UNIVERSIDAD JOSÉ CARLOS MARIÁTEGUI

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

“EFECTO CITOTÓXICO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA SOBRE

STREPTOCOCUS MUTANS Y ARTEMIA SALINA COMO POTENCIAL USO
EN LA PREVENCIÓN DE PLACA BACTERIANA”

INTEGRANTES:

VALERIA ISABEL VALDEZ GONZALES

GUILLERMO CAYTANO QUEVEDO
GABRIEL CRISTIAN AMÉZQUITA LEÓN
KELLY MILAGROS CHAVEZ QUISPE
BIANNEY RIVAROLA HUANCA
NILDA CORI AJAHUANA
MANUEL GUSTAVO APAZA PUMA
MARIA ALEJANDRA MOSCOSO CAMPOS

MOQUEGUA
 2018
“EFECTO CITOTÓXICO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA SOBRE
STREPTOCOCUS MUTANS Y ARTEMIA SALINA COMO POTENCIAL USO
EN LA PREVENCIÓN DE PLACA BACTERIANA”

INTRODUCCIÓN:
En estas últimas décadas, la investigación en ciencia y tecnología se ha centrado en la fabricación
de estructuras atómicas y materiales a escalas nanométricas, lo que comúnmente se conoce
como “Nanotecnología”. Esta nueva ciencia multidisciplinar proporciona productos con nuevas
propiedades fisicoquímicas diferentes a las de las moléculas individuales o sólidos de la misma
composición. La plata ha ganado mucho interés debido a su buena conductividad, estabilidad
química y su actividad catalítica y antibacteriana. Las AgNPs se están convirtiendo en una de las
categorías de productos de mayor crecimiento en la industria de la nanotecnología, por ello en
este trabajo veremos el efecto citotóxico de las nanopartículas de plata que consiste en lisar o
destruir a una célula en este caso al streptococus mutans y artemia salina, se estudiará sus
propiedades físico-químicas de dichas partículas.

PROPOSITO: Determinar el efecto citotoxico.

UNIDAD DE ESTUDIO: Nano partículas de plata, Streptococus mutans y
Artemia salina.
POBLACION DE ESTUDIO:
UBICACIÓN ESPACIAL: UJCM Moquegua.
TEMPORALIDAD: 2018

HIPOTESIS:

Las nanopartículas de plata promueven una acción antibacteriana mayor que la Clorhexidina,
sobre Streptococcus mutans, Lactobacillus casei y artemia salina

Por ello al ver estas cualidades de ser menos toxico y tener un amplio espectro es que nosotros
basaremos la investigación en las nanopartículas de plata con el fin de demostrar que tiene un
efecto preventivo de gran eficacia para evitar la aparición y proliferación del estreptococo
mutans y de la artemia salina.
OBJETIVOS:

 Determinar el mecanismo de acción de nano partículas de plata sobre el estreptococo

mutans y la artemia salina, como una manera de prevención en la salud bucal.
 Determinar la citotoxicidad de las nano partículas de plata mediante cultivos realizados
en el laboratorio, utilizando las placas Petri.
 Determinar el Índice de éxito en la prevención de caries en la cavidad bucal del paciente.
 Estudiar el efecto de las nanopartículas de plata sobre el crecimiento bacteriano.
 Determinar la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima, relacionada
al nivel de citotoxicidad.
 Obtener un tratamiento preventivo óptimo para el estreptococo mutans y la artemia
salina, mejorando el medio.

“EFECTO CITOTÓXICO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA SOBRE

STREPTOCOCUS MUTANS Y ARTEMIA SALINA COMO POTENCIAL USO
EN LA PREVENCIÓN DE PLACA BACTERIANA”

ARTEMIA SALINA Y STREPTOCOCUS MUTANS:

LA ARTEMIA SALINA:
La Artemia salina, es un pequeño crustáceo de más de dos centímetros de longitud
(adulta), catalogado como el más primitivo insecto, por su constitución fisiológica
simple, cuya tasa de reproducción es casi constante en el orden de 100 a 300 huevos
por desove. Es de indicar que un gramo de huevos, contiene un promedio de 200.000
cystos. Son crustáceos branquiópodos del orden Anostraca, el único género de la familia
Artemiidae, que habita en aguas salobres.

Su distribución se extiende a todos los continentes, excepto en la Antártida, se

encuentran en más de 300 lagos de alta salinidad donde sus predadores no pueden
sobrevivir, llegando a encontrarse en aguas con una concentración de hasta 300gr de
sal por litro de agua, pero su facilidad de adaptación hace que también pueda
encontrarse en agua dulce.

"Somos lo que comemos " dice un viejo adagio. El ganado que es criado con buen pasto,
tiene mayor valor alimenticio que aquel que no tiene casi que comer. En el caso de la
artemia, se cumple este principio. si los estanques de cría son ricos en alimento natural,
especialmente algas diatomeas, más suplementos alimenticios de origen vegetal, tales
como salvado y afrecho de arroz, de trigo, harinas de soya (soja), de quinua, de maíz (la
machica), de plátano, así como de espirulina, combinados con aceite de hígado de
bacalao, más suplementos naturales de vitaminas, minerales y oligoelementos
esenciales y bioestimuladores del sistema inmunológico como el ajo, la uña de gato, el
propóleo de las abejas y la sangre de drago, obtendremos una artemia rica en proteínas,
carbohidratos, sales minerales, etc., con una producción de células inmunodefensoras
mayor al promedio normal, lo que será transmitido al vector (camarones, peces, etc .)
del consumidor final que es el ser humano, reforzándolo y nutriéndolo efectivamente.
Un perfil patrón, nos indica el contenido de la biomasa de artemia :

 Humedad 85-90 %
 Cenizas 9-20 %
 Proteínas 52-74 %
 Carbohidratos 7-17 %
 Glucógenos 2-9 %
 Lípidos 8-16 %
 Fosfolípidos 4-6 %
 Colesterol 0.5-0.9%
 Azucares 3-4 %

Son crustáceos branquiópodos del orden Anostraca, el único género de la familia

Artemiidae, que habita en aguas salobres.

Su distribución se extiende a todos los continentes, excepto en la Antártida, se

encuentran en más de 300 lagos de alta salinidad donde sus predadores no pueden
sobrevivir, llegando a encontrarse en aguas con una concentración de hasta 300gr de
sal por litro de agua, pero su facilidad de adaptación hace que también pueda
encontrarse en agua dulce.

Streptococcus mutans
En este apartado nos referiremos al Streptococcus mutans (S. mutans), conocido como
el más importante odontopatógeno presente en la placa supragingival y el principal
agente etiológico en la caries dental
La virulencia de Streptococcus mutans ha sido ampliamente estudiada, encontramos
referencias explicando que coloniza al huésped sólo después de que los primeros
dientes erupciones y recientemente se ha reportado su presencia en la cavidad bucal
incluso antes de la erupción dental.
Transmisión
El reservorio principal del cual los niños adquieren S. mutans es su madre o la persona
que se encuentre a su cargo.
La evidencia de este concepto proviene de varios estudios clínicos en los que cepas de
S. mutans aisladas de las madres y sus bebés mostraron perfiles de bacteriocina
similares y patrones de ADN o cromosomas idénticos
Se menciona que los niveles de S. mutans en cavidad oral se relacionan con los niveles
de caries en los individuos, por lo que puede considerarse un factor predictivo o
indicador del riesgo a desarrollar caries.
Localización
El sitio preferido para la colonización es la superficie dental y se encuentra sobre todo
en la placa de las lesiones iniciales o “de mancha blanca”. S. mutans se encuentra
principalmente en los sitios de retención, tales como las lesiones de caries, fosas, fisuras,
así como las superficies oclusales y proximales.
Virulencia
Este microorganismo posee una variedad de mecanismos para colonizar la superficie
dental.
Los principales factores de virulencia asociados con su cariogenicidad incluyen adhesión,
acidogenicidad, y acidotolerancia.
Cada una de estas propiedades trabaja coordinadamente para alterar la ecología de la
placa dental. La flora cariogénica aumenta la magnitud de la caída en el pH (potencial
de hidrógeno) después de la fermentación de hidratos de carbono provenientes de la
dieta, dando como resultado la desmineralización del esmalte.
Una de las características de Sm. es que sintetiza macromoléculas a partir de sacarosa,
lo que favorece su unión a la superficie dental. Es un rápido roductor de ácido a partir
de carbohidratos simples, incluyendo sacarosa.
El mecanismo principal para la adhesión de S. mutans es la producción de glucano a
partir de sacarosa por edio de glucosil-transferasas
El metabolismo de la sacarosa es complejo, pero no hay duda de que la vía principal
tiene que ver con el metabolismo energético y sus resultados, cuando la sacarosa en la
dieta es superior, en la producción de ácido láctico. 18, 35 Existen estudios en los que
Streptococcus mutans ha sido asociado con lesiones en diversas superficies dentales
tanto en roedores como en humanos alimentados con sacarosa. No obstante, en los
animales libres de microorganismos, no se desarrolló caries a pesar del consumo de
sacarosa en la dieta, por lo que la caries es resultado de un proceso infeccioso
multifactorial y no de la sola presencia de microorganismos patógenos como el mutans,
ni exclusivo del consumo de carbohidratos.
Estos organismos sintetizan dextranos extracelulares de la sacarosa, y se ha postulado
que los polímeros son responsables de la capacidad de estos Streptococci para formar
placas gelatinosas en las superficies de los dientes
Se sabe que Streptococcus mutans contiene una vía glicolítica y puede producir lactato,
formiato, acetato y etanol como productos de fermentación.
La conversión de la sacarosa dietética a los polímeros es una propiedad cariogénica
importante. En particular, la producción de glucano insoluble se ha demostrado que
aumenta enormemente la capacidad de estos organismos para colonizar las superficies
de los dientes.
La capacidad de las bacterias para sobrevivir y persistir en un medio ambiente
específico, dependerá de su plasticidad genética inherente, lo que determina su
capacidad para responder a las fluctuaciones de las condiciones ambientales locales; las
bacterias de la biopelícula son sometidas a muchas presiones ambientales, incluyendo
la disponibilidad o la falta de nutrientes, pH ácido, y la exposición a los ácidos orgánicos.

Detección de streptococcus mutans cariogénicos

Se han establecido diferentes metodologías para la detección de cepas potencialmente
cariogénicas de S. mutans. Uno de ellos es la identificación mediante la detección de
mutacinas (bacteriocinas), ya que se considera que la producción de mutacinas está
relacionada con la capacidad para producir caries, y se utilizan además como un
marcador epidemiológico para establecer la fuente de infección y el mecanismo de
transmisión, debido a que predomina un tipo productor de bacteriocinas en un individuo
de la misma forma.
En adición al anterior existen métodos para la identificación de genes de streptococcus
mutans, involucrados en la síntesis de polisacáridos extracelulares como los genes gtfB
y gtfC de la glucosiltranferasa-I y glucosiltransferasa-SI respectivamente y gtfD para la
enzima glucosiltranferasa- S, e identificar a las bacterias potencialmente cariogénicas
con una alta especificidad. Otros métodos más sencillos permiten calcular número de
UFC de S. mutans para establecer el riesgo y monitorear el nivel de colonización de un
individuo, tal es el caso de la prueba de la tira de mutans (S. mutans), puede ser utilizado
para dar seguimiento a un paciente o una población, e identificar grupos de personas
con riesgo de desarrollar caries.14 También se han descrito pruebas más sencillas
utilizando un palillo de dientes para tomar una muestra de placa dental y transferir la
muestra a medios selectivos o mediante la utilización de un abatelenguas.
El propósito de éste trabajo es conocer la prevalencia de caries dental, identificar la
proporción de flora cariogénica y su influencia en la presencia de caries dental en una
población infantil de la comunidad de Tacoaleche Guadalupe, Zacatecas.
Caracterización microbiológica del S. mutans
En general, en la comunidad científica hay consenso en señalar al S. mutans como el
microrganismo más importante en la caries dental. Por lo tanto, las estrategias de
aislamiento, identificación, tipificación, prevención y control están dirigidas hacia este.
El S. mutans es un coco grampositivo que fue aislado e identificado por Clarke, en 1924,
a partir de lesiones cariosas en humanos. Lo denominó S. mutans por las formas
mutantes en que se presenta: cocobacilo (forma ovalada) en un medio ácido y coco
(forma redonda) en un medio alcalino (8). En cultivos de agar sangre, las colonias de este
microrganismo se diferencian fácilmente: altas, convexas, pulvinadas (en forma de cojín)
y mucoides, de 0,5 a 1 mm de diámetro, y opacas con un aspecto que recuerda al vidrio
esmerilado. Esta bacteria es anaeróbica facultativa, es decir, que puede utilizar el
oxígeno para su crecimiento; pero si este no está presente también puede sobrevivir.
Sin embargo, su crecimiento óptimo ocurre en anaerobiosis. De forma concomitante
con la síntesis de dextrano a partir de la sacarosa, las colonias de este microrganismo
emiten un exudado acuoso en la superficie del medio de cultivo, a menudo lo
suficientemente abundante como para que forme un charco en torno a la colonia. En
medios de cultivo con sacarosa este microrganismo está en capacidad de producir
polisacáridos extracelulares y adquirir una apariencia opaca, rugosa y blanca, no
adherente al medio de cultivo y ocasionalmente rodeada por polímeros de glucano de
aspecto húmedo. Estos estreptococos no hidrolizan el almidón y fermentan la inulina, la
rafinosa, el manitol y el sorbitol. El S. mutans produce polisacáridos extracelulares a
partir de la sacarosa por la acción de dos enzimas: la glucosiltransferasa (GTF) y la
fructosiltransferasa (FTF). La GTF sintetiza glucano a partir de la glucosa, y la FTF,
fructano a partir de la fructosa. El medio más común para el aislamiento de S. mutans
es el agar mitis salivarius suplementado con bacitracina 0,2 U/ml y sacarosa al 20 %, que
permite la selección de otros estreptococos. El S. mutans se encuentra de forma
permanente en la cavidad oral después de la erupción dental, debido a que requiere la
presencia de tejido duro no descamativo para colonizar. La principal fuente para la
adquisición y transmisión del S. mutans en los niños es la saliva de sus madres. La
evidencia al respecto proviene de diferentes estudios que han mostrado un patrón
idéntico de ADN cromosomal en las bacterias de los niños y sus madres. La colonización
de esta bacteria ocurre a los 26 meses de edad, periodo que ha sido denominado
ventana de infectividad. Por todo lo anterior, es importante recordar que el S. mutans
es un microrganismo que forma parte de la 68Gamboa F Univ Odontol floral oral
microbiana, por lo que se puede encontrar tanto en pacientes sin caries como en
pacientes con caries. Actualmente, los estudios no solo se dirigen hacia la búsqueda del
S. mutans en la saliva y la placa dental, sino también hacia la cuantificación de este
microrganismo. Diferentes estudios han mostrado una correlación entre los recuentos
de este microrganismo en la cavidad oral con la prevalencia e incidencia de la caries. No
obstante, en otros estudios no se ha hallado correlación entre la cantidad de S. mutans
y la incidencia de caries. Actualmente, el hallazgo de un recuento alto de S. mutans es
un factor de riesgo para tener en cuenta en la prevención y control de la caries dental.

NANOPARTICULAS DE PLATA Y SU EFECTO EN LA

PREVENCION DE EL STREPTOCOCOS MUTANS Y LA
ARTEMIA SALINA
La nanotecnología ha cambiado la perspectiva funcional de los materiales empleados en la
medicina, ofreciendo éstos una mejor funcionalidad debido principalmente a su tamaño
nanométrico. Un ejemplo son las nanopartículas de plata que exhiben diferentes propiedades
una vez aplicadas a los sistemas biológicos, en comparación con los sistemas tradicionales de
tratamiento. El tamaño nanométrico les confiere la habilidad para penetrar distintas
membranas biológicas como la pared bacteriana, incrementando su efecto bactericida. Esta
revisión aborda de manera general los procesos empleados en la obtención de las
nanopartículas de plata como un ejemplo de la tecnología empleada en el diseño de estos
vehículos; los parámetros de calidad aplicados para resguardar su funcionalidad y una
explicación de su mecanismo de acción antibacteriana en vista de una evaluación terapéutica
eficaz y como punto de referencia del impacto del desarrollo de materiales a través de la
nanotecnología.

PROCESO DE OBTENCION
De manera general, los métodos de preparación de Nps se clasifican como top-down (utilizan
métodos físicos, procesos de molienda) y como bottom-up (métodos químicos en solución
coloidal, procesos de formación de partículas a partir de una solución). Los métodos top-down
son aquellos que reducen el tamaño de agregación del material hasta llegar a un tamaño
nanométrico con un consumo considerable de energía, mientras que los métodos bottom-up
involucran la obtención de un estado de agregación nanométrico partiendo de una dispersión
molecular, es decir, es una vía contraria a la primera. Mientras que los métodos físicos tienen la
ventaja de ser capaces de producir grandes cantidades de Nps, a su vez, tienen la desventaja de
no tener un suficiente control sobre el tamaño de la partícula, produciendo Nps con un amplio
rango de tamaño que pueden originar un efecto poco controlable y predecible cuando es
administrado en un sistema biológico.

MECASNISMO DE ACCION ANTIBACTERIANA

Varios estudios indican que las Nps-Ag se pueden adherir a la membrana celular, alterando la
permeabilidad celular y funciones respiratorias de la célula. Es posible que las Nps-Ag no sólo
interactúen con la superfi cie de la membrana, sino que también penetren al interior de la
bacteria (Cuadro I). La función que pueden tener los agentes de superfi - cie de las Nps, aparte
de su mecanismo de estabilización, es su actividad antimicrobiana. Por ejemplo, se ha visto que
las Nps-Ag estabilizadas con lauril sulfato de sodio tienen mayor actividad antibacteriana que las
formulaciones con Tween 80 mediante un mecanismo de sinergia. Es posible que el lauril sulfato
de sodio como surfactante iónico pueda penetrar o alterar la pared celular, especialmente en
las bacterias Gram positivas. De tal manera que el efecto bactericida de las Nps-Ag puede ser un
sinergismo de los siguientes mecanismos:

1) El material estabilizante y las Nps-Ag desestabilizan la membrana bacteriana, y con esto,

alteran su permeabilidad, provocando un daño irreversible.

2) Las Nps-Ag se internalizan en la bacteria con facilidad debido a su tamaño diminuto.

3) Las Nps-Ag en su trayecto van liberando iones de plata que funcionan como un reservorio
del agente bactericida alterando el citoplasma.

4) Los iones de plata se enlazan con grupos sulfhidrilos de biomoléculas y con compuestos
fosforosulfurados como el ADN inactivando a la bacteria.10 Estos mecanismos pueden darse
simultáneamente.

De manera general, estableciendo una comparación entre la actividad antibacteriana de las Nps-
Ag y los iones de plata se ha comprobado que los primeros presentan esa actividad en niveles
nanomolares; mientras que los últimos lo exhiben en niveles macromolares, evidenciando su
efectividad por el diseño de formulación. Se ha observado un aspecto sinérgico cuando las Nps-
Ag son oxidadas por el medio, y un fenómeno de desorción provoca la liberación de iones de
plata, de tal manera que cuando es comparada la misma formulación con o sin la presencia de
oxígeno, se observa un mayor efecto antibacteriano en la presencia de este oxidante. Los
estudios actuales en el tema de Nps-Ag se centran en nuevas plataformas de síntesis a
nanoescala, empleo de biorreactores para su obtención, nuevas aplicaciones (ya sea por
combinación con otros materiales o por modificaciones en el arreglo espacial), amplios estudios
de citotoxicidad y evaluación del grado de efecto bactericida en distintas cepas bacterianas. Las
investigaciones actuales se perfilan para que en un futuro se pueda disponer de formulaciones
bactericidas de Nps-Ag de mayor seguridad y de una eficacia más prolongada.

Métodos para potenciar las nano partículas de plata y

prevenir la aparición de estreptococos mutans y
Artemia Salinas
La plata es una reciente promesa, debido a la resistencia de ciertas bacterias a
los antibióticos como resultado del abuso de ellos, lo cual es un problema real.
Como se ha reportado, las nanopartículas de plata son un antimicrobiano muy
efectivo (Madhumathi K. 2010); dado que las partículas de metal en el intervalo
de tamaño nanométrico presentan propiedades físicas que son diferentes del
ion de plata, proporcionando propiedades notables tales como aumento de la
actividad catalítica (Mritunjai, 2008).
Estudios recientes muestran que la disposición antimicrobiana de plata en la
nanotecnología es eficaz contra los patógenos asociados con bio-películas,
incluyendo E coli, S. pneumoniae, S. aureus y A.niger (Park EJ, Bae E, 2010).
Se ha informado de igual manera que los compuestos de plata son altamente
tóxicos para las células procariotas, ya que muestran fuertes efectos biocidas en
las bacterias, mientras que tienen un efecto menor en células eucariotas, tales
como hongos y levaduras (Ki-Young Nam ,2011)

Es evidente que a lo largo de los años se ha observado que estos compuestos

exhiben notables efectos antimicrobianos, de ahí su amplio uso en
electrodomésticos como las lavadoras; en sistema para la purificación del agua;
productos de higiene personal como la pasta dental, shampoo, enjuagues,
desodorantes; filtros: utensilios de cocina; juguetes; pintura (García Contreras R
2011)(Kim Yongs 2010); y apósitos con plata en dispositivos médicos
(Madhumathi K. 2010). De igual modo, se ha sido estudiado su uso en
aplicaciones dentales como materiales de restauración, implantes dentales,
soluciones inhibitorias de caries, y en cementos endodónticos (García Contreras
R, 2011).

El mecanismo de acción antimicrobiana de los iones de plata libre se puede

describir de la siguiente manera. Los iones de plata forman compuestos
insolubles con los grupos sulfhidrilo de la pared celular de las bacterias y hongos:
que son componentes esenciales de las enzimas responsables del metabolismo
de la energía y el transporte de electrolitos. Estos iones bloquean la cadena
respiratoria de las bacterias y entran en la célula y se unen al ADN bacteriano.
Por lo que se han utilizado para crear distintos productos médicos como los
catéteres donde su citotoxicidad, hemo-compatibilidad y la trombogenicidad de
estos materiales impregnados con plata, se ha determinado y muestran
excelentes resultados

Estas nanopartículas liberan iones de plata en las células aumentando su

actividad bactericida; así como debido a su tamaño, las nanopartículas de plata
posen mejor y mayor superficie de contacto con las bacterias, es por ello que su
actividad antibacteriana es alta (más que la de los iones plata en disolución),
incluso en concentraciones muy bajas (Madhumathi K, 2010). Mritunjai Singh
también hace mención de los efectos antibacterianos de las nanoparticulas de
plata a bajas concentraciones.

Se ha demostrado que las nanopartículas de plata causan la inactivación de

bacterias y evitan la replicación bacteriana in-vitro (Liao J, 2010). Así como que
la alteración de la homeostasis del calcio juega un papel importante en las
condiciones patológicas y toxicológicas siendo un signo temprano del daño
celular. Ya que los iones de calcio tienen el potencial para activar las enzimas
catabólicas como la fosfolipasa, las proteasas y estas aumentan la toxicidad. Por
lo que en los estudios de Asharani, vincula que el estrés oxidativo, el calcio y el
agotamiento de ATP se producen en las células tratadas con nanoparticulas de
plata (Asharani PV, 2009). Otro de los mecanismos de actividad antimicrobiana
se realiza por medio de los iones de plata que afectan a las enzimas de
membrana respiratoria. Mientras que en el estudio de Sondi ( Sondi I, y col. 2004
),demostró cambios estructurales y daños a las membranas bacterianas, lo que
resulta en la muerte celular.

Estos estudios sugieren que todo el azufre que contienen las proteínas y
enzimas, son clave en la membrana o dentro de las células así como los
elementos que tienen fósforo, como el ADN, siendo los probables sitios
preferenciales de unión para las nanopartículas de plata. Kim sugiere que una
38 célula bacteriana en contacto con nanopartículas de plata inhiben las enzimas
respiratorias y de esta manera facilita a la generación de radicales libres para
dar paso al daño de la membrana