ENZIMOLOGÍA ALIMENTARIA

D en C. SANTIAGO GALLEGOS TINTORE

CINÉTICA DE POLOFENOLOXIDASA

EQUIPO 4:
BARDALES ECHEVERRIA NELLY
CORTÉS GUTIERRES MAYRA
PACHECO UC NIDIA GUADALUPE
 CINÉTICA DE
POLIFENOLOXIDASA
Autores

Bardales E. Nelly, Cortés G. Mayra, Pacheco U. Nidia

RESUMEN
Se realizó la determinación la actividad de la polifenoloxidasa en papa usando
3,4-dihidroxifenilalanina como substrato y monitoreando espectrofotométricamente
la formación de indol-5,6-quinona (IQ).

La papa se cortó y pelo una papa cruda, pesando 10 g y mezclo con 50 ml de buffer
A en un baño con hielo, luego se Licuo la mezcla durante aproximadamente
1 min., se filtró la mezcla con papel Whatman No. 1. Y se Mantuvo el filtrado en
un matraz Erlenmeyer de 125 ml sumergido en un baño de hielo hasta que se utilizó.

Se prepararon 12 tubos eppendorf con las soluciones previamente elaboradas, se

agregaron el y la el buffer B (fosfato de sodio al 0.1M) y la solución dopa (3,4-
dihidroxifenilalanina) en diferentes cantidades que se indicaron en un cuadro,
luego se leyeron las absorbancias con la reacción, iniciando la reacción cuando se
agregó el extracto enzimático.

Se realizó la lectura de las absorbancias en cada uno de los tubos, en el espectro

fotómetro a 475 nm en las celdas de plástico de 3.5 ml.
INTRODUCCIÓN
La cinética es el estudio de las velocidades de reacción y principios que permiten
comprender como sucede las reacciones. El mecanismo de reacción es único para
cada enzima, todas las enzimas funcionan del mismo modo general (Bohinski,
1991).

La polifenoloxidasa (PFO), es enzima que cataliza la hidroxilación de monofenoles

a odifenoles (actividad cresolasa EC 1.14.18.1) y la oxidación de o-difenoles a o-
quinonas (actividad catecolasa EC 1.10.3.1). Esta polimerización ocurre a partir de
reacciones químicas no enzimáticas muy complejas que suceden con
posterioridad a la oxidación de las o-quinonas producidas en el pardeamiento
enzimático, dando lugar, en la papa, a la formación de pigmentos pardos o negros,
así como a modificaciones desfavorables del color (Trujillo y Col., 2013).

El pH es otro factor determinante en la actividad de la enzima PFO en donde, la

relación entre pH y la actividad de la enzima depende del comportamiento ácido-
base de la enzima y del sustrato (Badui, 2000).

El pardeamiento enzimático en los tejidos ha sido atribuido a la actividad de la

polifenol oxidasa (PFO), una cobreproteína que actúa en los compuestos
fenólicos, causando su oxidación y polimerización con el consecuente desarrollo
de un color café, como se muestra en la Figura 1. Dado a que el color es un
atributo importante en las comidas, un cambio en él puede señalar otras
alteraciones y, además, reducir la aceptabilidad del consumidor (Garcia, 2006).
METODOLOGIA:

Material Reactivos Equipos

1 Probeta de 50 ml 50 ml Buffer A frío. Balanza analítica
licuadora
1 Vaso para licuadora. 30 ml Buffer B
Espectrofotómetro 475
1 Matraz kitazato de 125 mL 15 ml de DOPA nm
1 Papa cruda
1 Embudo Buchner (para el
matraz de 125 ml)
2 Papel filtro Whatman No. 1
1 Manguera de látex.
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml
estéril.
1 Pipeta automática de 200 µl.
1 Pipeta automática de 1000µl.
25 Puntas de 200. Estériles.
25 Puntas de 1000µl. Estériles.
1 caja para celdas vacía
1 Baño con Hielo frapé.
1 Cronómetro.
1 Tabla para cortar.
1 Cuchillo.
1 Celda de plástico 3.5 ml
1 Piseta con agua destilada

Procedimiento :
A) Preparación de extracto enzimático crudo

1. Pelar una papa cruda y cortar en pequeños trozos.

2. Pesar rápidamente 10 g de papa y mezclar con 50 ml de buffer A en un baño
con hielo.
3. Licuar la mezcla durante aproximadamente 1 min.
4. Filtrar la mezcla con papel Whatman No. 1. Mantener el filtrado en un matraz
Erlenmeyer de 125 ml sumergido en un baño de hielo hasta que se vaya a utilizar.
 Inicio

Se retiro

La cascara de una papa cruda y se

corto en pequeños trozos

Se pesaron

10 g de papa y mezclar con 50 ml de

buffer A en un baño con hielo

Se licuo

La mezcla durante aproximadamente 1 Fin

min

Se filtro Se mantuvo

La mezcla con papel Whatman No. 1 El filtrado en UN matraz Erlenmeyer de

125 ml sumergido en UN baño de hielo

Figura 2. Diagrama de flujo de la Preparación de extracto enzimático crudo

B) Ensayo enzimático

1. Preparar los tubos para el ensayo con las soluciones y cantidades que se
indican
2. Preparar el espectrofotómetro a 475 nm y blanquear con agua destilada.
Blanquear antes de cada ensayo.
3. Iniciar la reacción adicionando el extracto enzimático, mezclar y leer la
absorbancia Inmediatamente. Tomar lecturas a intervalos de 15 segundos durante
2 minutos para cada tubo.

Inicio

Se preparo

Los tubos para el ensayo con las

soluciones y cantidades que se
indicaban
Se preparo

El espectrofotómetro a 475 nm y
blanqueo con agua destilada. Fin

Se adiciono Se anoto

El extracto enzimático al inicio de la Los resultados arrojados por el

lectura (se mezcló) espectrofotómetro

Se leyó Se tomo

La absorvancia inmediatamente Lecturas a intervalos de 15 segundos

durante 2 minutos para cada tubo

Figura 3. Diagrama de flujo Ensayo enzimático

RESULTADOS
La realización del ensayo enzimático se llevó acabo en base a los datos que se
presentan en la tabla 1. Al término de la preparación de las muestras estas se
llevaron al espectrofotómetro; para la obtención de diferentes lecturas respecto al
tiempo dividido en intervalos de 15 segundos respectivamente, esto lo puedes
observar en la gráfica 1; en esta se representan las lecturas de absorbancia de
los tubos del 1 al 9 esto porque son las muestras que tienen la misma cantidad de
extracto enzimático. En cambio en la gráfica 2 se presenta la absorbancia
obtenida en las lecturas del tubo 10 respecto a los 2 minutos que se mantuvo en el
espectrofotómetro, pero con diferente contenido de extracto enzimático 200 µl, lo
mismo se puede observar en la gráfica 3 que representa la muestra del tubo 11
con un contenido de extracto enzimático de 150 µl; en el grafico 4 se presenta
también la absorbancia de la muestra contenida en el tubo 12 con un contenido de
extracto enzimático de 100 µl.

Relación Absorvancia vs. Tiempo

1
0.9
0.8 TUBO 2
Absorvancia (475 nm)

0.7
TUBO 3
0.6
TUBO 4
0.5
TUBO 5
0.4
TUBO 6
0.3
TUBO 7
0.2
TUBO 8
0.1
TUBO 9
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (s)

Grafica 1.- Representación de la Cinética de la enzima Polifenoloxidasa en papa, en los tubos de

muestra enumerados del 1 al 9, con el uso del sustractor Dopa.
 Realacion Absorvancia vs Tiempo del Tubo 10
0.5
0.45
0.4
Absorvancia (475 nm) 0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (s)

Grafica 2.- Representación de la Cinética de la enzima Polifenoloxidasa en papa, en el tubo de

muestra 10, con el uso del sustractor Dopa.

Realacion Absorvancia vs Tiempo del Tubo 11

0.4
0.35
Absorvancia (475 nm)

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (s)

Grafica 3.- Representación de la Cinética de la enzima Polifenoloxidasa en papa, en el tubo de

muestra 11, con el uso del sustractor Dopa.
 Realacion Absorvancia vs Tiempo del Tubo 12
0.3

0.25
Absorvancia (475 nm)
0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tiempo (s)

Grafica 4.- Representación de la Cinética de la enzima Polifenoloxidasa en papa, en el tubo de

muestra 12, con el uso del sustractor Dopa.

En base a la cinética de la enzima PPO, representada en las gráficas anteriores;

se determinó la posición lineal de cada curva para obtener la concentración (mmol
IQ/min*L) en los tubos que en base a la literatura es igual a la velocidad de
reacción (Vo); porque se da un cambio de concentración respecto a un tiempo.
Tomando la formulación siguiente:
�
�=
�∗ �

Donde
 m=pendiente

 E=coeficiente de extinción molar = 3600 M-1 cm-1

 C=concentración.
 l= longitud de la ruta a través de la muestra = 1 cm
Un ejemplo es, el tubo 2.-
0.0006
�= = 1.66𝑥 10−7 ����𝑆��
(3600 M − 1 cm − 1) ∗ (1 ��)

1.66𝑥 10−7 ��� 1000 ���� 60 �� �

�= 𝑥 𝑥 = 0.01 �
���𝐼��/�
����
�𝑆�� 1� �� 1� ���
Con los cálculos anteriores se obtuvo para cada tubo de muestra, las
concentraciones en unidades requeridas y su posterior velocidad de reacción; Tabla
2.
Después de obtener los resultados de la velocidad de reacción, se calcula la
actividad enzimática por cada gramo de papa para cada tubo. Esto se consigue
con la formulación a continuación:
𝐼𝑄 �� 𝑟 ����𝑖�� 50 �
�� ��� ��
�𝑟 𝐴
𝐴 = ����𝑖�
𝑖��
�����𝑖�
��𝑖�
�(�
��� ) 𝑖�∗
𝐿� ����� ����
𝑥�𝑟� ���𝑖��
�𝑖��
𝑥 10 ���.�
�����

Siguiendo el ejemplo del tubo 2.-

𝐼𝑄 1.5 �
�� � ������
� 50 �
�� ���
����𝐴
�
𝐴 = 0.01 (��� )∗ 𝑥
����� 0.25 �
�� ��𝑥��
� ���� ���𝑖�
��𝑖�
� 10 ��
.�����
�
�

= 0.3
�
�
A continuación en la tabla 2 se pueden apreciar los resultados de los tubos de
muestra en base a los cálculos anteriores.
Tabla 2.- Presentación de la velocidad de reacción y actividad enzimática que posee cada tubo de
muestra.

Velocidad de Actividad
reacción (mmol enzimática (U/g
tubo Pendiente IQ/min*L) de papa)
2 0.0006 0.01 0.3
3 0.0008 0.013333333 0.4
4 0.001 0.016666667 0.5
5 0.0014 0.023333333 0.7
6 0.0017 0.028333333 0.85
7 0.0021 0.035 1.05
8 0.0023 0.038333333 1.15
9 0.0023 0.038333333 1.15
10 0.0032 0.053333333 2
11 0.0025 0.041666667 2.08333333
12 0.0017 0.028333333 2.125

En este apartado se graficó la relación que existe entre la velocidad de reacción y

la concentración del sustractor (grafica 5); estos presentes en los tubos del 2 al 8.
Para la realización de los cálculos de concentración en cada tubo, se tomó como
concentración inicial la del sustrato Dopa 4 mg/ml del buffer B. Guiados de igual
manera de la tabla 1 en la preparación de las muestras para cada tubo se toma
en cuenta que solo se utiliza una alícuota de esta solución, dando como volumen
final en cada tubo 1.5 ml; con estos datos proporcionados ya se puede proseguir
al cálculo de la concentración del sustrato llamado Dopa.
4 �� ���
� � � 1𝜇��
�����
∗�
��. �
����
�𝑖�
�����
�𝑖�𝑖���
��∗
1.5 ������
�. �𝑖�
�� 0.19718 �� �
����
�

Este cálculo se realizó en los tubos de 2 al 8, tomando en cuenta sus cantidades

de alícuotas de dopa utilizadas en la preparación de la muestra de cada tubo
(tabla 3).

Tabla 3.- Representación de la velocidad de reacción y la concentración del sustrato dopa.

Concentración
Sustractor Velocidad de reacción
Tubo (µmol/Dopa) (mmol IQ/min*L) 1/[S] 1/[V]
2 0.6762011 0.01 1.47885 100
3 1.01430165 0.013333333 0.9859 75
4 1.3524022 0.016666667 0.739425 60
5 2.02860331 0.023333333 0.49295 42.8571429
6 2.70480441 0.028333333 0.3697125 35.2941176
7 3.38100551 0.035 0.29577 28.5714286
8 4.05720661 0.038333333 0.246475 26.0869565

Relacion Velocidad de Reaccion vs. Concentracion

Velocodad de reaccion (mmol IQ/min*L)

del sustracto

0.05

0.04

0.03

0.02

0.01

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Concentracion Sustracto (µmol/Dopa)

Grafica 5.- Relación de la velocidad de reacción, con la concentración del sustrato utilizado en los
tubos del 1 al 8.
Para el cálculo de la Km y Vmax; se utilizó el método de dobles recíprocos
propuesto por Lineweaver-Burk donde se hace uso de los inversos de la
concentración y la velocidad, presentados en la tabla 3. Este método se puede
observar en la gráfica 6.
Linealidad Por el Metodo de Dobles Reciprocos
120

100

80
y = 60.948x + 12.414
1/[V]

R² = 0.9945
60

40

20

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
1/[S]

Grafica 6.- Linealidad por el método de dobles recíprocos de tubo 2 al 8.

En base al método mencionado en el párrafo anterior se presenta la ecuación de

este modelo:
1 �
� 1 1
= + ∗
� � �á��. ��á��. 𝑆

Ya teniendo la gráfica 6 que representa este método; en base a su linealidad se

saca la ecuación de la recta. Teniendo así el cálculo correspondiente para sacar el
valor de la Vmáx.
y= 60.948x + 12.414
Vmáx= 1/12.414= 0.08055 mmol IQ /L min
Posteriormente al cálculo de Km.
y= 60.948x + 12.414
Km/Vmáx= 60.94
Km= (60.948)(0.08055)=4.090 mM
DISCUSIÓN

La enzima PPO se encuentra en alimento tanto de origen animal como en plantas

y frutos; en estos últimos este tipo de enzimas son las encargadas de la catálisis del
pardeamiento en los tejidos superficiales. En el análisis experimental llevado acabo
se utilizó como materia prima papa, a la cual se le extrajo la enzima PPO presente
en sus tejidos; Después ese extracto enzimático se empleó para la medición
de las velocidades de reacción a diferentes agregados de concentraciones de un
sustrato conocido como L- Dopa. En base a los resultados obtenidos de las
mediciones de las muestras en el espectófometro se pudo recurrir a la construcción
de graficas utilizando métodos de cinética enzimática; en este caso Lineweaver-
Burk, con el fin de determinar las constantes cinéticas Km =
4.090 mM L-DOPA y Vmáx =2.8538 0.08055 mmol IQ /L min.
Cabe mencionar que la importancia de este estudio de la cinética enzimática
reside en dos principios básicos. En primer lugar, permite explicar cómo funciona
una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cómo se comportará esa
enzima in vivo. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son
los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de
las enzimas en el control del metabolismo. También tienen gran importancia y
utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede
determinar la presencia y tipo de inhibidor.
En base a la literatura cuando se necesita conocer la cantidad de enzima
presente en una muestra se recurre a la velocidad de la reacción enzimática que
cataliza, en condiciones saturantes de sustrato (Vmáx). Teniendo en cuenta
Consideración como: en que a medida que aumenta la concentración de enzima
aumenta el complejo [ES] y por lo tanto aumenta la velocidad de la reacción. Cuando
se trabaja con concentraciones de sustrato saturantes, toda la enzima está
formando el complejo [ES] y el aumento de la velocidad es proporcional al aumento
de la concentración de enzima, es decir que estamos trabajando en condiciones de
Vmáx. Si la concentración de sustrato deja de ser saturante el aumento de la
actividad deja de ser proporcional, y la velocidad deja de ser máxima.
El comportamiento cinético de la reacción resultante por espectofotometría muestra
una concentración de producto un poco progresiva, de manera creciente esto
causado por la concentración de Dopa agregada a diversas cantidades de alícuotas.
A concentraciones de sustrato bajas en los tubos de 2 al 8 el aumento en
absorbancia fue casi sucesivo. A concentraciones altas de sustrato del tubo 9 al
12 se puede observar algunos valores y/o etapas en equilibro. Esto puso ser debido
a la inhibición, ya que se sabe que la tirosinasa puede ser inhibida irreversiblemente
por sus sustratos o-difenol, tales como L-dopa y catecol. De igual manera se
pudo haber dado a la actividad enzimática de la materia prima
utilizada ya que no se mantuvo en congelación sino que se refrigero un día antes
del análisis.

CONCLUSIÓN
Se determinó la actividad de la polifenoloxidasa presente en papa usando 3,4-
dihidroxifenilalanina como substrato y llevándose a observación de su cinética,
gracias a la utilización del espectrofotómetro en la formación de indol-5,6-quinona
(IQ).

EJERCICIOS

Para la determinación de la concentración con la cual se llevaría a cabo encontrar

la velocidad de reacción, se tomó en cuenta el dato proporcionado de 2mmol/L y
también teniendo en cuenta que el Coeficiente de extinción molar del indol-5,6-
quinona a 475 nm= 3600 1/M cm.
Tabla 3.- Representa los datos de las muestras llevadas al espectrómetro y las cuales representan
la linealidad de la curva.

Tiempo Absorbancia Concentración

(min) 475 nm (M)
0 0 0
0.25 0.1 2.78E-05
0.5 0.2 5.56E-05
0.75 0.3 8.33E-05
1 0.39 1.08E-04
 Relación Concentración - Tiempo
0.00012

0.0001
Concentracion (M)
0.00008
0.00006

0.00004 y = 0.0001x + 6E-07

R² = 0.9996
0.00002

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Tiempo (min)

Grafica 7.- Representación de la relación de la concentración con respecto el tiempo.

a) La velocidad de reacción es 0.0001 M/min

b) La Actividad Enzimática es 0.1 U/ml

Tabla 4.- velocidades de reacción de la oxidación del sustrato Dopa en la enzima
Polofenoloxidasa varias concentraciones de sustrato.
[S]mmol/L 1/[S] [V] mmol 1/[V]
/Lmin
1 1 0.05 20
1.5 0.66666667 0.069 14.4927536
2 0.5 0.085 11.7647059
2.5 0.4 0.099 10.1010101
3 0.33333333 0.111 9.00900901
3.5 0.28571429 0.125 8
4 0.25 0.132 7.57575758

Relacion Concentracion vs Relocidad

de Reacción
0.16
0.14 y = 0.0274x + 0.0273
[v] mmol /L min

0.12 R² = 0.9868
0.1
0.08
Series1
0.06
0.04 Lineal (Series1)
0.02
0
0 1 2 3 4 5
[S] mmol /L

Grafica 8.- Relación Velocidad de reacción con variantes en concentración del sustrato

La relación mostrada en la gráfica 8 nos da por observar que es linal la velocidad

de reacción respecto a la concentración de sustrato esto porque la enzima
transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida
que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo
la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad
de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica en la gráfica.
 Linealidad por el Método de Dobles
Reciprocos
25
y = 16.626x + 3.4032
20 R² = 0.9997

15
1/[V]

10 Series1

5 Lineal (Series1)

0
0 0.5 1 1.5
1/[S]

Grafica 9.- Linealidad Por el método de dobles recíprocos; cinética de PPO por la actividad
enzimática.

Km= 4.88 mmol

Vmáx: 0.293 mmol/min

Las variables antes encontradas que son Km y Vmáx, pueden variar cuando el
proceso de extracción de la enzima se prolonga en un intervalo de tiempo muy largo;
también influye la temperatura en la que se encuentra el extracto por su actividad
enzimática. Otro factor es el manejo de la calibración en los equipos utilizados.

REFERENCIAS
-Badui Salvador (2000). Química de los alimentos. Cuarta edición. Logman de
México editores. Pág. 310-311.

-Bohinski R. (1991) Bioquimica. Quinta edición. Pearson education. Pág. 186-187.

-García y Col. (2006). CINÉTICA Enzimática de la polifenol oxidasa del banano gros
michel en diferentes estados de maduración. Universidad de Antioquia Colombia.
-Trujillo y Col.( 2013).Characterization of the polyphenoloxidase in three varieties
of potato (Solanum tuberosum L.) minimally processed and its color effect.
Universidad de Pamplona.