You are on page 1of 118

ANALISIS JURNAL

IDENTIFIKASI FLAVONOIDA HASIL FRAKSINASI DENGAN

KROMATOGRAFI KOLOM VAKUM EKSTRAK METANOL-AIR HERBA

PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.)

Oleh :

Anita Devi Ariesnawati NIM : 038114057

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA


ABSTRAK

Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) dipercayai dapat


mengobati sakit kuning (hepatitis), batu empedu, kencing batu, infeksi saluran
kencing, batuk, sesak nafas, sariawan, radang tenggorokan, amandel, infeksi
telinga tengah (Anonim, 2005). Dimungkinkan bahwa flavonoida berperan dalam
mengatasi penyakit di atas. Anonim (2005) menyebutkan adanya kandungan
flavonoida dalam pegagan embun yaitu hiperin. Penelitian ini diarahkan untuk
menentukan golongan flavonoida lain yang ada dalam herba pegagan embun dan
diharapkan hasil penelitian ini dapat memberi informasi tentang kandungan aktif
senyawa obat alamI. Serbuk diekstraksi dengan metanol-air (9:1 dan 1:1) dan
penyarian dilakukan dengan maserasi. Fraksinasi flavonoida dari ekstrak
dilakukan dengan kromatografi kolom vakum. Fase diam yang digunakan adalah
selulosa, sedangkan fase geraknya adalah BAW (4:1:5 v/v,fase atas). Pemeriksaan
kandungan flavonoida dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan
menggunakan fase diam dan fase gerak yang sama dengan yang digunakan pada
kromatografi kolom. Deteksi bercak dilakukan dengan sinar ultraviolet λ 365 nm
dan uap amonia.
Identifikasi menggunakan KLT menghasilkan dua bercak yaitu ungu (Rf
0,86 yang selanjutnya disebut isolat flavonoida) dan biru (Rf 0,76). Isolasi bercak
dilakukan dengan KLTP. Bercak ungu dikerok kemudian dilarutkan dalam
metanol dan disaring, lalu diuji kemurniannya. Pemeriksaan kemurnian isolat
flavonoida menggunakan kromatografi multi eluen yang menunjukkan bahwa
isolat flavonoida sudah murni secra kromatografi. Pemeriksaan dilanjutkan
menggunakan reaksi warna dan spektroskopi ultraviolet dengan penambahan
pereaksi geser.
Berdasarkan analisis data dari KLT, reaksi warna dan spektroskopi
ultraviolet menunjukkan bahwa isolat flavonoida diduga mempunyai golongan
flavon dengan kemungkinan struktur parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau
7,4’,5’ trihidroksi flavon.

Kata kunci : flavonoida, kromatografi, spektroskopi, Hydrocotyle sibthorpioides.


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Indonesia yang kaya dengan berbagai macam sumber alam telah

memanfaatkan tumbuh-tumbuhan sebagai bahan obat tradisional secara turun-

temurun. Akan tetapi hanya sedikit yang telah diteliti kandungan kimia dan

efek farmakologinya. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian tentang zat

aktif yang terkandung dalam tumbuhan tersebut, untuk selanjutnya tumbuhan

yang semula digunakan sebagai obat tradisional dapat digunakan dalam

bentuk sediaan obat modern. Tumbuhan tersebut salah satunya adalah pegagan

embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) yang belum banyak dikenal

masyarakat.

Pegagan embun tumbuh merayap, ramping, subur di tempat lembab, kira-

kira 2.500 m dari permukaan laut (Anonim, 2005). Pegagan embun dapat

dimanfaatkan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis), batu empedu, kencing

batu, infeksi saluran kencing, batuk, sesak nafas, sariawan, radang

tenggorokan, amandel, dan infeksi telinga tengah. Kandungan kimia yang

diketahui terdapat dalam pegagan embun, antara lain minyak atsiri, kumarin,

hiperin (Anonim, 2005). Hiperin (kuersetin 3-O-galaktosida) merupakan

salah satu senyawa flavonoida yang disebutkan sebagai salah satu kandungan

kimia yang terdapat dalam pegagan embun. Pada umumnya suatu tanaman

yang memiliki kandungan flavonoida memiliki lebih dari satu jenis senyawa

flavonoida (Markham,1988). Dimungkinkan masih terdapat kandungan


senyawa flavonoida lain yang ada dalam pegagan embun selain hiperin.

Flavonoida merupakan salah satu kandungan zat aktif yang banyak

terkandung dalam tumbuh-tumbuhan dan mempunyai berbagai macam

aktivitas biologis. Senyawa flavonoida berkhasiat sebagai anti radang, bersifat

bakterisid, anti jamur, dan anti histamin (Harborne, 1984). Kandungan

flavonoida di dalam herba pegagan embun dimungkinkan berperan penting

dalam pengobatan beberapa penyakit yang telah disebutkan di atas. Oleh

karena itu perlu dilakukan upaya untuk mengisolasi dan mengidentifikasi

kandungan flavonoida yang ada dalam suatu tumbuhan.

Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi

flavonoida lain dalam herba pegagan embun. Metode fraksinasi yang

digunakan adalah kromatografi kolom vakum karena dapat memisahkan suatu

senyawa dengan cepat. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberi

informasi tentang kandungan aktif senyawa obat alami.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah ada golongan flavonoida lain dalam herba pegagan embun selain

hiperin ?

2. Bagaimanakah perkiraan struktur parsialnya ?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan umum

Menganalisis adanya golongan flavonoida lain dalam herba pegagan embun

selain hiperin beserta strukturnya.


1.3.2 Tujuan khusus

1. Menganalisis adanya golongan flavonoida lain dalam herba pegagan

embun selain hiperin beserta strukturnya.

Menganalisis struktur flavonoida lain dalam herba pegagan embun selain

hiperin beserta strukturnya.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat teoritis

Diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah terhadap

eksplorasi kandungan aktif senyawa obat alami dalam pegagan embun.

1.4.2 Secara praktis

Memberikan informasi dalam bidang ilmu kefarmasian khususnya dalam

bidang farmakognosi tentang golongan flavonoida yang terkandung dalam

herba pegagan embun.


BAB 2

KAJIAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Pegagan Embun

2.1.1 Klasifikasi tanaman

Pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) merupakan salah satu

anggota familia Umbelliferae (Apiaceae). Pegagan embun mempunyai

sinonim H.rotundifolia Roxb.,dan H.formosana Masamune (Anonim,

2005).

2.1.2 Morfologi tanaman

Pegagan embun tumbuh merayap, ramping, subur di tempat lembab,

terbuka maupun teduh di pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput

dan tempat lain sampai setinggi kira-kira 2.500 m dari permukaan laut

(Anonim, 2005). Tumbuhan pegagan embun mempunyai batang lunak dan

bercabang-cabang. Daunnya majemuk menjari tiga yang anak daunnya

berbentuk jantung dengan warna hijau muda. Bunga keluar dari ketiak

daun, berwarna kuning berbentuk payung kecil-kecil. Buah berupa kotak

lonjong, tegak, bagian ujungnya seperti paruh, bila sudah masak berwarna

coklat merah yang pecah bila disentuh (Anonim, 2004).

2.1.3 Kegunaan

Pegagan embun dapat digunakan untuk mengobati sakit kuning (hepatitis),

batu empedu, batu dan infeksi saluran kencing, batuk dan sesak nafas,

sariawan, radang tenggorokan, amandel, infeksi telinga tengah (Anonim,

2005). Kandungan kimia yang diketahui terdapat dalam pegagan embun,


antara lain minyak atsiri, kumarin, hiperin (Anonim, 2005). Hiperin

mempunyai nama lain kuersetin 3-O-galaktosida (Gambar 1)

(Anonim,2007).

2.2 Flavonoida

Flavonoida adalah golongan senyawa alam yang strukturnya terdiri dari 2

cincin aromatik yang dihubungkan oleh tiga atom karbon membentuk

rangka dengan sistem C6-C3-C6; masing-masing C6 merupakan cincin

benzene. Untuk memudahkan dalam penomoran cincin diberi tanda A, B

dan C, serta angka “beraksen” untuk cincin B (Gambar 2) (Markham, 1988).

Flavonoida adalah senyawa fenol alam yang terdapat dalam hampir semua

tumbuhan dari bangsa algae hingga Gimnospermae. Di dalam tumbuhan,

flavonoida biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang

berikatan dengan gula disebut aglikon. Di alam dikenal hampir lebih dari

500 aglikon dan kurang lebih 200 flavonoida (Mursyidi, 1990). Flavonoida

merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan alga dan

hornwort. Flavonoida sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan

termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah buni, dan

biji (Markham, 1988).

Perbedaan penggolongan di dalam kelompok flavonoida dibedakan dengan

penambahan rantai oksigen heterosiklik dan gugus hidroksil. Senyawa

flavonoida meliputi katekin, leukoantosianidin, flavanon, flavanonol,

flavon, antosianidin, flavonol, khalkon, auron, dan isoflavon (Gambar 3)

(Kaufman dkk, 1999). Flavonoida mempunyai aktivitas estrogenik, diuretik,


hipotensif, anti histamin, bersifat bakterisida dan anti jamur. Flavonoida

juga dapat berkhasiat sebagai anti radang, zat ini terutama berguna dalam

menjaga kesehatan (Harborne, 1984). Flavonoida sering merupakan

pereduksi yang baik, menghambat banyaknya reaksi oksidasi, baik secara

enzim maupun nonenzim. Flavonoida tertentu mempunyai aktivitas anti

oksidan yang digunakan secara tradisional mengobati penyakit hati

(Robinson, 1995).

2.3 Penyarian

1. Cairan penyari

Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor antara

lain: mudah atau murah diperoleh, mudah menguap, tidak mudah

terbakar, selektif yaitu hanya mengekstraksi zat yang berkhasiat yang

diinginkan, dan tidak mempengaruhi zat berkhasiat, bereaksi netral,

stabil secara fisika dan kimia (Anonim,1986).

2. Ekstraksi

Cara penyarian dapat dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi

dan penyarian berkesinambungan (Anonim,1986).

a. Infundasi

Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia

dengan air pada suhu 90ْ C selama 15 menit. Infundasi adalah

proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat

kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati.

Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan
mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang

diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam.

b. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi

dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan

penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan

karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di

dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat

didesak ke luar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan diluar sel dan di dalam sel.

c. Perkolasi

Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip

perkolasi adalah serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana

silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari

dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari

akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai

keadaan jenuh.

d. Penyarian berkesinambungan

Penyarian berkesinambungan memiliki prinsip menghasilkan ekstrak

cair yang kemudian dilanjutkan dengan proses penguapan cairan

penyari. Cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan

pada tabung dari kertas saring atau tabung yang berlubang-lubang


dari gelas, baja tahan karat atau bahan lain yang cocok. Cairan

penyari dipanaskan hingga mendidih penyari akan mengembun

karena didinginkan oleh pendingin balik kemudian embun turun

melalui serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali

ke labu. Cairan akan menguap kembali berulang proses seperti

diatas.

2.4 Kromatografi Kolom Vakum

Isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir ke skala industri dengan

menggunakan kromatografi kolom. Pada dasarnya, cara ini meliputi

penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) di atas kolom yang berisi

serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, poliamida), dilanjutkan dengan

elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok (Markham,

1988). Kromatografi kolom vakum merupakan metode yang sederhana dan

memerlukan waktu yang relatif singkat untuk melakukan pemisahan.

Metode ini dapat digunakan untuk pemisahan campuran baik dalam jumlah

sedikit maupun banyak. Pemilihan sistem pelarut yang tepat didapat dengan

percobaan analisis kromatografi lapis tipis. Metode kromatografi kolom

vakum menggunakan sebuah perlengkapan yang sederhana dan murah yang

dapat diterapkan pada laboratorium manapun (Pelletier et al, 1986).


2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar

perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut

pengembang atau pelarut pengembangan campur. Pemilihan pelarut

pengembangan atau pelarut pengembangan campur sangat dipengaruhi oleh

macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan (Mulja, 1995).

Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa,

sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca atau

penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang

lebih besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan

pada pelat dan merupakan keuntungan bila kita menelaah senyawa labil.

Akhirnya, kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat

dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran μg (Harborne,

1987). Bilangan Rf adalah jarak yang ditempuh senyawa pada kromatografi,

nisbi terhadap garis depan. Bilangan Rf diperoleh dengan mengukur jarak

antara titik awal dan pusat bercak yang dihasilkan senyawa, dan jarak ini

kemudian dibagi dengan jarak antara titik awal dan garis depan (yaitu jarak

yang ditempuh cairan pengembang). Bilangan ini selalu berupa pecahan dan

terletak antara 0,01 dan 0,99 (Harborne, 1987).

2.6 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Preparatif

KLT Preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1

mm) sebagai pengganti lapisan penjerap yang tipis (0,10-0,25 mm). Pelat

preparatif yang dibuat oleh pabrik dapat dibeli. Kandungan yang sudah
dipisah dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok penjerap di tempat

yang sesuai pada pelat yang telah dikembangkan, lalu serbuk dielusi dengan

pelarut seperti eter, dan akhirnya dipusingkan untuk menghilangkan

penjerap (Harborne, 1987).

2.7 Identifikasi Flavonoida

2.7.1 Reaksi warna

Flavonoida dapat dideteksi dengan amoniak, jika tidak bercampur dengan

pigmen lain. Reaksi ini memberikan warna spesifik untuk masing-masing

golongan. Flavon, flavonol dan xantin memberikan warna kuning

kemerahan, antosianin menunjukkan warna biru, flavonol berwarna orange

sampai coklat, warna merah dan lembayung akan timbul mendadak pada

suasana asam disebabkan adanya khalkon dan auron (Robinson, 1995).

Penelitian fitokimia lazimnya diawali dengan pengujian kimiawi tertentu,

seperti larutan natrium hidroksida, asam sulfat pekat, besi (III) klorida,

logam magnesium, asam klorida (Venkataraman, 1962; Harborne,1984). Uji

warna selanjutnya didukung analisis spektroskopi ultraviolet, inframerah,

spektroskopi inti dan massa (Mabry dkk,1970; Markham,1988; Harborne,

1984). Uji warna flavonoida (Tabel II) (Venkataraman, 1962).


2.7.2 Kromatografi Lapis Tipis

Identifikasi flavonoida dengan kromatografi lapis tipis dilakukan

dengan mengamati warna bercak sebelum dan sesudah diuapi

amonia dengan dibandingkan dengan pustaka (Tabel I)

(Markham,1998).

Tabel I. Penafsiran bercak dari segi struktur flavonoida (Markham, 1988)

Warna bercak dengan UV 366 nm Jenis flavonoida yang mungkin

tanpa NH3 dengan NH3

Lembayung Kuning, hijau- a. Biasanya 5-OH flavon atau flavonol

gelap kuning atau hijau (tersulih pada

3-O dan mempunyai 4’-OH)

b. Kadang-kadang 5-OH flavanon dan 4’-OH

khalkon

tanpa OH pada cincin B

Perubahan warna a. Biasanya flavon atau flavonol tersulih pada

sedikit atau tanpa 3-O mempunyai 5-OH tetapi tanpa 4’-OH

perubahan warna bebas

b. Beberapa 6- atau 8-OH flavon dan flavonol

tersulih

pada 3-O serta mengandung 5-OH

c. Isoflavon, dihidroflavon, biflavonil dan

beberapa flavanon yang mengandung 5-OH

d. Khalkon yang mengandung 2- atau 4-OH


bebas

Biru muda Beberapa 5-OH flavanon

Merah atau jingga Khalkon yang mengandung 2- dan/atau 4-OH

bebas

Fluoresensi biru Fluoresensi hijau- a. Flavon dan Flavanon yang tidak

muda kuning atau hijau- mengandung 5-

biru OH, misalnya 5-OH-glikosida

b. Flavanol tanpa 5-OH bebas tetapi tersulih

pada 3-

OH

Perubahan warna Isoflavon yang tidak mengandung 5-OH

sedikit atau tanpa

perubahan

Fluoresensi Isoflavon yang tak mengandung 5-OH bebas

muru

biru muda

Tak tampak Fluoresensi biru Isoflavon tanpa 5-OH bebas

muda

Kuning redup Perubahan warna Flavonol yang mengandung 3-OH bebas dan

dan kuning, atau sedikit atau tanpa mempunyai atau tak mempunyai 5-OH bebas

fluoresensi perubahan (kadang-kadang dari dihidroflavonol)

jingga

Fluoresensi Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’-OH bebas dan
kuning beberapa

2- atau 4-OH bebas

Hijau-kuning, Perubahan warna a. Auron yang tak mengandung 4’-OH bebas

hijau-biru, atau sedikit atau tanpa dan

hijau perubahan flavanon tanpa 5-OH bebas

b. Flavanol yang mengandung 3-OH bebas

dan disertai atau tanpa 5-OH bebas

Merah Biru Antosianidin 3-glikosida

jingg

redup atau

merah senduduk

Merah Biru Sebagian besar antosianidin 3,5-diglikosida

jambu

atau

fluoresen

si

kuning
Tabel II. Reaksi warna beberapa golongan flavonoida (Venkataraman, 1962)

Tipe flavonoida Reaksi warna

NaOH H2SO4 pekat Logam Mg dan

HCl

Khalkon Jingga, merah Jingga, merah, atau Tidak berwarna

magenta

Dihidrokhalkon Agak kuning Agak kuning Tidak berwarna

Auron Merah-ungu Merah-magenta Tidak berwarna

Flavanon Kuning-jingga, jika Jingga Merah-magenta,

dingin merah, violet, biru

dipanaskan ungu

Flavon Kuning Kuning-jingga Kuning, merah

Flavonol Kuning-jingga, bila Kuning-jingga dengan Merah-magenta

teroksidasi fluoresensi

coklat

Flavanonol Kuning cepat Agak merah-kuning Merah-magenta

menjadi coklat

Leukoantosianin Kuning Merah tua Merah muda

Antosianidin dan Biru-violet Kuning-jingga Merah-merah muda

antosianin

Katekin Kuning berubah Merah Tidak berwarna

merah/coklat
Isoflavon Kuning Kuning Kuning

Isoflavanon Kuning Kuning Tidak berwarna

1. Spektroskopi Ultraviolet

Dasar metode ini adalah interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan

atom, molekul atau ion, di daerah ultraviolet dan daerah sinar tampak.

Energi yang diserap menyebabkan elektron tereksitasi dari orbital tingkat

dasar ke orbitel yang berenergi tinggi (Sastroamijoyo,1985; Silverstein,

1986).
Beberapa istilah dalam spektroskopi ultraviolet (Sastrohamidjojo, 2001):

a. Kromofor

Suatu gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah- daerah

ultraviolet dan terlihat. Contoh: C=C, C=O.

b. Auksokrom

Suatu gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang

dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah heteroatom yang

langsung terikat pada kromofor, misal: -OCH3, -Cl, -OH dan NH2.

c. Pergeseran batokromik (pergeseran merah)

Pergeseran serapan kearah panjang gelombang yang lebih

panjang disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut.

d. Pergeseran hipsokromik (pergeseran biru)

Pergeseran serapan kearah panjang gelombang yang lebih

pendek disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut.

e. Efek hiperkromik

Kenaikan dalam intensitas serapan.

f. Efek hipokromik
Penurunan dalam intensitas serapan.
17

Struktur flavonoida terdiri dari dua cincin aromatik dan ikatan rangkap

terkonjugasi, sehingga dapat menunjukkan pita serapan pada spektrum ultraviolet

dan serapan sinar tampak (Gambar 4). Flavonoida merupakan senyawa yang

mempunyai struktur sebagian besar dengan pola flavon (Mabry dkk, 1970).

3'

2' 4'

8 B
1' O

7 2 5'

A C 6'

6 3

5 4

O Sistem konjugasi
Sistem konjugasi

Benzoil Cinnamoyl

Gambar 4. Kerangka dasar flavonoida (Mabry dkk, 1970)


Energi ultraviolet dapat diukur karena spektrum serapan timbul dari transisi

elektronik tunggal mengandung garis yang tunggal dan terputus-putus. Garis ini

tidak akan terlihat jika serapan elektronik berhimpit pada sub tingkat putaran dan

getaran. Spektrum molekul sederhana mengandung puncak serapan yang sempit

menggambarkan suatu transisi dari kombinasi tertentu dari tingkat dasar

elektronik dengan yang sesuai di dalam tingkat tereksitasi. Kekhasan dari pita

serapan adalah letak dan intensitasnya.

Pola spekrum flavonoida biasanya memberikan dua puncak pada rentang λ 240 –

285 nm (puncak I) dan λ 300 – 350 nm (puncak II). Panjang gelombang dan

besarnya absorbsi akan memberikan informasi yang berharga mengenai


18

sifat dan pola oksigenasi flavonoida. Ciri khas spektrum tersebut memberikan

puncak relatif rendah pada pita I untuk golongan: hidroflavon, dihidroflavonol,

dan isoflavon dengan kedudukan pita I dalam spektrum: khalkon, auron, dan

antosianin terdapat pada panjang gelombang yang relatif tinggi. Ciri ini tidak

berubah meskipun pada oksigenasi berubah. Petunjuk mengenai letak puncak

maksimum (Tabel III) (Markham, 1988).

Tabel III. Rentangan serapan spektrum UV pada flavonoida (Markham, 1988)

Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis Flavonoida

250-280 310-350 Flavon

250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubstitusi)

250-280 350-385 Flavonol 3-OH bebas

245-275 310-330 Isoflavon

320-329 Isoflavon 5-deoksi-6,7 dioksigenasi

275-295 300-330 Flavanon dan dihidroflavonol

230-270 340-390 Khalkon

(kekuatan lemah)

230-270 380-430 Auron

(kekuatan kuat)
270-280 465-560 Antosianin, antosianidin

Flavon, isoflavon dan dihidroflavanol memberikan spektrum UV yang mirip

karena senyawa ini tidak mempunyai sistem konjugasi cinnamoil dengan cincin B

antara C-2 dan C-3.

Isoflavon memberikan spektrum UV dengan puncak II pada daerah λ 245

– 270 nm dan puncak I pada λ 310 – 330 nm. Flavon dan dihidroflavonol

memberikan puncak II pada λ 275 – 295 nm dan puncak I λ 310 – 330 nm

(Geissman, 1967; Harborne,1984; Markham, 1988).

Senyawa flavon dan flavonol dalam metanol memberikan spektrum UV dengan

puncak I λ 300 – 380 nm dan puncak II λ 240 – 280 nm penambahan


19

NaOMe pada senyawa menyebabkan gugus hidroksi pada inti aromatik akan

terionisasi dan mengakibatkan terjadinya pergeseran puncak I dan puncak II

menjadi pergeseran batokromik.

Efek yang timbul akibat penambahan pereaksi geser :

a. Efek hidroksilasi

Penambahan gugus OH dalam cincin A pada flavonol menghasilkan pergeseran

batokromik yang nyata pada pita puncak I dan efek puncak serapan II. Bila gugus

5-OH tidak terdapat dalam flavonol dan flavon maka puncak tersebut mempunyai

panjang gelombang (λ) yang pendek dibanding gugus 5-OH pada posisi 3,5,4’

yang mempunyai sedikit atau tidak sama sekali efek pada spektrum UV.

b. Efek metilasi dan glikosilasi

Terjadi pada pola resapan flavon dan flavonol. Bila gugus 3,5 atau 4’-OH pada

flavon dan pergeseran hipsokromik pada puncak I, maka pergeseran itu terjadi 12-

17 nm atau dapat pula mencapai 22 – 25 nm pada flavon yang tidak mempunyai

gugus 5-OH. Efek asetilasi bila gugus OH fenolik diasetilasi maka efek dari gugus

itu akan hilang.


c. Efek natrium metoksida

Penambahan basa menyebabkan pergeseran yang khas pada kebanyakan

flavonoidaa yaitu batokromik. Natrium-metoksida merupakan basa kuat yang

dapat mengionisasi gugus OH pada inti flavonoidaa. Penambahan Na-metoksida

pada flavon dan flavonol dalam metanol menyebabkan pergeseran batokromik

yang besar pada puncak serapan pergeseran tersebut 40 – 65 nm pada puncak I


20

tanpa penurunan intensitas menunjukkan gugus 4’-OH bebas. Flavonol

mengalami pergeseran batokromik 50 – 60 nm pada puncak I dengan penurunan

intensitas disebabkan oleh adanya 3-OH bebas. Flavonol mempunyai 5 dan 4’ OH

bebas maka spektrumnya dengan Na-metoksida mengalami dekomposisi.

d. Efek natrium asetat

Merupakan basa lemah akan mengionisasi gugus yang keasamannya tinggi,

digunakan untuk mendeteksi adanya gugus 7-OH bebas. Flavon dan flavonol

dengan gugus 7-OH bebas menunjukkan pergeseran batokromik sebesar 5 – 20

nm pada puncak serapan II dengan natrium asetat. Adanya natrium asetat dan

asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus ortohidroksi pada semua

posisi kecuali pada atom C-5 dan C-6 (Mabry dkk, 1970).

e. Efek alumunium klorida

Adanya alumunium klorida maka gugus OH pada C-3 dan C-5 flavon dan

flavonol akan membentuk kompleks yang stabil dengan penambahan asam.

Kompleks antara alumunium klorida dengan C4-keto dan atau 5-OH tetap stabil

dengan adanya asam. Adanya gugus ortohidroksi pada cincin B dapat diketahui

dengan penambahan AlCl3 menghasilkan pergeseran hipsokromik panjang


gelombang 20 -30 nm pada pita I (I.a terdiri dari dua puncak). Adanya pergeseran

batokromik pada I.a dalam AlCl3 dan HCl dibandingkan denga pita I dalam

metanol sebesar panjang gelombang 35 – 55, menunjukkan adanya 5-OH flavon

atau flavonol 3-OH tersubtitusi (Mabry dkk, 1970).


21

Tabel IV. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOH

(Markham, 1988)

Jenis Pergeseran tampak Petunjuk penafsiran

Flavonoida Pita I Pita II

Flavon Kekuatannya 3’,4’OH, o-diOH

Flavonol menurun terus pada cincin A dan

pada cincin B: 3OH

yang berdampingan

Mantap ±45-65 nm 4’-OH

kekuatan tidak

menurun

Mantap ±45-65 nm 3-OH, tidak ada 4’-

kekuatan menurun OH bebas

Pita baru (bandingkan dengan MeOH) 7-OH

Isoflavon, Tidak ada Tidak ada OH pada

flavanon, dan pergeseran cincin A

dihidroflavono Kekuatan menurun o-di OH pada cincin

l A
(penurunan

lambat; O-diOH

pada cincin B)

Bergeser dari ±280 Flavanon dan

nm ke ±325 nm, dihidroflavonol

kekuatan dengan 5,7-OH, 7-

meningkat ke 330- OH tanpa 5-OH

340 nm bebas

Auron Khalkon + 80-95 nm 4’OH (auron) 6-OH

(kekuatan meningkat) tanpa oksigenasi

pada 4’ (auron)

+60-70 (kekuatan

naik) pergeseran kecil 6-OH dengan

oksigenasi pada 4’

(auron)

+60-100nm 4’OH (auron)

(kekuatan naik)

tanpa kenaikan 2-OH atau 4’OH

kekuatan dan tanpa 4’OH

+40-50 nm 4’OH (2’OH atau

4’OH)

Antosianidin Semuanya terurai Nihil

Antosian kecuali 3-
deoksiantosianin
22

Tabel V. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan NaOAc

(Markham, 1988)

Jenis flavonoida Pergeseran yang tampak Petunjuk Flavonoidaa

Pita I Pita II

Flavon +5-20 nm 7-OH

(berkurang bila ada

Flavonol oksigenasi pada

Isoflavon 6/8)

Kekuatannya berkurang dengan -OH di 6,7 atau 7,8

bertambahnya waktu atau 3,4’

Flavanon +35 nm 7-OH (dengan 5-OH)

Dihidroflavonol +60 nm 7-OH (tanpa 5-OH)

Kekuatannya berkurang dengan -OH di 6,7 atau 7,8

bertambahnya waktu

Pergeseran batokromik atau bahu 4’-OH dan atau 4- OH

pada panjang gelombang yang lebih (khalkon) 4’-OH dan


panjang atau tanpa 6-OH

(Auron)

Tabel VI. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan

NaOAc dan H3BO3 (Markham, 1988)

Jenis flavonoida Pergeseran Tampak Petunjuk

Pita I Pita II penafsiran

Flavonol, Auron, +12-36 nm (nisbi o- di OH pada

Khalkon terhadap spektrum cincin B

metanol), pergeseran

lebih o- di OH pada

kecil cincin A (6,7

atau 7,8)

Isoflavon, +10-15 nm (nisbi o- di OH pada

Flavanon, terhadap spektrum cincin A (6,7

Dihidroflavonol metanol) atau 7,8)


23

Tabel VII. Penafsiran spektrum ultraviolet flavonoida dengan penambahan AlCl3

serta AlCl3 dan HCl (Markham, 1988)

Jenis flavonoida Pergeseran yang tampak Petunjuk penafsiran

(Pereaksi) Pita I Pita II

Flavanon dan +35 sampai 55 5- OH

flavonon (AlCl3 nm 5-OH dengan oksigenasi

dan HCl) +17 sampai 20 pada 6

nm Mungkin 5-OH dengan

Tak berubah gugus prenil pada 6

+ 50 sampai 60 Mungkin 3-OH (dengan

nm atau

tanpa 5-OH)

(AlCl3) Pergeseran o-diOH pada cincin B

AlCl3/HCl

tambah 30

sampai 40 nm

Pergeseran o-di OH pada cincin A

AlCl3/HCl (Tambahan pada


tambah 20 pergeseran o- di OH pada

sampai 25 nm cincin B)

Isoflavon, +10 sampai 14 5-OH (Isoflavon)

flavanon, dan nm

dihidroflavonol +20 sampai 26 5-OH

(AlCl3 dan HCl) nm (Flavano

n, dihidroflavonol)

(AlCl3) Pergeseran o-diOH pada cincin A (6,7

AlCl3/HCl, dan 7,8)

tambah 11

sampai 30 nm

Pergeseran Dihidroflavonol tanpa 5-

AlCl3/HCl OH (tambahan pada

tambah 30 sembarang pergeseran o-di

sampai 38 nm OH)

Auron, Khalkon +48 sampai 64 2’-OH (khalkon)

(AlCl3 dan HCl) nm

+40 nm 2’-OH (Khalkon

dengan

(AlCl3) +60 sampai 70 oksigenasi pada 3’

nm 4-OH (Auron)

Pergeseran o- diOH pada cincin B

AlCl3/HCl
tambah 40

sampai 70 nm

Penambahan Mungkin o-diOH pada

lebih kecil cincin

Antosianidin, +25 sampai 35 o-diOH

Antosianin (AlCl3) nm (Pada pH 2-

4)

Pergeseran lebih Banyak o-diOH atau o-

besar diOH

(3-deoksi antosianidin)
24

D. Keterangan Empiris

Dari ekstrak metanol herba pegagan embun dapat diidentifikasi jenis flavonoida

dan gambaran struktur parsial flavonoida tersebut.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental yang dilakukan di

laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

B. Definisi Operasional

1. Herba pegagan embun adalah seluruh bagian tanaman pegagan embun

yang berada di atas tanah.

2. Ekstrak metanol-air adalah ekstrak yang diperoleh dari penyarian herba

pegagan embun secara maserasi dengan metanol-air (9:1 dan 1:1).

3. Struktur parsial merupakan kerangka dasar dari segi struktur senyawa

dengan gugus-gugus tersubstitusi pada bagian struktur tersebut.


C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah bahan kimia yang berderajat pro

analisis (p.a), kecuali dinyatakan lain.

1. Bahan tanaman : herba segar dari pegagan embun (yang telah

dikeringkan dan diserbuk).

25
26

2. Bahan kimia untuk penyari : bahan yang digunakan adalah metanol dan

aquadest (lokal).

3. Bahan untuk kromatografi : kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase

diam selulosa, n-butanol, aquadest (lokal), asam asetat, amonia pekat.

4. Bahan pereaksi identifikasi warna flavonoida : serbuk Mg, asam klorida

pekat, asam sulfat pekat, natrium hidroksida (NaOH).

5. Pereaksi diagnostik untuk penentuan struktur flavonoida secara

spektroskopi ultraviolet : natrium hidroksida (NaOH), alumunium klorida (AlCl3),

natrium asetat (CH3COONa), asam borat (H3BO3).

D. Alat Penelitian

1. Alat pengeringan, penyerbukan dan penyarian : oven, blender, ayakan,

kertas saring, alat-alat gelas (pipet tetes, gelas ukur, Beaker glass, corong,

pengaduk).

2. Alat kromatografi dan spektroskopi Ultraviolet : seperangkat alat

spektroskopi UV-Vis (Genesys 6), vakum, pipa kapiler, lampu 365 nm,

seperangkat alat kromatografi kolom, alat-alat gelas (corong pisah, Beaker glass,

gelas ukur, pipet), kertas saring.


E. Jalannya Penelitian

1. Determinasi tanaman pegagan embun

Determinasi dilakukan terhadap tanaman pegagan embun di laboratorium

Farmakognosi Fitokimia menurut Backer dan Backhuizen van de Brink (1963).


27

2. Pengumpulan bahan

Herba segar dari pegagan embun dikumpulkan pada bulan januari 2006 pada

musim penghujan dari daerah Paingan, Yogyakarta. Pencucian dilakukan terlebih

dahulu untuk menghilangkan kotoran yang menempel seperti debu dan serangga.

Bagian herba juga dipisahkan dari bagian tanaman lain yang terikut saat

pengumpulan.

3. Pengeringan herba pegagan embun

Herba pegagan embun dikeringkan tanpa dirajang terlebih dahulu karena herba

yang tipis.Pengeringan dilakukan dalam oven pada suhu 40ºC selama 5 jam.

Dikatakan kering jika herba pegagan embun sudah dapat hancur ketika diremas

dengan tangan.

4. Penyerbukan herba pegagan embun


Herba pegagan embun yang telah dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan

blender, lalu diayak.

5. Ekstraksi herba pegagan embun

Penyarian dilakukan dengan memaserasi terlebih dahulu simplisia yang telah

digiling menjadi serbuk dengan campuran pelarut pertama yaitu metanol : air (9

:1) secukupnya hingga terbentuk bubur cair. Campuran dibiarkan selama 6 – 12

jam, di tempat yang terlindung cahaya pada suhu kamar. Untuk pemisahan serbuk

dan cairan hasil penyarian, dilakukan penyarian menggunakan corong dengan

kapas. Bagian serbuk disari lagi dengan


28

pelarut metanol : air (1:1), dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas.

Kedua hasil penyarian dicampur, diuapkan hingga tinggal sepertiga atau

pelarutnya hampir menguap semua (Mursyidi, 1990).

6. Fraksinasi flavonoida dengan kromatografi kolom vakum

Kolom yang digunakan mempunyai diameter 4 cm dan mempunyai tinggi 20 cm.

a. Cara membuat fase diam

Sejumlah selulosa dimasukkan ke dalam Beaker glass kemudian diaduk hingga

berbentuk bubur (slurry) menggunakan aquadest.

Bubur selulosa dimasukkan ke dalam kolom setinggi 5 cm dengan bantuan corong

dan batang pengaduk.

b. Penempatan sampel

Sebanyak 1,0 gram ekstrak kering diletakkan di atas fase diam.

c. Pemisahan fraksi

Sebanyak 25 ml fase gerak dituang di atas sampel, kemudian divakum sampai


semua fase gerak tersedot keluar. Hal tersebut dilakukan 15 kali sampai fraksi

yang dihasilkan berwarna bening. Masing-masing fraksi lalu dipekatkan.

7. Identifikasi flavonoida dengan KLT

Kandungan flavonoida fraksi dari hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom

vakum diperiksa dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi ditotolkan pada lempeng

selulosa, kemudian dikembangkan dengan jarak pengembangan 8 cm dari totolan

menggunakan pelarut BAW (n-butanol:asam asetat:air = 4:1:5 v/v,


29

fase atas) hingga batas yang ditetapkan. Bercak dideteksi menggunakan uap

amonia, dan lampu UV 365 nm.

8. Isolasi flavonoida dengan KLT preparatif

Dilakukan isolasi KLT preparatif dalam fase diam selulosa dan fase gerak BAW

(4:1:5 v/v, fase atas). Isolat ditotolkan berupa garis yang selanjutnya

dikembangkan, dan didapatkan pemisahan bercak. Hasil kerokan diekstraksi

dengan metanol kemudian disaring dengan kertas saring. Maka diperoleh isolat

flavonoida untuk diuji kemurnian, reaksi warna, dan spektroskopi ultraviolet.

9. Pemeriksaan kemurnian isolat senyawa flavonoida

Kemurnian isolat flavonoida dapat diketahui menggunakan lempeng

kromatrografi dengan menotolkan pada dua lempeng yang masing-masing

dikembangkan menggunakan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas) dan asam

asetat 15 %.

10. Reaksi warna flavonoida

Isolat senyawa flavonoida dianalisis reaksi warna menggunakan pereaksi-pereaksi

warna :
a. Natrium hidroksida 4% (larutan ini dibuat dengan melarutkan 4 g

NaOH dalam air bebas CO2 hingga 100 ml), 3 tetes larutan isolat flavonoida pada

droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan natrium hidroksida, warna yang

terjadi dicatat.
30

b. Logam magnesium dan asam klorida, 3 tetes larutan isolat

flavonoida pada droping plate ditambah sedikit serbuk magnesium dan asam

klorida, warna yang terjadi dicatat.

c. Asam sulfat pekat 98%, 3 tetes larutan isolat flavonoida pada

droping plate ditambah dengan 1 tetes larutan asam sulfat pekat 98%, warna yang

terjadi dicatat.

11. Identifikasi spektra senyawa flavonoida dengan spektroskopi ultra

violet

Tiap isolat senyawa flavonoida yang telah diperiksa kemurniannya, diencerkan

dengan metanol sampai konsentrasi 0,2% dan kemudian dilakukan pembacaan

absorbansi melalui tahapan sebagai berikut :

a. isolat flavonoida dimasukkan dalam kuvet sampel dan ke dalam

kuvet pembanding diisikan metanol. Pembacaan absorbansi dilakukan pada

panjang gelombang 200 – 500 nm.

b. Penambahan pereaksi geser NaOH, pembacaan absorbansi pada

panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan segera setelah penambahan 3 tetes

NaOH 2 N. Untuk memeriksa apakah ada penguraian pergeseran panjang

gelombang diperiksa lagi setelah 5 menit, kemudian cuplikan dibuang dan kuvet
yang telah dicuci diisi dengan larutan isolat persediaan.

c. Penambahan pereaksi geser AlCl3, pembacaan absorbansi pada

panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan setelah penambahan larutan AlCl3

pada isolat flavonoida. Selanjutnya dibaca lagi absorbansi setelah penambahan 3

tetes HCl.
31

d. Penambahan pereaksi geser natrium asetat, pembacaan pada panjang

gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk natrium asetat

dimasukkan dalam kuvet berisi 2 -3 ml isolat flavonoida lalu digojog, sedemikian

rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan natrium asetat pada dasar kuvet.

Pembacaan dilakukan setelah 2 menit penambahan natrium asetat.

e. Penambahan pereaksi geser natrium asetat / H3BO3, pembacaan

absorbansi pada panjang gelombang 200 – 500 nm dilakukan dengan cara serbuk

H3BO3 dimasukkan ke kuvet berisi 2 ml isolat flavonoida, larutan dijenuhkan

secepatnya dengan serbuk kasar natrium asetat lalu dibaca absorbansinya.

Pembacaan absorbansi dilakukan pada kecepatan 50 nm per menit.

12. Pembuatan pereaksi geser (Markham, 1988)

a. Natrium hidroksida (NaOH)

Pereaksi NaOH menggunakan larutan NaOH 2 M dalam air.

b. Natrium asetat (NaOAc) Digunakan serbuk NaOAc anhidrat.

c. Alumunium klorida (AlCl3)


Sebanyak 5 g AlCl3 ditambahkan ke dalam 100 ml metanol.

d. Asam hidroklorida (HCl)

Sejumlah 50 ml HCl pekat ditambahkan ke dalam 100 ml aquadest.

e. Asam borat (H3BO3)

Digunakan serbuk asam borat anhidrat.


32

F. Tata Cara Analisis Hasil

Analisis hasil dilakukan terhadap data yang diperoleh dari kromatografi lapis tipis,

reaksi warna ,dan spektroskopi ultraviolet dibandingakan dengan pustaka

Markham (1988) dan Venkataraman (1988).


BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman pegagan embun dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui

kebenaran identitas nama ilmiah tanaman pegagan embun. Determinasi pada

penelitian ini dilakukan dengan cara mencocokkan keadaan tanaman dengan ciri-

ciri yang terdapat pada pustaka acuan (Backer dan Backhuizen van de Brink,

1963).

Tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman pegagan embun yang

dideterminasi sampai tingkat spesies menurut Backer dan Backhuizen van de

Brink (1963) (Lampiran 1). Berdasarkan determinasi hingga kategori spesies

tersebut, maka tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar

pegagan embun dengan nama ilmiah Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.


B. Ekstraksi Herba Pegagan Embun

Herba pegagan embun yang telah diambil kemudian dicuci dan dibersihkan

dengan air untuk memisahkan kotoran , tanah dan mikroba yang melekat pada

herba. Setelah itu, herba dikeringkan dalam oven pada suhu 40˚ C selama 5 jam.

Pengeringan dimaksudkan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang dapat

menguraikan senyawa aktif dan mencegah tumbuhnya mikroba. Setelah kering,

yang ditandai dengan herba mudah hancur ketika diremas dengan

33
34

tangan maka herba tersebut diserbuk. Penyerbukan dilakukan untuk memperbesar

luas permukaan sehingga pada waktu penyarian hasilnya akan optimal.

Flavonoida merupakan polifenol yang memiliki sifat kimia fenol. Adanya gula

yang terikat pada aglikon akan meningkatkan polaritas, maka flavonoida cukup

larut dalam pelarut polar yaitu metanol. Adanya gula yang terikat pada flavonoida

cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air dan dengan

demikian campuran metanol-air merupakan pelarut yang baik untuk melarutkan

flavonoida. Maka penyarian yang dilakukan secara maserasi dengan prinsip

perendaman dan penggojogan sudah dapat membuat flavonoida tersari ke dalam

cairan penyari. Selain itu, maserasi dapat dikerjakan tanpa alat yang khusus dan

cara kerjanya sederhana.

Cairan penyari menembus membran dan masuk ke dalam rongga sel herba

sehingga zat aktif herba terlarut karena terjadi perpindahan dari konsentrasi yang

lebih besar ke konsentrasi yang lebih kecil dari dalam sel ke cairan penyari.

Penyarian dengan maserasi dapat mencapai titik jenuh, maka penggojogan

dilakukan untuk menjaga perbedaan konsentrasi di dalam sel dan di luar sel

sehingga tetap terjadi perpindahan senyawa aktif dari sel tersebut.


C. Isolasi dengan Kromatografi Kolom Vakum

Fraksi metanol dipisahkan dengan kromatografi kolom vakum menggunakan fase

diam selulosa dan fase gerak BAW. Digunakan fase diam selulosa karena selulosa

ideal untuk memisahkan glikosida yang satu dari glikosida yang lain, glikosida

dari aglikon, serta untuk memisahkan aglikon yang


35

kurang polar (Markham,1988). Sedangkan dipilih fase gerak BAW karena BAW

sesuai untuk memisahkan glikosida, aglikon, dan gula (Markham,1988). Selulosa

bersifat non polar dan BAW bersifat polar sehingga sesuai untuk memisahkan

flavonoida dimana flavonoida akan lebih terikat dalam fase gerak Penggunaan

vakum dimaksudkan untuk mempercepat proses keluarnya fraksi dari kolom.

Jika fraksi yang dihasilkan sudah bening dan jika dilihat di bawah lampu UV

sudah tampak tidak ada bercak warna, maka proses pemisahan dapat dihentikan.

Pemisahan komponen-komponen fraksi metanol dengan kromatografi kolom

vakum menghasilkan 15 fraksi.

D. Identifikasi Flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis

(KLT)

Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dengan kromatografi lapis tipis. Kromatografi

lapis tipis merupakan metode yang umum dan cocok untuk memeriksa senyawa

polar seperti flavonoida yang umumnya mempunyai kelarutan polar (struktur

flavonoida banyak mengandung gugus hidroksi).

Jumlah ekstrak yang ditotolkan menentukan kualitas pola flavonoida yang terjadi.
Jika ekstrak yang ditotolkan terlalu sedikit, bercak flavonoida yang terbentuk

setelah pengembangan akan sulit untuk dideteksi. Jika terlalu banyak, maka

setelah dilakukan pengembangan akan terjadi pengekoran (tailing) yang akan

mengganggu hasil analisis karena menurut Sastrohamidjojo (2005), ekor akan

menaikkan kelebaran pita sehingga cenderung menimbulkan penindihan pita satu

dengan pita lainnya (overlap).


36

Fraksi-fraksi dari hasil kromatografi kolom vakum diperiksa dengan KLT dengan

fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5, fase atas). Hasil pemisahan fraksi

3 - 12 dengan KLT menghasilkan dua bercak pemisahan yang dideteksi di bawah

lampu UV 365 nm, yaitu bercak A yang berwarna ungu gelap dengan harga Rf

0,86 dan bercak B yang berwarna biru dengan harga Rf 0,76 (Lampiran 2). Reaksi

antara flavonoida dengan amonia akan memperpanjang ikatan

rangkap terkonjugasi sehingga intensitas warna kuning menjadi

jelas (Gambar 5). Dari hasil penelitian, setelah diuapi dengan amonia maka

intensitas warna kuning menjadi jelas jika dilihat secara visible. Fraksi 3 – 12

menunjukkan kromatogram yang sama, oleh karena itu fraksi-fraksi tersebut

disatukan dan dipekatkan untuk kemudian dipisahkan dengan

kromatografi lapis tipis preparatif. Berdasarkan data

tersebut yang didapat dari warna bercak dan nilai Rf pada kromatografi lapis tipis

dan dibandingkan dengan pustaka ada indikasi bahwa fraksi BAW ekstrak

metanol herba pegagan embun kemungkinan mengandung

flavonoida (Harborne, 1984; Markham, 1988) (Tabel VIII).

OH OH
OH O

HO O HO O

+ NH3 -NH4 +

O O

OH

HO O

O-

Gambar 5. Reaksi antara Flavon dengan amonia


37

Tabel VIII. Data kromatogram dari bercak fraksi herba pegagan embun

menggunakan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas)

deteksi dengan sinar UV 365 nm sebelum dan sesudah diuapi amonia (Markham,

1988)

Warna Bercak

Bercak Rf Visible UV 365 Amonia/ Amonia /UV

visible 365

AB 0,86 Agak kuning Ungu gelap Kuning Ungu gelap

Biru jelas Biru

0,76 Tidak

berwarna Kuning

E. Isolasi flavonoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Penggunaan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) lebih ditekankan untuk

mendapatkan isolat dengan menggunakan pelarut seminimal mungkin.

Keuntungan lain yang didapat yaitu penghematan waktu dan biaya yang
diperlukan.

Pada kromatografi lapis tipis preparatif fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak

metanol-air ditotolkan berupa garis / pita 10 cm pada lempeng kromatografi

dengan fase diam selulosa dan fase gerak BAW (4:1:5 v/v, fase atas). Penotolan

diulang beberapa kali agar bercak yang diperoleh lebih jelas. Pengembangan

dilakukan dengan jarak pengembangan 10 cm dari totolan awal. Bercak pita

dengan harga Rf dan warna yang sama dengan bercak yang dipilih pada

pemeriksaan sebelumnya, dikerok kemudian dikumpulkan dan diekstraksi dengan

metanol (Gambar 6).


38

Pada penelitian, dipilih bercak yang berwarna ungu dengan harga Rf 0,86.

Pemilihan bercak dilakukan karena pertimbangan bercak yang lebih dominan.

Hasil pengerokan dari kromatografi lapis tipis preparatif dari bercak tersebut

selanjutnya disebut isolat flavonoida.

F. Pemeriksaan Kemurnian Isolat Flavonoida

Kemurnian isolat flavonoida diperiksa secara KLT multi eluen dengan

menggunakan dua macam fase gerak yang mempunyai kepolaran yang berbeda

yaitu BAW dan asam asetat, dimana asam asetat 15% bersifat lebih polar daripada

BAW.

Hasil pengembangan KLT multi eluen diperoleh bercak tunggal berwarna ungu

yang mengindikasikan bahwa isolat flavonoida sudah murni dan dapat diperiksa

secara spektroskopi UV. Bercak tersebut dilihat di bawah sinar UV 365 nm

sebelum dan sesudah diuapi amonia. Diperoleh harga Rf 0,55 untuk

pengembangan dengan fase gerak BAW (Gambar 7) dan Rf 0,93 untuk

pengembangan dengan fase gerak asam asetat (Gambar 8).


39

Gambar 6. Kromatogram isolasi flavonoida dengan KLTP

Keterangan :

Sampel : Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak

metanol-air herba pegagan embun

Fase diam : Selulosa

Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas)

Bercak 1 : Bercak A (warna ungu) Rf 0,86

Bercak 2 : Bercak B (warna biru) Rf 0,76 Jarak

pengembang : 10 cm
40
Gambar 7 . Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida

Keterangan :

Sampel : Pita bercak (Rf 0,69) dari Fraksi BAW

(4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun

Fase diam : Selulosa

Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas) Bercak pada

pengembangan : Rf 0,93

Jarak pengembang : 10 cm
41
Gambar 8. Kromatogram pemeriksaan kemurnian isolat flavonoida

Keterangan :

Sampel : Pita bercak (Rf 0,69) dari Fraksi BAW

(4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak metanol-air herba pegagan embun

Fase diam : Selulosa

Fase gerak : Asam asetat 15 % Bercak pada

pengembangan : Rf 0,55

Jarak pengembang : 10 cm
42

G. Identifikasi Flavonoida dengan Reaksi Warna

Reaksi warna flavonoida merupakan uji pendahuluan untuk menentukan golongan

senyawa flavonoida. Uji ini memberi informasi berupa gambaran umum golongan

senyawa flavonoida pada hidroksilasi dan substitusinya.

Penambahan NaOH yang bersifat basa menyebabkan flavonoida menjadi kuning.

Warna ini timbul disebabkan oleh pembentukan garam dan terbentuknya struktur

kuinoid pada cincin B pada flavonoida (Venkataraman, 1962).

Adanya gugus fenol pada flavonoida akan memberikan reaksi positif antara

flavonoida dengan pereaksi untuk fenol, seperti H2SO4 pekat. Reaksi ini tidak

spesifik dan harus diikuti dengan reaksi warna yang lain (Venkataraman, 1962;

Harborne, 1987).

Flavonoida akan mengalami reduksi jika direaksikan dengan serbuk magnesium

dalam asam klorida dan menghasilkan warna kuning sampai merah untuk

golongan flavon (Venkataraman, 1962).

Berdasarkan data dari reaksi warna yang diperoleh (Tabel IX), maka dapat

disimpulkan bahwa isolat flavonoida mengarah pada golongan flavon

(Venkataraman, 1962).
Tabel IX. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun

Uji Warna NaOH H2SO4 p Mg-HCl p

Isolat Kuning Kuning Kuning

flavonoida

Flavon

(Venkataraman, Kuning Kuning - jingga Kuning-merah

1962)
43

H. Identifikasi Spektrum Isolat Flavonoida dengan Spektroskopi

Ultraviolet Analisis selanjutnya dilakukan pada data spektroskopi ultraviolet

untuk memastikan golongan flavonoida dan struktur parsialnya. Isolat flavonoida

dalam metanol yang diukur menghasilkan dua puncak serapan karena pada

struktur flavonoida terdapat dua komponen penyerap, yaitu komponen penyerap

benzoil

dan komponen penyerap sinamoil.

Komponen penyerap sinamoil merupakan puncak serapan untuk pita I, sedangkan

komponen penyerap benzoil merupakan puncak serapan untuk pita II. Pita I

mempunyai panjang gelombang yang lebih besar karena ikatan rangkap

terkonjugasinya lebih banyak dibanding pita II. Penambahan ikatan rangkap

terkonjugasi ini menyebabkan makin kecil energi yang diperlukan untuk

tereksitasi sehingga akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang yang lebih

besar.
44

Tabel X. Data spektrum dan pergeseran yang terjadi setelah diberi pereaksi –

pereaksi kimia

Puncak Pergeseran

Pereaksi yang Serapan (nm) Puncak

ditambahkan Serapan (nm) Prakiraan Struktur

Pita I Pita II Pita I Pita II (Mabry dkk, 1970)

Golongan Flavon

Isolat 345 260 Golongan Flavonol

Metanol dengan 3-OH

tersubstitusi

Isolat NaOH 395 270 +50* + 10 Adanya gugus OH pd

Metanol atom C nomer 4’

Isolat NaOH 395 270 +50* + 10 Tidak terjadi

Metanol (5 menit) dekomposisi

AlCl3 360 265 +15* + 5 Mengindikasikan ada

ortodihidroksi di B
Tidak menunjukkan

adanya 3-hidroksi di

Isolat AlCl3 + HCl 350 265 - 0 cincin B (jika

Metanol 10** dibandingkan dengan

AlCl3)

JIka dibandingkan

dengan metanol pada

pita I. maka tidak

menampakkan adanya 5

dan 3 OH

Isolat NaOAc 385 265 +40* + 5 Adanya gugus OH pada

Metanol atom C nomor 7

Posisi orto dihidroksi di

H3BO3 + cincin B (3’ dan 4’

Isolat NaOAc 365 260 +20* 0 atau 4’ dan 5’) Tidak

Metanol adanya posisi orto

dihidroksi pada cincin

Ket: * : dibandingkan dengan serapan isolat metanol

** : dibandingkan dengan isolat flavonoida dalam metanol diberi AlCl3


45

Hasil pengukuran isolat flavonoida dalam metanol memperoleh puncak dengan

serapan 345 nm pada pita I dan 260 nm pada pita II. Hal ini menunjukkan bahwa

isolat flavonoida hasil isolasi mengarah pada golongan flavon dan flavonol

dengan 3-OH tersubstitusi (Markham, 1988)(Tabel X).

260 270 345 395


MeOH

MeOH + NaOH

Gambar 9. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOH


46
Gambar 10. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan NaOMe (Mabry,dkk. 1970)

Tabel XI. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam

MeOH dan NaOMe

Senyawa Pita I Pita II

Isolat Flavonoida 395 270

Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 409 272

Pada penambahan NaOH dalam larutan ini didapat puncak serapan 395 nm pada
pita I dan 270 nm pada pita II. Pada pergeseran ini tidak terjadi dekomposisi, hal

ini tidak menunjukkan adanya gugus yang peka terhadap basa (Tabel X).
47

OH

OH

HO O

+ 3

NaOH - 3 Na+

-3 H2O

O-

O-

O- O
O
- O

-O O

O-

Gambar 11. Reaksi antara Flavon dengan NaOH

AlCl3 dan AlCl3/HCl menyebabkan pembentukan kompleks tahan asam antara

gugus hidroksil dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan

asam dengan gugus o-dihidroksil, pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi

kedua gugus tersebut. Pada penambahan AlCl3 ke dalam isolat flavonoida dalam

metanol didapatkan puncak serapan 360 nm pada pita I dan 265 nm pada pita II.

Pergeseran ini mengindikasikan adanya ortodihidroksi pada cincin B (Tabel X).


48

260 265 345 360


MeOH

MeOH + AlCl3

Gambar 12. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan AlCl3


49

265 350 360


AlCl3

AlCl3 + HCl

Gambar 13. Spektrum UV isolat flavonoida dalam AlCl3 dan HCl


50
Gambar 14. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan AlCl3/ HCl (Mabry,dkk.

1970)

Tabel XII. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam

MeOH dan AlCl3/ HCl

Senyawa Pita I Pita II

Isolat Flavonoida 350 265

Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 405 268

Adanya gugus 5-OH dan 3-OH dalam spektrum akan memperlihatkan pergeseran

batokromik relatif terhadap metanol dengan penambahan pereaksi


51

AlCl3/HCl. Dari analisis yang diperoleh tidak mengindikasikan adanya 5-OH dan

3-OH (Tabel X).

Cl

OH O Al

OH O

OH O OH O

AlCl3 HCl encer

O O
OH

OH

OH O

Gambar 15. Reaksi antara Flavon dengan AlCl3/HCl (Mabry dkk, 1970)

Penambahan pereaksi NaOAc bertujuan untuk mendeteksi adanya 7-OH bebas

dari golongan flavon dan flavonol. Keberadaan 7-OH bebas akan menyebabkan

pergeseran batokromik sebesar 5 – 20 nm pada pita II (Mabry dkk, 1970). Pada

penambahan NaOAc ke dalam isolat flavonoida dalam metanol diperoleh

pergeseran batokromik sebesar 5 nm pada pita II. Hal ini mengindikasikan

adanya: 7-OH pada golongan flavon atau 7-OH pada golongan flavonol (Tabel

X).
52

260 265 345 385


MeOH

MeOH + NaOAc

Gambar 16. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc

OH

OH

OH O + CH3 -C O

ONa - Na +

- CH3COOH
O

OH OH

OH OH

-O O O O
O O-

Gambar 17. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc


53

Penambahan pereaksi NaOAc/ H3BO3 untuk mendeteksi adanya gugus

ortodihidroksi pada cincin B dan gugus ortodihidroksi pada cincin A dari

golongan flavon dan flavonol. Adanya gugus ortodihidroksi pada cincin B

ditunjukkan dengan pergeseran batokromik sebesar 12 – 30 nm pada pita I,

sedangkan adanya gugus ortodihiroksi pada cincin A ditunjukkan dengan

pergeseran batokromik kira-kira sebesar 5 – 10 nm pada pita I (Mabry dkk, 1970).

Pada penambahan NaOAc/ H3BO3 ke dalam isolat flavonoida dalam metanol

diperoleh pergeseran batokromik sebesar 20 nm pada pita I. Hal ini memberikan

kemungkinan adanya gugus ortodihidroksi pada cincin B dan tidak menunjukkan

adanya gugus ortodihidroksi pada cincin A (Tabel X).

260 345 365


MeOH

MeOH + NaOAc/ H3BO3

Gambar 18. Spektrum UV isolat flavonoida dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3
54
Gambar 19. Spektrum UV Hiperin dalam MeOH dan NaOAc/ H3BO3

(Mabry,dkk. 1970)

Tabel XIII. Perbandingan data spektrum isolat Flavonoida dengan Hiperin dalam

MeOH dan NaOAc/ H3BO3

Senyawa Pita I Pita II

Isolat Flavonoida 365 260

Hiperin (Mabry,dkk. 1970) 377 262


55

OH

OH

HO

CH3- C O

O +
ONa - Na

- CH3C OOH HO OH

O B-

OH

O-

HO O
HO O

OH OH

O B

+ - H2O

OH

Gambar 20. Reaksi antara Flavon dengan NaOAc/ H3BO3 Berdasarkan analisis

warna bercak dan Rf (Tabel VIII), analisis

reaksi

warna (Tabel IX), dan analisis spektroskopi ultraviolet (Tabel X) maka isolat

flavonoida tersebut kemungkinan golongan flavon dengan kemungkinan struktur

parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau 7, 4’,5’ trihidroksi flavon.

OH

OH

HO O HO O

OH

O O
7,3’,4’ trihidroksi flavon 7,4’,5’ trihidroksi

flavon
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Penelitian yang dilakukan yaitu isolasi dan prakiraan struktur parsial herba

pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) secara kromatografi, reaksi

warna, dan spektroskopi ultraviolet maka isolat A diduga memiliki golongan

flavon, dengan kemungkinan struktur parsial 7,3’,4’ trihidroksi flavon atau 7,

4’,5’ trihidroksi flavon.

OH

OH

HO O HO O

OH
O O

7,3’,4’ trihidroksi flavon 7,4’,5’ trihidroksi

flavon

B. Saran

Perlu dilakukan penentuan golongan flavonoida dan prakiraan struktur parsial

terhadap bercak biru yang nampak pada KLT.

56
57

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1985, Cara Pembuatan Simplisia, 4-6, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta.

Anonim, 2004, Calincing untuk darah tinggi, http://www.suaramerdeka.com%20-

%20semata-mata%20fakta!htm, diakses, 27 April 2006.

Anonim,2005, Semanggi Gunung,

http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=58-15k. diakses, 26

April 2006.

Anonim, 2007, Noble rhubarb, http://en.w

Anonim,1986a, Sediaan Galenik, 1-5, 0-16, 25-28, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta.
Backer, C.A. dan Backhuizen Van de Brink Jr., R.C., 1963, Flora of Java,

Volume I, 3-9, 25-26, N.V.P. Noordhoff, Groningen, The Nederlands.

Backer, C.A. dan Backhuizen Van de Brink Jr., R.C., 1963, Flora of Java,

Volume II, 171-172, N.V.P. Noordhoff, Groningen, The Nederlands.

Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, Edisi II,

310-326, Intercept. Ltd, New York.

Creswell, C. J., Runquist, O.A., Campbell, M.M., 1982, Spectrum Analysis of

Organic Compound, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang

Soediro, Edisi III, 46-59, Penerbit ITB, Bandung.

Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, diterjemahkan oleh Kosasih

Padmawinata dan Iwang Soediro, Edisi II, 2-28, 34-37, 47-49,69-103, Penerbit

ITB, Bandung.

Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A., 1995, Cara Kromatografi

Preparatif, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 33-36, Penerbit ITB,

Bandung.

Kaufman, Peter B., dkk., 1999, Natural Products from Plants, 22-23, CRC Press

LLC, United States of America.


58

Mabry, T.J., Markham, K.R., Thomas, M.B., 1970, The Systematical

Identification of Flavonoida Compound, 35 – 55, Springer Verlag, New York –

Heidelberg – Berlin.

Markham K.R., 1988, Techniques of Flavonoida Identification, diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata, 15-27, 32-53, Penerbit ITB, Bandung.

Mulya, M., 1995, Analisis Instrumental, Penerbit Airlangga University Press,

Surabaya.

Mursyidi A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, Cetakan I, 171-187, Penerbit

PAU Bioteknologi UGM, Yogyakarta.

Pelletier, S. W., Chokshi, H. P., Desai, H. K., 1986, Journal of Natural Products,

Volume 49, 892, 897, The University of Georgia Athens, Georgia.

Robinson, T., 1995, The Constituen of Higher Plants, diterjemahkan oleh Kosasih

Padmawinata, Edisi 6, 191-213, Penerbit ITB, Bandung.


Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, Cetakan II, 22-23, Penerbit Liberty,

Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, H. , 2005, Kromatografi, Cetakan III, 4, Penerbit Liberty,

Yogyakarta.

Silverstein, R.M., Basser,C.G., Morril, I.C.,1974, Spectrometric Identification of

Organic Compounds, Edisi IV, 305-308, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, edisi VII, 3-6, Penerbit ITB, Bandung.

Venkataraman, K., 1962, Methods for Determining the Structure of Flavonoida

Compounds, in Geissman, T.A. (Ed.), 70-75, The Chemistry of Flavonoida

Compound.
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61

A A

R B B
Lampiran 2. Kromatogram pemeriksaan kandungan

flavonoida dengan kromatografi lapis tipis

Keterangan :
Sampel : Fraksi BAW (4:1:5 v/v, fase atas) ekstrak

metanol-air herba pegagan embun

Fase diam : Selulosa

Fase gerak : BAW (4:1:5 v/v, fase atas)

R : pembanding rutin, Rf 0,67

Bercak A : Bercak Rf 0,86

Bercak B : Bercak Rf 0,76 Jarak pengembang : 8 cm


62
Lampiran 3. Alat kromatografi kolom vakum
63
Lampiran 4. Pegagan Embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.)
64
Lampiran 5. Reaksi warna isolat flavonoida herba pegagan embun