Universidad Industrial de Santander

Facultad de Salud
Escuela de Microbiologia
Programa de Microbiología y Bioanálisis
Hematología II
Guía de Laboratorio

Nataly Cruz, Cecilia Salamanca Ojeda, Martha Lucia

Docentes
Sánchez Jaimes y Ruth Stella Sánchez Flórez.

FIBRINOLISIS

La fibrinólisis es el proceso fisiológico que elimina los depósitos de fibrina insolubles, mediante la
digestión enzimática de los polímeros de fibrina estabilizada. Conforme se produce la cicatrización, los
coágulos se disuelven por efecto de la plasmina

1. Dímero D:

El dímero D es un fragmento especifico generado por dos moléculas de fibrina con enlaces cruzados
después que se forma el coagulo. Para que se formen los dímeros D, deben funcionar bien tres etapas
de la hemostasia:

 Coagulación para formar el coagulo

 Enlaces cruzados covalentes de fibrina con el factor XIII activado.
 Fibrinólisis para disolver el coagulo de fibrina en fragmentos más pequeños.

Las tres etapas requieren una formación adecuada de trombina. Después de la formación del coagulo, se
activa el sistema fibrinolitico para regular la formación de plasmina. La plasmina degrada el coagulo de
fibrina en fragmentos de fibrina específicos más pequeños, de los cuales algunos o todos contienen el
epitopo dímero D. cuando se activa el sistema fibrinolitico, los fragmentos de dímero D se liberan del
coagulo y circulan en la sangre.

Las pruebas de laboratorio para dímero D son útiles en el diagnostico de trastornos trombóticos:

 Coagulación intravascular diseminada (CID)

 Trombosis venosa profunda
 Embolia pulmonar

Las pruebas cualitativas y semicuantitativas de dímero D ayudan a confirmar la CID. La prueba

cuantitativa rápida y sensible de dímero D contribuye a descartar la trombosis venosa profunda y la
embolia pulmonar. La presencia de dímero D sugiere que se lleva a cabo un proceso de coagulación-
fibrinólisis, pero no confirma que se haya formado un trombo.

 PRUEBAS CUALITATIVAS: látex

Fundamento Dímero D (fibrinosticon): Prueba inmunológica de aglutinación en látex que emplea

partículas de látex revestidas con un anticuerpo monoclonal especifico para el dominio del dímero D en la
fibrina. Estas partículas de látex forman agregados macroscópicos solo en presencia de derivados
soluble de la fibrina que contienen el dominio del Dímero D. Debido a que la lisis del coagulo por parte de
la Plasmina produce un conjunto heterogéneo de productos de degradación de la fibrina con mas de un
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dominio del dímero D por molécula. El único anticuerpo del anti dímero D utilizado como revestimiento en
partículas de látex provocará aglutinación de estas partículas en presencia del antígeno.

La fibrina reticulada se forma cuando la trombina fracciona el fibrinógeno para formar monómeros de
fibrina. Estos se polimerizan espontáneamente y son reticulados por el factor XIIIa. La trombina se
necesita para fraccionar el fibrinógeno y para activar al factor XIII. La formación de la Plasmina se
desencadena cuando se forma un coagulo de fibrina. La Plasmina degrada la fibrina y el fibrinógeno. Los
productos de degradación del fibrinógeno (PDF) resultantes NO contienen dominio del Dímero D
reticulado, por lo tanto, no son reconocidos por los análisis del Dímero D.

Por ejemplo aglutinación de látex tradicional son métodos manuales en los que el parámetro de
valoración se detecta en forma visual.

Materiales:

 Muestra de plasma del paciente CITRATADO. Se puede conservar 8 horas a temperatura ambiente,
un mes a -20°C y descongelar a 37°C
 Control positivo y negativo para dímero D
 Portaobjetos de mezclado
 Suspensión de látex (almacenar a 2-8 grados centígrados)
 Varilla de mezclado
 Vortex
 Micropipetas (20, 50 y 100 ul)
 Solución tampón (Glicina)
 Tubos de ensayo.
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Procedimiento:

Tomar las muestras, separar el plasma

Atemperar los reactivos (To Ambiente) y preparar controles

En cada círculo adecuadamente identificado de la tarjeta del test (portaobjetos de fondo oscuro),
pipetear en el pozo correspondiente: 20 µl de control positivo, 20 µl control negativo, 20 µl muestra del
paciente sin diluir y 20 µl de muestra diluida.

Agitar varias veces el frasco que contiene la suspensión de micropartículas de látex recubiertas con
anticuerpos monoclonales anti-dímero D para homogenizarlo. Pipetear 20 µl de la suspensión de
micropartículas de látex en cada círculo.

Mezclar bien con la varilla de mezclado. Utilizar varillas separadas para cada círculo.

Mezclar moviendo lentamente la tarjeta en forma circular durante 2 minutos.

Observar la aglutinación macroscópica. Compare el patrón de aglutinación de cada dilución de

círculocon los controles positivos y negativos. Anotar a que dilución se obtiene un resultado negativo
en comparación con los controles.

Plasma Presencia de aglutinación Dimero-D ug/ml -

FEU
Caso 1 Negativo < de 0,5
Caso 2 Positivo >de 0,5
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CONSIDERACIONES GENERALES:

 Si La lectura se realiza después de 3 minutos, la suspensión de látex se puede secar y dar un

patrón de aglutinación falso. En caso de duda repetir la prueba.

 Si la muestra arroja resultados positivos es necesario realizar diluciones hasta obtener

negatividad, así:

Reactivo y Muestra Dilución 1/2 Dilución 1/4 Dilución 1/8

Plasma en ul 50 50 dilución 1/2 50 dilución 1/4
Solución tampón o 50 50 50
buffer en ul

Realizar las pruebas para cada una de las diluciones.

Dilución del Plasma Concentración de Dimero - D
Sin Diluir 1/2 1/4 1/8 1/16 (ug/ml – FEU)
- < 0.5
+ - >0.5 <1.0
+ + - >1.0 <2.0
+ + + - >2.0 <4.0
+ + + + - >4.0 <8.0
+ + + + + >8.0

FALSOS POSITIVOS:
1. Pacientes con factor reumatoide positivo
2. Mujeres embarazadas
3. Ancianos
4. Recién nacidos

VALORES DE REFERENCIAS:

La concentración de Dimero D en plasma es inferior 0.5 ug/ml (FEU)

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EJEMPLO: CALCULO DE LA MUESTRA:

Control Positivo Control Negativo M.5 sin diluir M5 1/2 M5 1/4

POSIBLES CAUSAS DE ELEVACIÓN DEL DIMERO D:

 Tromboembolia venosa.
 Coagulopatias de consumo.
 Sepsis.
 Embarazo.
 Infarto agudo de miocardio.
 Trombosis arterial.
 Insuficiencia cardíaca congestiva.
 Tratamiento fibrinolítico.
 Neoplasias, leucemias agudas.
 Colagenosis.
 Postoperatorios.
 Hepatopatias.
 Neuropatías avanzadas.
 Traumatismos.
 Encamamiento.
 Edad avanzada.

NOTA: El dímero D no es generado durante la degradación del fibrinógeno por consiguiente es

específico de la lisis de la fibrina.

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2. PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN DEL FIBRINÓGENO (PDF)

Los PDF se encuentran en concentraciones bajas en el plasma de los individuos sanos debido a los
mecanismos fibrinoliticos normales. La concentración media normal en adultos en reposo es de 4,9 más
o menos 2,8 µg/ml. Puede ocurrir una elevación pequeña después del estrés el ejercicio o por la
densidad se asocian las concentraciones séricas más altas de los PDF con la coagulación intravascular
diseminada, la trombosis venosa profunda, algunas alteraciones del embarazo, el infarto de miocardio y
el embolismo pulmonar. La orina contiene normalmente menos de 0,25 µg/ml de PDF. Pueden aparecer
concentraciones elevadas en nefropatías como la glomérulonefritis y en el rechazo agudo del trasplante.

Fundamento: Utiliza la aglutinación directa del látex para detectar la elevación de los PDF en el plasma.
Las partículas de látex recubiertas de anti-fibrinógeno humano se mezclan con suero desfibrando, se
examinan para detectar la aglutinación macroscópica.

Materiales:

 Reactivo de látex
 Control positivo para PDF
 Control negativo para PDF
 Buffer tamponado con glicina
 Tubos de recogida de muestra
 Palillos para mezcla
 Tubos de ensayo
 Micropipetas
 Cronómetro
 Agitador vortex
 Portaobjetos de mezclado
 Muestras: Plasma obtenido con citrato de sodio al 3,8%. Se puede conservar 8 horas a temperatura
ambiente, un mes a -20°C y descongelar a 37°C
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Procedimiento:
Tomar muestra de sangre con citrato de sodio

Obtener plasma (centrifugar 3.500 r.p.m./10 minutos)

Dejar que todos los reactivos y las muestras alcancen temperatura ambiente

Marcar tubos de ensayo limpios con 1:2 y 1:8 para cada muestra de plasma.

Reactivos y Muestras Dilución 1:2 Dilución 1:8

Buffer tamponado con glicina 50 ul 50ul

Muestra 50 ul 50ul

Transferir 20 ul de plasma dilución 1:2 en uno de los círculos de la tarjeta de prueba, y 20 ul de la

dilución 1:8 en otro circulo, 20 ul de control negativo y 20 ul de control positivo en otros dos círculos.

Agitar en un agitador vortex el reactivo de látex en frasco cerrado, y agregar 20 ul del reactivo de
látex a cada pocillo de la prueba.

Mezclar con los palillos y extender el contenido de cada pocillo para llenar el pocillo completamente.
Balancear el portaobjetos de un lado a otro suavemente durante 3 minutos.

Examinar cada pocillo bajo fuente de luz directa para detectar la aglutinación.
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RESULTADOS:

Dilución 1:2 Dilución 1:8 Concentración de PDF ug/ml

- - <5

+ - >5 y <20

+ + >20

- Ausencia de aglutinación + Presencia de aglutinación

VALORES DE REFERENCIA:

La concentración de PDF en un plasma normal en menor a 5ug/ml.

Los valores de referencian dependen de la casa comercial que se utilice. Y algunas condiciones pueden
hacer que sus valores estén aumentados o disminuidos:

VALORES AUMENTADO EN:

 Stress
 Ejercicio
 Ansiedad
 CID
 Trombosis venosa profunda
 Infarto agudo de miocardio
 Embolia pulmonar
 Alteraciones del embarazo

VALORES DISMINUIDOS EN:

 NEFROPATIAS: Glomerulonefritis
 Rechazo agudo al trasplante.