos de alto peso molecular frecuentemente
resultan inmunogénicos, sin embargo, otras moléculas de menor tamaño, pero con gran complejidad
estructural también son efectivas. (Vega, 2009)
Los anticuerpos son proteínas que pertenecen a la fracción γ-globulina del suero, están constituidos
por dos cadenas proteicas: pesada y ligera. Aunque de estructura semejante, existen varias clases
inmunoglubulinas que se diferencian por sus características fisicoquímicas, fisiológicas e
inmunológicas. Se producen en el organismo en respuesta a los antígenos, y estos son capaces de
interaccionar específicamente entre sí.
La formación de anticuerpos tiene lugar en células procedentes de la medula ósea, llamadas linfocitos,
que en presencia del antígeno maduran. Cada linfocito produce un único anticuerpo, sin embargo, en
el suero sanguíneo de un animal inmunizado no aparece solo un anticuerpo, sino una mezcla de
heterogéneos de ellos, llamado antisuero o anticuerpos policlonales. (Coll, 1993)
Los anticuerpos policlonales frecuentemente reconocen múltiples epítopes haciéndolos más tolerantes
a pequeños cambios en la naturaleza del antígeno. Son frecuentemente la opción preferida para la
detección de proteínas desnaturalizadas; también pueden ser generados en una variedad de especies,
incluyendo conejos, cabras, ovejas, asnos, gallinas y otros, dándole al usuario muchas opciones en el
diseño experimenta. A veces son usados cuando la naturaleza del antígeno en una especie no
estudiada no se conoce y al unirse a múltiples epítopes generalmente proveen una detección más
robusta. (Calderón, 2007)
Eritrocitos humanos como antígeno.
Los antígenos de los eritrocitos están compuestos por azucares que protruyen de la membrana de la
superficie de estos, unidos a un componente denominado ceramida.
Por lo tanto, son una serie de cuatro azúcares se une a la ceramida, a esta estructura se le unen otros
azucares que le dan la especificidad a cada antígeno. (Arbeláez, 2009)
La respuesta es del tipo humoral, es decir es mediada por inmunoglobulinas, cuyas funciones
principales son: neutralización, opsonización y activación del complemento. Los anticuerpos
sanguíneos son usualmente IgG y/o IgM y en casos raros IgA. (Grispan, 1983)

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 4. METODOLOGÍA
4.1 Obtención del suero pre-inmune y post protocolo del sujeto de pruebas

Dejar coagular en Centrifugar a Decantar

Sangrado del sujeto de prueba Conservar a
baño maría a °C por 3500 rpm, 5 suero en tubo
por vena central minutos. minutos. eppendorf

4.2 Obtención del antígeno (Suspensión de eritrocitos humanos 47.3 %

transmitancia)

Extracción de sangre (20 mL) Dejar coagular en baño maría a

Centrifugar a 3500 rpm 15 Ajustar
de un individuo sano. °C por minutos.
min, realizando lavados suspensión
con solución salina (x3). a 47.3% T

*Es necesaria una prueba de esterilidad en medio fluido de tioglicolato de acuerdo al MGA 0381
de la FEUM.

4.3 Inmunización del sujeto de prueba

Limpiar con Colocar En esterilidad tomar Pasado tiempo de Introducir la aguja

una torunda lidocaína en 1 mL del tubo falcon efecto de lidocaína, en un ángulo de
la oreja del la oreja del con Antígeno con inmovilizar al 15°y administrar
conejo. conejo. jeringa conejo.

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 4.3.1 Calendario de inmunización
Tabla 1. Calendario de inmunización de conejo con suspensión de eritrocitos humanos al 47 % de Transmitancia como
antígeno.

No. de Tiempo (días) Fecha de Antígeno Dosis VÍA

inmunizació inmunización mL
n
n/a Obtención del 17-oct-2018 Suspensión de - -
antígeno eritrocitos
1 0 26-oct-2018 humanos 47%T 0.9 I.V.
2 4 31-oct-2018 1.0 I.V.
3 8 05-nov-2018 0.7 I.V.
4 12 09-nov-2018 1.0 I.V.
Sangrado 16-21 13-nov-2018 10 mL

4.4 Precipitación medio sólido: Inmunodifusión doble

4.5 Precipitación medio líquido: Precipitación en capilar.

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 5. RESULTADOS
5.1 Resultados de precipitación en medio sólido: inmunodifusión doble
Tabla 2. Resultados de la prueba de precipitación en medio sólido.

Tipo de suero Resultados Observaciones

Suero
preinmune

Suero post-
protocolo de
inmunización

Figura 1. Resultados de la prueba de difusión en medio sólido.

Figura 2. Resultados de la prueba de difusión en medio sólido.

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 5.2 Resultados de precipitación en medio líquido: Precipitación en capilar
Tabla 3. Resultados de la prueba de precipitación en medio líquido.

Tipo de Precipitación Observaciones

suero
Suero - No se observa precipitación
preinmune

Suero post- -
protocolo de
inmunización

1 2 6 7 10 11 12
3 4 5 8 9

Figura 3. Resultados de la prueba de precipitación en capilar a las 24 horas. (1) dilución 10-1, (2) dilución 10-2 (3) dilución
10-3 (4) dilución 10-4 (5) dilución 10-5 (6) dilución 10-6 (7) dilución 10-7 (8) dilución 10-8 (9) dilución 10-9 (10) dilución 10-
10 (11) Solución madre de eritrocitos al 47.3 % T (12) Suero preinmune

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 1 2 3 6 7 10 11 12
4 5 8 9

Figura 4. Resultados de la prueba de precipitación en capilar a las 48 horas. (1) dilución 10-1, (2) dilución 10-2 (3) dilución
10-3 (4) dilución 10-4 (5) dilución 10-5 (6) dilución 10-6 (7) dilución 10-7 (8) dilución 10-8 (9) dilución 10-9 (10) dilución 10-
10 (11) Solución madre de eritrocitos al 47.3 % T (12) Suero preinmune

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6. ANÁLISIS DE RESULTADOS

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 7. CONCLUSIONES

8. REFERENCIAS

Říha, I. (1961). Antibody formation in young rabbits immunized with erythrocytes.

Folia Microbiologica, 6(6), 355–361. doi:10.1007/bf02877176.
Klykova, G. T., & Prokopenko, L. G. (1975). Formation of complete and incomplete
antibodies in rabbits immunized with sheep’s red cells. Bulletin of Experimental
Biology and Medicine, 79(3), 295–296. doi:10.1007/bf00804220.

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 ANEXOS
A1. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE SANGRE A HUMANOS

1. Datos del paciente

Nombre Jorge Lamas

Sexo Masculino
Edad 21 años
Peso
Altura
Tipo de sangre O+
2. Procedimiento de toma de muestra

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A2. PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN
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 A3. MANEJO DE ANIMALES

Conformación corporal del conejo.

ADVERTENCIA
Nunca se debe manipular a los conejos por las orejas o por las patas, eso puede causarles daños
permanentes.
SUJECIÓN
Existen diversas maneras de sujetar al conejo, una de ellas es la siguiente: Se realiza con la mano
derecha, se suspende de la piel floja de la región del dorso y la nuca del conejo, y con la mano izquierda
se le sujeta por debajo de los muslos como si se lo fuera a sentar sobre la palma de la mano, con el
objeto de sostener el peso del animal.
TRANSPORTE
El transporte debe hacerse siempre realizando movimientos lentos, sin gritos o sonidos repentinos.
TÉCNICAS DE MANEJO PARA USO DE VÍAS DE ADMINISTRACIÓN EN CONEJOS

Vías de administración al conejo.

Debido a que se empleará la vía intravenosa en el presente protocolo, solo se describirá la misma. Para
más información consulte la referencia al final del anexo. Es necesario señalar que conejo las
sujeciones o manipulaciones del conejo pueden tener ciertas modificaciones debidas a la personalidad
de este.
1. Colocar al conejo en la caja especial de sujeción.
2. La vena marginal se encuentra en la oreja del conejo y es muy fina, por lo que antes de la
administración hay que dilatarla, frotando desde la base de la oreja hacia el extremo, con algodón
en la mano, utilizando vasodilatadores como lo es el alcohol al 70%.
3. Colocar lidocaína.
4. Se limpia la zona donde se realizará la punción con alcohol al 70%.
5. Se introduce una aguja estéril con el bisel hacia arriba, siguiendo la trayectoria de la vena a 15°.
6. Una vez terminada la administración, extraer la aguja suavemente de la misma manera que la
introdujo, luego aplicar una torunda de algodón con presión suave hasta que deje de sangrar.

Fuentes, F., Mendoza, R., Rivera, R. Vara, M. (2010). Guía de manejo y cuidado de animales de laboratorio. Recuperado de:
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Manejo.cuidado.conejos.pdf consultado 06/10/18.

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