DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS

(ÁCIDO 3,5-DINITROSALICÍLICO)

DETERMINATION OF REDUCING SUGARS BY THE DNS METHOD

(ACID 3,5-DINITROSALICÍLICO)

Ena Hernández*, Ivan Padilla*, Guillermo Pérez*, Estela Oviedo*, Verónica Camargo*
*Estudiante de Ingeniería de Alimentos
Universidad de Córdoba, mayo de 2019

RESUMEN
En instalaciones del laboratorio de biotecnología y fermentación de ingeniería de alimentos de la
Universidad de Córdoba, se realizó la práctica de determinación de azúcares reductores por el
método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico), a partir de una solución estándar de glucosa. Se
tomaron datos de absorbancia para cada una de las 6 diluciones (agua destilada+ solución de
glucosa a distintas concentraciones y diluciones) y para una muestra problema con concentración
desconocida. Finalmente se graficó una curva de calibración para los datos obtenidos
(concentración vs absorbancia), y se halló la concentración de la solución problema.
Palabras claves: azúcares reductores, DNS, absorbancia, concentración, curva de calibración

ABSTRACT
In facilities of the laboratory of biotechnology and fermentation of food engineering of the
University of Córdoba, the practice of determination of reducing sugars by the DNS method
(3,5-dinitrosalicylic acid), from a standard solution of glucose was carried out. Absorbance data
were taken for each of the 6 dilutions (distilled water + glucose solution at different
concentrations and dilutions) and for a test sample with unknown concentration. Finally, a
calibration curve was graphed for the data obtained (concentration vs absorbance), and the
concentration of the problem solution was found
Keywords: reducing sugars, DNS, absorbance, concentration, calibration curve

1. INTRODUCCIÓN
Entre los distintos componentes de
los alimentos, después del agua, los
carbohidratos son las sustancias más
abundantes y más ampliamente
distribuidas en la naturaleza; el
almidón es una de las fuentes
alimentarias más empleadas en el
mundo (Muñoz, 2014).
Además de ser componentes
naturales de muchos alimentos, la
industria alimentaria emplea los
carbohidratos en función de sus
propiedades funcionales, usándose
como ingredientes para mejorar la
aceptabilidad, palatabilidad y vida
útil de diversos alimentos (Muñoz,
2014).
Existen diversos métodos para
identificación de azúcares, de
acuerdo a los usos, y de acuerdo
también a su capacidad reductora,
haciéndolos reaccionar con sales de
metales.
La reactividad de los distintos
azúcares está dada por la
disponibilidad de su grupo carbonilo.
Se sabe que la forma abierta o
extendida de los azúcares no es muy
estable, a tal punto que, por ejemplo,
en la glucosa representa sólo el 0,002
%. Las moléculas de azúcar
consiguen estabilizarse a través de un
equilibrio entre dicha forma abierta y
por lo menos dos formas cerradas
(anómeros cíclicos) en las que el
grupo carbonilo ha desaparecido
(Toledo, 2015).
Uno de los métodos más acordes y
con mejor resultado en la
determinación de azúcares con
carácter reductor, es el método
(DNS), su principal ventaja radica en
su alta sensibilidad y productividad
debido a que es un método
espectrofotométrico (Rodríguez, sf)
El procedimiento se basa en una
reacción redox que ocurre entre el
DNS y los azúcares reductores
presentes en la muestra, sin embargo,
a nivel industrial no es recomendable
utilizarlo cuando dicha muestra trata
de sustancias tales como mieles y
caldos de fermentación que lo
contenga, esto es debido a estudios
realizados en la materia, a los altos
niveles de dispersión (Rodríguez, sf)
El método DNS es una técnica
colorimétrica que emplea 3,5-ácido
dinitrosalicílico para la hidrólisis de
polisacáridos presentes en una
muestra, seguido de la determinación
espectrofotométrica a 540 nm de los
azúcares reductores. Esta técnica
sirve para cuantificar los azúcares
reductores producidos durante una
fermentación o para cuantificar los
productos de una reacción
enzimática (Rojas, s.f).
El objetivo de la práctica fue aplicar
una técnica sencilla, rápida y eficaz
para determinar azúcares reductores
en caldos y medios de fermentación
que permitan conocer los
rendimientos en sustrato y productos
durante un bioproceso.
2. METODOLOGÍA
2.1.Preparación de solución
estándar de glucosa
Se disolvió 1 g de glucosa anhidra en
1000 mL de agua destilada, y se
conservó en refrigeración hasta el
momento del uso.
2.2. Preparación de soluciones
Se estableció una escala de 0 a 1000
ppm de glucosa. Dentro de una serie
de tubos de ensayo, previamente
lavados y sumergidos en solución de
ácido sulfúrico al 5% durante toda
una noche; se introdujeron: 0; 0.2;
0.4; 0.6; 0.8; y 1 mL de solución
estándar de glucosa y se completó a
1 mL con agua destilada (Tabla 1)
Tubo mL de s/n mL de agua Concentración Absorbancia
estándar destilada final (ppm) (575 nm)
1 0.0 1.0 0
2 0.2 0.8 200
3 0.4 0.6 400
4 0.6 0.4 600
5 0.8 0.2 800
6 1.0 0.0 1000
Tabla 1 Soluciones

2.3. Determinación de DNS 3. RESULTADOS

Para la determinación de azúcares Tubo Concentración Absorbancia
reductores se efectuó sobre 1 mL de (ppm) (575 nm)
muestra convenientemente diluida. 1 0 0
En primer lugar, se adicionó 1 mL de 2 200 0.076
reactivo DNS, se agitó fuertemente 3 400 0.178
en el vórtex, se puso a ebullición 4 600 0.332
durante 5 minutos, luego se enfrió 5 800 0.464
por tres minutos para detener la 6 1000 0.598
reacción, se agregó 8 mL de agua Sln ------------------- 0.025
destilada, se volvió a agitar en vórtex problema
y se leyó la absorbancia en cada Tabla 2
tubo.
4. CÁLCULOS
-Grafica de la curva de calibración
(Concentración vs absorbancia), y
cálculo de R2
Absorbancia VS Concentración
0.8
Absorbancia (575nm)

y = 0,0006x - 0,033
0.6
R² = 0,9895
0.4

0.2

0
0 200 400 600 800 1000
Concentración (ppm)

Figura 1 Absorbancia VS Concentración

Utilizando la ecuación de la recta
obtenida en curva de calibración, y el
 dato de absorbancia para la muestra La concentración de la solución
problema, tenemos: problema en partes por millón es de
483.5
Pendiente Intercepto Absorb [ppm]
(m) (b) (570
nm)
0.0006 -0.0033 0.025 Incógnita 5. ANÁLISIS DE RESULTADOS
(X)
De acuerdo con los resultados obtenidos
en la gráfica de calibración, el R2 es de
-Además, el R2 tuvo un valor de 0.9895, 0.9895, y la pendiente de la línea es
y: positiva, esto nos indica que el método
es estadísticamente confiable, ya que,
muestra que la recta está describiendo
Cálculo de concentración de solución bien el comportamiento de las
problema absorbancias vs las concentraciones de
las disoluciones, pues era de esperarse
y = 0,0006x - 0,033 que a medida que se tenía una disolución
más alta con contenido de glucosa, la
absorbancia fuera más elevada.
Para esto se está usando:
Para esta técnica, se sabe que el ácido
Y= mx+b 3,5-dinitrosalicílico es reducido en
presencia de calor, por los azúcares
Despejamos x de la ecuación reductores que entran en contacto con él,
𝑦 + 0.033 se desarrolla un cambio de color
𝑥= parecido al café (con variaciones de
0.0006
amarillo hasta café). El cambio de
coloración puede entonces determinarse
𝑦 = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎 por lecturas de densidad óptica, leídas
por espectrofotometría a una
Entonces tenemos:
determinada longitud de onda (Nuñez,
0.025 + 0.033 2012), lo cual explica muy bien lo
𝑥= = 96.7 ocurrido en los resultados de
0.0006
absorbancia.
Hallamos factor de dilución:
Lo anterior indica que a mayores
concentraciones de azúcares reductores
0.2 𝑚𝑙 1 se provocan una mayor coloración de la
𝐹𝑑 = = muestra (Fajardo, 2007). Lo cual explica
0.8 𝑚𝑙 4
la coloración más oscura en las muestras
𝐹𝑑 = 1: 5 de los tubos 5 y 6, que presentaban
mayor contenido de glucosa.
𝐼𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝐹𝑑 = 5
En este mismo orden, se sabe que la
Ahora,
curva de calibración obtenida para el
X (ppm) = 96.7 ∗ 5 método de cuantificación de glucosa por
el método de DNS, presenta una
𝐗 (𝐩𝐩𝐦) = 𝟒𝟖𝟑. 𝟓 tendencia lineal donde se aplica a la Ley
de Beert que representa la relación entre
la absorbancia y la concentración del
complejo obtenido por la reducción de la
glucosa con el DNS directamente
proporcional (Guillen, 2017).
Ahora, la pendiente de la gráfica
relaciona el coeficiente de extinción
molar, la sensibilidad del método
analítico se expresa en unidades de
concentración y está asociado cambio
mínimo de glucosa que puede detectar el
instrumento (Guillen, 2017).
La bibliografía indica que, para poder
hallar concentraciones de muestras
desconocidas, se debe hacer una gráfica
de calibración con una muestra de azúcar
conocido que relacione absorbancia vs
concentraciones, en este caso glucosa
(Bello et al. 2006).
Así, usando los valores arrojados por la
ecuación de la recta y el factor de
dilución, se obtuvo que la concentración
de la solución problema es de 483.5
ppm, valor que está dentro del rango de
la gráfica. Esto se basa en una
interpolación en la gráfica de calibración
del azúcar usado como modelo estándar,
basado en datos de concentración y
absorbancia.
6. CONSULTA
Otros métodos utilizados para
determinación de azúcares reductores
Método Lane-Enyon
Es un método volumétrico que consiste
en la determinación del volumen
necesario de la muestra problema que se
necesita para reducir un reactivo alcalino
de cobre. El punto final se establece en
presencia de azul de metileno el cual se
reduce a blanco de metileno si hay
exceso de azúcares reductores.
Ventajas
En condiciones especificadas, la
cantidad de cobre reducido está
en proporción con la cantidad de
azúcares reductores presentes.
Ha demostrado ser exacto y
preciso en la determinación de
azúcares reductores.
Desventajas
Los métodos de reducción del
cobre para determinar la cantidad
de azúcares reductores no son
estequiometricas.
Tiene principal inconveniente ser
un método volumétrico donde el
punto final de la valoración se
detecta por cambio de color
(Bello et all., 2006).
La prueba de Benedict
Para determinar la presencia de azúcares
reductores en una muestra, esta se
disuelve en agua hirviendo. A
continuación, se agrega una pequeña
cantidad del reactivo de Benedict y se
espera a que la solución alcance la
temperatura ambiente. En los siguientes
10 minutos la solución debería comenzar
a cambiar de color.
Si el color cambia a azul, entonces no
hay azúcares reductores presentes,
particularmente glucosa. Si hay una gran
cantidad de glucosa presente en la
muestra a analizar, entonces el cambio
de color progresará a verde, amarillo,
naranja, rojo y finalmente marrón.
Si hay azúcares reductores, estos
reducirán el sulfato de cobre (color azul)
de la solución de Benedict a un sulfuro
de cobre (color rojizo), que se ve como
el precipitado y es responsable del
cambio de color.
Ventajas
Técnica rápida y sencilla para
determinar la presencia de
azúcares reductores.
Gran estabilidad del reactivo
suministrado.
Almacenamiento a temperatura
ambiente.
Método químico-cualitativo. No
requiere equipo para su lectura.
El reactivo de Benedict está
disponible a partir de 125 ml.
El reactivo de Fehling
De manera similar a la prueba de
Benedict, la prueba de Fehling requiere
que la muestra esté disuelta por
completo en una solución; esto se hace
en presencia de calor para garantizar que
se disuelva por completo. Luego de esto,
se agrega la solución de Fehling
agitando constantemente.
Si hay azúcares reductores presentes, la
solución debería comenzar a cambiar de
color a medida que se forma un óxido o
un precipitado de color rojo. Si no hay
azúcares reductores presentes, la
solución permanecerá azul o verde. La
solución de Fehling también se prepara a
partir de otras dos soluciones (A y B).
Esta prueba sirve para determinar
monosacáridos, específicamente aldosas
y cetosas. Estos se detectan cuando el
aldehído se oxida a ácido y forma un
óxido cuproso.
Ventajas
Estas variaciones han sido para cada
tipo de alimento, en cualquier caso el
principal logro de modificaciones ha
sido mejorar la precisión de
reducción y eliminar cualquier factor
que interfiera con la producción de
óxido de cobre, de los factores
estudiados, la alcalinidad del
reactivo, la proporción, el tiempo de
calentamiento, la concentración del
azúcar, son los más importantes.
Desventajas
La prueba de Fehling no es
específica; otras sustancias que
dan reacción positiva son los
fenoles, aminofenoles, benzoína,
ácido úrico, catecol, ácido
fórmico, hidrazobenceno,
fenilhidrazina, pirogalol y
resorcinol (Acasti).
La reducción del cobre y la
oxidación de los azucares no es
estequiometrica.
La producción de óxido cuproso
varia, dependiendo del reactivo
álcali, la velocidad y tiempo de
calentamiento y la concentración
de azucares en la muestra.
Los azucares difieren en su
habilidad para reducir la solución
cúprica.
El reactivo de Tollens
La prueba de Tollens, también conocida
como prueba de espejo de plata, es una
prueba de laboratorio cualitativa que se
usa para distinguir entre un aldehído y
una cetona. Explota el hecho de que los
aldehídos se oxidan fácilmente, mientras
que las cetonas no.
En la prueba de Tollens se utiliza una
mezcla conocida como reactivo de
Tollens, que es una solución básica que
contiene iones de plata coordinados con
amoniaco.
Este reactivo no está disponible
comercialmente debido a su corta vida
útil, por lo que debe ser preparado en el
laboratorio cuando se vaya a emplear.
Así, un resultado positivo con el reactivo
de Tollens se determina mediante la
observación de un “espejo de plata” en el
interior del tubo de ensayo; este efecto
espejo es característico de esta reacción.
Ventajas:
Es más sensible que el de Fheling
y más adecuado para revelar
pequeñas diferencias de
actividad.
Desventajas:
Es menos eficaz en la
diferenciación de azúcares
reductores y no reductores
Determinación de azúcares (glucosa)
por HPLC
Es un método cromatográfico utilizado
para separar componentes de una
muestra que se dividen entre una fase
móvil líquida y una fase sólida
estacionaria conformada por partículas
muy finas que se encuentran en una
columna, y donde se utiliza una presión
muy alta para permitir el paso del
disolvente por medio de ésta, logrando
así separaciones de alta resolución, para
su posterior identificación y muestras de la solución problema
cuantificación.
Ventajas
Es el método de determinación
de azúcares más preciso y
confiable, tanto así que puede
utilizarse para cuantificar
azúcares mayoritarios y obtención de biomasa como fuente
minoritarios.
Tiene gran solubilidad en agua.
Es idónea para la separación de
especies no volátiles o
termolábiles.
Desventaja
Requiere mayores restricciones, por
ejemplo la película resinosa que se
use debe ser no porosa, debe tener
elevada estabilidad a cambios de pH
7. CONCLUSIONES
El ácido 3,5 dinitrosalicílico, tiene la
capacidad de oxidar a los azúcares
reductores dando resultados
colorimétricos que se pueden medir
con una longitud de onda de 575nm
por espectrofotometría, que durante
la obtención de resultados se puede
llegar a la confirmación de que la
cantidad de azúcar es proporcional a
la absorbancia, a medida que hay
mayor contenido de glucosa, mayor
es la lectura de absorbancia.
Hacer la curva de calibración con un
azúcar de concentración conocida
hace mucho más fácil el cálculo de la
concentración de la solución
problema a través de la pendiente de
la curva y el factor de dilución
manejado en el laboratorio; sin
embargo, sería bueno hacer más
lecturas de absorbancia para varias
para tener un estudio más amplio.
La determinación de azucares
reductores en la biotecnología de
alimentos es muy importante, ya que,
en la industria de los alimentos los
azucares son bastante utilizados
como sustratos de los procesos de
de energía de las células implicadas.
 Razón por la cual, se deben estudiar
las formas de determinarlos.
8. BIBLIOGRAFÍA
Bello, D. (2006). Determinación de
azúcares reductores totales en jugos
mezclados de caña de azúcar
utilizando el método del ácido 3,5
dinitrosalicílico. ICIDCA. Sobre los
Derivados de la Caña de Azúcar. [En
línea], disponible en
https://www.redalyc.org/pdf/2231/22
3120664006.pdf
Fajardo, C. (2007). Evaluación de
melaza de caña como sustrato para la
producción de Saccharomyces
cerevisiae. Trabajo de grado para
obtener el título de microbiólogo
industrial. Universidad javeriana.
Bogotá D.C. [En línea], disponible
en
https://www.javeriana.edu.co/biblos/t
esis/ciencias/tesis26.pdf
Guillen, C. (2017). Metodologías
analticas para determinar el nivel de
degradación de la celulosa en soporte
papel por procesos de óxido
reducción o hidrólisis. [En línea],
disponible en
https://www.academia.edu/4413523/
Metodolog%C3%ADas_analticas_pa
ra_determinar_el_nivel_de_degradac
i%C3%B3n_de_la_celulosa_en_sopo
rte_papel_por_procesos_de_%C3%B
3xido_reducci%C3%B3n_o_hidr%C
3%B3lisis
Luján, Deivis. Guía n° 2: determinación
de azucares reductores por el método
DNS (Acido 3,5- Dinitrosalicílico).
Manual de laboratorio de
Biotecnología de alimentos.
Universidad de Córdoba. Facultad de
Ingeniería. Programa Ingeniería de
Alimentos.
Muñoz, A. (2014). Determinación de
azúcares reductores por
espectrofotometría (Método DNS).
[En línea], disponible en
https://es.slideshare.net/vegabner/det
erminacin-de-azcares-reductores-por-
espectrofotometra-mtodo-dns
Nuñez, R. (2012). Contenido de azúcares
totales, reductores y no reductores en
Agave cocui Trelease. Venezuela.
Vol. 12, Nº 2, 2012 (129 - 135) [En
línea], disponible en
https://www.redalyc.org/pdf/904/904
24216002.pdf
Rodríguez, F. (sf). Determinación de
azucares reductores por el método de
DNS. [En línea], disponible en
https://es.scribd.com/document/3381
60367/Determinacion-de-Azucares-
Reductores-Por-El-Metodo-Del-DNS
Rojas, M. (s.f). Determinación de
azúcares reductores por la técnica de
Miller (DNS). [En línea], disponible
en
https://www.academia.edu/8255551/D
ETERMINACI%C3%93N_DE_AZ%C3%9A
CARES_REDUCTORES_POR_LA_T%C3%8
9CNICA_DE_MILLER_DNS
Toledo, F. (2015). Determinación de
azucares reductores totales (art). [En
línea], disponible en
https://es.slideshare.net/FranKlinTole
do1/determinacion-de-azucares
reductores-totalesart