KEBERHASILN ICSI TERGANTUNG PADA STABILITAS

DNA DAN STATUS DISULFIDA INTI SPERMATOZOA

Dosen Pembimbing : Dr. Widjiati, drh., M.Si

Disusun oleh :
Nurul Jannatul Wahidah
NIM. 011724653011

MAGISTER ILMU KESEHATAN REPRODUKSI

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA

0
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Perkembangan bioteknologi reproduksi ternak telah banyak menghasilkan

manfaat bagi manusia khususnya dalam industri peternakan. Teknologi-

teknologi tersebut antara lain adalah inseminasi buatan (IB) yang telah

memasyarakat di daerah-daerah dan sudah membuahkan hasil (Rustanto dan

Sugiono, 1997) dan transfer embrio (TE) yang saat ini masih dikembangkan

dapat dilakukan untuk memperbanyak embrio. Untuk keperluan transfer

embrio dibutuhkan embrio dalam jumlah yang banyak. Salah satu cara yang

dapat dilakukan adalah dengan aplikasi teknologi in vitro fertilization (IVF)

meliputi in vitro maturation (IVM) dan in vitro culture (IVC).

Ovarium sapi yang berasal dari rumah potong hewan (RPH) sesaat setelah

penyembelihan dapat dimanfaatkan sebagai sumber oosit untuk keperluan in

vitro maturasi sehingga dapat memudahkan in vitro fertilisasi (Pujol et al.,

2004), namun keberhasilan IVF sampai ke tahap blastosist sangat tergantung

pada beberapa faktor diantaranya jenis suplemen yang digunakan dalam media

maturasi in vitro (Hammam et al., 2010), kualitas oosit yang digunakan

(Lonergan et al., 2003; Anguita et al., 2007), serta resiko kontaminasi dan

kondisi kultur (Sagirkaya et al., 2007). Jenis suplemen, kualitas oosit serta

kondisi kultur yang baik sangat men- dukung untuk meningkatkan

kemampuan maturasi oosit in vitro.

1
 Optimalisasi maturasi in vitro oosit antara lain adalah pengklasifikasian

oosit, penambahan zat aditif berupa faktor pertumbuhan dan hormon (Shen et

al., 2008), maupun berbagai macam serum. Klasifikasi oosit yang didasarkan

pada kelengkapan struktur oosit sangat mempengaruhi maturasi in vitro dan

perkembangan oosit sampai ke tahap blastosist (Alm et al., 2005;

Ksiazkiewicz et al., 2007). Penggunaan serum seperti fetal calf serum (FCS)

banyak digunakan dalam produksi embrio (Sagirkaya et al., 2004) karena

mengandung epidermal growth factor (EGF) yang berperan sebagai regulator

intraovarian dalam proses maturasi oosit (Mtango et al., 2003). Fetal calf

serum telah dibuktikan bermanfaat selama kultur in vitro, namun kadar

penggunaannya dan hasil yang diperoleh masih bervariasi (Abe et al., 2002;

Holm et al., 2002; Rizos et al., 2002). Penelitian tentang pengaruh suplemen

FCS terhadap kemampuan maturasi oosit sapi in vitro dilakukan dalam rangka

untuk memanfaatkan hasil samping RPH dan sekaligus menambah referensi

hasil IVF.

1.2 Rumusan Masalah

Apakah suplementasi fetal calf serum dapat meningkatkan kemampuan

maturasi in vitro pada oosit sapi?

1.3 Tujuan

1.3.1 Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh suplementasi fetal calf serum dalam meningkatkan

kemampuan maturasi in vitro pada oosit sapi.

2
1.3.2 Tujuan Khusus

Membuktikkan pengaruh suplementasi fetal calf serum dalam

meningkatkan kemampuan maturasi in vitro pada oosit sapi.

1.4 Manfaat

Manfaat dari pembuatan makalah ini adalah untuk memberikan informasi

tentang manfaat suplementasi fetal calf serum dalam meningkatkan

kemampuan maturasi in vitro pada oosit sapi sebagai bahan alternatif pada

medium IVF.

3
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Fisiologi Reproduksi pada Kucing

Reproduksi fisiologi kucing betina berbeda dari banyak spesies yang lain.

Kucing betina biasanya mencapai pubertas diusia 4-12 bulan, waktu yang

tepat tergantung pada musim kawinnya dan berat badan kucing. Kucing betina

melakukan polyestrous secara musiman, maka kucing betina telah melakukan

beberapa siklus estrous selama musim kawin tetapi berjalan melalui periode

anestrus yang panjang selama bulan gelap per tahun. Musim kawin biasanya

dimulai pada bulan Januari atau Februari dan berlanjut sampai akhir musim

panas atau awal musim gugur, jika tidak terjadi ovulasi. Kucing betina

dianggap sebagai pemicu ovulator, dengan kopulasi menyebabkan pelepasan

hormon luteinizing (LH) yang menyebabkan ovulasi. Hal ini berlaku di

sebagian besar pada kucing betina, tetapi telah dicatat bahwa ovulasi spontan

terjadi secara sporadis di hingga 60% dari kucing betina.

Siklus estrus

Siklus estrus di kucing betina terdiri dari beberapa fase, sering didefinisikan

dan digunakan berbeda oleh penulis yang berbeda. Hal ini umumnya dibagi

menjadi lima fase perilaku yaitu proestrus, estrus, interestrus, diestrus dan

anestrus.

4
Proestrus

Fase proestrus berlangsung selama rata-rata 1 atau 2 hari (kisaran antara 0,4-2

hari) di kucing betina dan akan sulit untuk dilihat, karena waktu singkat dan

kurangnya tanda-tanda di eksternal pada alat kelaminnya. Dalam sebuah

penelitian yang dilakukan pada tahun 1979, proestrus hanya bisa diamati di 27

dari 168 siklus, dan di sisanya 141, betina melanjutkan langsung ke estrus dari

anestrus atau periode antar estrus. Fase proestrus terdiri dari pertumbuhan

folikel dan sintesis estrogen yang masuk sirkulasi dalam konsentrasi tinggi,

sering dua kali lebih tinggi dapat ditemukan di kucing betina selama anestrus

atau interestrus. Kucing mulai menunjukkan tanda-tanda estrus yaitu dengan

perilaku seperti bersuara, menggosok kepala dan leher terhadap benda dan

berguling-guling di tanah. Seekor kucing betina di proestrus menarik laki-laki

tetapi tidak ingin jantan untuk mengawininya. Akhir proestrus ditandai

dengan penerimaan kucing betina terhadap kucing jantan.

5
Estrus

Estrus adalah siklus perkawinan dan biasanya berlangsung selama rata-rata 7,2

hari. Tanda-tanda klinis estrus adalah sama seperti di proestrus, hanya saja

kucing betina menerima kucing jantan untuk mengawininya. Kucing betina

masuk ke posisi kawin jika kucing jantan datang, atau jika kucing jantan

sedang mengelus di bagian belakang di dasar ekor. Perilaku estrus terkait erat

dengan fase folikular yang didefinisikan sebagai periode waktu ketika folikel

memproduksi dan mengeluarkan tingkat tinggi estrogen. Kedua fase folikular

berkisar selama 3-16 hari dengan rata-rata 7,4 hari, dan bahwa panjang fase

itu tidak berubah karena kopulasi atau ovulasi. Hanya 8% dari kucing betina

menunjukkan perilaku estrus pada hari pertama, sementara itu fase folikuler

bisa dilihat pada 100% dari kucing betina dihari ke 5, yang menunjukkan

bahwa dua fase tidak berlangsung bersamaan. Konsentrasi estrogen terus

meningkat hingga konsentrasi puncak, rata-rata mencapai pada hari ke 3

dari fase folikular, dan kemudian dengan cepat menurun, meskipun sebagian

besar kucing betina terus jadi menunjukkan perilaku estrus untuk 1-4 hari

setelah fase folikular berakhir. Bahkan jika ovulasi diinduksi, yang mengarah

ke konsentrasi progesteron plasma mulai meningkat, keterbukaan seksual

kucing betina akan dilanjutkan ke periode estrus akhir. Jika ovulasi tidak

diinduksi selama estrus, kucing betina akan masuk ke fase anovulasi, sering

disebut sebagai fase interestrus, dan melanjutkan ke proestrus lagi segera

setelah itu. Jika kucing betina berovulasi selama estrus, kucing betina akan

hamil atau tidak hamil.

Interestrus

6
Kucing betina akan memasuki fase interestrus setelah periode estrus berakhir.

Ini adalah periode aktif reproduksi dan juga periode siklus estrus yang

membuat kucing betina berbeda. Periode interestrus yang telah diamati

bertahan selama 1,4-16,6 hari, dengan rata-rata di 9 hari, tapi berlangsung

lebih lama jika ovulasi diinduksi selama estrus. Estrogen dan kadar

progesteron dalam sirkulasi tetap rendah selama seluruh fase interestrus.

Kucing betina kembali ke perilaku normal dan tidak menarik kucing jantan.

Interestrous kadang-kadang disebut memiliki tiga hasil yang berbeda setelah

estrus yaitu fase anovulasi, kehamilan semu setelah ovulasi atau kehamilan.

Diestrus

Diestrus didefinisikan sebagai periode dominasi progesteron, yang merupakan

fase setelah estrus jika ovulasi diinduksi. Seekor kucing betina diestrus dapat

berupa kehamilan atau kehamilan semu, yang berarti bahwa dia berovulasi

tapi tidak hamil. Corpora lutea berkembang 1-2 hari setelah ovulasi dan mulai

mensintesis dan mensekresi progesteron, yang menghambat sekresi

gonadotropin-releasing hormone (GnRH) dari hipotalamus dan, pada

gilirannya, LH dan follicle stimulating hormone (FSH) dari kelenjar pituitari.

Pada akhir diestrus, kucing betina akan kembali ke fase proestrus atau

anestrus, tergantung pada musim.

Anestrus

Anestrus adalah fase dormansi reproduksi di mana konsentrasi plasma dari

kedua estrogen dan progesteron tetap pada tingkat dasar. Betina tidak menarik

laki-laki atau mengekspresikan perilaku seksual. Kucing betina subur, fase

anestrus musiman biasanya dimulai pada akhir musim panas atau awal musim

7
gugur dan terakhir sampai awal musim semi. Kucing betina bergantung pada

musim estrusnya, jumlah hari yang lebih pendek dapat memicu timbulnya

anestrus bahkan di tengah-tengah musim kawin. Hal ini juga memunkginkan

bahwa suhu yang lebih tinggi mungkin memulai periode anestrus, seperti yang

dapat terjadi selama musim panas dengan suhu tinggi. Oleh karena itu, telah

terlihat bahwa musim kawin kadang-kadang dibagi menjadi dua periode, salah

satu di musim semi dan satu di awal musim gugur, dengan periode anestrus

selama bulan-bulan hangat musim panas. Anestrus adalah fase yang mirip

dengan interestrus dan mereka kadang-kadang disebut sebagai fase yang sama.

a. Meningkatnya Ovulasi

Selama melakukan perkawinan, penis kucing jantan merangsang reseptor

di vagina yang mengirimkan sinyal ke hipotalamus melalui jalur tulang

belakang aferen. Hipotalamus dirangsang untuk menghasilkan GnRH,

yang pada gilirannya menyebabkan pelepasan LH dan FSH dari kelenjar

pituitari. Pelepasan FSH kemudian dihambat oleh inhibitor dari folikel.

Refleks ovulasi lebih sering terjadi pada beberapa individu. Dalam

beberapa spesies kucing liar telah mengamati bahwa kehadiranbetina

lainnya di estrus memicu ovulasi spontan pada frekuensi yang lebih tinggi.

b. Dampak perkawinan tunggal dan ganda

Meskipun kucing betina dianggap menjadi pemicu ovulator, sebuah

perkawinan tunggal tidak selalu cukup untuk menyebabkan puncak LH

yang diperlukan untuk ovulasi. Dalam sebuah penelitian yang dilakukan

oleh Concannon hanya 50% dari kucing betina yang ovulasi setelah kawin

tunggal dengan kucing jantan yang subur, hal ini menunjukkan variabilitas

8
yang signifikan antara individu dalam regulasi puncak LH. Setelah empat

kali perkawinan , 100% dari kucing betina telah berovulasi. Plasma

tingkat LH pada kucing betina yang berovulasi lebih tinggi dan

berlangsung lama setelah beberapa kali perkawinan dibandingkan dengan

setelah kawin tunggal. Pelepasan LH setelah kopulasi tunggal terjadi

hanya hitungan menit setelah. Hubungan perkawinan dan konsentrasi LH

dapat dilihat.

Perbedaan yang signifikan antara konsentrasi plasma pada kucing

betina dengan perkawinan tunggal dan kucing betina perkawinan
berkali-kali diyakini merupakan hasil dari pelepasan ulang GnRH. Ini
juga menunjukkan bahwa interval antara beberapa kegiatan sanggama
mungkin memiliki efek pada ovulasi. Dalam sebuah studi oleh Shille,
dapat disimpulkan bahwa peningkatan kadar LH untuk 2-4 jam dapat
menginduksi ovulasi pada kucing betina, dan bahwa lonjakan LH
berkepanjangan tidak diperlukan. Pelepasan LH setelah kopulasi pada
kucing betina telah diamati terus menerus. Ini tidak terlihat di spesies
dengan ovulasi spontan, di mana pelepasan impuls diintensifkan
hanya sesaat sebelum ovulasi.

9
c. Ovulasi pada hari yang berbeda estrus

Fase estrus setelah kucing dikawinkan berdampak pada lonjakan LH dia

bisa menghasilkan. Baik kelenjar pituitari atau hipotalamus membutuhkan

peningkatan kadar plasma estrogen yang terjadi selama fase folikular dan

harus siap untuk merilis jumlah GnRH yang cukup, dan sebagai respon

dihasilkan LH. Selama satu fase estrus, kucing betina mampu

menghasilkan hormone LH yang cukup untuk menginduksi ovulasi.

Konsentrasi estrus memuncak pada hari ke 1 dan 2 ketika kucing betina

sedang dikawinkan beberapa kali, tapi kopulasi terus setelah itu tidak

menyebabkan lonjakan hormon yang signifikan.

d. Estradiol dan progesteron selama pseudo-kehamilan

Tingkat estradiol dalam plasma punya puncak segera setelah kopulasi

tetapi menurun tak lama setelah itu dan tetap pada tingkat dasar sampai

kucing betina sekali lagi mencapai estrus. Tingkat progesteron tinggal di

konsentrasi dasar untuk 2-3 hari pertama setelah kopulasi dan kemudian

dengan cepat meningkat dan mencapai puncak pada hari ke-21, kemudian

menurun sampai konsentrasi kembali pada tingkat awal.

e. Kehamilan

Jika kucing betina berhasil dikawinkan selama estrus dan hamil, corpora

lutea akan aktif untuk 40-50 hari sebelum memulai regresi luteal, yang

merupakan periode lebih lama dari yang diamati selama kehamilan semu..

Sebuah periode kehamilan normal kucing betina berlangsung 61-69 hari

dan kembali ke estrus biasanya memakan waktu 2-8 minggu setelah

laktasi dan penyapihan.

10
2.2 Spermatozoa

In vitro Maturation adalah pematangan oosit pada medium di luar

tubuh dan dikultur secara in vitro (Gordon dkk., 1994). Adanya teknik in

vitro maturation dimungkinkan untuk memperoleh oosit matang dalam

jumlah besar dengan cara menanam telur yang belum diovulasikan dalam

medium pematangan. Pematangan oosit primer dapat berkembang menjadi

oosit sekunder yang akan melakukan proses pembelahan meiosis dengan

normal dan sempurna sehigga menghasilkan sel telur yang siap untuk

dibuahi (Trounson, 1992). Oosit yang matang in vivo dan in vitro tidak ada

perbedaan yang nyata dalam tingkat pematangan inti, fertilisasi atau

pembelahan, tetapi bagaimanapun tergantung dari perkembangan

kemampuan pada oosit itu sendiri (Greve dkk., 1993). Prosedur koleksi

oosit ovarium dari rumah potong hewan (RPH) telah banyak dilakukan di

Laboratorium penghasil embrio secara in vitro. Ada beberapa metode

koleksi oosit yang telah diterapkan, yaitu: metode aspirasi, metode

puncture dan metode slicing.

11
 IVF merupakan teknologi produksi embrio pada media di luar tubuh

(Jaswandi dkk., 2001). Teknologi fertilisasi secara in vitro (IVF) pada ternak,

khususnya sapi merupakan salah satu usaha memanfaatkan limbah ovari dari

induk sapi betina yang dipotong di Rumah Potong Hewan. Fertilisasi in vitro

(IVF) merupakan teknologi yang memproduksi embrio dalam jumlah banyak

dan relatif murah. Perkembangan IVF telah semakin meluas dengan

menggunakan materi, baik dari sapi yang masih hidup maupun yang sudah

dipotong. Ovarium sapi yang berasal dari Rumah Potong Hewan merupakan

sumber oosit yang murah dan mampu menyediakan oosit dalam jumlah yang

banyak. Namun demikian belum semua potensi ovarium dapat dimanfaatkan

karena daya hidup oosit yang terbatas dan medium yang digunakan dalam

pematangan oosit in vitro masih belum dapat menghasilkan angka

pematangan oosit yang optimal. Teknologi fertilisasi in vitro dapat menjadi

alternative untuk produksi embrio dalam jumlah banyak. Produksi embrio in

vitro telah banyak dilakukan pada sapi (Trounson dkk., 1992).

Prosedur fertilisasi in vitro meliputi: pengambilan oosit dari ovarium,

maturasi oosit in vitro, kapasitasi sperma in vitro, fertilisasi in vitro, dan

kultur oosit yang sudah difertilisasi. Kemampuan maturasi oosit secara in

vitro lebih rendah daripada secara in vivo. Maturasi oosit secara in vitro dapat

ditingkatkan dengan penambahan hormon gonadotropin dalam media

maturasi (Choi dkk., 2001). Oosit yang diperoleh dari folikel ovarium

merupakan oosit yang belum matur, artinya belum mencapai tingkat maturasi

sitoplasma yang siap dibuahi atau difertilisasi. Sehingga oosit perlu

dimaturasi terlebih dahulu sebelum dilakukan fertilisasi in vitro (Putro, 1993).

12
 Oosit matur merupakan produk dari pembelahan meiosis pertama yaitu oosit

sekunder dan first polar body (PB I), yang terletak di antara membran vitelina

(membran plasma) dan zona pelusida di ruang perivitelin. Jumlah kromosom

oosit berubah dari status diploid (2n) ke haploid (n). Pembelahan meiosis

pertama sempurna sesaat sebelum ovulasi pada sapi, babi serta domba betina,

dan segera setelah ovulasi pada kuda betina. Maturasi oosit dipengaruhi oleh

maturasi nukleus dan kualitas fisiologis dari nukleus, sitoplasma, dan zona

pelusida yang transparan. Beberapa komponen penting pada maturasi nukleus

dan sitoplasma yaitu terputusnya membran nukleus yang disebut germinal

vesicle break down (GVBD), ekstrusi polar body pertama (PB I), dan

ekspansi sel-sel kumulus (Gordon, 1994).

Pelaksanaan pematangan oosit memerlukan kualitas oosit yang baik dan

pelaksanaan pembuahan diatur seperti keadaan alami pada saluran reproduksi

ternak betina. Proses pematangan oosit in vitro berguna untuk menyediakan

oosit yang berkembang baik pada sel kumulusnya, pematangan komponen

sitoplasmik dan pematangan inti pada tahap metafase II, yang selanjutnya

diperlukan untuk proses fertilisasi (Trounson, 1992).

2.3 Maturasi Oosit

Ovarium mengandung oosit dalam jumlah yang sangat banyak, tetapi

hanya sedikit sekali dari jumlah oosit tersebut yang dimatangkan dan

diovulasikan selama masa reproduktif (Austin dan Short, 1984).

Perkembangan oosit pada ovarium dipengaruhi oleh beberapa aktifitas sel

lain yang berada disekitarnya yakni sel folikel, sel granulose dan zona

13
pelusida (Byskov dan Hoyer, 1988). Pada ovarium mamalia, setiap satu

siklus reproduktif normal akan mematangkan satu oosit dominan dalam

satu folikel yang mengakibatkan terjadi ovulasi tunggal (hanya dilepaskan

satu oosit).

Sel-sel kumulus merupakan bagian dari folikel, pada saat ovulasi sel

ini selalu terbawa oleh oosit dan menempel pada oosit (Cole dkk., 1997).

Fungsi sel kumulus adalah sebagai agen komunikasi antar sel dan

penghubung mekanisme hormonal menuju oosit, karena pada sel-sel

kumulus terdapat banyak reseptor FSH dan LH, yang juga berfungsi

sebagai reseptor PMSG dan HCG. Sel kumulus juga berperan sebagai

pemasok nutrisi untuk oosit. Selain itu, sel kumulus mengalami ekspansi

atau mengembang jika terstimulasi oleh adanya peningkatan aktifitas peran

hormon gonadotropin dan metabolisme seluler (Gibbonset dkk., 1994). Sel-

sel kumulus berperan penting di dalam pematangan oosit. Apabila selsel

kumulus dilepaskan sebelum dikultur, maka akan terjadi kelambatan dalam

pematangan oosit atau bahkan tidak terjadi pematangan. Oosit yang

mempunyai kumulus lengkap menunjukkan perkembangan yang lebih baik

apabila dibandingkan dengan oosit yang telah dihilangkan sel–sel

kumulusnya (Younis et al.1989). Adapun kriteria penilaian oosit:

- Complete: terdapat sel-sel cumulus oophorus, terdapat lebih dari 3

lapisan tebal (5 lapisan tebal), oosit kelihatan kompak

- Partital: terdapat sel-sel cumulus oophorus, terdiri dari 3 lapisan tebal,

oosit kelihatan kompak, oosit kelihatan kompak

14
 - Expanded: terdapat sel-sel cumulus oophorus, sel-sel cumulus

meunjukan ekspansi (meluas), sel-sel cumulus kelihatan dalam bentuk

kumpulan hitam terpencar-pencar

- Nude: tidak ada kumpulan sel-sel yang mengelilingi oosit, oosit hanya

dikelilingi zona pelucida secara merata. (Tim Laboratorium Reproduksi,

2009).

Menurut Eppig et al. (1980), ekspansi sel-sel kumulus bertepatan

dengan terjadinya pembelahan meiosis. Sel-sel yang berkembang

(ekspansi) berperan dalam menciptakan lingkungan mikro untuk oosit

dengan cara meningkatkan aktivitas metabolisme kebutuhan makanan oosit.

Ekspansi ini disebabkan oleh adanya asam hyaluronat yang dihasilkan oleh

sel-sel kumulus. Asam hyaluronat yang dihasilkan berfungsi juga untuk

menginduksi reaksi akrosom spermatozoa (Rutledge et al. 1997).

2.4 Pengaruh Suplementasi Fetal Calf Serum dalam meningkatkan

kemampuan maturasi in vitro pada oosit sapi

Pelaksanaan pematangan oosit memerlukan kualitas oosit yang baik

dan pelaksanaan pembuahan diatur seperti keadaan alami pada saluran

reproduksi ternak betina. Proses pematangan oosit in vitro berguna untuk

menyediakan oosit yang berkembang baik pada sel kumulusnya,

pematangan komponen sitoplasmik dan pematangan inti pada tahap

metafase II, yang selanjutnya diperlukan untuk proses fertilisasi (Trounson,

1992).

15
 Sel kumulus merupakan alat spesifik dalam mekanisme tranduksi untuk

transfer sinyal gonadotropin ke oosit melalui sistem gap juction. Hal ini

didukung oleh Boediono dan Suzuki (1996), bahwa gap junction tersebut

merupakan jalan lintas nutrisi untuk oosit. Selama proses pematangan oosit,

hubungan antara individu sel kumulus dan hubungan antara sel kumulus

dengan oosit akan terputus. Terputusnya hubungan ini dimulai dengan adanya

perenggangan disebabkan oleh faktor-faktor pematangan oosit dan sel-sel

kumulus yang terekspansi. Terputusnya hubungan tersebut menyebabkan gap

junction dengan cepat menurun jumlahnya sehingga akses penghambatan

berlangsungnya meiosis berkurang drastis serta terjadinya deposisi matrik

asam hyaluronat diantara sel-sel kumulus (Eppig 1980) dan ekspansi atau

aktivitas sel-sel kumulus dapat diamati secara mikroskopik. Oleh karena itu,

terjadinya ekspansi sel-sel kumulus dapat dijadikan sebagai indikasi yang kuat

untuk pematangan oosit sebab hanya oosit dengan sel-sel kumulus aktif yang

dapat difertilisasi in vitro.

Pendapat Brackett dan Zuelke (1993), bahwa komposisi media pada

proses in vitro menentukan terjadinya pemekaran sel-sel kumulus. Adanya

piruvat, glutamin dan glukosa dalam medium pematangan dapat

meningkatkan ketersediaan sumber energi yang digunakan dalam proses

metabolisme oksidatif mitokondria. Metabolisme glukosa dan glutamin

lebih tinggi pada kumulus yang lengkap dibanding dengan oosit tanpa

kumulus. Aktivitas glikolitik tidak ada yang teramati dalam oosit tanpa sel

kumulus setelah proses pematangan oosit. Aktivitas siklus tricarboxylic

acid (TCA) dapat ditingkatkan dengan penambahan hormon LH dalam

16
medium pematangan oosit, yang ditandai dengan meningkatnya

metabolisme glutamin dalam siklus TCA. Glukosa dan glutamin

merupakan substrat asam hyaluronat yang perlu ditambahkan pada medium

selain hormon gonadotropin dan serum, yang dapat menginduksi terjadinya

pemekaran sel-sel kumulus secara in vitro. Hormon gonadotropin akan

menstimulir sel-sel kumulus untuk memproduksi dan mensekresikan asam

hyaluronat. Hormon gonadotropin ini akan aktif dalam kondisi in vitro jika

ada serum dalam medium yang dapat merangsang asam hyaluronat dan

terjadinya pemekaran sel-sel kumulus yang optimal. Dalam hal ini serum

diduga berperan menstabilkan asam hyaluronat dalam bahan ekstraseluler

kumulus sel (Setiadi 2001).

Fetal calf serum adalah suplemen serum yang paling banyak digunakan

untuk kultur sel in vitro sel eukariotik. Hal ini karena ia memiliki tingkat

antibodi yang sangat rendah dan mengandung lebih banyak faktor

pertumbuhan, memungkinkan fleksibilitas dalam berbagai aplikasi kultur sel.

Protein globular, bovine serum albumin (BSA), merupakan komponen utama

serum janin sapi. Ragam protein yang kaya dalam fetal calf serum

mempertahankan sel-sel biakan dalam suatu medium di mana mereka dapat

bertahan hidup, tumbuh, dan membelah. FCS bukanlah komponen media yang

terdefinisi penuh, dan dengan demikian dapat bervariasi dalam komposisi

antar batch, akibatnya, serum yang bebas dan media yang ditentukan secara

kimia (CDM) telah dikembangkan sebagai praktik laboratorium yang baik.

Menurut Guyton (1997), bahwa di dalam protein serum darah hewan

terdapat 3 kandungan protein utama yaitu albumin, globulin dan fibrinogen.

17
Prinsip dasar albumin memberikan tekanan osmotik larutan, mencegah

tekanan osmotik plasma berkurang dari pembuluh kapiler. Unsur globulin di

dalamnya terdapat enzim plasma yang berperan terhadap kekebalan dan

menghadapi serangan organisme pengganggu (Guyton,1997).

Kualitas sel telur dan kualitas folikel mempengaruhi tingkat pematangan

in vitro sel telur. Selama pematangan secara in vitro keberadaan sel kumulus

yang mengelilingi sel telur sangat membantu pematangan sel telur sapi sampai

pada perkembangan embrio tahap blastosis (Hawk et al. 1992, Boediono dan

Suzuki 1996). Ini dikarenakan sel kumulus berfungsi menyediakan nutrisi

untuk sel telur salama perkembangan dan membantu sintesis protein untuk

pembentukan zona pelusida. Menurut Sirard and Blondin (1996) sel telur yang

berasal dari folikel dominan mempunyai potensi yang lebih besar untuk

berkembang menjadi embrio karena mampu mengalami pematangan inti dan

sitoplasma pada maturasi in vitro. Menurut Zhang et al. (1995), sel-sel

kumulus yang melekat pada zona pelusida berperan dalam pemeliharaan

komunikasi intraseluler serta mengatur pertumbuhan oosit dan maturasi

dengan memfasilitasi dalam proses metabolisme hormonal serta transformasi

nutrisi.

18
 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni dengan desain

penelitian menggunakan rancangan studi sebelum dan sesudah dengan

control (before and after with control) dengan tujuan mengetahui pengaruh

suplementasi fetal calf serum terhadap peningkatan maturasi in vitro oosit

sapi.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

19
 Perlakuan hewan coba dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan

Reproduksi Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Gadjah Mada, pada

bulan September sampai Desember 2012.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Penelitian

Ovarium sapi lokal sebagai sumber oosit yang diperoleh dari RPH

Giwangan Yogyakarta.

3.3.2 Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini adalah ovarium sapi lokal hasil persilangan

(sapi PO, sapi SimPO, dan sapi LimPO) sebagai sumber oosit yang

diperoleh dari RPH Gwangan Yogyakarta dengan total 455 oosit yang

dibagi menjadi 2 kelompok. Yakni 230 kelompok perlakuan, dan 222

kelompok kontrol.

3.4 Kelompok Eksperimen

Kelompok Intervensi : oosit diletakkan dalam media maturasi yang

sama dan diberi tambahan 10% FCS dari 100
ml TCM-199.
Kelompok Kontrol : oosit diletakkan dalam media maturasi 100
ml TCM-199 (25 mM Hepes TCM-199
dengan garam Earle’s) yang telah diberi
antibiotik (Penisilin G 100 IU/ml dan
streptomisin sulfat 10 mg/ml) tanpa FCS

3.5 Kriteria Retriksi

20
3.5.1 Kriteria Inklusi

1. Ovarium sapi lokal persilangan (sapi PO, sapi SimPO, dan sapi

LimPO)

2. Oosit kelas 1 dan kelas 2.

3.5.2 Kriteria Eksklusi

Ovarium kualitas jelek

3.6 Identifikasi Variabel dan Definisi Operasional

3.6.1 Identifikasi Variabel

Pada penelitian ini terdapat tiga variabel yaitu variabel bebas

(Independent), variabel terikat (Dependent) dan variabel perantara.

Adapun variabel pada penelitian ini adalah:

A. Variabel Bebas (Independent)

Pada penelitian ini yang termasuk ke dalam variabel bebas adalah

suplementas fetal calf serum.

B. Variabel Terikat (Dependent)

Pada penelitian ini yang termasuk ke dalam variabel terikat adalah

tingkat kematangan maturasi oosit sapi secara in vitro.

3.6.2 Definisi Operasional

Adapun definisi operasional yang disajikan dalam Tabel 2 dibawah ini.

Tabel 2. Definisi Operasional

No Variabel Definisi Alat Ukur Hasil Ukur Skala

1 Suplementasi Pemberian serum janin - Larutan Nominal
fetal calf sapi sebanyak 10% dengan
serum dari 100 ml TCM-199 dosis,

21
 pada media maturasi volume dan
oosit in vitro. konsentrasi
tertentu.
2 Maturasi oosit Tingkat kematangan Lapang - Ordinal
sapi oosit sapi dilihat dari pandang
lapisan sel cumulus
yang berada disekitar
oosit.

3.7 Alat dan Bahan Penelitian

Ovarium sapi lokal hasil persilangan (sapi PO, sapi SimPO, dan sapi

LimPO) sebagai sumber oosit yang diperoleh dari RPH Giwangan

Yogyakarta, TCM- 199, D-PBS, BSA, heparin, Na- caffein, Na-piruvat,

NaCL fisiologis, Pen-Strep, FCS, minyak mineral dan aquabides steril. Alat

yang digunakan dalam penelitian ini adalah modifikasi Inkubator CO2, cawan

petri disposibel berdiameter 35 mm, syringe disposibel 3 ml, alat- alat gelas:

pipet ukur, pipet pasteur, tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas beker dan alat-alat

gelas lainnya, laminar air flow, mikroskop inverted, kamera Optilab,

mikropipet, termos, penangas air, dan filter Millipore.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Koleksi Ovaria

Ovaria diambil dari RPH setelah sapi disembelih, kemudian dicuci

dengan larutan NaCl 0,9% yang telah diberi penisilin G dan streptomisin

sulfate, ditempatkan dalam termos yang berisi larutan (100 ml NaCl 0,9% +

22
 100 IU/ml penisilin G + 10 mg/ml streptomisin sulfat) pada suhu 31-34ºC.

Ovaria dibawa ke laboratorium dalam waktu tidak lebih dari 3 jam.

3.8.2 Aspirasi dan pencarian oosit

Oosit diaspirasi menggunakan syringe 3 ml dan jarum 23 G yang

berisi D-PBS + 3% FCS. Cairan yang diperoleh dari folikel ditampung

dalam tabung yang terpisah, kemudian dilakukan pencarian oosit. Pencarian

dan evaluasi oosit dilakukan dengan menuangkan cairan folikel pada cawan

petri di bawah mikroskop stereo dengan pembesaran 10x

3.8.4 Klasifikasi oosit

Oosit diklasifikasikan berdasarkan kelengkapan strukturnya dan

diseleksi mengikuti Gordon (1994): kelas 1) lapisan sel kumulus utuh dan

kompak, ooplasma rata dan tidak bergranula, kelas 2) lapisan kumulus tidak

utuh (minimal setengah keliling oosit) dan ooplasma rata, kelas 3) oosit

gundul tanpa lapisan kumulus, kelas 4) oosit dikelilingi oleh fibrin yang

menyerupai sarang laba-laba. Oosit yang digunakan dalam penelitian ini

hanya oosit kelas 1 dan 2.

3.8.5 Maturasi oosit

Oosit yang diperoleh dipisahkan ke dalam 2 (dua) kelompok yaitu

kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Kelompok kontrol diletakkan

dalam media maturasi 100 ml TCM-199 (25 mM Hepes TCM-199 dengan

garam Earle’s) yang telah diberi antibiotik (Penisilin G 100 IU/ml dan

streptomisin sulfat 10 mg/ml) tanpa FCS, sedang pada kelompok perlakuan

oosit diletakkan dalam media maturasi yang sama dan diberi tambahan 10%

FCS dari 100 ml TCM-199. Proses inkubasi dilakukan dengan

23
 menggunakan modifikasi inkubator CO2. Oosit yang diletakkan pada media

maturasi ditutup dengan minyak mineral kemudian petridishnya dimasukkan

dalam kantong aluminium kedap udara, lalu melalui filter millipore 22 ηm

gas CO2 dari saluran pernapasan ditiupkan dalam aluminium tersebut hingga

plastiknya mengembung, segera ditutup dan dimasukkan dalam aluminium

foil sehingga tidak tembus cahaya. Proses inkubasi dilakukan dengan

memasukkan dalam inkubator pada suhu 39ºC dan kelembaban 99% selama

22 jam

3.8.6 Pengamatan

Oosit yang sudah dimaturasi in vitro selama 22 jam kemudian diamati

dengan mikroskop stereo. Terjadinya maturasi ditandai dengan pemekaran

sel-sel kumulus, zona pelusida terlihat semakin jelas, dan munculnya polar

bodi pertama

3.9 Pengolahan dan Analisis Data

3.9.1 Pengolahan Data

Data yang telah diperoleh dari proses pengumpulan data akan

diubah kedalam bentuk tabel–tabel, kemudian proses pengolahan data

menggunakan program komputer yang terdiri beberapa langkah:

1. Koding, untuk menerjemahkan data yang dikumpulkan selama

penelitian kedalam simbol yang cocok untuk keperluan analisis.

2. Data entry, memasukkan data kedalam komputer.

3. Verifikasi, memasukkan data pemeriksaan secara visual terhadap

data yang telah dimasukkan kedalam komputer.

24
 4. Output komputer, hasil yang telah dianalisis oleh komputer

kemudian dicetak.

3.9.2 Analisis Data

Hasil penelitian ini dilakukan analisis menggunakan program

analisis data SPSS dengan Chi Square, karena jenis hipoteis pada

penelitian ini adalah katagorik komparatif.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil penelitian

Pada penelitian ini dilakukan perhitungan angka maturasi dengan

rumus jumlah oosit matur dibagi jumlah total oosit yang diinseminasi

dikalikan seratus, dan kualitas oosit dilihat dari grade kematangannya.

Tabel 1. Menunjukkan persentase oosit yang matur dari dua perlakuan

setelah maturasi in vitro (percentage of maturation oocytes in the two

treatment groups after in vitro maturation).

25
Berdasarkan tabel tersebut diatas, pada kelompok perlakuan didapatkan

127 oosit matur dari total 230 oosit, sedangkan pada kelompok control

didapatkan 89 oosit matur dari total 222 oosit, dan setela setelah dilakukan

perhitungan analisis chi square pada kedua kelompok, dapat dilihat bahwa

kelompok perlakuan sebesar 55,22% lebih besar dibandingkan kelompok

control 40,09%, dengan p<0,05.

Gambar 1. Oosit grade 1 kelompok perlakuan (+FCS), (a)

sebelum maturasi dan (b) setelah maturasi; serta oosit kelompok

kontrol (tanpa FCS) (c) sebelum maturasi dan (d) setelah maturasi

(oocyte grade 1 experiment group (+FCS), (a) before maturation and

(b) after maturation; oocyte control experiment (absence FCS) (c)

before maturation and (d) after maturation).

26
 Dari gambar 1 dapat dilihat perbedaan antara oosit yang dimaturasi

dalam kelompok kontrol dan perlakuan. Oosit pada kelompok

perlakuan mem- punyai kualitas oosit matur lebih baik yang ditandai

dengan struktur sel-sel kumulus dan nukleus yang lebih proporsional

dibandingkan dengan oosit matur pada kelompok kontrol.

4.2 Pembahasan

Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan FCS pada medium

maturasi in vitro memperlihatkan pengaruh yang signifikan antara dua

kelompok perlakuan. Hasil penelitian ini sama dengan hasil penelitian Sagirkaya

et al. (2004) yang menunjukkan efektivitas penggunaan 10% FCS jika

dibandingkan dengan serum lain dan atau tanpa serum. Hal ini disebabkan

27
karena FCS merupakan serum fetus sapi yang banyak mengandung zat yang

dibutuhkan oleh oosit selama proses kultur in vitro. Mucci et al. (2006)

menyatakan bahwa FCS dapat menyediakan substrat energi, asam amino,

vitamin, growth factor dan antioksidan. Zat-zat tersebut merupakan zat yang

bermanfaat selama proses kultur in vitro. Fetal calf serum juga dapat bersifat

sebagai biosecurity yang dapat menghambat resiko kontaminasi patogen selama

kondisi kultur in vitro (Moore dan Bonilla, 2006).

Hasil analisis menunjukkan perbedaan yang nyata (P≤0,05) antara

kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Persentase oosit matur pada

kelompok perlakuan sebesar 55,22% lebih besar dibandingkan kelompok

kontrol sebesar 40,09% (Tabel 1). Hasil ini hampir sama dengan yang diperoleh

Rutledge et al. (1986) yang mendapatkan tingginya angka maturasi oosit pada

penambahan 10% FCS dibandingkan dengan 20%, 5%, dan 1% secara berturut-

turut. Ciri yang paling menonjol dari oosit matur adalah ekspansi sel-sel

kumulus serta semakin terlihat jelas zona pelusida oosit. Secara in vitro ekspansi

atau pemekaran sel-sel kumulus sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor

diantaranya medium dan kondisi kultur selama proses inkubasi (Wattimena,

2006), dan aktivitas berbagai komponen yang melibatkan enzim, dan hormon

(Widayati, 1998), serta komposisi medium kultur yang digunakan (Tavares et

al., 2008).

Oosit dengan sel- sel kumulus yang intak (grade 1) dan dimaturasi

dengan penambahan FCS akan menyebabkan kualitas maturasi yang lebih baik

dibanding dengan oosit yang hanya memiliki sebagian sel-sel kumulus (grade

2) atau tanpa penambahan FCS pada medium maturasinya. Hal ini berkaitan

28
dengan fungsi FCS yang dapat menyediakan protein bagi oosit selama proses

maturasi. Gambar 1 menyajikan oosit grade 1 yang digunakan dalam

penelitian.

Dari Gambar 1 dapat dilihat perbedaan antara oosit yang dimaturasi

dalam kelompok kontrol dan perlakuan. Oosit pada kelompok perlakuan mem-

punyai kualitas oosit matur lebih baik yang ditandai dengan struktur sel-sel

kumulus dan nukleus yang lebih proporsional dibandingkan dengan oosit matur

pada kelompok kontrol. Hal ini disebabkan oleh komponen FCS yang tidak

terdapat pada kelompok kontrol. Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Lorenzo

et al. (1994) bahwa besarnya pengaruh FCS yang ditambahkan dalam medium

maturasi in vitro pada kelompok oosit yang memiliki COCs, berkaitan dengan

peran FCS yang sangat dibutuhkan oleh FSH yang membuat terjadinya

ekspansi sel-sel kumulus, memperbaiki viabilitas sel, dan menyelesaikan

pembelahan meiosis pertama.

Cumulus oocyte complexes (COCs) yang dimaturasi in vitro dalam

medium maturasi yang disuplementasi fetal calf serum akan mengalami

kemampuan perkembangan maturasi yang lebih baik dibandingkan dengan

oosit yang memiliki sel- sel kumulus sebagian. Hal ini disebabkan selain fungsi

FCS yang menginaktifkan radikal bebas dan logam berat selama kondisi kultur

(Sagirkaya et al.,2004) sel cumulus juga berperan dalam mekanisme kompleks

yang melibatkan komunikasi intraseluler oosit dan sel somatis selama proses

maturasi (Zhu et al ., 2007).

Kualitas oosit merupakan factor yang sangat penting dalam menentukan

matuasi oosit. Sama halnya dengan FCS yag dapat meningkatkan angka

29
maturasi (Koo et al.,1997). Oosit dengan sel-sel cumulus intak menyediakan

factor esensial selama proses maturasi, menaga oosit dan berperan selama

tahapan pembelahan meosis serta mendukung maturasi sitoplasma. Pada babi

oosit sel cumulus intak dapat menurunkan penetrasi spermatozoa pada saat

fertilisasi in vitro (Wongsrikeao et al,, 2005), sedangkan pada manusia oosit

matur dengan sel-sel cumulus intak sangat berpotensi untuk fertilisasi saat

inseminasi namun rendah fertilitasnya. Kualitas oosit yang tidak bagis seperti

kurangnya sel-sel cumulus yang mengelilingi oosit akan menyebabkan

penurunan metabolisme antara oosit dan sel-sel cumulus yang mengakibatkan

tidak tersedianya nutrisi yang sangat dibutuhkan selama proses maturasi

(Widayati, 1998). Selain itu oosit yang memiliki sel-sel cumulus intak atau

COCs akan memungkinkan terjadinya komunikasi intraseluler melalui gap

junction yang merupakan tempat transfer sebagian oosit, dan menngkatkan in

vitro maturasi dan menyelamatkan oosit dari degradasi (Adiva, 2010). Oosit sel

cumulus sebagian akan menyebabkan mautrasi yang kurang sempurna. Hal ini

berkaitan dengan maturasi sitoplasma atau transformasi inti yang ditandai

dengan diferensiasi dan pembentukan polar bodi I serta maturasi membrane

(germinal vesicle) yang ditandai oleh pemekaran sel sel cumulus dan

terputusnya membrane.

BAB V

PENUTUP

30
5.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan

bahwa suplementasi fetal calf serum (FCS) dalam media maturasi dapat

meningkatkan angka maturasi in vitro oosit sapi.

5.2 Saran

Proses maturasi oosit secara in vitro dengan menggunakan FCS 10% dan

inkubator CO2 modifikasi dapat menghasilkan oosit dengan maturasi yang

sempurna, sehingga diharapkan penelitian lanjutan seperti fertilisasi in vitro

dan kultur embrio in vitro dengan kadar FCS 10% dan menggunakan

inkubator CO2 modifikasi.

DAFTAR PUSTAKA

31
Alm, H., H. Torner, B. Lohrke, T. Viergutz, I. M. Ghoneim and W. Kanitz.
2005. Bovine blastocyst development rate in vitro is influence by selection
of oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM as indicator for
glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. Theriogenology 63: 194-
205.

Koo, D. B., N. H. Kim, H. T. Lee and K. S. Chung. 1997. Effects of fetal calf
serum, amino acids, vitamins and insulin and blastocoel formation on
hatching of in vivo and IVM/IVF-derived porcine embrio developing in
vitro. Theriogenology 48: 791-802.

Guyton, A. C., Hall, J. E., 2014. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 12.
Jakarta : EGC

Jerome F. Strauss III, Robert Barbieri. 2014. Yen & Jaffe’s Reproductive
Endocrinology Physiology, Pathophysiology, and Clinical Management.
Philadelpia: Elsevier.

Sperrof. 2011. Clinical Gynecologyc Endrocrinology and infertility. USA:

Wolters Kluwer.

Daoed MD dkk. 2013. Pengaruh suplementasi Fetal Calf Serum terhadap

kemampuan maturasi in vitro oosit sapi. Buletin Peternakan 37(3):136-
142

https://www.reproductivefacts.org/news-and-publications/patient-fact-sheets-
and-booklets/documents/fact-sheets-and-info-booklets/what-is-in-vitro-
maturation-ivm/ akses 19 okt 2018

32