ANALISIS CUANTITATIVO DE ACIDO ACETIL SALICILICO MEDIANTE

ESPECTROFOTOMETRIA UV
FERNANDEZ, Maria José (1116277960); MANRIQUE, Esther (1098779305); ORTIZ
GUTIERREZ, Javier José (1094277849)
Técnicas de Análisis Instrumental – Grupo B
Facultad de Ciencias Básicas. Departamento Química y Biología
Universidad de Pamplona
Km. 1 Vía Bucaramanga Pamplona Norte de Santander.

RESUMEN: Se compararon los métodos de extracción MSPD y SPE para la extracción de flavonoide (quercetina)
en miel de Frieseomelitta, una especie de abeja sin aguijón presente en Colombia. Se usaron los diferentes
procedimientos para cada técnica encontrado necesaria la construcción de cartuchos usando jeringas comunes.
Se usó metanol como solvente para las dos técnicas. Posterior a la extracción se cuantificó la concentración en las
muestras mediante el uso de un espectrofotómetro UV-vis, los valores encontrados resultaron similares a los
reportados en la literatura. Se encontró que MSPD proporciona una mayor extracción y se observó que las técnicas
usadas resultan ser viables en cuanto a factor tiempo y economía.

PALABRAS CLAVE: Flavonoide, quercetina, abejas sin aguijón, miel de pote, espectrometría UV.

ABSTRACT: The MSPD and SPE extraction methods were compared for the extraction of flavonoid (quercetin) in
honey from Frieseomelitta, a species of stingless bee present in Colombia. The different procedures were used for
each technique found necessary to build cartridges using common syringes. Methanol was used as solvent for the
two techniques. After the extraction, the concentration in the samples was quantified by using a UV-vis
spectrophotometer, the values found were similar to those reported in the literature. It was found that MSPD
provides greater extraction and it was observed that the techniques used turn out to be viable in terms of time and
economy.

KEY WORDS: Flavonoid, quercetin, stingless bees, pot honey, UV spectrometry.

1. INTRODUCCIÓN: aminoácidos y ácidos orgánicos, lípidos, vitaminas,

minerales y metabolitos secundarios, principalmente
En Colombia se conoce la existencia de cerca de 120
compuestos fenólicos, la importancia de estos
especies de abejas nativas sin aguijón, muchas de las
compuestos con respecto a la nutrición es debido a
cuales tienen importantes usos y representaciones
los efectos fisiológicos, pues muestran varias
para diversos grupos sociales y culturales. [1]
propiedades relacionadas con la salud. [6]
Algunas de las familias de abejas sin aguijón
conocidas son: Frieseomelitta, Melipona, Plebeia, Los flavonoides son uno de los grandes grupos de los
entre otras.[2] compuestos fenólicos, estos proceden de las plantas
que son utilizadas por las abejas para recolectar el
Existen alrededor de 500 especies de abejas sin
néctar, es así como estos componentes bioactivos se
aguijón pertenecientes a la sub-familia Meliponini, las
transfieren de las abejas a la miel. [7] La figura 1
cuales viven en regiones tropicales y subtropicales
muestra la clasificación de los compuestos fenólicos:
del planeta. [3] A diferencia de la Apis mellifera, estas
abejas almacenan su miel en sus nidos expuestos o
en cavidades preexistentes y no en panales.[4]
La miel es esencialmente una solución concentrada
de diferentes hidratos de carbono, que comprenden
aproximadamente 95% de su peso, en ella se pueden
encontrar compuestos como la fructosa, glucosa y
otros oligo y polisacáridos. [5] En una menor cantidad
la miel está compuesta por proteínas, enzimas
1

Figura 1: Árbol familiar de los compuestos fenólicos
alimenticios. [7]
El origen botánico y la composición química son
factores que influyen en la calidad de la miel, los
perfiles de flavonoides de mieles están determinados
por su origen botánico y geográfico, y por las
condiciones climáticas de la zona. [8] Dichos
compuestos son importantes porque contribuyen al
color y el sabor de la miel y también por sus efectos
beneficiosos para la salud, los flavonoides son
compuestos con una alta capacidad antioxidante,
estos están presentes en la mayoría de las plantas,
especialmente en las frutas y hortalizas. Debido a su
propiedad antioxidante, las industrias de
procesamiento de alimentos, cosméticas y
farmacéuticas se han interesado por el estudio la
identificación y cuantificación de los flavonoides en la
miel. [9]
La estructura de los flavonoides es formada por 15
átomos de carbono (C6-C3-C6), que consiste en dos
anillos aromáticos (A y B) que contienen
generalmente grupos hidroxilos unidos por una
cadena lineal de tres carbonos como se muestra en
la figura 2. Las diferencias en la estructura y la
sustitución influirán en la estabilidad de los radicales,
nivel de oxidación y por lo tanto en las propiedades
antioxidantes. [10]
Figura 2: estructura básica de un flavonoide. [7]
La quercetina (figura 3) es uno de los flavonoides más
comunes y estudiados dentro de la gran variedad de
estos compuestos que se pueden encontrar en la miel
2
de abejas, la quercetina posee la, estructura de la cual
se derivan otros compuestos fenólicos y se le han
atribuido gran número de actividades biológicas.
Figura 3: estructura molecular de la quercetina. [7]
La estructura de la quercetina cumple con las
características determinantes para una buena
reactividad frente a los radicales libres y actividad
antioxidante, pues promueve sus propiedades
antirradicales y metal-quelante lo cual conduce a su
buen desempeño antioxidante. [11]
Además de brindar características beneficiosas y de
gran interés, la estructura molecular quercetina hace
posible que después de una adecuada extracción,
este compuesto sea “fácilmente” novedoso
cuantificable mediante el uso de la técnica
espectrometría UV-vis.
Métodos de extracción como SPE y SPME han sido
aplicados para la extracción de flavonoides. [12] Se
considera que la MSPD puede ser una alternativa
para la extracción de flavonoides en miel teniendo en
cuenta las propiedades de la muestra como densidad
y viscosidad y los factores como costo y el porcentaje
de recuperación. [13]
Se han investigado técnicas mediante las cuales se
pueda optimizar la de extracción de flavonoides en
frutos como el caso de Vilbett Briones-Labarca y
colaboradores en su estudio en el cual se intenta
optimizar la extracción de flavonoides en pulpa de
tomate con el uso de alta presión hidrostática. [14]
Investigaciones en mieles monoflorales de Apis
mellifera en países como Túnez, Australia y Nueva
Zelanda han reportado concentraciones de
quercetina variables y se sabe que el valor oscila
entre 0.03 mg/100g y 1.10 mg/100g
aproximadamente. [15] [16] [17] [18]
En la experiencia de laboratorio se determinó la
cantidad de quercetina presente en la miel de abeja
de la especie “Frieseomelitta” mediante
espectrometría UV-vis, además, se compararon las
técnicas extracción usadas, extracción en fase sólida
(SPE) y dispersión de matriz en fase sólida (MSPD).
2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:
2.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Se usaron los reactivos grado analítico: gel de sílice,
sulfato de sodio anhidro y metanol, todos los
anteriores de marca Merck ®. Después de la
extracción, con el objetivo de realizar las curvas de
calibración para la cuantificación del flavonoide se
utilizó el estándar analítico de quercetina Fluka ® y un
espectrofotómetro UV-Vis, Shimadzu (UV-2401PC).
2.2 PROCEDIMIENTO:
Para la extracción de la quercetina mediante los dos
métodos usados fue necesaria la preparación de 4
cartuchos usando jeringas desechables de 5 mL, dos
de ellos fueron usados para el procedimiento de
extracción en fase solida y los dos restantes para el
método de dispersión de matriz en fase sólida.
2.2.1 EXTRACCIÓN EN FASE SOLIDA (SPE)
Para esta parte de la experiencia el procedimiento
consistió en tomar una muestra de 1mL de miel, dicha
muestra se diluyó en una mezcla 1:3 de metanol: agua,
se llevó a calentamiento (sin ebullición) por 10
minutos, paralelamente se elaboraron los dos
cartuchos usados para SPE, estos se construyeron
como muestra el siguiente esquema:
Figura 4: Es quema del cartucho usado para SPE.
2.2.2 DISPERSIÓN DE MATRIZ EN FASE SOLIDA
(MSPD)
3
Para esta técnica se tomaron 0.5 gramos de miel (11
gotas), el procedimiento consistió en macerar la
muestra en un crisol con 0.4g de sílica, hasta lograr
una consistencia con aspecto de pasta viscosa la cual
fue recogida con un algodón y se agregó a un cartucho
con la siguiente configuración:
Figura 5: Esquema del cartucho para MSPD
2.2.3 EXTRACCIÓN AL VACIO
Después de preparadas las muestras y los cartuchos
correspondientes a cada técnica, se preparó un
montaje con una bomba de vacío al cual se le
conectaron los cartuchos, para el caso de los
cartuchos de SPE se agregó la mezcla de miel,
metanol y agua al cartucho y en el caso de los
cartuchos de MSPD se agregó el disolvente (metanol)
para la elusión. Posteriormente se activó la bomba de
vacío para realizar la extracción, dejando la bomba
encendida por aproximadamente 7 minutos. Las
soluciones extraídas fueron recolectadas en viales
para posterior análisis.
2.2.4 CUANTIFICACIÓN MEDIANTE
ESPECTROMETRIA UV-vis.
Para la cuantificación de quercetina en miel se realizó
la curva de calibración, tomando un pequeño volumen
de la solución madre y preparando soluciones
acuosas de diferentes concentraciones, utilizando
el estándar analítico de quercetina (Fluka®). En la
tabla 1 se presenta la preparación de las mismas y su
lectura en el espectrofotómetro UV-vis, Shimadzu
(UV-2401PC) a 510 nm.
 Vol sln Concentración muestras. La tabla 2 muestra los resultados de esta
Absorbancia
madre (L) [mg/L] parte del procedimiento.
1 1,E-05 0,24 0,062
2 2,E-05 0,48 0,141 3. RESULTADOS:
3 3,E-05 0,72 0,201 Después de realizar el análisis en el
4 4,E-05 0,96 0,264 espectrofotómetro se obtiene la respuesta para
5 5,E-05 1,20 0,329 absorbancia en las muestras, se obtuvieron los
6 6,E-05 1,44 0,449 siguientes resultados:
7 7,E-05 1,68 0,499
8 8,E-05 1,92 0,581 Método Absorbancia Concentración (mg/L)
SPE 1 0.091 0.3529
Tabla 1. Curva de calibración y lectura muestras SPE 2 0.086 0.3367
MSPD 1 0.084 0.3303
Solución madre: 25 mL solución (15mg de estándar MSPD 2 0.073 0.2947
quercetina) concentración: 600 mg/L

Las muestras preparadas para determinar la curva de Tabla 2: Datos obtenidos para las muestras
calibración se tomaron de la solución madre y se
Para determinar la concentración de quercetina en las
aforaron a 25 mL.
muestras que se llevaron al equipo es necesario
La figura 6 muestra la linealización obtenida para los aplicar la ecuación 1, teniendo en cuenta que la
datos de la tabla 1: concentración hallada mediante esta fórmula es la
concentración del flavonoide en la muestra llevada al
0.7 equipo y se debe realizar el calculo para estimar la
cantidad de quercetina en la miel de la cual se tomó
0.6
dicha muestra.
Absorbancia

0.5
0.4 Al despejar X de la ecuación 1 se tiene:
0.3 Y + 0.0181
0.2 X= Ec. 2
y = 0,3091x - 0,0181 0.3091
0.1 R² = 0,9937
Esta ecuación se usó para calcular las diferentes
0
concentraciones de quercetina, consignadas en la
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Concentración (mg/L) anterior tabla.
El calculo para estimar la cantidad real de flavonoide
Figura 6: Grafica de la curva de calibración
en la muestra es el siguiente:
La ecuación 1 permite hallar la concentración de  Para SPE:
quercetina en la muestra, dicha ecuación se obtiene
al linealizar la tendencia de los datos. Muestra 1

Y=0.3091X-0.0181 Ec. 1 Se debe iniciar con la concentración calculada con la

Donde:
Y: Absorbancia
X: Concentración (mg/L)
Las soluciones obtenidas después de la extracción se
concentraron a 1mL con la ayuda de un rota
evaporador y posteriormente se prepararon
soluciones de 10mL, las cuales se analizaron en el
espectrofotómetro UV-vis, Shimadzu (UV-2401PC), a
una longitud de onda de 510 nm para determinar la
respuesta del equipo (absorbancia) permitiendo
calcular la concentración de quercetina en las
4
curva de calibración y tener en cuenta que esta es la
concentración en la solución de 10 mL de la cual se
tomó la muestra para ser llevada al equipo, por lo
tanto 0.3529 mg/L es la concentración de quercetina
en esta solución, siguiendo la formula para diluciones
es posible calcular la concentración de quercetina en
la muestra concentrada a 1 mL y de la misma manera
para hallar la concentración en la solución con
metanol y agua, hasta llegar a la muestra de 1 mL
tomada al inicio del procedimiento.
El cálculo es el siguiente: 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎
= 0.6606
100 𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙
Para la solución concentrada a 1 mL:
Se aplicó el mismo calculo para la segunda muestra
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2
trabajada con MSPD y se obtuvo
(0.3529𝑚𝑔/𝐿)(0.01𝐿) 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎
0.5809
𝐶2 = 100 𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙
0.001𝐿
𝐶2 = 3.529 𝑚𝑔/𝐿
4. ANALISIS DE RESULTADOS:
Para la dilución con metanol y agua
(3.529𝑚𝑔/𝐿)(0.001𝐿) La tabla 3 presenta un resumen con las
𝐶2 = concentraciones en la miel halladas por las dos
0.004𝐿
técnicas:
𝐶2 = 0.8822 𝑚𝑔/𝐿
Método Concentración (mg/100 g miel)
Para la muestra tomada al inicio del experimento SPE 1 0.2520
(1mL de miel): SPE 2 0.2405
MSPD 1 0.6606
(0.8822𝑚𝑔/𝐿)(0.004𝐿)
𝐶2 = MSPD 2 0.5809
0.001𝐿
𝐶2 = 3.529 𝑚𝑔/𝐿 La concentración promedio en SPE fue de 0.2462 ±
0.0081 y para MSPD 0.62075 ± 0.0563, la segunda
Esta es la concentración de quercetina en la miel, con técnica posee una mayor desviación estándar, sin
el fin de comparar el resultado obtenido con el valor embargo, observa que las muestras analizadas por
reportado en la literatura (mg de quercetina/100g de MSPD presentan una mayor cantidad de quercetina,
miel) se realiza el siguiente calculo tomando una lo anterior se puede traducir en efectividad del método
densidad de 1,4 g/mL para la miel: en la extracción de este compuesto. En el
mg 1L 1mL mg quercet procedimiento aplicado para la extracción en fase
3.529 ∗ ∗ 100g = 𝟎. 𝟐𝟓𝟐 solida (SPE) se calentó la dilución de miel con
L 1000mL 1.4g 100 g de miel
metanol y agua, es posible que esta parte del
Se realizó el mismo calculo para la muestra 2 y se procedimiento haya afectado la concentración del
𝐦𝐠 𝐪𝐮𝐞𝐫𝐜𝐞𝐭 flavonoide debido a la fluctuación de temperatura
obtuvo 𝟎. 𝟐𝟒𝟎𝟓 𝟏𝟎𝟎 𝐠 𝐝𝐞 𝐦𝐢𝐞𝐥
presentada en la plancha de calentamiento que se
 Para MSPD utilizó para tal fin. La naturaleza de la muestra hace
necesario un tratamiento de extracción por MSPD
Muestra 1 debido a su consistencia viscosa, el protocolo
efectuado para esta técnica optimiza la extracción del
El calculo para MSPD es similar al cálculo
analito en la etapa de extracción al vacío, además de
anteriormente realizado, se halló la concentración
esto, el procedimiento aplicado en MSPD reduce las
hasta llegar a la muestra de 1mL.
perdidas de analito al “limpiar” el mortero con el
Aplicando las formulas de diluciones se tiene que la algodón, lo que se ve reflejado en una mayor
concentración de la muestra concentrada a 1 mL es cuantificación de quercetina en las muestras.
3.303 mg/mL, para calcular la cantidad de quercetina
en la muestra de 0,5 g se realizó de la siguiente Se debe tener en cuenta que los cálculos
manera: anteriormente presentados para las dos técnicas
mg consideran una extracción de 100% para el
3.303 ∗ 0.001L = 3.303 ∗ 10−3 𝑚𝑔 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎 compuesto de interés.
L
3.303 ∗ 10−3 𝑚𝑔 𝑞𝑢𝑒𝑟𝑐𝑒𝑡𝑖𝑛𝑎 𝑚𝑔 Los valores de concentración del flavonoide en la
= 6.606 ∗ 10−3
0.5 𝑔 𝑑𝑒 𝑚𝑖𝑒𝑙 𝑔 𝑚𝑖𝑒𝑙 muestra se encuentran dentro del rango reportado por
en la literatura notando que para las muestras
cuantificadas por SPD a pesar de tener una baja
5
concentración, es mayor que el rango más bajo
reportado para mieles de Apis mellifera.
Los métodos de extracción analizados en el presente
trabajo han sido anteriormente estudiados para
extracción de flavonoides, autores han reportado que
la técnica de dispersión de matriz en fase solida es
una mejor alternativa al compararla con SPE en
cuanto al porcentaje de recuperación, costo y
contaminación por el uso de solventes.[19]
5. CONCLUSIONES:
Debido a la naturaleza viscosa de la miel, la técnica
de dispersión de matriz en fase solida resulta ser una
mejor opción para la extracción de flavonoides,
factores como perdida de muestra y uso de solvente
se reducen para esta técnica.
El procedimiento efectuado para SPE puede afectar
la cuantificación de flavonoide si no se regula
adecuadamente la temperatura al calentar la dilución.
Se comprobó que el contenido de porcentaje de
quercetina en miel se encuentra dentro del rango
reportado en la literatura. Los métodos usados
resultan ser económicamente factibles y viables en
tiempo para la cuantificación del analito.
La técnica de espectrometría UV-vis resulta ser una
buena alternativa para la cuantificación de quercetina.
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