Curso: 6to “b”

ENSAYO 1

TEMA: Evaluación de tres promotores constitutivos para la expresión de GUS en

arroz ( Oryza sativa L., var. J-104)
Introducción

Un promotor constitutivo es capaz de dirigir la expresión génica en muchos o todos los

tejidos de una planta. Esta investigación quiere obtener un promotor altamente eficiente
que impulsaría la expresión constitutiva del transgén en el cultivar de arroz cubano J-
104, para lo cual se introduce tres promotores diferentes fusionados con el gen
reportero gus en los callos de arroz, utilizando técnicas de biobalística es decir a través
del bombardeo con microproyectiles.

Se evaluaron diversidad de promotores por su capacidad para dirigir la expresión de

transgenes en monocots, incluyendo ZmUbi1 de maíz, y Act1, OsCc1, RUBQ1 y 2, rubi3
y OsAct2 del arroz. Sin embargo se optaron por cuatro promotores fueron el CaMV 35S,
el promotor A9 quimérico y el promotor de ubiquitina. Estos promotores son muy activos
en los cultivos de monocotiledóneas, pero también son diferentes en varias formas.Para
lo cual se les evaluó cualitativamente y cuantitativamente, utilizando el sistema
informador GUS, en diferentes tejidos y en varias etapas de crecimiento de plantas de
arroz transgénicas obtenidas de callos.

El gus posee variedad de estudios los cuales le confiere varias funcionalidades como las
más importantes en el sistema de fusión de genes informadores tenemos: Comprender los
patrones de desarrollo de la expresión génica; optimizar los parámetros de bombardeo de
partículas; comparar diferentes métodos de transformación; para identificar el promotor
ideal para la transformación de especies de plantas y para comparar el mejor explante
para la transformación y regeneración de plantas. (Daymi, Onel Valdivia Pérez, Rigo, &
Raul, 2016)

Desarrollo

Se comenzó seleccionando el material vegetal que fue semillas de arroz maduro en un

medio de inducción callo con sales y vitaminas, además del uso de plásmidos Se utilizó
3 vectores: p35SGUS, pUbiGUS y pA9GUS que contenían CaMV35S, Ubi1 de maíz y
A9, respectivamente, con el gen gus y el terminador de la sintasa nopaline
de Agrobacterium tumefaciens.

A través de la técnica de biobalística por medio de micro proyectiles con partículas de

oro de 1,0 µm de diámetro en sesiones de bombardeo con 10 placas cada una , se sometió
15 callos de 2 a 3 mm de longitud en medio con sales y vitaminas con manitol. Se
bombardeó con 0,154 µg de oro y 0,350 µg de ADN, después se vació a 700 mmHg a
una distancia de 6 cm desde la placa de parada hasta el tejido del callo. Terminado el
bombardeo los callos se les dejo en oscuridad por 16h después se transfirieron al medio
de inducción del callo y se mantuvieron dos semanas en la oscuridad a 28 ° C.

En la regeneración de la planta a partir de callos se realizó utilizando el medio de cultivo

KIBAM donde se mantuvieron durante un mes a 25 ± 2 ° C, en una habitación; bajo
control ambiental e iluminación de 1500 lux emitidos por tubos fluorescentes.

Con las Plantas regeneradas en medio MS (con 3.0 g / L de Phytagel), Se optó por obtener
las semillas T1 por autopolinización de las plantas de arroz transformadas previamente
en (T0). Estas fueron utilizadas para estudiar la segregación del gen GUS en
la progenie T 1.

En el Ensayo histoquímico de GUS los tejidos de arroz como hojas, tallo, raíces y
semillas, se transfirieron a tubos eppendorf, los cuales contenían una solución de tinción
GUS (fosfato de sodio 50 mM a pH 7,0, EDTA 10 Mm), y fue incubado a 37°C.

Culminado el periodo de incubación se eliminó la solución de tinción y se llevó a los

tejidos a almacenamiento en etanol al 70%.Para posteriormente ser examinados, bajo un
microscopio estereoscópico.

El Ensayo fluorimétrico de GUS consiste en el uso de hojas, tallos y raíces molidas con
nitrógeno con un tampón de extracción de proteínas homogeneizado y centrifugado por
15min a 4°C en 500 µl de reacción.

En cambio en 400 µl de muestra proteica con tampón de extracción y 100 µl de 4-MUG

en un tiempo de cero se extrajo alícuota de 50 μl de reacción y se añadió a 450 μl de
carbonato de sodio 0.2 M lo cual resulto que el MUS fue escindido por GUS para liberar
metilumbeliferona y ácido glucurónico, lo cual se llevó a cuantificación en
espectrofluorómetro utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 365 y 455
nm.
Se utilizó análisis estadísticos para evaluar la segregación del gen GUS a la progenie T1
, los números de plantas GUS positivas y GUS negativas se procesaron mediante una
prueba de bondad de ajuste de Chi cuadrado (p≥0.05), utilizando la versión 11.5 del
Paquete Estadístico para Ciencias Sociales.

Como resultados de la Actividad cualitativa GUS en tejidos de arroz in vitro se dio

después de 72 horas del bombardeo, el ensayo histoquímico de GUS no mostró
diferencias visibles entre los callos bombardeados con tres promotores en estudio.

En todos los casos se observaron manchas azules pequeñas y aisladas en la capa más
externa de los callos. Los patrones de tinción de GUS en callos cultivados durante 7 días
después del bombardeo fueron diferentes, dependiendo del promotor utilizado para dirigir
la expresión de GUS.

Se dio 3 distintas imágenes donde la imagen denominada A que contenía el promotor A9

mostró grandes y numerosas áreas de tinción azul, mientras que el B y C Con el promotor
Ubi1 y 35s las áreas azules eran más pequeñas y más aisladas.

En plantas regeneradas a partir de callos transformados, se verificó la expresión

constitutiva del gen gus impulsado por tres promotores: la tinción GUS se confirmó en
hojas, tallos y raíces de todas las plantas.

El promotor A9, la actividad GUS fue cualitativamente más alta en todos los órganos de
la planta; Las raíces se tiñeron completamente de color azul , pero con mas más intensidad
en hojas y tallos, y la mancha azul se extendió a la solución del sustrato.

La tinción azul se detectó en todos los órganos de las plantas Ubi1-GUS y 35S-GUS, pero
fue menos intensa que en las plantas A9-GUS

En la actividad cualitativa de GUS en plantas ex vitro, la aclimatación de las plantas

al ambiente fue exitosa, considerando que el 98% de ellas sobrevivieron y las semillas se
establecieron en las condiciones establecidas.

La actividad de GUS durante el crecimiento vegetativo ex vitro se examinó en secciones

de hojas, tallos y raíces que se habían tratado con el sustrato de GUS cromogénico X-
Gluc.

En la Expresión GUS cuantitativa se cuantificó la actividad fluorimétrica y se lograron

resultados comparables más precisos en hojas teniendo un promedio máximo de 2.5 nmol
de proteína MU / min.mg, en tallos, la actividad varió de 2.09 a 2.88 nmol de proteína
MU / min.mg y en las raíces de 2.1 a 2.28 nmol de proteína MU / min.mg.

Los autores demostraron que el promotor podría conducir a la expresión de GUS en varias
etapas de desarrollo y en diferentes tejidos y órganos, resultados similares a los obtenidos
en la investigación. Los promotores CaMV35S , A9 y Ubi1 se encontraron activos en
todo el cuerpo de la planta de arroz J-104 o en diversos tejidos y / o etapas del crecimiento
de la planta, con distintos patrones de actividad relativa. El análisis cualitativo y
cuantitativo de la actividad de GUS demostró que la expresión de GUS es mayor en el
promotor A9. Aunque se considera un promotor constitutivo fuerte, la expresión de los
genes regulados por el promotor CaMV-35S puede modularse mediante el fotoperíodo,
la temperatura y la etapa de desarrollo.

Por la cual se supone es la razón por la cual la expresión de GUS bajo 35S en ex vitro las
plantas fueron menores en algunos órganos, en comparación con la expresión de GUS
bajo el promotor A9 que fue mejor en las plantas completas y en las etapas de crecimiento

Dado que los genes de la ubiquitina se expresan en casi todos los tejidos de las plantas en
su contexto nativo, sus promotores deberían dirigir la expresión génica constitutiva en
plantas transgénicas, especialmente de la misma especie. La caracterización de plantas
transgénicas que contienen diferentes promotores de ubiquitina hasta la fecha ha revelado
que estos promotores dirigen la expresión génica preferentemente en tejidos jóvenes,
tejidos vasculares y granos de polen.

Las pruebas estadística ajuste de Chi cuadrado permitió evaluar entre los patrones de
segregación esperados y observados. En la mayoría de las líneas, el gen gus se heredó en
una proporción mendeliana de 3: 1 esperada , se demostraron que si el gen es dominante
y se inserta en un locus, seguirá un patrón de segregación mendeliana 3: 1 para un solo
gen dominante en la generación subsiguiente, ya que el arroz es principalmente una planta
autopolinizada. Para un uso adicional en los programas de reproducción, es importante
asegurarse de que el transgén sea dominante y se herede de manera estable y predecible

CONCLUSIONES

Mediante esta investigación los promotores CaMV35S, A9 y Ubi1 dieron resultados que
se encontraron activos en todo el cuerpo de la planta de arroz J-104 o en diversos tejidos
y / o etapas del crecimiento de la planta, con distintos patrones de actividad relativa.
El A9, Ubi1 y 35S demostraron el mismo patrón de expresión y actividad en el
endospermo.

El promotor A9 muy activo en todo el grano de arroz sea embrión, endospermo o en la

capa de la aureola

Se demostró la expresión constitutiva de GUS bajo los patrones de actividad relativa en

hojas, tallos y raíces de plantas in vitro y ex vitro, y en plantas de la progenie T1.

Bajo el promotor quimérico A9 se lograron los mayores niveles de expresión GUS en

todos los tejidos y fases del crecimiento de las plantas.

Bibliografía
Daymi, R., Onel Valdivia Pérez, D., Rigo, A., & Raul. (junio de 2016). Evaluación de tres
promotores constitutivos para la expresión de GUS en arroz ( Oryza sativa L., var. J-
104). Recuperado el 1118 de 2018, de
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-
34752016000100009&lang=pt&fbclid=IwAR1PbdybBlyoXTkfo9fpYtroT6uLfQ6YghHUW
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